Quinolylnitrones متميز للعلاج المشترك للسكتة الدماغية ومرض الزهايمرⅡ

3. المواد والطرق

3.1. توليف

تم تحضير وتنقية QNs المستهدفة كما هو موضح في المواد التكميلية.

3.2 تحليل الحماية العصبية في نموذج تجريبي لنقص التروية

3.2.1. الثقافات العصبية الأولية

تم تحضير الثقافات العصبية الأولية من القشرة الدماغية كما هو موضح سابقًا [16]. تم الحصول على قشور دماغية من أجنة الفئران E16 Sprague-Dawley ، وتم تجانسها وبذرها على أطباق بلاستيكية متعددة مطلية مسبقًا بـ 0. 05 مجم / مل بولي-ديسين بكثافة 2.5 × 105 خلية / سم 2. تم الاحتفاظ بالمزارع الخلوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 6.5 في المائة عند 37 درجة مئوية ، في وسط Dulbecco عالي الجلوكوز المضاف إليه 15 في المائة من مصل العجل الجنيني المعطل بالحرارة (56 درجة مئوية ، 30 دقيقة). بعد 24 ساعة ، تم استبدال وسط المزرعة بوسط خالٍ من المصل (Dulbecco's / Ham's F12 ، 1: 1 vol / vol ، 5 مجم / مل من الجلوكوز ، 2 ملي L- الجلوتامين ، و 1 ملي بيروفات الصوديوم ، وتستكمل بـ 100 ميكروغرام. / مل ترانسفيرين ، 100 ميكرومتر بوتريسين ، 20 نانومتر بروجسترون ، 30 نانومتر سيلينيت الصوديوم ، و 5 ميكروجرام / مل أنسولين).

انقر فوق cistanche tubulosa كبسولات لمرض الزهايمر

في التجارب التي تم الإبلاغ عنها ، تم استخدام مزارع عصبية من 6- إلى {{1} أيام في المختبر (DIV) ، والتي تحتوي على 90 في المائة من الخلايا العصبية الناضجة الإيجابية من نوع إيزوتيوبولين III ، كما هو موضح سابقًا [17]. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المرتبطة بالتجارب على الحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة رامون واي كاجال (مدريد ، إسبانيا).

3.2.2. الإقفار التجريبي في الثقافات والعلاجات العصبية

للحث على نقص التروية التجريبية ، تعرضت الثقافات العصبية الأولية للحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD) [18]. تم غسل ثقافات 6- إلى 7- DIV ووضعها في وسط Dulbecco الخالي من الجلوكوز ، والذي كان يحتوي في السابق على فقاعات بنسبة 95 بالمائة N2 / 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة ، وتم الاحتفاظ بها في غرفة غير هوائية مرطبة تحتوي على خليط غازي بنسبة 95 في المائة N2 / 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات (OGD4h). تم وضع المجموعة الضابطة في وسط Dulbecco المضاف إليه الجلوكوز واحتفظت به في الحاضنة المعيارية لمدة 4 ساعات. بعد 4 ساعات من الحضانة في ظل حالة نقص الأكسجين (OGD4h) أو حالة طبيعية (تحكم) ، تم وضع خلايا المزرعة بسرعة في وسط مستنبت خالي من المصل وظروف إعادة الأكسجة ، ثم تمت إضافة المركبات أو المركبات وتم الحفاظ على الخلايا في ظروف سامة ونموذجية لسكر الدم للتعافي لمدة 24 ساعة.

تضمنت المجموعة التجريبية للمركبة (R24h) نفس كميات المركبات التي تم اختبارها (التركيز النهائي بدون نص 0. 5 بالمائة إيثانول). بعد التعافي لمدة 24 ساعة ، تم تحديد صلاحية الخلية. تم تعيين ترتيب عشوائي لكل مجموعة تم فحصها لأداء الإجراء التجريبي بشكل أعمى. تم إجراء فحوصات مركبة بشكل مستقل من أربع إلى ثماني مرات مختلفة مع دفعات مختلفة من الثقافات ، وتم إجراء كل تجربة في أربع مرات.

3.2.3. فحص جدوى الخلية

لتقييم التأثير الوقائي للمركبات ضد OGD ، تم تقييم قابلية بقاء الخلية من خلال القياس الكمي للخلايا الحية النشطة الأيضية ، على النحو الذي يحدده الاختزال الضوئي لـ 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيل ثيازول {{3) }} yl) -2 ، 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (Roche) إلى منتج فورمازان أزرق.

تم إجراء فحص MTT بعد فترة الاسترداد - باستثناء مجموعة OGD 4 ساعات ، والتي تمت إضافة MTT لها بعد نهاية فترة OGD مباشرة ، بدون استرداد — عن طريق معالجة الخلايا باستخدام 0. 2 مجم / مل MTT في وسط الاستزراع لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو 6.5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، تم تحلل الخلايا بكمية متساوية من محلول التحلل (10 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك ، 10 في المائة SDS) بين عشية وضحاها. تم تحديد كمية تخفيض MTT من خلال قياس الامتصاصية عند 595 نانومتر (690 نانومتر كمرجع). يشير انخفاض نشاط MTT إلى ضعف في وظيفة الميتوكوندريا ويعتبر مؤشراً على تلف الخلايا.

3.3 تحليل الحماية العصبية في النماذج التجريبية ميلادي

3.3.1. SHSY -5 ثقافة الخلية Y

تم الحصول على خط الخلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y من Sigma-Aldrich (مدريد ، إسبانيا) ، وتمت صيانته وتربيته في مزيج 1: 1 من الوسط الأساسي الأدنى لـ Eagle (EMEM) ووسائط F12 المكملة بنسبة 10 في المائة من مصل الأبقار الجنيني (FBS) ) وفق الإجراءات التي سبق وصفها [8].

تم زرع البذور في قوارير والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون و 95 في المائة من الهواء. لمقايسات الجدوى ، تم زرع خلايا SH-SY5Y في 96- ألواح بئر بكثافة 50 ، 000 خلية / بشكل جيد بعد الإجراء المبلغ عنه [8]. في هذه الدراسة ، تم استخدام جميع الخلايا بعدد ممر منخفض (<14).

3.3.2. دراسات الحماية العصبية

لدراسة التأثير الوقائي العصبي المحتمل للمركبات ، تم تحضين الخلايا مسبقًا بالمركبات عند 0. 3 ، 1 ، 3 ، أو 10 ميكرومتر لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا بـ 30 ميكرومتر من Rotenone و 10 ميكرومتر Oligomycin-A (R / O) [19] ، أو Okadaic Acid (20 نانومتر) [20] ، أو Amyloid - 25-35 (30 ميكرومتر) (Sigma-Aldrich ، مدريد ، إسبانيا) مع أو بدون مركبات بتركيزات مختلفة لمدة 24 ساعة. في نهاية التجربة ، تم قياس صلاحية الخلية باستخدام طريقة MTT الموصوفة في القسم 3.2.3.

3.4. تحليل احصائي

تم حساب متوسط ​​النتائج التي تم الحصول عليها لكل علاج وتحليلها بشكل مستقل ، وتم إخفاء معلومات العلاج طوال فترة الدراسة. تم تمثيل البيانات على أنها تعني ± SE. تم إجراء تحليل التباين (ANOVA) لمقارنة البيانات بين تركيزات متعددة ، بعد اختبار لاحق عندما كان تحليل التباين مهمًا. تم تعيين مستوى الأهمية الإحصائية عند {{0}}. 05 باستخدام برنامج Prism الإحصائي 5.0 (GraphPad).

3.5 تحليل ADME

تم تقييم خصائص ADME للمركب MC903 باستخدام وحدة QikProp من Schrödinger (QikProp ، الإصدار 5.1 ، Schrödinger ، LLC ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، يناير 2017) [21-23].

4. الخلاصةالاستخدامات

في هذا العمل ، كشفنا عن النتائج الأولية التي حصلنا عليها في البحث عن عوامل فردية وجديدة للعلاج المشترك المحتمل للسكتة الدماغية ومرض الزهايمر. على عكس الأساليب الأخرى التي تم الإبلاغ عنها [14 ، 15] ، تناولنا هنا لأول مرة تصميم دواء مدفوع بعقلانية باستخدام استراتيجية تصميم دواء مبني على الشظايا استنادًا إلى تجاور العقاقير المختارة من QN23 و Contilisant ، مركبات الرصاص الأكثر تقدمًا لدينا لعلاج السكتة الدماغية ومرض الزهايمر على التوالي.

وبالتالي ، عند البحث عن نيترونات جديدة كعوامل مضادة للأكسدة وقائية للأعصاب ، قادرة ليس فقط على تقليل مستويات ROS ولكن أيضًا على الارتباط بالأهداف البيولوجية وزيادة مستوى النواقل العصبية - وهو عجز رئيسي موجود في دماغ مرضى الزهايمر - قمنا بتصنيع QNs JMA101A ، JMA98C و DDI89 و DDI88 و JMA12A و JMA11A و MC903 و MC902 (الشكل 1) وأخضعوهم لفحوصات النمط الظاهري المناسبة للإصابة الدماغية و AD. نتيجة لذلك ، تمكنا من تحديد MC903 كعامل ناجح. فيما يتعلق بالهيكل ، يحمل MC903 نفس المجموعات الوظيفية في نفس المواضع مثل QN23 ، باستثناء N-propargyl piperazine الذي تم استبداله في النيتروجين الآخر بواسطة شكل خطي ثلاثي الميثيلين مرتبط بـ O (C6) ، بدلاً من مجموعة methoxy.

مع الأخذ في الاعتبار النتائج التي تم الحصول عليها من خلال تقرير التقييم المبدئي الأولي المذكور هنا ، يبدو هذا الترتيب الوظيفي والمتخصص في الصيدلة حاسمًا للأنشطة التي تمت ملاحظتها ويجب أن يؤخذ في الاعتبار لمزيد من التطورات. وبالتالي ، يعد MC903 QN جديدًا وصغيرًا للعلاج المشترك المحتمل للسكتة الدماغية ومرض الزهايمر ، حيث يُظهر خصائص قوية للحماية العصبية على الثقافات العصبية الأولية في ظل ظروف OGD كنموذج تجريبي لنقص التروية ، وعلى خلايا الخط العصبي ضد R / O أو OA أو أ 25 - 35 علاجًا يحاكي التأثيرات الموجودة في ميلادي.

بناءً على هذه النتائج الواعدة ، يتم توجيه جهودنا الآن لتحسين المظهر الدوائي المرصود لـ hit-MC903 من خلال التصميم والتوليف والتقييم البيولوجي لـ QNs الجديدة ذات الصلة ، بما في ذلك تحليلات الارتباط الأنزيمية والمستقبلات ذات الصلة ، والبحث عن الرصاص QN للخضوع لسكتة دماغية إقفارية مناسبة ونماذج حيوانية. تمهد النتائج الحالية الطريق لأفكار وتطورات علاجية جديدة في البحث عن عوامل جديدة للعلاج المشترك للسكتة الدماغية ومرض الزهايمر.

آلية Cistaتأثير الحماية العصبية nche

Cistanche هو عشب صيني تقليدي تم الإبلاغ عن أن له تأثيرات اعصاب. الآليات الكامنة وراء هذه التأثيرات ليست مفهومة تمامًا ، ولكن هناك العديد من الآليات المحتملة التي اقترحها الباحثون:

1. نشاط مضاد للأكسدة: تم العثور على مقتطفات Cistanche تمتلك نشاطًا قويًا مضادًا للأكسدة ، والذي يمكن أن يحمي من تلف الخلايا العصبية الناجم عن الإجهاد التأكسدي.

2. التأثيرات المضادة للالتهابات: الالتهاب سبب شائع للأمراض التنكسية العصبية ، وقد ثبت أن مستخلصات الكستانش لها تأثيرات مضادة للالتهابات يمكن أن تخفف من تلف الخلايا العصبية.

3. حماية وظيفة الميتوكوندريا: يعد الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا مساهمًا رئيسيًا في تلف الخلايا العصبية وموت الخلايا ، وقد تم العثور على مقتطفات cistanche للحماية من تلف الميتوكوندريا وتحسين وظيفة الميتوكوندريا.

4. تنشيط عوامل التغذية العصبية: العوامل التغذوية العصبية هي مواد كيميائية تعزز نمو الخلايا العصبية وبقائها على قيد الحياة ، وقد ثبت أن مستخلصات الكيستانش تزيد من التعبير عن عوامل التغذية العصبية مثل عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) وعامل نمو الأعصاب (NGF) .

إحالةسيس

1 كارني ، جي إم ؛ ستارك ريد ، بي ؛ أوليفر ، سي إن ؛ Landum ، RW ؛ تشنغ ، مرض التصلب العصبي المتعدد ؛ وو ، جي إف ؛ Floyd ، RA عكس الزيادة المرتبطة بالعمر في أكسدة بروتين الدماغ ، وانخفاض نشاط الإنزيم ، وفقدان الذاكرة الزمانية والمكانية عن طريق الإدارة المزمنة لمركب محاصرة الدوران N-tert-butyl-alpha-phenylnitrone. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 1991، 88، 3633–3636. [CrossRef]

2. القيقب ، KR ؛ أخضر ، AR ؛ فلويد ، RA العلاجات ذات الصلة بالنيترون. أدوية الجهاز العصبي المركزي 2004 ، 18 ، 1071-1084. [CrossRef] [PubMed]

3. تشانغ ، س. جاو ، ت. لوه ، واي. تشين ، العاشر ؛ جاو ، ج. جاو ، العاشر ؛ تشو ، واي. Dai، J. يتسبب نقص التروية الدماغي البؤري العابر / ضخه في تغيرات عصبية مبكرة ومزمنة في الفئران: أهميته لخطر الإصابة بمرض الزهايمر. بلوس وان 2012 ، 7 ، e33722. [CrossRef]

4. كيم ، ها. ميلر ، AA ؛ دروموند ، GR ؛ أماندا ، ج. التوفير ، AG ؛ اروموجام ، تلفزيون ؛ فان ، تيراغرام ؛ سريكانث ، ف. سوبي ، سي جي ضعف الإدراك الوعائي ومرض الزهايمر: دور نقص تدفق الدم الدماغي والإجهاد التأكسدي. قوس نونين شميدبرج. فارماكول. 2012 ، 385 ، 953-959. [CrossRef] [PubMed]

5. زين ، ج. كيم ، واي تي ؛ لي ، أرسي ؛ يوكوم ، ياء ؛ كابور ، إن. لانجر ، ياء ؛ Dobrowolski ، P. ؛ ماروياما ، تي. ناروميا ، إس. تسبب مستقبل Doré، S. PGE2 EP1 في تفاقم السمية العصبية في نموذج فأر للإقفار الدماغي ومرض الزهايمر. نيوروبيول. شيخوخة 2012، 33، 2215-2219. [CrossRef]

6. ماكراي ، ميشيغان ؛ ألان ، SM Stroke: الماضي والحاضر والمستقبل. علم الأعصاب الدماغي. حال. 2018 ، 2 ، 1-5. [CrossRef]

7 - شيوا م. Martìnez-Alonso، E.؛ Gonzalo-Gobernado ، R. ؛ أيوسو ، ميشيغان ؛ إسكوبار بيزو ، أ. الرضع ، لام ؛ Hadjipavlou-Litina، D. ؛ مونتويا ، ي. مونتانير ، ياء ؛ ألكازار ، أ. وآخرون. quinolylnitrones الجديدة لعلاج السكتة الدماغية: مضادات الأكسدة والوقاية العصبية (Z) -N-tert-butyl -1- (2- كلورو -6- ميثوكسيكوينولين -3- yl) أكسيد الميثينامين (كرصاص جديد -مركب لعلاج السكتة الدماغية. J. Med. Chem. 2019، 62، 2184-2201. [CrossRef] [PubMed]

8. Bautista-Aguilera، OM ؛ هاجنو ، إس. Palomino-Antolìn، A .؛ Farré-Alìns، V.؛ الإسماعيلي ، إل. جوفرين ، P.-L. ؛ جيمينو ، مل ؛ Soukup ، O. ؛ جانوكوفا ، ياء ؛ كالينوفسكي ، إل. وآخرون. الروابط متعددة الأغراض الموجهة التي تجمع بين تثبيط إنزيم الكولينستيراز وأكسيداز أحادي الأمين مع عداء الهيستامين H3R للأمراض التنكسية العصبية. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إد. 2017 ، 56 ، 12765-12769. [CrossRef] [PubMed]

9. Bautista-Aguilera، OM ؛ بودني ، ياء ؛ مينا ، ف. ميديروس ، إب ؛ دوثر كونراد ، دبليو. إنترينا ، جي إم ؛ موراليدا ، أنا. Iriepa ، أنا ؛ لوبيز مونوز ، ف. Marco-Contelles ، J. Contilisant ، وهو جزيء صغير مستهدف رباعي لعلاج مرض الزهايمر يجمع بين الكولينستراز وتثبيط أوكسيديز أحادي الأمين وتضاد H3R مع ملف ناهض S1R. جيه ميد. تشيم. 2018، 61، 6937–6943. [CrossRef] [PubMed]

10. بوليا ، أنا. Juàrez-Jiménez، J.؛ دي لوس روس ، سي ؛ شيوا ، م. بوبلانا ، ر. لوك ، FJ ؛ Unzeta ، M. ؛ ماركو كونتيليس ، ياء ؛ Samadi، A. التوليف والتقييم البيولوجي والنمذجة الجزيئية لـ donepezil و n - [(5- (benzyloxy) -1- methyl -1 h-indol -2- yl) methyl] - nmethylprop -2- yn {11}} الهجينة أمين كمثبطات الكولينستراز / مونوامين أوكسيديز متعددة القدرات لعلاج مرض الزهايمر. جيه ميد. تشيم. 2011 ، 54 ، 8251-8270. [CrossRef] [PubMed]

11. برونس ، ر. De Deyn، PP تعقيد العمليات العصبية الحيوية في السكتة الدماغية الحادة. كلين. نيورول. جراحة الأعصاب. 2009 ، 111 ، 483-495. [CrossRef]

12. ماركو كونتيليس ، ج. أ تاو ، لوبي ، أم دين؟ ACS ميد. تشيم. بادئة رسالة. 2019 ، 10 ، 1361-1362. [CrossRef] [PubMed]

13. Oset-Gasque، MJ؛ ماركو-كونتيليس ، مرض ألزهايمر ، نموذج "جزيء واحد ، هدف واحد" ، ونهج الترابط متعدد الأهداف الموجه. ACS Chem. نيوروسسي. 2018 ، 9 ، 401-403. [CrossRef] [PubMed]

14. الشمس ، ص. تشو ، دبليو. يو ، ح. تشانغ ، سي. أوييييييييييييييييييييييي يانغ ، زي. يعمل Hu، W. Compound AD110 كإدارة علاجية لمرض الزهايمر والسكتة الدماغية في نماذج الفئران والجرذان. ACS Chem. نيوروسسي. 2020 ، 11 ، 929-938. [CrossRef] [PubMed]

15. Liu، Z .؛ كاي ، دبليو. لانج ، م. يان ، ر. لي ، زي. تشانغ ، جي ؛ نعم.؛ وانغ ، واي. الشمس ، واي. Zhang، Z. التأثيرات الوقائية للأعصاب وآليات عمل العوامل متعددة الوظائف التي تستهدف الجذور الحرة وأكسيداز أحادي الأمين B والكولينستراز في نموذج مرض باركنسون. J. مول. نيوروسسي. 2017 ، 61 ، 498-510. [CrossRef] [PubMed]

16 - كيفيدو ، سي. ساليناس ، م. Alcázar، A. يتم تنظيم نشاط عامل البدء 2 ب بواسطة بروتين فوسفاتيز 1 ، والذي يتم تنشيطه بواسطة مسار بروتين كيناز (الخريطة) المعتمد على الميثوجين في الخلايا العصبية التي تحفز عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1-. J. بيول. تشيم. 2003 ، 278 ، 16579–16586. [CrossRef]

17. سيد ، سي. ألكازار ، أ. ريجيدور ، أنا. Masjuán ، J. ؛ ساليناس ، م. Álvarez-Cermeño ، J. موت الخلايا المبرمج العصبي الناجم عن السائل الدماغي الشوكي من مرضى التصلب المتعدد يرتبط بآفات hypointense على التصوير بالرنين المغناطيسي t1. J. نيورول. علوم. 2002 ، 193 ، 103-109. [CrossRef]

18- شيوا م. سالغادو راموس ، م. Diez-Iriepa ، D. ؛ إسكوبار بيزو ، أ. Iriepa ، أنا ؛ Hadjipavlou-Litina، D. ؛ Martínez-Alonso، E.؛ ألكازار ، أ. ماركو كونتيليس ، J.Newel quinolylnitrones يجمع بين خصائص الحماية العصبية ومضادات الأكسدة. ACS Chem. نيوروسسي. 2019 ، 10 ، 2703-2706. [CrossRef] [PubMed]

19. مالك ر. Arribas ، RL ؛ Palomino-Antolín، A .؛ توتوسون ، ب. ديموجيوت ، سي ؛ كوبريلوفا ، تي. Soukup ، O. ؛ Iriepa ، أنا ؛ موراليدا ، أنا. DiezIriepa، D.؛ وآخرون. جزيئات صغيرة مزدوجة جديدة لعلاج مرض الزهايمر تجمع بين عداء مستقبلات الهيستامين h 3 (h3r) وقنوات الكالسيوم التي تحجب مع تثبيط إضافي للكولينستريز. جيه ميد. تشيم. 2019 ، 26 ، 11416-11422. [CrossRef]

20. Buendía، I .؛ إيجيا ، ياء ؛ بارادا ، إي. نافارو ، إي. ليون ، ر. Rodríguez-Franco، MI؛ López، MG يوفر الميلاتونين- N ، N-dibenzyl (Nmethyl) amine hybrid ITH91 / IQM157 الحماية العصبية في نموذج الزهايمر في المختبر عن طريق تحريض hemo-Oxygenase -1. ACS Chem. نيوروسسي. 2015 ، 18 ، 288-296. [CrossRef]

21. ليبينسكي ، كاليفورنيا ؛ لومباردو ، ف. دوميني ، BW ؛ Feeney ، PJ الأساليب التجريبية والحسابية لتقدير الذوبان والنفاذية في إعدادات اكتشاف وتطوير الأدوية. حال. المخدرات Deliv. القس 2001 ، 46 ، 3-26. [CrossRef]

22. Duffy، EM؛ Jorgensen ، WL التنبؤ بالخصائص من المحاكاة: الطاقات الحرة للذوبان في هيكساديكان ، أوكتانول ، وواتر. جيه. تشيم. شركة 2000 ، 122 ، 2878-2888. [CrossRef]

23. Jorgensen، WL؛ دافي ، إم توقع قابلية ذوبان الدواء من محاكاة مونت كارلو. بيورج. ميد. تشيم. بادئة رسالة. 2000 ، 10 ، 1155-1158. [CrossRef]