نسبة التركيز في النظام الغذائي لأبقار الألبان في وقت مبكر من الرضاعة لها تأثيرات متناقضة على الملامح النسخية العالمية لكريات الدم البيضاء والصحة والخصوبة وفقًا للتكافؤ

خلاصة:يتم تثبيط وظيفة كريات الدم البيضاء المنتشرة في أبقار الألبان بعد الولادة، مع وجود توازن الطاقة السلبي كعامل خطر. تمت مقارنة الملامح النصية للكريات البيض بشكل منفصل في 44 بقرة متعددة الولادات (MP) و 18 أبقار هولشتاين-فريزيان أولية (PP) تتلقى وجبات تختلف في نسبة التركيز لاختبار ما إذا كان يمكن تخفيف الخلل المناعي عن طريق التغذية المناسبة. بعد الولادة، تم تقديم الأبقار إما (1) تركيز منخفض (LC)؛ (2) علائق متوسطة التركيز (MC)، أو (3) علائق عالية التركيز (HC) بنسب من التركيز إلى سيلاج العشب تبلغ 30%: 70%، 50%: 50%، و70%: 30%، على التوالي. وشملت بيانات النمط الظاهري للبقرة التي تم جمعها المستقلبات المنتشرة وإنتاج الحليب وسجلات الصحة والخصوبة. تم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) لكريات الدم البيضاء المنتشرة عند 14 يومًا في الحليب. أدى النظام الغذائي HC إلى تحسين توازن الطاقة في كلا الفئتين العمريتين. كان هناك جينات معبر عنها تفاضليًا أكثر في PP مقارنة بالأبقار MP (460 مقابل 173، مقارنة HC مقابل LC) مع القليل من التداخلات. أظهرت الأبقار MP التي تتبع النظام الغذائي LC زيادة في تنظيم المتممات وسلسلة التخثر وآليات الدفاع المناعي الفطرية ضد مسببات الأمراض وكان لديها اتجاه لمزيد من حالات التهاب الضرع وضعف الخصوبة. في المقابل، أظهرت أبقار PP التي تتبع النظام الغذائي HC استجابات مناعية أكبر بناءً على كل من التعبير الجيني والبيانات المظهرية وفترة أطول من الولادة حتى الحمل. ولذلك استجابت الكريات البيض للأبقار MP وPP بشكل تفاضلي للنظام الغذائي بين العمر، وإمدادات المواد الغذائية، والمناعة التي تؤثر على صحتها وخصوبتها اللاحقة.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

الكلمات الدالة:كبت المناعة بعد الولادة. المناعة الفطرية الاسْتِقْلاب؛ الكريات البيض. حمية الرضاعة؛ نسخة. التكاثر؛ الأبقار

1 المقدمة

تتميز أبقار الألبان في فترة ما بعد الولادة المبكرة بكبت المناعة الذي يؤثر على المناعة الفطرية والتكيفية، بما في ذلك المناعة الخلوية والمناعة الخلطية. يتم تجنيد كريات الدم البيضاء المنتشرة في أنسجة مثل الغدة الثديية وبطانة الرحم أثناء الالتهاب. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات السابقة انخفاضًا في أعداد كريات الدم البيضاء وقدرتها الوظيفية خلال فترة ما حول الولادة [1،2]. تشمل التأثيرات المبلغ عنها ضعف البلعمة ونشاط الانفجار التأكسدي [3-5]، وانخفاض استجابة الخلايا التائية المنتشرة للعوامل المسببة للتسبب في التسبب في التسبب، وانخفاض إنتاج الجلوبيولين المناعي بواسطة الخلايا البائية [6،7]. الأسباب متعددة العوامل ولكنها تبدو مرتبطة بتقسيم المغذيات لصالح إنتاج الحليب في بداية الرضاعة، مما يضر بوظيفة المناعة [8-10]. تتطلب الكريات البيض إمدادات كافية من الجلوكوز والأحماض الدهنية المختلفة والكوليسترول أو الأوكسيستيرول لصيانتها ووظائفها [8،11،12]. ومع ذلك، يتم إعطاء الأولوية لإمدادات المغذيات المتاحة للغدة الثديية بعد الولادة، مما يتطلب ما يقرب من 25٪ من الطاقة القابلة للاستقلاب والبروتين أكثر مما يوفره تناول العلف [8،13،14]. بالإضافة إلى ذلك، تتميز الولادة بعمليات التهابية مرتبطة بالتغيرات في إفراز البروستاجلاندينات والستيرويدات والسيتوكينات المختلفة والإصابات المحتملة أثناء عملية الولادة نفسها [15-17]. الاستجابات الالتهابية للولادة والأيضات التي يتم إطلاقها أثناء تعبئة الأنسجة لها تأثيرات قوية لفقدان الشهية، مما يؤدي إلى تقليل المدخول وتفاقم توازن الطاقة السلبي (NEB) [18]. عندما لا يتمكن تناول العلف من تلبية الطلب المتزايد على الطاقة، تدخل الأبقار في فترة NEB، حيث يصبح بعض الأفراد غير متوازنين في التمثيل الغذائي [19-21]. يرتبط NEB بمقاومة الأنسولين، وانخفاض التعبير عن مستقبلات هرمون النمو الكبدي (GH)، وانخفاض تخليق IGF -1 الكبدي [22،23]. إن فصل هرمون النمو عن الأنسولين في الأبقار بعد الولادة هو تكيف يعطي الأولوية لإمداد الجلوكوز إلى الأنسجة مثل الخلايا الظهارية الثديية، حيث يكون امتصاصها مستقلاً عن الأنسولين [8]. في هذه الحالة، لا يمكن تجنب التنافس على إمدادات الطاقة بين الغدة الثديية والجهاز المناعي، حيث يعتمد كلاهما على نفس الركائز الأساسية وكلاهما مستهلكان رئيسيان للطاقة. كفيديرا وآخرون. [24] أثبت أن تنشيط الاستجابة المناعية الكاملة في الأبقار يتطلب 2.5 إلى 3.1 كجم من الجلوكوز يوميًا. وهذا مشابه للمتطلبات المقدرة بـ 2.7 كجم / يوم من الجلوكوز التي تتناولها الخلايا الظهارية الثديية لإنتاج الحليب البالغة 40 كجم / يوم [8].

ترتبط تعبئة الأنسجة أيضًا بزيادة تركيزات الدورة الدموية للأحماض الدهنية غير الأسترة (NEFAs)، وبيتا هيدروكسي بويترات (BHB)، وانخفاض IGF -1، وكلها تساهم في الخلل المناعي [5,9,10,20 ]. على سبيل المثال، أوضحت دراستنا الأخيرة أن التصاق خلية إلى خلية الكريات البيض تم تثبيطه عندما تجاوز تركيز NEFA 750 ميكرومتر [25]. على الرغم من أن تعبئة الأنسجة هي تكيف طبيعي للثدييات لدعم الرضاعة، فقد أظهرت العديد من الدراسات أن NEB الشديد له تأثير كبير على قدرة البقرة اللاحقة على الحمل في الوقت المناسب [26]. يمكن أن يكون هذا بسبب مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك التأخير في استعادة بيئة الرحم المناسبة [2]؛ فترة طويلة من انقطاع الإباضة [27]، وضعف البيئة داخل الجريب [28]، وضعف جودة البويضات [29]. عادة ما تصل عجول الألبان إلى حوالي 90% من وزن جسمها الناضج [30]. أظهرت دراستنا السابقة أن الأبقار البكر (PP) لديها تركيزات أعلى من الأنسولين، IGF-1، والليبتين في الدورة الدموية، وتركيزات أقل من مستقلبات الدم (BHB، NEFAs، واليوريا)، وتركيزات أعلى من الجلوكوز مقارنة بالأبقار متعددة الولادات (MP). ) الأبقار لمدة 7 أسابيع على الأقل بعد الولادة [31،32]. يشير هذا إلى أن هناك انفصالًا أقل للمحور الجسدي في الرضاعة المبكرة في أبقار PP مقارنة بالأبقار MP، ويرتبط ذلك بإعطاء الأولوية الأضعف للعناصر الغذائية للغدة الثديية، مما يسمح بالنمو المستمر. تختلف أيضًا ملامح التعبير الجيني في كريات الدم البيضاء المنتشرة بين الأبقار PP وMP أثناء الرضاعة المبكرة [33].

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

يمكن أن يؤدي تحسين إدارة التغذية خلال فترة الجفاف إلى زيادة تناول المادة الجافة (DMI)، وتقليل حدوث الأمراض المحيطة بالولادة، وتحسين الخصوبة [34]. توجد إرشادات عامة حول كيفية تقليل مخاطر الأمراض المتعلقة بالتغذية والإدارة [35]. ومع ذلك، هناك القليل من المعلومات المتاحة عن التركيبات الغذائية للبقرة الفردية التي تعاني من خلل أيضي خلال فترة ما بعد الولادة والتي يمكن أن تحسن وظيفة المناعة، وتقلل من حدوث المرض، وتحسن الأداء الإنجابي اللاحق. إن صياغة الأنظمة الغذائية التي تحتوي على نسبة عالية من العناصر الغذائية يعد نهجًا عمليًا [36]. في هذه الدراسة، تم تقديم وجبات منخفضة (LC)، أو متوسطة (MC)، أو عالية التركيز (HC) للأبقار في مرحلة الرضاعة المبكرة بناءً على نسب التركيز إلى سيلاج العشب، والتأثيرات على الصحة الأيضية والمرض، والمناعة الجهازية ( من خلال تقييم ملامح التعبير الجيني للكريات البيض المنتشرة عالميًا). تم تحليل البيانات من الأبقار PP وMP بشكل منفصل لتجنب أي تأثير مربك ينشأ عن التكافؤ. كانت فرضيتنا هي أن الأنظمة الغذائية عالية التركيز من شأنها أن تحسن وظائف المناعة وتفيد الخصوبة.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

2. النتائج

2.1. تأثير النظام الغذائي على مدخول المادة الجافة وإنتاج الحليب وتوازن الطاقة ومستقلبات الدم

تم تلخيص معلمات الحليب ووزن الجسم (BW) وDMI ودرجة حالة الجسم (BCS) وتوازن الطاقة (EBAL) ومستقلبات الدم لكل من الأبقار MP وPP عند حوالي 14 يومًا في الحليب (DIM) في الجدول 1. كانت أبقار MP مختلفة بشكل كبير بين المجموعات الغذائية الثلاث بترتيب HC > MC > LC (p < 0.01–0.0{{11 }}1). كان إنتاج الحليب في الأبقار MP التي تتغذى على النظام الغذائي HC أعلى بكثير من تلك التي تتلقى النظام الغذائي LC (p < 0.05). كان الفرق في إنتاج الحليب المصحح بالطاقة (ECM) بين مجموعتي LC وHC كبيرًا (p < 0.05)، مع وجود قيم متوسطة في مجموعة MC. كانت قيم EBAL في جميع مجموعات MP الثلاث سلبية ولكن تلك الموجودة في أبقار MC وHC كانت أفضل بكثير (أقل سلبية) مما كانت عليه في أبقار LC (P <0.01). كانت التركيزات المنتشرة لكل من الجلوكوز (p <0.01) وIGF -1 (p <0.001) في أبقار HC أعلى بكثير منها في أبقار LC. أنتجت الأبقار MP التي قدمت وجبات HC أيضًا يوريا أقل انتشارًا (P <0.001) وBHB (P <0.05) وNEFAs مقارنة بتلك التي قدمت وجبات LC بتركيزات LC > MC > HC، على الرغم من وجود اختلافات في تركيزات NEFA بين المجموعات الغذائية لم تكن ذات دلالة إحصائية.

الجدول 1. إجمالي مدخول المادة الجافة، ومعلمات الحليب، وأوزان الجسم، وتوازن الطاقة، ودرجة حالة الجسم، ومستقلبات الدم في حوالي 14 يومًا بعد الولادة، ويتم تحليلها وفقًا للتكافؤ والنظام الغذائي 1،2

في أبقار PP، كان لدى أولئك الذين يتلقون نظام MC أو HC مؤشر DMI أعلى من أولئك الذين يتلقون نظام LC (p < {{0}}.01). وكانت إنتاجية الحليب لا تختلف كثيرا. كان EBAL إيجابيًا في الأبقار التي قدمت نظامًا غذائيًا MC أو HC، بينما كان سلبيًا بالنسبة لتلك التي قدمت نظامًا غذائيًا LC. وكانت الاختلافات في EBAL بين الأبقار HC وLC PP كبيرة (P <0.05). من بين المستقلبات المقاسة، اختلفت تركيزات اليوريا فقط بين المجموعتين، حيث كانت أقل في أبقار HC (LC > MC > HC، p <0.001 لـ LC مقابل HC أو MC).

2.2. تأثير النظام الغذائي على المعلمات الالتهابية

يتم عرض آثار النظام الغذائي على المعلمات الالتهابية المقاسة في الرحم والغدة الثديية في الجدول 2. في أبقار PP، كانت نسبة كريات الدم البيضاء متعددة الأشكال النووية إلى الخلايا الظهارية الرحمية (PMNs: UECs) التي تم جمعها من الرحم باستخدام فرشاة خلوية أعلى بكثير الأبقار الموجودة على HC مقارنة بالنظام الغذائي LC (p < 0.05). في الأبقار MP، كان الاتجاه في نفس الاتجاه، مع LC < MC < HC، لكنه لم يحقق دلالة إحصائية. في الحليب، كان لدى الأبقار MP التي تتبع النظام الغذائي LC نسبة SCC أعلى بكثير من تلك الموجودة في النظام الغذائي MC أو HC (p < 0.05)، بينما في الأبقار PP كان الاتجاه غير المهم في الاتجاه المعاكس. . اتبعت تركيزات الحليب N-acetyl- - d-glucosaminidase (NAGase) ونازعة هيدروجين اللاكتات (LDH)، وهي إنزيمات الحليب التي تشير إلى التهاب الضرع، نفس الاتجاهات العامة مثل قيم SCC ولكن لم تكن هناك اختلافات مهمة. وقد تم دعم هذه النتائج من خلال السجلات الصحية. لم تواجه الأبقار MP التي تتبع النظام الغذائي HC أي حالات التهاب الضرع (0/15) في حين تم تشخيص 4/14 (28.6٪) من الأبقار التي تتبع النظام الغذائي LC بالتهاب الضرع السريري خلال 16 يومًا من الولادة. كان الاتجاه مرة أخرى في الاتجاه المعاكس بالنسبة للأبقار PP مع واحدة من ستة (16.7٪) على النظام الغذائي LC مصابة بالتهاب الضرع السريري مقارنة بحالة واحدة من التهاب الضرع السريري وحالتين من التهاب الضرع تحت السريري على النظام الغذائي HC (50٪).

الجدول 2. المعلمات الالتهابية بعد حوالي 14 يومًا من الولادة وفقًا للعدد والنظام الغذائي 1،2.

2.3. بيانات الخصوبة

ترد تفاصيل بيانات الخصوبة في الجدول 3. بالنسبة للأبقار MP، استغرقت تلك التي تتبع النظام الغذائي LC وقتًا أطول قليلاً للحمل وتتطلب المزيد من الخدمات لكل حمل مقارنة بالأبقار HC (2.4 ± 0.42 مقابل 1.6 ± 0.23)، على الرغم من أن المزيد من أبقار HC إما لم يتم تقديم الخدمة لها (قرار إداري) أو فشلت في الحمل على الإطلاق (6{{10}}.0% مقابل 71.4%). ومع ذلك، لم تكن أي من هذه الاختلافات ذات أهمية. بالنسبة للأبقار PP، كان العكس هو الصحيح، حيث كانت لدى الأبقار LC أقصر فترة زمنية لحدوث الحمل بمقدار 29 يومًا (p < {{20}}.05)، حيث حملت خمسة من الحيوانات الستة للمرة الأولى. . في المقابل، لم يتم تقديم الخدمة لنصف مجموعة HC (ن=2) أو فشلوا في الحمل (ن=1)، مع أن الثلاثة الذين تصوروا يحتاجون إلى 2.0 ± 0.41 خدمة لكل حمل. أدى ذلك إلى حصول مجموعة HC على درجة "في ربلة الساق" (ICB) أعلى بكثير (P <0.05).

الجدول 3. بيانات الخصوبة حسب التكافؤ والنظام الغذائي 1،2

2.4. عرضت الملامح النسخية للكريات البيض في الأبقار نسبًا مختلفة من التركيز

يحتوي الجينوم البقري المرجعي لـ ARS-UCD 1.2 المقدم من RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly، تم الوصول إليه في 1 مايو 2022) على 35158 جينًا، منها 19001 جينًا من كريات الدم البيضاء قابلة للقياس الكمي عندما يقرأ التسلسل في ملفات FASTQ تم تعيينها لها. يعرض الشكل 1 مخططات بركانية توضح ملامح التعبير في كل من أبقار MP وPP التي تتلقى الأنظمة الغذائية الثلاثة المختلفة. في أبقار MP، كان هناك 173 جينًا معبرًا عنها تفاضليًا (DEGs) في المقارنة بين HC وLC، و126 بين MC و LC، و68 لـ HC مقابل MC (ملف تكميلي S1A – C). يوضح مخطط فين أنه لم يكن هناك أي جين (DEG مشترك) مهم في جميع المقارنات الغذائية الثلاثة (الشكل 2A). في أبقار PP، كان هناك 460 درجة مئوية في مقارنة HC مقابل LC، و178 بين MC مقابل LC، و128 بين HC مقابل MC (الملف التكميلي S2A – C). كان هناك جين واحد مشترك فقط (DCN، تغيير الطية (FC)=−7.3) مهمًا في جميع المقارنات الغذائية الثلاثة (الشكل 2B). وهذا يشفر الديكورين، وهو بروتين يلعب دورًا في تجميع ألياف الكولاجين. بشكل عام، كان ملحوظًا أنه تم العثور على عدد أكبر من DEGs في المقارنات الغذائية للتعبير الجيني للكريات البيض في PP مقارنةً بأبقار MP على الرغم من أحجام المجموعة الأصغر، مع تنظيم غالبية هذه الجينات في النظام الغذائي HC. علاوة على ذلك، كان هناك القليل من التداخل في الجينات المحددة بين الفئات العمرية المختلفة، كما هو موضح في مخططات فين في الشكل 3. ويشير هذا إلى أن الأنظمة الغذائية كان لها تأثيرات مختلفة على نسخة الكريات البيض في الأبقار PP وMP. في كلا الفئتين العمريتين، تم العثور على أكبر الاختلافات بين الأبقار المقدمة للوجبات الغذائية LC مقابل HC، لذلك ركزنا على هذه المقارنة في التحليلات اللاحقة.

الشكل 1. تظهر مؤامرات البركان ملامح التعبير في كل من أبقار MP وPP التي تتلقى ثلاث وجبات غذائية مختلفة. (أ) أبقار MP HC مقابل LC، (B) أبقار MP HC مقابل MC، (C) أبقار MP MC مقابل LC، (D) PP HC مقابل LC، (E) PP HC مقابل MC و (F) ) PP MC مقابل LC. HC: تركيز عالي (n=6 في أبقار PP و n=14 في أبقار MP)، MC: تركيز متوسط ​​(n=5 في أبقار PP و n=15 في أبقار MP) ) ، و LC: تركيز منخفض (n=6 في أبقار PP و n=14 في أبقار MP). تم تحويل تغييرات الطية إلى سجل2-. تشير النقاط الخضراء إلى الجينات المنتظمة مع p (BH) < 0.05 وتغييرات الطية أقل من أو تساوي .51.5 وتشير النقاط الحمراء إلى الجينات المنتظمة مع p (BH) < {{ 16}}.05 وأضعاف التغييرات أكبر من أو تساوي 1.5. تشير النقاط البرتقالية إلى الجينات ذات p (BH) <0.05 لكن الطية المطلقة تتغير <1.5.

الشكل 2. مخططات فين توضح الجينات المعبر عنها تفاضليًا بواسطة كريات الدم البيضاء المنتشرة بين المجموعات الغذائية الثلاث في (A) الأبقار متعددة الولادات (MP) والأبقار (B) الأولية (PP). HC: تركيز عالي (n=6 في أبقار PP و n=14 في أبقار MP)، MC: تركيز متوسط ​​(n=5 في أبقار PP و n=15 في أبقار MP) ) و LC: تركيز منخفض (n=6 في أبقار PP و n=14 في أبقار MP).

الشكل 3. مخططات فين توضح الجينات المعبر عنها تفاضليًا عن طريق تعميم كريات الدم البيضاء بين الأبقار PP وMP في مقارنات (A) التركيز العالي (HC) مع التركيز المنخفض (LC)؛ (ب) HC مع التركيز المتوسط ​​(MC)، و (C) MC مع LC. HC: n=6 في الأبقار PP و n=14 في الأبقار MP، MC: n=5 في الأبقار PP و n=15 في الأبقار MP و LC: n {{5 }} في الأبقار PP وn=14 في الأبقار MP

2.5. مقارنة ملامح التعبير الجيني للكريات البيض بين الأبقار متعددة الولادات التي تتلقى وجبات غذائية عالية أو منخفضة التركيز

أفضل 20 مجموعة DEG منظمة وقليلة التنظيم مصنفة حسب القيم p (المعدلة BH) في أبقار MP التي تتغذى على HC مقارنة بتلك التي تتغذى على نظام غذائي LC مذكورة في الملف التكميلي S1D، E. من بين DEGs المنتظمة، شارك معظمهم في GO وظائف عملية الجهاز المناعي، والتمثيل الغذائي، والاستجابة للمحفزات، حيث أن العديد من البروتينات المشفرة لها أدوار متعددة. على سبيل المثال، ALAS2 (ترميز 50 - أمينوليفولينات سينسيز 2) له دور في عملية التمثيل الغذائي، والاستجابة للمحفزات، وعملية النمو. يشارك COL1A1 (سلسلة الكولاجين من النوع الأول ألفا 1) وDAB2 في عملية التمثيل الغذائي، والاستجابة للمحفزات، والكائنات متعددة الخلايا، والحركة، والتطور. توضح أفضل 20 جينة خاضعة للتنظيم موضوعًا واضحًا للتغيرات في المناعة مع 14 DEGs مرتبطة. من بينها، يقوم DMTB1 وFGA وFGB وTF بتشفير الببتيدات المضادة للميكروبات، بينما يقوم ALB وTF بتشفير بروتينات الطور الحاد السلبي (APP)، ويقوم FGA وFGG بتشفير التطبيقات الإيجابية. تلعب ثمانية جينات أدوارًا في عملية التمثيل الغذائي وتشارك 10 في الاستجابة للمحفزات.

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

تم بعد ذلك إخضاع DEGs الكريات البيض المستمدة من مقارنة HC مع مجموعة LC لتحليل تخصيب GO. تم إثراء 76 DEGs المنتظمة بشكل كبير بـ 208 وظيفة، منها أفضل 20 وظيفة بناءً على درجات التخصيب موضحة في الشكل 4A. وارتبطت هذه بجوانب مختلفة من الوظيفة الخلوية، مع ارتباط عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية في الأعلى. ارتبطت العديد من الوظائف باستقلاب البروتين والأحماض الأمينية (بما في ذلك APLP1، وCOL1A1، وCOL1A2، وCOL3A1، وHTR1B، وP2RY12 في معظمها)، والتمعدن الحيوي ومعالجة الكولاجين (بما في ذلك COL1A1، وCOL1A2، وSPP1، وTUFT1)، والتواصل الخلوي. في المقابل، كان للوظائف العليا لـ 97 DEGs الخاضعة للتنظيم موضوع واضح لعمليات الدفاع المناعي المختلفة (الشكل 4B) والتي كانت مرتبطة في الغالب بـ 20 DEGs. من بينها، تم تقليل تنظيم FGA (تطبيق إيجابي) بمقدار 85- أضعاف في مقارنة HC مقابل LC. لخصت أداة متصفح GO الوظائف البيولوجية لكل من DEGs الخاضعة للتنظيم لأعلى ولأسفل في ثماني فئات مهمة (الجدول 4). باستثناء التمعدن الحيوي، كانت جميع الوظائف البيولوجية الأخرى، وخاصة تلك المرتبطة بالدفاع المناعي، مرتبطة في الغالب مع DEGs المنتظمة.

الشكل 4. أهم 20 وظيفة GO مرتبطة بـ DEGs المستمدة من مقارنات HC مقابل LC. (A) MP DEGs منظم، (B) MP DEGs منظم، (C) PP منظم DEG و (D) PP منظم DEGs.

الجدول 4. ملخص الوظائف الرئيسية لتخصيب GO لخلايا الكريات البيض DEGs في المقارنة بين الأبقار متعددة الولادات التي تتلقى نظامًا غذائيًا عالي التركيز (n=14) ومنخفض (n=14) في الرضاعة المبكرة.

الجدول 4. تابع.

تم إثراء DEGs لأعلى وأسفل التنظيم (n=173) بشكل كبير بـ 23 مسارًا لـ KEGG والتي كانت مرتبطة بشكل أساسي بعمليات المناعة والتمثيل الغذائي المختلفة (الجدول 5). كانت شلالات التكميل والتخثر في الأعلى مع ثمانية DEGs منظمة (CFB و FGA و FGB و FGG و KNG1 و PROC و SERPINA1 و VTN). ارتبط المسار الالتهابي للإشارات الشبيهة بـ NOD بستة DEGs (IFNB1 وMAPK10 وOAS1X وOAS1Y وOAS1Z وOAS2)، والتي تم تنظيمها جميعها باستثناء MAPK10. يحتوي مسار هضم البروتين وامتصاصه على ستة DEGs، ثلاثة منها (COL1A1، COL1A2، وCOL3A1) تم تنظيمها وثلاثة تم تنظيمها (CELA2A، COL5A3، وELN). شاركت خمسة DEGs منظمة في مسار إشارات مستقبلات البيروكسيسوم المنشط (PPARs) (APOA2 و APOC3 و FABP1 و HMGCS2 و PCK1). تشارك مسارات التفاعل بين المصفوفة والمستقبلات خارج الخلية، والالتصاق البؤري، وإشارات الشحميات السفينجولية في الحفاظ على بنية الخلية والأنسجة.

الجدول 5. المسارات الهامة التي تم تحديدها من خلال إثراء مسار KEGG المرتبط بجينات الكريات البيض المعبر عنها تفاضليًا في الأبقار متعددة الولادات قدمت نظامًا غذائيًا عالي التركيز (ن=14) مقارنة مع تلك التي قدمت نظامًا غذائيًا منخفض التركيز (ن=14).

2.6. مقارنة أنماط التعبير الجيني للكريات البيض بين الأبقار البدائية التي تتلقى وجبات عالية أو منخفضة التركيز

تم إدراج أفضل 20 DEGs من كريات الدم البيضاء المنتشرة في أبقار PP التي تتغذى على HC مقارنةً بالأنظمة الغذائية LC في الملف التكميلي S2D و E. وسيطرت عمليات المناعة والتمثيل الغذائي على الوظائف البيولوجية لأعلى DEGs المنتظمة ، والتي تحتوي على 11 و 12 DEGs على التوالي. ومن بين هؤلاء، تشارك ACSL6 وMMP9 وSLC11A1 في تكاثر كريات الدم البيضاء، وACSL6 وADGRG3 وCOL1A2 وDUSP1 وHCK وMMP9 وPADI4 في عملية النمو. SLC40A1 هو ناقل حديد رئيسي يلعب دورًا رئيسيًا في موازنة مستويات الحديد الخلوية والجهازية. تقوم بعض هذه DEGs بتشفير البروتينات بوظائف متعددة. على سبيل المثال، ترتبط MMP9 وDUSP1 وSLC11A1 وCOL1A2 بمعظم وظائف GO المذكورة أعلاه. كانت الوظائف البيولوجية للـ DEGs ذات التنظيم الأعلى أكثر تنوعًا. كان هناك ثمانية DEGs تشارك في عملية الجهاز المناعي، وخمسة أدوار تلعب في عملية التمثيل الغذائي، واثنان مرتبطان بكل من تكاثر الكريات البيض وعملية النمو (EPCAM وFCRL3). مرة أخرى، تقوم بعض DEGs، على سبيل المثال CD96 وFCRL3، بتشفير البروتينات بأدوار متعددة.

في أبقار PP، ارتبطت 382 DEGs المنتظمة المستمدة من مقارنة HC مقابل LC بشكل كبير مع 690 وظيفة GO، مع عرض أفضل 20 وظيفة في الشكل 4C. كل هذه تنطوي على 116 درجة (ملف إضافي S2F) مع أنشطة مناعية مختلفة. وكانت الوظيفة العليا هي مسار إشارات مستقبل سطح الخلية. وارتبط هذا بـ 43 DEGs والتي تضمنت الجينات التي تشفر العديد من مستقبلات الروابط المناعية، مثل CXCR1، وCXCR2، وIL17RD، وIL1RAP. كان لهذه الوظيفة ست وظائف فرعية مهمة بما في ذلك مسار الإشارات بوساطة عديد السكاريد الدهني (LPS) (PTAFR وTLR4 وSCARB1) ومسار إشارات مستقبل سطح الخلية المنظم للاستجابة المناعية. كانت الوظيفة الفرعية العليا ضمن تنظيم العملية العضوية متعددة الخلايا هي تنظيم إنتاج السيتوكينات، مع 24 DEGs منتظمة، مثل MARK13، وLTF، وTLR4. كان هناك عدد أقل من DEGs الخاضعة للتنظيم (78 فقط) والتي ارتبطت بـ 298 وظيفة GO مهمة، مع درجات إثراء أقل وعمليات بيولوجية أكثر تنوعًا. ويبين الشكل 4D أهم 20 وظيفة. ارتبط عدد منها بجوانب المناعة، مثل التصاق الخلايا، وتنظيم إنتاج وسيط الاستجابة المناعية، والاستجابة لـ LPS، والاستجابة للجزيئات ذات الأصل البكتيري. وكان البعض الآخر مرتبطًا بالحفاظ على التوازن، مثل سطح الخلية، والتحلل الخلوي، ونقل الغشاء، والإندوببتيداز من النوع السيريني. أدى تلخيص الوظائف البيولوجية المهمة المرتبطة بكل من DEGs الأعلى والأسفل إلى توليد سبع فئات (الجدول 6)، مع عملية الجهاز المناعي في الأعلى ومعظم الوظائف الأخرى المرتبطة أيضًا بالدفاع المناعي. على سبيل المثال، تم إثراء الحركة بواسطة DEGs بخصائص كيميائية ومناعية وتفاعل بين الأنواع بين الكائنات الحية، والذي يتضمن قتل مسببات الأمراض الغازية. ارتبطت كل من العملية الخلوية والتنظيم البيولوجي بأعداد كبيرة من DEGs. تضمنت العملية الخلوية (n=239 DEGs) العديد من الوظائف الفرعية المرتبطة بالتصاق الخلايا وقتل الخلايا وتنشيط الخلايا المناعية وتكاثر الخلايا. يتضمن التنظيم البيولوجي (125 درجة) أيضًا العديد من الأنشطة المناعية، مثل تنظيم عملية الجهاز المناعي، والحركة، والاستجابة للمحفزات. كل هذه الوظائف تحتوي في الغالب على DEGs المنتظمة في النظام الغذائي HC.

الجدول 6. ملخص الوظائف الرئيسية لتخصيب GO لـ DEGs في المقارنة بين الأبقار البدائية التي عرضت النظام الغذائي عالي التركيز (n=6) والمنخفض (n=6) في الرضاعة المبكرة.

الجدول 6. تابع

تم إثراء DEGs لأعلى وأسفل التنظيم (460) في أبقار PP بـ 35 مسارًا مهمًا لـ KEGG (الجدول 7). ارتبط العديد منها بعمليات التمثيل الغذائي التي تشمل الأحماض الأمينية (فالين، ليوسين، آيزوليوسين، أرجينين، والجلوتاثيون)، والبروتينات، والدهون (حمض الأراكيدونيك، والجليسيروليبيد، والكوليسترول)، وفيتامين ب 6، وبعض الهرمونات (الألدوستيرون، والكورتيزول، والغدة الدرقية وهرمون النمو). ). تم إثراء هذه المسارات الأيضية في الغالب باستخدام DEGs المنتظمة في النظام الغذائي HC. على سبيل المثال، ارتبط التخليق الحيوي للأحماض الأمينية بخمسة DEGs منتظمة (ARG2 وASS1 وGPT2 وSDS وSDSL)، وتم إثراء مسار تخليق هرمون النمو وإفرازه وعمله بستة DEGs منتظمة (ADCY6، CREB3L2، CREB5، FOS). و MAPK13 و SOCS3) وواحد من DEGs منظم (BCAR1) واستقلاب حمض الأراكيدونيك يحتوي على خمسة DEGs منتظمة (CYP2J2 وGGT5 وGPX3 وPLB1 وTBXAS1). تم أيضًا إثراء العديد من المسارات المرتبطة بالعملية المناعية/الالتهابية بشكل كبير، ومرة ​​أخرى بشكل رئيسي باستخدام DEGs المنتظمة. وشملت هذه مسارات إشارات chemokine وMAPK وTNF وشلالات مكملة وتخثر. على سبيل المثال، يحتوي مسار إشارات الكيموكين على ثمانية مستويات تنظيمية (ADCY6، وCCL16، وCCR1، وCXCL13، وCXCR1، وCXCR2، وGNG7، وHCK) واثنين من مجموعات DEG المنتظمة (BCAR1 وCCR5)، ويحتوي مسار إشارات TNF على ستة مجموعات DEG منظمة (CREB3L2، CREB5). و FOS و MAPK13 و MMP9 و SOCS3) ، وتحتوي مسارات إشارات MAPK على 12 DEGs منتظمة، بما في ذلك IL1A وMAP3K6 وMAPK13.

الجدول 7. المسارات المهمة التي تم تحديدها من خلال إثراء مسار Kegg المرتبط بجينات الكريات البيض المعبر عنها تفاضليًا في الأبقار الأولية قدمت نظامًا غذائيًا عالي التركيز (ن=6) مقارنة مع تلك التي قدمت نظامًا غذائيًا منخفض التركيز (ن=6).

3. المناقشة

تمتلك أبقار الألبان بعد الولادة آليات توازنية للتحكم في تقسيم المغذيات بين الرضاعة ووظائف الحياة المهمة الأخرى، مثل المناعة والنمو [8]. تعد تعبئة الأنسجة تكيفًا طبيعيًا للثدييات لدعم الرضاعة، لكن بعض الأبقار تصبح غير متوازنة من الناحية الأيضية [35،37]. تعاني مثل هذه الحيوانات من تعبئة الأنسجة الدهنية المفرطة، ومقاومة الأنسولين، والالتهابات الجهازية التي تساهم في ضعف المناعة التي غالبًا ما يتم ملاحظتها في هذا الوقت [38]. ويرتبط هذا مع وسطاء الالتهابات مثل TNF و IL6 [39،40]. في اليوم 14 بعد الولادة، عندما تم جمع عينات الكريات البيض المنتشرة في هذه الدراسة، تعرضت الخلايا لفترة من التحفيز الالتهابي. لقد أثبتنا باستخدام تحليل التسلسل والمعلوماتية الحيوية من الجيل التالي أن الأنظمة الغذائية ذات النسب المختلفة من التركيز أنتجت تأثيرات مختلفة على نسخة كريات الدم البيضاء المنتشرة في أبقار PP وMP في الرضاعة المبكرة. وارتبط هذا بالاختلافات في صحتهم وخصوبتهم. أضافت هذه المعلومات نتائج جديدة إلى تقريرنا السابق حول التأثيرات الغذائية على إنتاج الحليب والمناعة [32].

3.1. مقارنة تأثيرات العلائق عالية ومنخفضة التركيز في الأبقار متعددة الولادات

كان للأبقار MP التي تتبع النظام الغذائي HC مؤشر DMI أعلى من أبقار MC وLC، وكان ذلك مرتبطًا بتركيزات أعلى في الدورة الدموية لكل من الجلوكوز وIGF{{0}}. أدى ذلك إلى أن تكون أبقار HC في حالة NEB أقل خطورة وتنتج المزيد من الحليب. تمت صياغة النظام الغذائي HC لتلبية متطلبات الطاقة والبروتين لكل من الرضاعة والحفاظ على توازن الجسم وأكدت قياسات الأيض أن الحالة الأيضية لديهم كانت بالفعل أفضل من الأبقار LC، مع متطلبات أقل لتعبئة الأنسجة لتلبية متطلبات الطاقة. من المفترض أن يساعد هذا في تسريع حل العمليات الالتهابية بعد الولادة، حيث أن العديد من الأمراض الالتهابية في الرضاعة المبكرة ترتبط أو تسببها اضطرابات التمثيل الغذائي [38] وقد أظهرنا سابقًا أن التهاب الرحم تم حله بسرعة أكبر في الأبقار التي تتمتع بحالة أفضل لتوازن الطاقة. [2]. في هذه الدراسة، لم يكن هناك اختلاف في نسبة PMNs إلى الخلايا الظهارية في تجويف الرحم وفقا للنظام الغذائي في الأبقار MP. غالبا ما يؤخذ هذا المؤشر كمؤشر على التهاب بطانة الرحم الخلوي [41]. ومع ذلك، فقد لوحظت اختلافات وفقًا للنظام الغذائي في الغدة الثديية حيث أن الأبقار LC كانت لديها SCC أعلى، وكان هذا مرتبطًا بنسبة أكبر منها تعاني من التهاب الضرع السريري خلال أول 16 DIM (28.6٪ مقابل 0٪ في LC مقابل مجموعات HC).

معظم DEGs التي تم تحديدها في تحليل نسخة الكريات البيض كانت متورطة في العمليات المناعية و/أو الأيضية، كما هو متوقع في مجتمع الخلايا المناعية. كان مسار KEGG الأكثر أهمية هو سلسلة المكملات والتخثر، والتي تضمنت ستة من الجينات الأكثر تنظيمًا في أبقار HC. ومن بين هذه العناصر، يقوم CFB بتشفير العامل المكمل B، وهو أحد مكونات المسار البديل للتنشيط التكميلي. يقوم FGA وFGB وFGG بتشفير ثلاث وحدات فرعية من عامل التخثر الفيبرينوجين، وهو مكون رئيسي لجلطة الدم وهو مهم أيضًا في ربط البكتيريا بالصفائح الدموية [42]. يعد شكل الوزن الجزيئي العالي للكينينوجين، المشفر بواسطة KNG1، ضروريًا أيضًا لتخثر الدم، ويطلق الكينينوجين البراديكينين، وهو ببتيد له وظائف مختلفة بما في ذلك النشاط المضاد للبكتيريا والفطريات. ويشارك أيضًا Vitronectin، المشفر بواسطة VTN، في تنظيم مسار التخثر وشفاء الجروح، في حين يوفر مجال ربط الهيبارين الخاص به خصائص مضادة للميكروبات. يقوم PROC بتشفير بروتين سكري البلازما الذي يحتوي شكله المنشط على مجال بروتياز سيرين الذي يعمل في تحلل الأشكال النشطة لعوامل التخثر V وVIII، بينما يقوم SERPINA1 بتشفير مثبط بروتياز سيرين الذي تشمل أهدافه البلازمين والثرومبين ومنشط البلازمينوجين. سبق أن تم عرض تنظيم سلسلة المتممات والتخثر في أنسجة الثدي كاستجابة مضيفة مبكرة لـ E. coli أو Staph. عدوى المكورات العنقودية [43]. وبما أن هذا المسار تم التعبير عنه بشكل أكبر في الأبقار التي اتبعت النظام الغذائي LC، فإن هذا يدعم الدليل على زيادة حدوث التهاب الضرع في هذه الحيوانات.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

كانت الوظيفة الرئيسية الأخرى التي لخصها متصفح GO هي عملية قتل مسببات الأمراض (التفاعل بين الأنواع بين الكائنات الحية)، والتي ارتبطت بـ 14 DEGs منظمة في أبقار HC (الجدول 4). وشمل ذلك عددًا من الجينات المشاركة في النشاط المضاد للفيروسات (IFI6، وIFNB1، وISG15، وMX2، وOAS1Y، وOAS1Z، وOAS2، وRSAD2) والتي تم التعبير عنها بمستويات أقل. ومن بين هذه الجينات، يقوم IFNB1 بتشفير إنترفيرون بيتا 1، في حين أن الجينات الأخرى كلها عبارة عن جينات محفزة للإنترفيرون [44،45]. كما أنها جميعها جزء من مسار إشارات المستقبل الشبيه بـ NOD (NLR). NLRs هي مستقبلات للتعرف على الأنماط العصارية الخلوية التي يتم تنشيطها بواسطة مكونات غير ذاتية مختلفة بما في ذلك الببتيدوغليكان البكتيري، ومن المحتمل أن تبدأ التعبير المعتمد على NF-kappa B-/AP-1- للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات، والتعبير عن الإنترفيرونات من النوع الأول، والبلعمة الذاتية و الالتهاب [46]. أظهرت دراستنا الحديثة أن هذا المسار قد تم تنظيمه في كريات الدم البيضاء من الأبقار المصابة بالإشريكية القولونية [47]. الجين الآخر الذي تم تحديده هو MPO، الذي يشفر إنزيم الميلوبيروكسيديز، وهو إنزيم مخزن في حبيبات محبة للأزرق من PMNs والبلاعم. يتم إطلاقه في السائل خارج الخلية أثناء العمليات الالتهابية وقد تم استخدامه كعلامة للالتهاب والإجهاد التأكسدي [48]. يشفر IL1R2 عضوًا في عائلة مستقبلات interleukin 1 وكان أحد أكثر DEG الخاضعة للتنظيم والتي تم تحديدها في أبقار MP. يمكن أن يرتبط هذا بمستقبلات IL1A وIL1B وinterleukin 1، من النوع الأول (IL1R1/IL1RA) ولكنه يعمل كمستقبل خادع لمنع نشاط الربيطة.

كان الجين ذو التعبير التفاضلي الأكثر أهمية بين الأبقار MP في الأنظمة الغذائية المختلفة هو FCER1A، مع تعبير أقل في أبقار HC. يقوم هذا بتشفير وحدة فرعية من مستقبل IgE، وهو البادئ للاستجابات التحسسية التي ربما تطورت لتعزيز دفاع المضيف ضد الطفيليات من خلال إطلاق وسطاء مثل الهستامين [49]. ومن المثير للاهتمام أن FCER1A كان واحدًا من 18 جينًا فقط تم تحديد مستوى تعبيرها على أنه يميز بين خصوبة أبقار البقر [50]. لا يزال دورها الدقيق في الماشية غير محدد، ولكن في تجربة لقاح على العجول المصابة تجريبيًا بالديدان الخيطية الطفيلية ذات الأهمية الاقتصادية Ostertagia ostertagi، ارتبطت مستويات تعبيرها في الدم بشكل إيجابي مع عدد الخلايا البدينة وسلبًا مع عدد الديدان [51]. ثلاثة جينات أخرى منتظمة في أبقار HC مع بعض الوظائف المناعية هي ALAS2 وGZMB وLIF. يقوم ALAS2 بتشفير 50 - أمينوليفولينات سينسيز 2، وهو إنزيم خاص بالكريات الحمر يقع في الميتوكوندريا والذي يحفز الخطوة الأولى والمحددة للمعدل في مسار التخليق الحيوي للهيم. يعد الهيم عاملاً مساعدًا أساسيًا في مجموعة متنوعة من العمليات الرئيسية بما في ذلك نقل الأكسجين، في حين تم ربط الطفرات في هذا الجين بمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية بما في ذلك فقر الدم [52]. يقوم GZMB بتشفير البروتين الأولي الذي تفرزه الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا ويتم معالجته لتوليد بروتياز نشط يحفز موت الخلايا المبرمج للخلايا المستهدفة ويعالج أيضًا السيتوكينات ويتحلل بروتينات المصفوفة خارج الخلية [53]. تم تحديد عامل تثبيط سرطان الدم السيتوكيني، المشفر بواسطة LIF، في البداية من خلال المشاركة في تمايز البلاعم ولكن ثبت أيضًا أنه يلعب دورًا مهمًا في تطور الجنين وإنشاء الحمل في مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الماشية [54].

تم أيضًا إثراء DEGs المستمدة من مقارنة HC مقابل LC في الأبقار MP بالعديد من المسارات المهمة المرتبطة باستقلاب الجلوكوز والبروتين والأحماض الدهنية. وشملت هذه أربعة DEGs منظمة المشاركة في مسارات إشارات PPAR (APOA2، APOC3، FABP1، وPCK1). في هذه الدراسة، تم اكتشاف ثلاثة أشكال إسوية رئيسية لـ PPAR (A، D، G) في مجموعة الكريات البيض. على الرغم من أن التعبير عن PPARs نفسه لم يتأثر بالنظام الغذائي، إلا أن هذا المسار يمكن أن يؤثر على التعبير عن الجينات المشاركة في استقلاب الجلوكوز والدهون، وتمايز الخلايا الشحمية، والاستجابات الالتهابية [55،56] ويساهم في التكيف الأيضي مع إمدادات غذائية محدودة عن طريق تحفيز الجينات المشاركة في الأكسدة [57]. تم أيضًا تنظيم مسار استقلاب الريتينول في أبقار HC، مع انخفاض التعبير عن RBP4 وTTR (ترميز البروتين المرتبط بالريتينول والترانسثيريتين، على التوالي)، وكلاهما يعمل كناقلين للريتينول في الدم. يؤثر تفاعل الريتينول مع مسار إشارات PPAR على نسخ العديد من الجينات الأخرى في اتجاه المصب [58]. يعد APOA2 وAPOC3 مع APOH أيضًا جزءًا من المسار الأيضي للكوليسترول. يعد الكوليسترول مكونًا رئيسيًا في غشاء البلازما ويؤثر على تنظيمه ووظيفته [59،60]. أكدت الدراسات الحديثة على الدور الناشئ للكوليسترول كمعدِّل مهم للنشاط المناعي الفطري والتكيفي [61].

ارتبط مسار تحلل السكر / تكوين الجلوكوز بثلاثة DEGs منظمة في الأبقار التي تتغذى على HC (ADH1C و ALDOB و PCK1). من بين هذه العناصر، يقوم PCK1 بتشفير إنزيم فسفوينول بيروفيت كربوكسي كيناز 1 الذي يعمل كنقطة تحكم رئيسية لتنظيم تكوين السكر في الدم. يحفز هذا الإنزيم، مع GTP، تكوين فوسفونول بيروفات من أوكسالوسيتات، مع إطلاق ثاني أكسيد الكربون والناتج المحلي الإجمالي. يؤدي تنشيط المسارات المناعية/الالتهابية إلى تعزيز نسخ الجينات المولدة للجلوكون عبر مستقبل يشبه الرقم 4 (TLR4) [62]. يمكن أن يتسبب هذا في قيام الخلايا المناعية بتحويل استقلاب الجلوكوز من الفسفرة التأكسدية إلى تحلل السكر لإنتاج الطاقة والمواد المغذية اللازمة للتكاثر وإنتاج الجزيئات المناعية [12،63]. وهذا يؤدي إلى زيادة الطلب على الجلوكوز الذي يتنافس مع متطلبات إنتاج اللاكتات [64].

باختصار، فإن اختلافات التعبير الجيني بين الأبقار MP في النظام الغذائي HC وLC توفر دليلًا على زيادة النشاط المناعي المنتظم والالتهاب في الأبقار LC. وكان هذا مصحوبًا بارتفاع معدل الإصابة بالتهاب الضرع. في المقابل، تم تنظيم الجينات التي تشفر بعض البروتينات التي من المحتمل أن تفيد الصحة والخصوبة مثل ALAS2 وLIF في أبقار HC. وهذا يدعم المؤشرات الأيضية التي تم قياسها والتي توضح أن هناك حالة محسنة لـ EBAL في أبقار MP التي تتبع نظامًا غذائيًا HC، والذي ربما ساعد في حمايتهم من تطور الأمراض المعدية أو الأيضية.

3.2. مقارنة تأثيرات العلائق عالية ومنخفضة التركيز في الأبقار البدائية

على نحو مشابه للأبقار MP، فإن أبقار PP التي تتبع النظام الغذائي HC كان لديها أيضًا مؤشر DMI أعلى بحوالي 4 كجم / يوم، لكن إنتاج الحليب لم يرتفع بشكل ملحوظ. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في تركيزات الجلوكوز أو NEFA أو BHB أو IGF -1 المنتشرة، مع ارتفاع اليوريا فقط في النظام الغذائي LC. في المقابل، كانت هناك اختلافات أكثر أهمية في التعبير الجيني للكريات البيض بين المجموعات الغذائية مقارنة بالأبقار MP، حيث تم تحديد 460 مقابل 173 درجة مئوية في مقارنات HC مقابل LC، والتي تم تنظيم 83٪ منها في أبقار PP على النظام الغذائي HC. فقط نسبة صغيرة من DEGs تتداخل بين الفئتين العمريتين (الشكل 3)، مما يشير إلى أن التغييرات في وظيفة الكريات البيض في نظام الرضاعة المبكر كانت أكثر حساسية في الأبقار PP منها في الأبقار MP. لقد توقعنا أن النظام الغذائي HC سيفيد أبقار PP من خلال زيادة مؤشر DMI الخاص بها وتلبية متطلبات البروتين الغذائي المحسوبة غير القابلة للتحلل والقابلة للاستقلاب بشكل كامل. لقد تم بالفعل تحسين EBAL في نظام HC الغذائي، لكن تحليل التعبير الجيني أظهر تنظيمًا أكبر بكثير للجينات المشاركة في الدفاع المناعي. كان لدى الأبقار التي تتغذى على HC أيضًا نسبة أعلى من PMNs: UEC في الرحم بالإضافة إلى SCC أكبر عدديًا والمزيد من حالات التهاب الضرع. وهذا يشير إلى أنهم كانوا في الواقع أكثر عرضة للإصابة بالأمراض، وليس أقل. لقد وجدنا سابقًا أن العدلات التي تم جمعها من أبقار PP في هذه الدراسة في الأسابيع الثلاثة الأولى من الرضاعة كان لها مؤشر بلعمة ومؤشر انفجار مؤكسد أعلى بكثير مقارنة بالأبقار MP، ولكن 2-طريقة تأثير النظام الغذائي والتكافؤ على ولم يتم الإبلاغ عن هذه القياسات [32].

تضمنت عمليات الجهاز المناعي التي تم تحديدها في مقارنة HC مقابل LC تنظيم مستقبلات سطح الخلية ومسارات إشارات التعرف على الأنماط، والتسمم الكيميائي، وإنتاج السيتوكينات، وهجرة الكريات البيض في الأبقار التي تتغذى على HC. ارتبطت DEGs المحددة بمجموعة متنوعة من آليات الدفاع المناعي، بما في ذلك مجموعة متنوعة من الببتيدات المضادة للميكروبات (AMP) (CATHL6، CXCL13، DEFB1، LTF، PGLYRP1، PGLYRP4، SA100A8، SA100A9، S100A1، وSLC11A1). لا يمكن لهذه الكائنات أن تقتل الكائنات الحية الغازية مباشرة فحسب، بل تساعد أيضًا عن طريق تعديل العمليات المناعية والمضادة للميكروبات الأخرى [65-67]. سبق أن تم إثبات تنظيم الببتيدات المضادة للميكروبات في الملامح النسخية للكريات البيض في الأبقار المصابة بالتهاب الضرع السريري [47،68] والتهاب الرحم/التهاب بطانة الرحم [69،70]. ارتبطت وظيفة التصاق الكريات البيض بـ 16 DEGs منتظمة وخمسة DEGs منظمة في الحيوانات التي تتغذى على HC. يعد التصاق الكريات البيض بجدران الشعيرات الدموية خطوة أولى حيوية لتمكينها من الانتقال من الدم والانتقال نحو مواقع تلف الأنسجة والعدوى والالتهابات [71]. تؤثر تفاعلات كل من الخلية والخلية والمصفوفة على النمط الظاهري للكريات البيض، ويمكن أن يؤدي خلل تنظيم مسارات الالتصاق إلى تنشيط كريات الدم البيضاء المستمر مع التهاب لم يتم حله [72]. من بين DEG المنتظم الذي تم تحديده، يشارك كل من ADAM8 وANGPTL3 وCD24 وICAM3 وTHY1 في التسرب [73،74] في حين أن FN1 وNRP1 وTNFAIP6 وVCAN لها أدوار محتملة في تهريب خلايا الكريات البيض وتعمل في الأنسجة الملتهبة [72، 75]. تم أيضًا تنظيم الجينات التي تشفر مستقبلات الكيموكين CXCR1 وCXCR2 في الأبقار التي تتغذى على HC؛ كلاهما مهم في تحفيز الانجذاب الكيميائي للـ PMN نحو مواقع العدوى بالإضافة إلى تنشيط العمليات الكيميائية الحيوية التي تقتل البكتيريا الغازية [76].

من بين الجينات منخفضة التنظيم المرتبطة بالالتصاق في الأبقار التي تتغذى على HC، يقوم BCAR1 بتشفير بروتين متعدد الوظائف يُعرف باسم cas مع المشاركة في حركية الخلية، وموت الخلايا المبرمج، والتحكم في دورة الخلية [77]. سبق أن ارتبطت الأشكال المتعددة في BCAR1 بـ SCC ومقاومة التهاب الضرع [78]. يقوم ADGRG1 (المعروف أيضًا باسم GPR56) بتشفير مستقبل مقترن بالبروتين G الذي يربط الكولاجين 3 وtransglutaminase 2، وكلاهما مكونان لسدى الأنسجة. تبين أن ADGRG1 يلعب دورًا في الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية (NK)، حيث يمنع السمية الخلوية [79]. يتم تنظيم التعبير الخاص به بعد التنشيط الناجم عن السيتوكين، والذي يتوافق مع النتائج الموضحة هنا. يعمل بروتين CD96 أيضًا كمستقبل نقطة تفتيش مثبط على الخلايا القاتلة الطبيعية [80]. وجدت الدراسات السابقة حول التغيرات في نسخة الكريات البيض خلال الفترة الانتقالية أيضًا تغيرات في التعبير الجيني المتعلق بالهجرة عبر البطانية على الرغم من وجود استنتاجات مختلفة، حيث تم الإبلاغ إما عن التنشيط بعد الولادة [81] أو التثبيط [82]، على التوالي. حدد تحليلنا أيضًا عددًا من الاختلافات في مسارات إشارات استقلاب الأحماض الأمينية في أبقار PP على النظام الغذائي HC مقارنةً بتلك الموجودة على النظام الغذائي LC، المرتبطة بالإنزيمات المشفرة بواسطة خمس DEGs منظمة (ARG2، ASS1، GPT2، SDS، وSDSL). . من بين هذه العناصر، يشفر ASS1 سينسيز سكسينات الأرجينين 1، الذي يحفز الخطوة قبل الأخيرة من مسار التخليق الحيوي للأرجينين، بينما يشفر ARG2 الأرجيناز، مما يحفز التحلل المائي للأرجينين إلى الأورنيثين واليوريا. يمكن أيضًا تحويل إل-أرجينين إلى أكسيد النيتريك، وهو جزيء إشارة يلعب دورًا رئيسيًا في التسبب في الالتهاب [83]. ناقلة الأمين الجلوتاميك-بيروفيك 2 (GPT2) هو إنزيم الميتوكوندريا الذي يحفز النقل العكسي بين ألانين و2- أوكسوجلوتارات لتوليد البيروفات والغلوتامات. يتم تنظيم هذا الجين في ظل ظروف الإجهاد الأيضي ويلعب دورًا في تحفيز تكوين الجلوكوز من استقلاب الأحماض الأمينية [84]. يشفر سيرين ديهيدراتيز (SDS) إنزيمًا يحول إل-سيرين إلى البيروفات والأمونيا، في حين من المتوقع أن يشارك ديهيدراتاز سيرين (SDSL) في مسار التخليق الحيوي للإيسولوسين من الثريونين.

ارتبط مسار استقلاب الكوليسترول بأربعة مستويات DEG منتظمة في النظام الغذائي HC (ANGPTL3 وLRP1 وSCARB1 وSORT1). قد يؤدي هذا إلى تراكم الكوليسترول في كريات الدم البيضاء في الأبقار التي تتغذى على HC ويعزز الالتهاب، بما في ذلك زيادة إشارات TLR، وتنشيط الالتهاب، وزيادة إنتاج الخلايا الوحيدة والعدلات في نخاع العظم والطحال [85]. يؤدي مسار استقلاب حمض الأراكيدونيك مع خمسة مستويات DEG منتظمة (كما هو مذكور سابقًا) إلى إنتاج مجموعات من المنتجات المؤيدة والمضادة للالتهابات، مثل البروستاجلاندين والليكوترينات [86]. ارتبط مسار استقلاب الجلسرين بأربعة DEGs منتظمة (DGAT2، DGKG، GK، وGPAT3) والتي تشفر للجينات الشحمية المشاركة في تخليق ثلاثي الجلسرين. تراكمه قد يؤدي إلى تنشيط الكريات البيض والالتهابات [87،88]. كل هذه النتائج تدعم الاستنتاج القائل بأن النظام الغذائي HC ينظم مسارات التمثيل الغذائي للكريات البيض في أبقار PP بطريقة تزيد من استجاباتها المناعية / الالتهابية. ركز العمل السابق على الأبقار بشكل أساسي على فترة الجفاف وأظهر أن الإفراط في التغذية وارتفاع BCS في هذا الوقت يعزز تعبئة الدهون اللاحقة وزيادة الاستجابة الالتهابية خلال فترة ما حول الولادة [34]. في هذه الدراسة، تدعم نسبة PMN الرحمية: UEC والاتجاه نحو ارتفاع SCC الاقتراح القائل بوجود زيادة في هجرة الكريات البيض إلى الرحم والغدة الثديية في أبقار PP التي تتلقى نظام HC الغذائي. في حين أن هذا عنصر أساسي للدفاع المناعي، إلا أن فرط التنشيط قد يساهم في فرط الالتهاب. مطلوب مزيد من الدراسة مع حجم عينة أكبر لتأكيد هذه النتائج.

3.3. التشابه في الاستجابة للنظام الغذائي من قبل الأبقار متعددة الولادات والبكرية

In terms of metabolic changes, both the MP and PP cows had higher circulating concentrations of urea when on the LC diet. Blood urea in both late pregnancy and early lactation may rise following mobilization of amino acids stored in skeletal muscle [89] or when dietary protein supply exceeds energy availability or protein needed [90], so these situations could have applied here. Elevated levels of urea have been associated with reduced fertility, but only at >4.5 مليمول/لتر، أعلى من التركيزات التي تم الوصول إليها في الحيوانات التي تتغذى على LC في الدراسة الحالية [91]. فيما يتعلق ببيانات نسخ الجينات الكريات البيض، فمن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن DEGs المستمدة من مقارنة HC مقابل LC في كلتا الفئتين العمريتين تم إثراؤها بمسار هضم البروتين وامتصاصه، حيث تلعب الجينات التي تشفر الأشكال الإسوية المختلفة للكولاجين أدوارًا مهمة. . من بينها، كان هناك ثلاثة جينات كولاجين منتظمة (COL1A1، COL1A2، وCOL3A1) في كل من الأبقار MP وPP، وجين كولاجين واحد منظم (COL5A3) في أبقار MP. وكانت قيم التعبير في العينات صغيرة، ولكن الاختلافات كانت كبيرة. قد يأتي جزء من هذا الحمض النووي الريبي (RNA) من الخلايا الليفية، وهي مجموعة من الخلايا تشتمل فقط على 0.1–0.5% من الخلايا غير الكريات الحمر في الدم المحيطي [92،93]. الكولاجين هو مُحسِّن مناعي قديم يشارك في العديد من العمليات المناعية/الالتهابية [93،94]. وبالتالي فإن إنتاجه المنتظم في الدورة الدموية عن طريق النظام الغذائي HC قد يؤثر على وظيفة الكريات البيض.

3.4. الآثار المترتبة على الخصوبة

أفادت العديد من الدراسات السابقة أن الحالة الأيضية والمناعية المترابطة وحدوث المرض لدى الأبقار في مرحلة الرضاعة المبكرة لها تأثير كبير على خصوبتها اللاحقة (على سبيل المثال، [38،95]). أظهر عملنا أن الأبقار متعددة الأغراض ذات تركيز IGF -1 المنخفض عند 14 DIM كانت أقل عرضة للحمل على الإطلاق [37]. في الآونة الأخيرة، أبلغنا أن 63% من الأبقار ذات IGF المنخفض-1 في هذا الوقت واجهت أكثر من مشكلة صحية خلال أول 35 DIM مقارنة بـ 26% فقط من الأبقار ذات IGF العالي-1. وشمل ذلك المزيد من الحيوانات المصابة بالتهابات الرحم والتهاب الضرع السريري [10]. فولي وآخرون. [69] ميز بين الأبقار السليمة، التي كانت قادرة على استعادة التوازن في غضون 3 أسابيع بعد الولادة، وغيرها من الأبقار التي شهدت استجابة التهابية أكثر شدة وطويلة والتي استمرت بعد ذلك في تطوير التهاب بطانة الرحم السريري. تم إثبات وجود ارتباط بالدم المحيطي بواسطة Galvão et al. [96] الذي أظهر أن العدلات من الأبقار في حالة EBAL الأسوأ تحتوي على محتوى أقل من الجليكوجين عند سبعة DIM، وقد عانت هذه الحيوانات من أمراض الرحم أكثر، والتي من المحتمل أن ترتبط بانخفاض توافر الوقود المؤكسد للاستجابات المناعية. يرتبط التهاب الضرع السريري في مرحلة الرضاعة المبكرة أيضًا بزيادة معدلات فقدان الأجنة قبل الزرع، مع بعض المؤشرات على أن انخفاض BCS يزيد من خطر الإصابة [97]. تم اقتراح عدد من الآليات المرتبطة بإنتاج السيتوكين والبروستاجلاندين والوسطاء الالتهابيين الآخرين والتي يمكن أن تؤثر على المبيض و/أو تسبب بيئة رحمية غير مواتية [98،99]. دعمت بيانات الخصوبة التي تم الحصول عليها من الأبقار في دراستنا النتائج المتعلقة بحالتها المناعية وصحتها في مرحلة الرضاعة المبكرة. تتطلب أبقار MP التي تتبع النظام الغذائي LC عددًا أكبر من S / C بما يتوافق مع EBAL الأكثر فقرًا بالإضافة إلى الأدلة من تحليل نسخة الكريات البيض من الدفاع المناعي الأكثر نشاطًا في التقدم، كما يدعمه ارتفاع معدل الإصابة بالتهاب الضرع. في المقابل، استغرقت أبقار الـPP التي تتبع النظام الغذائي HC وقتًا أطول بكثير للحمل وكان عدد الحمل أقل مقارنةً بالأبقار التي تتغذى على LC. كان لديهم المزيد من الأدلة على الالتهاب في بداية الحمل على الرغم من أن حساب EBAL المحسوب كان أفضل. في الوقت الحاضر، الآليات الأساسية التي تسبب سوء حالتهم الصحية وخصوبتهم غير مؤكدة على الرغم من أننا وجدنا أيضًا أدلة تعتمد على التعبير الجيني العالمي لزيادة الالتهاب الكبدي والتليف (Cheng، Little، Ferris، Takeda، Ingvartsen، Crowe and Wathes، ملاحظات غير منشورة) .

3.5. القيود المفروضة على دراسة

كان هناك عدد أقل من الأبقار PP لكل مجموعة متاحة، مما أدى إلى تقليل القوة الإحصائية للتحليلات المتعلقة بالأنماط الظاهرية. ولذلك يلزم إجراء مزيد من الدراسة باستخدام حجم عينة أكبر لتأكيد التأثيرات الغذائية على التكاثر والمرض. في هذه الدراسة، قمنا باستخراج كل الحمض النووي الريبي (RNA) من الدم المحيطي بالكامل باستخدام أنابيب Tempus ونظام العزل الخاص بها. وهذا يوفر سهولة التجميع لإجراء دراسة مزرعة واسعة النطاق ولكنه لا يفصل بين أنواع الخلايا، والتي ستشمل الخلايا الليمفاوية التائية والبائية، والخلايا القاتلة الطبيعية، والصفائح الدموية، والخلايا الوحيدة، والخلايا المحببة (العدلات، والحمضات، والقاعدات)، والخلايا الليفية. لذلك تأثرت بيانات التعبير الجيني المقدمة بتأثيرات العلاج المحتملة على النسب النسبية لأنواع معينة من الخلايا بالإضافة إلى التغييرات النصية الفردية. وتستند هذه النتائج أيضًا إلى مستويات نسخ الجينات ولا تتضمن معلومات عن معالجتها بعد الترجمة، والتي ستؤثر أيضًا على كمية البروتين الوظيفي الذي يتم إنتاجه.

4. المواد والأساليب

4.1. الحيوانات والنظام الغذائي

تم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب قانون الحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986 وتم تغطيتها بترخيص مشروع وزارة الداخلية رقم PPL2754 وشهادة التعيين للمؤسسة. تمت الموافقة على العمل أيضًا من قبل لجنة الأخلاقيات والرفاهية التابعة لمعهد الأغذية الزراعية والعلوم البيولوجية (AFBI، بلفاست، أيرلندا الشمالية، المملكة المتحدة). تم تجنيد اثنين وستين بقرة حلوب هولشتاين-فريزيان من قطيع AFBI. من بينها، 18 أبقار PP (الرضاعة 1) و44 MP مع أرقام الرضاعة 2-7 (3.5 ± 1.28) وكانت جميع الأبقار سليمة حسب فحص الطبيب البيطري. كان وزن الولادة 680 ± 62 (متوسط ​​± STD) كجم للأبقار MP و 55 0 ± 39 كجم للأبقار PP. بعد الولادة، تم تخصيص الأبقار PP وMP بشكل منفصل إلى ثلاث مجموعات غذائية، مع تخصيص كل فئة عمرية متوازنة لقدرة النقل المتوقعة للدهون بالإضافة إلى البروتين (كجم)، ووزن الجسم قبل الولادة، وBCS. تمت أيضًا موازنة أبقار MP من حيث التكافؤ وإنتاج الحليب في يوم الرضاعة السابق 305-. تم تقديم الأبقار إما (1) تركيز منخفض (LC، تركيز 30٪ بالإضافة إلى 70٪ سيلاج عشبي، n=6 لـ PP و n=14 لـ MP)؛ (2) تركيز متوسط ​​(MC، تركيز 50% بالإضافة إلى 50% سيلاج عشبي، n=6 لـ PP وn=15 لـ MP) أو (3) تركيز عالي (HC، تركيز 70% بالإضافة إلى 30%) سيلاج العشب، n=6 لـ PP و n=15 لـ MP) في العلائق (النسب المئوية على أساس المادة الجافة). تمت صياغة المركز لكل معاملة لتحقيق تركيز إجمالي مشترك من البروتين الخام في النظام الغذائي (CP) لكل من LC وMC وHC (152، 152، و154 جم / كجم DM على التوالي)، في حين أن إجمالي الطاقة القابلة للاستقلاب في النظام الغذائي المحسوبة (152، 152، و154 جم / كجم DM) ME) كانت المحتويات 12.0 و12.4 و12.8 ميجا جول/كجم DM. تشير التقديرات إلى أن الوجبات الغذائية توفر 1556 و1997 و2420 جم/يوم من بروتين الكرش الفعال القابل للتحلل؛ 559 و733 و888 جم/يوم من البروتين الغذائي غير القابل للتحلل و1346 و1817 و2275 جم/يوم من البروتين القابل للاستقلاب لـ LC وMC وHC، على التوالي. تم التحكم في الوصول إلى حصص العلاج من خلال نظام تغذية Calan Broadbent (American Calan Inc.، Northwood، NH، USA) المرتبط بنظام تحديد إلكتروني، مما سمح بتسجيل مدخول الأبقار الفردية يوميًا. تم تقديم الوجبات الغذائية لكل علاج بنسبة 107٪ من تناول الأيام السابقة لضمان الاستهلاك حسب الرغبة. كما تم تقديم تركيز إضافي قدره 0.5 كجم لجميع الأبقار عند كل حلبة عبر نظام تغذية داخل الصالة للمساعدة في الحفاظ على تدفق فعال للأبقار. كانت الدراسة الحالية جزءًا من مشروع أوسع وتم وصف التفاصيل الكاملة للأنظمة الغذائية المقدمة وإدارة التغذية وتكوين الأعلاف سابقًا [32].

4.2. جمع بيانات النمط الظاهري للبقرة

تم تسجيل أوزان الجسم مرتين أسبوعيا باستخدام موازين الوزن. تم تقدير BCS بحوالي 14 DIM [100]. تم حلب جميع الأبقار مرتين يومياً وتم تسجيل إنتاجها اليومي. تم تحليل عينات الحليب مرتين أسبوعيًا باستخدام تحليل الأشعة تحت الحمراء المتوسطة لتركيزات البروتين والدهون واللاكتوز، وتم حساب الخلايا الجسدية للحليب. تم جمع عينات إضافية من حليب الصباح (2 × 8 مل) مرتين أسبوعيًا وتخزينها عند -18 درجة مئوية لتحليل LDH (EC.1.1.1.27) وNAGase (EC 3.2.1.30) باستخدام فحوصات قياس الفلور [101]. تم حساب إنتاجية الحليب المصححة بالطاقة (ECM؛ كجم/يوم) باتباع الطرق المستخدمة في مجموعتنا [32]. تم تقدير EBAL لكل بقرة باستخدام الطريقة الموصوفة سابقًا [102].

تم تشخيص التهاب الضرع السريري باستخدام طرق قياسية تعتمد على الملاحظات اليومية للتغيرات غير الطبيعية في مظهر الحليب (مثل الرقائق والجلطات) والجودة وإنتاج الحليب والاستجابات الالتهابية الثديية (الاحمرار أو التورم أو الحرارة أو الألم). تم استخدام قراءات الحليب SCC مع التشخيص السريري لتصنيف الأبقار إلى ثلاث مجموعات. تم تعريف الأبقار السليمة على أنها تحتوي على SCC أقل من 100،000 خلية/مل حليب ولا توجد أعراض سريرية. تم تعريف الأبقار المصطادة تحت الإكلينيكي على أنها تحتوي على SCC بين 100،000 و 400،000 خلية / مل حليب ولا توجد أعراض سريرية واضحة. الأبقار التي تم تشخيص إصابتها بالتهاب الضرع السريري كان لديها SCC > 400 000 خلية / مل من الحليب وأظهرت بعض الأعراض السريرية المذكورة أعلاه. تم تلقيح الأبقار عند الشبق المرصود باستخدام ممارسة القطيع العادية وبيانات الخصوبة طوال مدة الرضاعة اللاحقة أو حتى يتم إعدام الحيوان من سجلات القطيع. تضمنت البيانات المبلغ عنها الأيام حتى الخدمة الأولى (DFS)، والأيام حتى الحمل (الأيام المفتوحة)، والخدمات لكل حمل، ونسبة الأبقار التي حملت. بالإضافة إلى ذلك، تم تسجيل بيانات الحمل باستخدام 4-نقطة في ربلة الساق بواسطة درجة (ICB) كـ (1)<100 days, (2) 100–200 days, (3) >200 يوم، أو (4) فشل في الحمل أو أعدم.

4.3. تحليل خلايا الرحم

تم أخذ عينة من فرشاة الخلايا الرحمية (Minitube، Minitüb GmbH، Tiefenbach، ألمانيا) من كل بقرة عند حوالي 14 DIM لتقييم علم خلايا بطانة الرحم، كما هو موضح سابقًا [103]. تم توجيه الفرشاة الخلوية ذات الحماية المزدوجة يدويًا عبر عنق الرحم إلى الرحم، وتم بثق الواقي الداخلي من الواقي الخارجي، وتم تدوير الفرشاة بلطف على جدار بطانة الرحم. ثم تم سحب الفرشاة إلى الواقي الداخلي وإزالتها. تم إعداد شرائح الفحص الخلوي عن طريق دحرجة الفرشاة الخلوية على شريحة مجهرية زجاجية نظيفة وتثبيت العينة باستخدام Fisherbrand ™ CytoPrep ™ Cytology Fixative (Fishers Scientific، Blanchardstown، Ireland). تم إرسال الشرائح الثابتة إلى كلية الطب البيطري بجامعة كاليفورنيا في دبلن، جامعة كوليدج دبلن، أيرلندا لمعالجتها وصبغها بصبغة جيمزا المعدلة. تم إجراء التقييم الخلوي عن طريق حساب PMNs UECs عند التكبير × 400 (Leitz Labourlux-S، Wetzlar، Germany) وتحديد نسبتها، بمتوسط ​​​​عدد 10 مجالات عالية الطاقة لكل شريحة.

4.4. تحليل المستقلبات المتداولة وIGF-1

عند 14 ± 2 (متوسط ​​± STD) يومًا بعد الولادة، تم جمع 10 مل من عينات الدم من الوريد الوداجي لجميع الأبقار في أنابيب Na Heparin للبلازما وأنابيب عادية للمصل. بعد فصل البلازما أو المصل بالطرد المركزي، تم تخزينهما عند -20 درجة مئوية حتى التحليل. تم قياس تركيزات الجلوكوز في البلازما، واليوريا، وBHB، وNEFA، والكوليسترول باستخدام الطرق الموصوفة سابقًا [20،25]. باختصار، تم تحديد تركيز NEFA في المصل باستخدام طريقة ACS-ACOD باستخدام مجموعات NEFA C (Wako، Neuss، ألمانيا). تم قياس كمية الجلوكوز في البلازما بطريقة إنزيمية (ADVIA 1800 Clinical Chemistry System، Siemens Healthcare Diagnostics، Ballerup، الدنمارك). تم تحديد مصل BHB عن طريق قياس الامتصاصية عند 340 نانومتر بسبب إنتاج NADH عند درجة الحموضة القلوية في وجود هيدروجيناز BHB. تم تحليل اليوريا في الدم بواسطة القياس الطيفي. كانت معاملات التباين داخل وبين الاختبارات (CV) في جميع الحالات أقل من ثلاثة وأربعة بالمائة، على التوالي، لكل من عينات التحكم المنخفضة والعالية. تم قياس تركيزات المصل IGF -1 باستخدام المقايسة المناعية الإشعاعية بعد استخلاص الإيثانول الحمضي [104]. كانت السيرة الذاتية داخل الفحص 12.4 و7.5 و9.9% لعينات التحكم المنخفضة والمتوسطة والعالية، على التوالي.

4.5. استخراج الحمض النووي الريبي في الدم

تم جمع عينات الدم لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق بزل الوريد الوداجي من جميع الأبقار عند 14 ± 2 DIM في أنابيب Tempus blood RNA (Thermo-Fisher Scientific، Loughborough، UK). تم رج الأنابيب بقوة لمدة 15-20 ثانية فور جمعها، ثم تم تجميدها وتخزينها عند درجة حرارة −80 ◦C لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA). تم استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) من الدم بالكامل باستخدام مجموعات عزل Tempus Spin RNA (Thermo-Fisher) باتباع إرشادات الشركة المصنعة كما هو موضح سابقًا [20]. تم استخدام Agilent BioAnalyzer 2000 (Agilent Technologies UK Ltd.، Cheadle، UK) مع Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies UK Ltd.، Cheadle، UK) لتقييم كمية الحمض النووي الريبي (RNA) وسلامته. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من صحة الكمية والنقاء باستخدام NanoDrop 1000 (Thermo Fischer). يتم تلخيص بيانات الجودة في الملف التكميلي S3. أظهر هذا أن جميع عينات الحمض النووي الريبي (RNA) تتمتع بسلامة معقولة (رقم RIN> 8.7، 9.3 ± 0.3) ونقاء (260/280 بين 2.01 و2.15، يعني ± STD 2.10 ± 0.03)، لذلك لم تتم إزالة أي حيوانات من التحليل. تم تخزين الحمض النووي الريبي (RNA) عند -80 درجة مئوية لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) اللاحق.

4.6. تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) ورسم الخرائط والقياس الكمي

تم تسلسل الكريات البيض RNA المستخرجة على منصة Illumina NextSeq 500 كما هو موضح سابقًا [68]. باختصار، باستخدام محطة عمل معالجة السوائل epMotion (إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا) تم نسخ 750 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل عكسي إلى مكتبات تسلسل cDNA باستخدام مجموعة Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Ribo-Zero Gold (Illumina، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). ). تم تسلسل مكتبات [كدنا] المجمعة على جهاز تسلسل Illumina NextSeq 500 عند 75 قراءة أحادية بطول النوكليوتيدات للوصول إلى متوسط ​​33.5 مليون قراءة لكل عينة. تم إيداع ملفات FASTQ الأولية في أرشيف النوكليوتيدات الأوروبي (E-MTAB-9347 وE-MTAB-9431). تم إجراء جميع تحليلات التسلسل باستخدام CLC Genomic Workbench v21 (Qiagen، Manchester، UK). تحتوي كل عينة على القراءات من أربعة ممرات، وتم دمجها في ملف fastq واحد. تم تقييم جودة كل من ملفات fastq الأولية والمشذبة بعد Illumina Pipeline 1.8 وتمت إزالة أي قراءات فاشلة. تم بعد ذلك تعيين القراءات إلى مجموعة الجينوم المرجعية Bos taurus (ARS-UCD1.2 مقدمة من RefSeq على https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly، تم الوصول إليها في 1 يناير 2021) وتم قياسها كقراءات لكل جين، يقرأ لكل كيلو قاعدة مليون (RPKM)، والنصوص لكل كيلو قاعدة مليون (TPM). تم تخزينها كملفات تعبير جيني (GE) في CLC Genomics Workbench لاستخدامها في التحليل التالي للتعبير الجيني التفاضلي.

4.7. تحليل التعبير الجيني التفاضلي بين المجموعات الغذائية

قبل تحليل التعبير التفاضلي للتأثير الغذائي، استخدمنا تحليل المكون الرئيسي (PCA) مع قيم RPKM لتحديد القيم المتطرفة، وأظهر هذا أن البقرتين (Blood020009, MP وBlood020103, PP) كانتا من القيم المتطرفة للسكان وبالتالي تم استبعادها من التحليل الإضافي (الملف التكميلي S4A). أظهر تحليل المكون الرئيسي أيضًا أنه كان هناك تداخل محدود فقط في نمط التعبير الجيني العام بين أبقار PP وMP (الملف التكميلي S2B). وهذا يدعم تصميم الدراسة الأصلي لتحليل كل فئة عمرية على حدة. لذلك تم فصل ملفات GE المشتقة من جميع العينات الفردية حسب الفئة العمرية (PP، n=5–6 لكل مجموعة وMP، n=14–15 لكل مجموعة). تم تحديد DEGs بين المجموعات الغذائية في أبقار PP أو MP باستخدام CLC Genomics Workbench V21 عبر إجراء يشبه ANOVA أحادي الاتجاه. تم تعديل معدلات الاكتشاف الكاذب (FDR) لاختبارات متعددة باستخدام Benjamini-Hochberg (BH) وتم اعتبار الأهمية عند p <0.05. تم حساب تغييرات الطية (FCs) كنسبة التعبير الجيني لمجموعة التركيز الأعلى إلى مجموعة التركيز الأدنى (على سبيل المثال، HC مقابل LC، MC مقابل LC، أو HC مقابل MC) إذا كانت قيمة مجموعة التركيز الأعلى كان أكبر من مجموعة التركيز الأدنى (تغيير الطية الإيجابي، والتنظيم). إذا كانت قيمة مجموعة التركيز الأدنى أكبر من قيمة مجموعة التركيز الأعلى، تم استخدام نسبة مجموعة التركيز الأدنى إلى مجموعة التركيز الأعلى (على سبيل المثال، LC مقابل HC، MC مقابل HC، وLC مقابل MC) ) (تغيير الطية السلبي، تقليل التنظيم). تم اختيار DEGs المنتظمة والمخفضة مع تغيير الطية المطلق أكبر من أو يساوي 1.5 بين المجموعات الغذائية لمزيد من التحليل.

4.8. تحليل إثراء الجينات (GO).

تم إدخال DEGs المستمدة من مقارنات الزوج بين المجموعات الغذائية في Partek Genomics Suite V7.1 (Partek Incorporation، Chesterfield، MO، USA) لتحليل تخصيب GO للتحقيق في الوظائف البيولوجية والتفاعلات بين DEGs وموسوعة كيوتو المرتبطة بها. مسارات الجينات والجينوم (KEGG) مع جينوم Bos taurus ARS-UCD1.2. تم استخدام اختبار فيشر الدقيق مع تعديل BH وتم أخذ الأهمية الإحصائية في الاعتبار عند p <0.05.

4.9. التحليل الإحصائي لبيانات النمط الظاهري

تم تقسيم البيانات المستمدة من جميع الأبقار أولاً حسب الفئة العمرية (أبقار PP وMP)، وفقًا لتصميم الدراسة. قيم DMI، وBW، ومعلمات الحليب، وEBAL، وBCS، والأيضات المنتشرة (الجلوكوز، واليوريا، وBHB، وNEFAs، والكوليسترول، وIGF{{0}})، وSCC (المتحولة لوغاريتميًا)، وعدد خلايا الرحم وتم تلخيص نسبها على أنها خطأ قياسي ± للوسط (SE). تم استخدام التحليل الإحصائي لمقارنة الاختلافات بين المجموعات الغذائية باستخدام تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه المدمج في حزمة برامج SPSS V28 (شيكاغو، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية). تم اختبار تجانس التباين لكل متغير باستخدام إحصائيات ليفين قبل ANOVA. أظهرت النتائج أن التجانس بين مجموعات ECM وEBAL والجلوكوز واليوريا وBHB وIGF-1 في أبقار PP لم يتحقق، لذلك تم تطبيق التحويل اللوغاريتمي لهذه المتغيرات. عندما أظهرت ANOVA أهمية، تم إجراء مقارنات متعددة مع طريقة Fisher's LSD لتحديد مصدر الاختلافات. نظرًا لأنه لا يمكن تحقيق تجانس التباين في بيانات SCC للحليب وعلم الخلايا الرحمية بعد التحول اللوغاريتمي، فقد تم اختبار هذه المتغيرات باستخدام Kruskal-Wallis ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات Dunn المتعددة. تم اختبار بيانات الخصوبة باستخدام طريقة ويلكوكسون. في جميع الحالات، تم اعتبار الأهمية عند p <0.05.

5. الاستنتاجات

تدعم هذه الدراسة العمل السابق في إظهار الروابط الواضحة بين الحالة الأيضية للأبقار في مرحلة الرضاعة المبكرة ووظائفها المناعية. ركزت معظم التحقيقات السابقة التي تهدف إلى تحسين صحة ما بعد الولادة من خلال تغذية أفضل على فترة ما قبل الولادة وأظهرت أن الإفراط في التغذية وارتفاع BCS في هذا الوقت يعزز تعبئة الدهون اللاحقة وزيادة الاستجابة الالتهابية خلال فترة ما حول الولادة [34]. لقد قمنا بدلاً من ذلك بتقييم ما إذا كان من الممكن تغيير وظائف المناعة بعد الولادة عن طريق تغيير النظام الغذائي للرضاعة. لقد وجدنا أن الاستجابة لإدراج التركيز الإضافي، والذي يوفر نظامًا غذائيًا مصممًا لتلبية احتياجات الحيوان من الطاقة والبروتين، قد أنتج تأثيرات مختلفة على نسخة الكريات البيض في أبقار MP وPP. في الأبقار MP، كان النظام الغذائي HC مفيدًا بشكل واضح، حيث أن كريات الدم البيضاء في بقرة LC كانت لديها تنظيم للتكملة وسلسلة التخثر وآليات الدفاع المناعي الفطرية ضد مسببات الأمراض. في المقابل، أظهرت الكريات البيض في أبقار PP التي تتبع النظام الغذائي HC استجابات مناعية/التهابية أكبر وكان لديهم نسبة PMN: UEC أعلى، مما يشير إلى زيادة هجرة الكريات البيض إلى الرحم. وبعد ذلك، كان لدى هذه الأبقار فترة أطول من الولادة حتى الحمل، مما يشير إلى ضعف الخصوبة. هناك ما يبرر إجراء المزيد من العمل مع أعداد أكبر من الأبقار لتأكيد اكتشاف تأثير غذائي على الخصوبة وفهم بشكل أكمل كيف تختلف الاستجابات الأيضية للنظام الغذائي بعد الولادة في الحيوانات الأصغر سنا.

مراجع

1. مالارد، بكالوريوس. ديكرز، جي سي؛ أيرلندا، إم جي؛ ليزلي، ك. شريف، س.؛ فانكامبين، CL؛ واتر، ل.؛ Wilkie، BN تغيير في الاستجابة المناعية خلال فترة ما حول الولادة وتداعياتها على صحة الأبقار والعجول. J. علوم الألبان. 1998، 81، 585-595. [CrossRef] [مجلات]

2. واثيس، العاصمة؛ تشنغ، Z .؛ شودري، دبليو؛ فينويك، MA؛ فيتزباتريك، ر.؛ موريس، د.ج. باتون، J.؛ ميرفي، جي جي توازن الطاقة السلبي يغير التعبير الجيني العالمي والاستجابات المناعية في رحم أبقار الألبان بعد الولادة. فيزيول. الجينوم. 2009، 39، 1-13. [المرجع المتقاطع]

3. إنجفارتسن، كوالالمبور؛ Moyes، K. التغذية ووظيفة المناعة وصحة أبقار الألبان. الحيوان 2013، 7 (ملحق 1)، 112-122. [CrossRef] [مجلات]

4. كيرلي، أنا، الابن؛ نوننيك، بج. Roth، JA التعديلات في وظيفة العدلات البقرية خلال الفترة المحيطة بالولادة. أكون. جي بيطري. الدقة. 1989، 50، 207-214. [مجلات]

5. ستير، سي؛ لويزيل، MC؛ Lacasse، P. تأثير تركيز الأحماض الدهنية غير المُسترة في مصل ما بعد الولادة على وظائف الخلايا المناعية البقرية. J. علوم الألبان. 2012، 95، 708-717. [CrossRef] [مجلات]

6. لاسيتيرا، ن.؛ سكاليا، د.؛ بيرنابوتشي، يو. رونشي، ب. بيرازي، د.؛ Nardone، A. وظيفة الخلايا الليمفاوية في الأبقار شديدة التكييف حول الولادة. J. علوم الألبان. 2005، 88، 2010-2016. [CrossRef] [مجلات]

7. نوننيك، بج. كيمورا، ك؛ جوف، جي بي؛ Kehrli، ME، Jr. تأثيرات الغدة الثديية على القدرات الوظيفية لمجموعات كريات الدم البيضاء أحادية النواة من الأبقار المحيطة بالولادة. J. علوم الألبان. 2003، 86، 2359-2368. [المرجع المتقاطع]

8. هابل، ج.؛ Sundrum، A. عدم تطابق تخصيص الجلوكوز بين وظائف الحياة المختلفة في الفترة الانتقالية لأبقار الألبان. الحيوانات 2020، 10، 1028. [المرجع المتقاطع]

9. هورست، EA. كفيديرا، كورونا؛ Baumgard، LH المراجعة المدعوة: تأثير التنشيط المناعي على صحة البقرة الانتقالية وأدائها - تقييم نقدي للعقائد التقليدية. J. علوم الألبان. 2021، 104، 8380-8410. [المرجع المتقاطع]

10. واثيس، العاصمة؛ بيكر، ف. بوجيوتي، L.؛ كرو، MA؛ فيريس، سي. فولداجر، L.؛ غريليت، C.؛ هوستينز، م. إنجفارتسن، كوالالمبور؛ ماركيتيلي، C .؛ وآخرون. الارتباطات بين تركيزات IGF -1 المنتشرة وحالة المرض ونسخة الكريات البيض في أبقار الألبان في وقت مبكر من الرضاعة. المجترات 2021، 1، 147-177. [المرجع المتقاطع]

11. ديميلوي، إس. برجرنر، إيه في؛ غراهلرت، J.؛ Hess، C. استقلاب الخلايا التائية الذي يحكم التنشيط والانتشار والتمايز ؛ عرض وحدات. علم المناعة 2017، 150، 35-44. [CrossRef] [مجلات]

12. لوفتوس، آر إم؛ Finlay، DK Immunometabolism: التمثيل الغذائي الخلوي يحول منظم المناعة. جي بيول. الكيمياء. 2016, 291, 1–10. [CrossRef] [مجلات]

13. بومان، DE. Currie، WB تقسيم العناصر الغذائية أثناء الحمل والرضاعة: مراجعة للآليات التي تنطوي على التوازن والتوازن. J. علوم الألبان. 1980، 63، 1514-1529. [CrossRef] [مجلات]

14. دراكلي، جائزة مؤسسة JK ADSA للباحثين. بيولوجيا أبقار الألبان خلال الفترة الانتقالية: الحدود النهائية؟ J. علوم الألبان. 1999، 82، 2259-2273. [CrossRef] [مجلات]

15. جبور، ح.ن. المبيعات، كيلوجول. كاتالانو، أردي؛ نورمان، JE المسارات الالتهابية في الصحة الإنجابية الأنثوية والأمراض. الاستنساخ 2009، 138، 903-919. [المرجع المتقاطع]

16. باسكوتيني، OB؛ LeBlanc، SJ تعديل الوظيفة المناعية في الرحم البقري في الفترة المحيطة بالولادة. علم التوالد 2020، 150، 193-200. [المرجع المتقاطع]

17. شيلدون، آي إم؛ لويس، ع. ليبلانك، إس. جيلبرت، RO تحديد مرض الرحم بعد الولادة في الماشية. علم التوالد 2006، 65، 1516-1530. [المرجع المتقاطع]

18. كوهلا، ب. مراجعة: السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والتهاب ما تحت المهاد: الآثار المترتبة على عدم كفاية تناول العلف لأبقار الألبان التي تمر بمرحلة انتقالية. الحيوان 2020، 14، س65 – س77. [المرجع المتقاطع]

19. إنجفارتسن، كوالالمبور؛ Moyes، KM العوامل المساهمة في كبت المناعة في بقرة الألبان خلال الفترة المحيطة بالولادة. اليابان. جي بيطري. الدقة. 2015، 63 (ملحق 1)، S15 – S24.

20. واثيس، العاصمة؛ تشنغ، Z .؛ سالافاتي، م.؛ بوجيوتي، L.؛ تاكيدا، ه.؛ تانغ، ل.؛ بيكر، ف. إنجفارتسن، كي؛ فيريس، سي. هوستينز، م. وآخرون. العلاقات بين الملامح الأيضية والتعبير الجيني في الكبد وخلايا الدم البيضاء في أبقار الألبان في مرحلة الرضاعة المبكرة. J. علوم الألبان. 2021، 104، 3596-3616. [المرجع المتقاطع]

21. بينيدو، ب. Melendez، P. اضطرابات الكبد المرتبطة بالاختلالات الأيضية في أبقار الألبان. دكتور بيطري. كلين. ن. صباحا. أنيم الغذاء. تدرب. 2022، 38، 433-446. [CrossRef] [مجلات]

22. فينويك، ماساتشوستس؛ فيتزباتريك، ر.؛ كيني، دا. ديسكين، ملغ. باتون، J.؛ ميرفي، جي جي؛ Wathes, DC العلاقات المتبادلة بين توازن الطاقة السلبي (NEB) وتنظيم IGF في كبد الأبقار المرضعات. محلي. أنيم. الغدد الصماء. 2008، 34، 31-44. [CrossRef] [مجلات]

23. كوباياشي، ي.؛ بويد، سي كيه؛ سرخس، CJ. لامبرسون، WR. كيسلر، دي إتش؛ لوسي، MC انخفاض مستقبلات هرمون النمو (GHR) حمض الريبونوكلييك الرسول في كبد الأبقار المحيطة بالولادة ناجم عن انخفاض محدد في GHR 1A المرتبط بانخفاض عامل النمو الشبيه بالأنسولين I. علم الغدد الصماء 1999، 140، 3947–3954. [المرجع المتقاطع]

24. كفيديرا، كورونا؛ هورست، EA؛ أبو عجمية، م.؛ مايورجا، إي جيه؛ فرنانديز، إم في؛ Baumgard, LH متطلبات الجلوكوز لجهاز المناعة المنشط في أبقار الهولشتاين المرضعة. J. علوم الألبان. 2017، 100، 2360-2374. [CrossRef] [مجلات]

25. تشنغ، Z .؛ ويلي، أ. فيريس، سي. إنجفارتسن، كوالالمبور؛ واثيس، العاصمة؛ Gplus، EC تأثير النظام الغذائي ومستويات الأحماض الدهنية غير المؤسترة على الملامح النسخية العالمية في تعميم خلايا الدم وحيدة النواة المحيطية في أبقار الألبان في وقت مبكر من الرضاعة. J. علوم الألبان. 2021, 104, 10059–10075. [المرجع المتقاطع]

26. واثيس، العاصمة؛ فينويك، م. تشنغ، Z .؛ بورن، ن.؛ لويلين، S .؛ موريس، د.ج. كيني، د.؛ ميرفي، J.؛ Fitzpatrick، R. تأثير توازن الطاقة السلبي على الدورة والخصوبة في بقرة الألبان عالية الإنتاج. علم التوالد 2007، 68 (ملحق 1)، S232 – S241. [المرجع المتقاطع]

27. سانتوس، جي إي؛ بيسينوتو، جمهورية صربسكا؛ ريبيرو، ES الآليات الكامنة وراء انخفاض الخصوبة في أبقار الألبان اللابولية. علم التوالد 2016، 86، 254-262. [المرجع المتقاطع]

28. باسكوتيني، OB؛ ليروي، J.؛ Opsomer، G. سوء التكيف مع الفترة الانتقالية وعواقبها على خصوبة أبقار الألبان. أعد إنتاجه. دوم. أنيم. 2022، 57 (ملحق 4)، 21-32. [المرجع المتقاطع]

29. ليروي، جي إل. فالككس، سد. جوردان، ل.؛ دي بي، J .؛ ديسميت، كوالالمبور؛ فان هوك، V.؛ بريت، JH. مرعي، WF؛ Bols، PE Nutrition والصحة الأيضية للأم فيما يتعلق بجودة البويضات والأجنة: آراء نقدية حول ما تعلمناه من نموذج البقرة الحلوب. أعد إنتاجه. خصبة. ديف. 2015، 27، 693-703. [المرجع المتقاطع]

30. كوفي، النائب. هيكي، J.؛ Brotherstone، S. الجوانب الوراثية لنمو أبقار الألبان هولشتاين-فريزيان منذ الولادة وحتى النضج. J. علوم الألبان. 2006، 89، 322-329. [المرجع المتقاطع]

31. واثيس، العاصمة؛ تشنغ، Z .؛ بورن، ن.؛ تايلور، VJ. كوفي، النائب؛ Brotherstone، S. الاختلافات بين أبقار الألبان البدائية ومتعددة الولادات في العلاقات المتبادلة بين السمات الأيضية وإنتاج الحليب وحالة الجسم في الفترة المحيطة بالولادة. محلي. أنيم. الغدد الصماء. 2007، 33، 203-225. [CrossRef] [مجلات]

32. ليتل، ميغاواط. ويلي، أرج؛ أوكونيل، NE؛ الويلزية، ماريلاند؛ غريليت، C.؛ بيل، إم جي؛ جوردون، أ. Ferris، CP التأثيرات المناعية لتغيير مستوى تضمين التركيز في نظام غذائي يعتمد على السيلاج العشبي لأبقار هولشتاين فريزيان في وقت مبكر من الرضاعة. الحيوان 2019، 13، 799-809. [CrossRef] [مجلات]

33. بوجيوتي، إل. تشنغ، Z .؛ سالافاتي، م.؛ واثيس، قرص مضغوط؛ النمط الجيني بالإضافة إلى البيئة، C. توفر مقارنة النسخة النصية في كريات الدم البيضاء المنتشرة في مرحلة الرضاعة المبكرة بين الأبقار البدائية والمتعددة الولادات دليلاً على التغيرات المرتبطة بالعمر. بي إم سي الجينوم. 2021، 22، 693. [CrossRef] [PubMed]

34. كاردوسو, نادي كرة القدم; كالشور، KF. مراجعة ندوة دراكلي، جيه كيه: استراتيجيات التغذية لتحسين الصحة والإنتاج والخصوبة خلال الفترة الانتقالية. J. علوم الألبان. 2020، 103، 5684-5693. [CrossRef] [مجلات]

35. Ingvartsen، KL الأمراض المرتبطة بالتغذية والإدارة في البقرة التي تمر بمرحلة انتقالية. أنيم. تغذية العلوم. تكنول. 2006، 126، 175-213. [المرجع المتقاطع]

36. فيريس، CP. جوردون، ف.ج. باترسون، العاصمة؛ ماين، CS؛ McCoy، MA مقارنة قصيرة المدى لأداء أربعة أنظمة لإنتاج الحليب تعتمد على الأراضي العشبية لأبقار الألبان التي تولد في الخريف. علوم العلف العشب. 2003، 58، 8. [المرجع المتقاطع]

37. تايلور، VJ. تشنغ، Z .؛ بوشباكومارا، PG؛ بيفر، دي. Wathes، DC العلاقات بين تركيزات البلازما لعامل النمو الشبيه بالأنسولين I في أبقار الألبان وخصوبتها وإنتاجية الحليب. دكتور بيطري. تفصيل. 2004، 155، 583-588. [المرجع المتقاطع]

38. LeBlanc، SJ تفاعلات التمثيل الغذائي والالتهابات وصحة الجهاز التناسلي في فترة ما بعد الولادة في أبقار الألبان. أعد إنتاجه. دومك. أنيم. 2012، 47 (ملحق 5)، 18-30. [المرجع المتقاطع]

39. فايلاتي ريبوني، م.؛ كانوال، م.؛ بلغاري، O.؛ ماير، S .؛ كاهن، نيفادا؛ بيرك، سي آر؛ كاي، جك؛ ماكدوغال، S .؛ ميتشل، ماريلاند؛ ووكر، CG. وآخرون. تؤثر درجة حالة الجسم ومستوى التغذية قبل الولادة على منظمات الأنسجة الدهنية لعملية التمثيل الغذائي والالتهابات في رعي أبقار الألبان خلال الفترة الانتقالية. J. علوم الألبان. 2016، 99، 758-770. [المرجع المتقاطع]

40. تريفيسي، إي؛ Minuti، A. تقييم الاستجابة المناعية الفطرية في البقرة المحيطة بالولادة. الدقة. دكتور بيطري. الخيال العلمي. 2018، 116، 47-54. [المرجع المتقاطع]

41. دركر، سا. سيسيك، ر. فان ستراتن، م.؛ جاسان، T.؛ كدمي، م.؛ Raz، T. تشخيص التهاب بطانة الرحم الخلوي في أبقار الألبان البدائية مقابل الأبقار متعددة الولادات. J. علوم الألبان. 2022، 105، 665-683. [CrossRef] [مجلات]

42. حمزة كونياس، ح. لارادي، س.؛ أوسيلير، جي سي؛ كوجنس، F.؛ Garraud، O. لا يغير تقليل مسببات الأمراض Amatosalen-HCl-UVA عملية التمثيل الغذائي بعد التخزين لـ CD40 ligand القابلة للذوبان وOx40 ligand وinterkeukin-27، السيتوكينات التي ترتبط بشكل عام بأحداث سلبية خطيرة. فوكس سانغ. 2015، 108، 205-207. [CrossRef] [مجلات]

43. دي جريف، أ.؛ زادوكس، ر.؛ رولز، ل.؛ توسان، م.؛ نجوين، المعارف التقليدية؛ داونينج، أ. المتمردين، J.؛ ستوكهوف زورفيدن، ن.؛ Smith، H. استجابة المضيف المبكرة في الغدة الثديية بعد تحدي Streptococcus uberis التجريبي في العجول. J. علوم الألبان. 2013، 96، 3723-3736. [CrossRef] [مجلات]

44. تشنغ، Z .؛ شوهان، ل.؛ باري، ال. أبودريمو، أ.؛ أوجوجيوفور، قوات التحالف؛ تشن، العاشر. Wathes، DC عدوى فيروس الإسهال الفيروسي البقري الحاد تمنع التعبير عن الجينات المحفزة للإنترفيرون تاو في بطانة الرحم البقري. بيول. أعد إنتاجه. 2017، 96، 1142-1153. [المرجع المتقاطع]

45. شوجينز، الجينات المحفزة بالإنترفيرون: ماذا تفعل جميعها؟ آنو. القس فيرول. 2019، 6، 567-584. [CrossRef] [مجلات]

46. ​​Ohto، U. آليات التنشيط والتنظيم للمستقبلات المشابهة لـ NOD بناءً على البيولوجيا الهيكلية. أمام. إيمونول. 2022، 13، 953530. [المرجع المتقاطع]

47. تشنغ، Z .؛ بالما فيرا، إس؛ بوجيوتي، L.؛ سالافاتي، م.؛ بيكر، ف. ويرلينج، D.؛ واثيس، العاصمة؛ Gplus، EC التحليل النسخي لكريات الدم البيضاء المنتشرة التي تم الحصول عليها أثناء الشفاء من التهاب الضرع السريري الناجم عن الإشريكية القولونية في أبقار هولشتاين الألبان. الحيوانات 2022، 12، 2146. [المرجع المتقاطع]

48. لوريا، ف؛ داتو، أنا؛ جراتسياني، ف.؛ بياسوتشي، إل إم ميلوبيروكسيديز: علامة حيوية جديدة للالتهاب في أمراض القلب الإقفارية ومتلازمات الشريان التاجي الحادة. الوسائط. التهاب. 2008، 2008، 135625. [المرجع المتقاطع]

49. أوليفيرا، أ. بيفن، MA؛ Metcalfe، DD تشير الخلايا البدينة إلى أهميتها في الصحة والمرض. J. عيادة الحساسية. إيمونول. 2018، 142، 381-393. [المرجع المتقاطع]

50. ديكنسون، SE. غريفين، بكالوريوس؛ إلمور، مف. كريس أندرسون، L.؛ إلمور، جي بي؛ دايس، PW. رودنينج، SP. تميز ملفات Biase، FH Transcriptome في خلايا الدم البيضاء المحيطية في وقت التلقيح الاصطناعي بين عجول البقر ذات إمكانات الخصوبة المختلفة. بي إم سي الجينوم. 2018، 19، 129. [المرجع المتقاطع]

51. فان مولدر، ف.؛ فان كوبرنول، إس؛ بورلو، J .؛ رينالدي، م.؛ لي، آر دبليو؛ تشيرز، ك. فان دن بروك، دبليو؛ فيركرويسي، J.؛ كليريبوت، إي. Geldhof، P. Granule exocytosis of granulysin و granzyme B كآلية رئيسية محتملة في المناعة التي يسببها اللقاح في الماشية ضد الديدان الخيطية Ostertagia ostertagi. تصيب. مناعة. 2013، 81، 1798-1809. [CrossRef] [مجلات]

52. تايلور، JL. براون، BL الأساس الهيكلي لخلل تنظيم سينسيز حمض أمينوليفولينيك في الأمراض البشرية. جي بيول. الكيمياء. 2022، 298، 101643. [CrossRef] [PubMed]

53. تراباني، جا؛ Sutton، VR Granzyme B: وظائف مؤيدة للاستماتة ومضادة للفيروسات ومضادة للأورام. العملة. رأي. إيمونول. 2003، 15، 533-543. [CrossRef] [مجلات]

54. كامبانيل، ج.؛ باروسيلي، ملاحظة؛ ليمون، أ. D'Occhio، MJ العمل المحلي للسيتوكينات والخلايا المناعية في التواصل بين المفهوم والرحم خلال الفترة الحرجة لتطور الجنين المبكر والارتباط والغرس - الآثار المترتبة على بقاء الجنين في الماشية: مراجعة. علم التوالد 2021، 167، 1-12. [CrossRef] [مجلات]

55. بوجارن، ن.؛ وييرز، ب. ديسميت، إس جيه؛ ديكرز، J.؛ راي، DW. ستيلز، ب. De Bosscher، K. Molecular Actions of PPARalpha في استقلاب الدهون والالتهابات. إندوكر. القس 2018، 39، 760-802. [المرجع المتقاطع]

56. سوبوليف، ف. تشيبورينا، إي؛ كورسونسكايا، آي إم؛ جيبي، NA؛ تشيبيشيفا، SN؛ سوبوليفا، AG. Mezentsev، A. دور عامل النسخ PPAR-gamma في التسبب في الصدفية وخلايا الجلد والخلايا المناعية. كثافة العمليات. جيه مول. الخيال العلمي. 2022، 23، 9708. [المرجع المتقاطع]

57. سونغ، س. عطية، ر. كونوتون، S.؛ نيسن، ميشيغن؛ نيس، جي سي؛ عيلام، ميغابايت؛ هوري، آر تي؛ كوك، جورجيا؛ يحفز بارك، EA مستقبلات ألفا المنشط بالبيروكسيسوم (PPARalpha) ومنشط غاما PPAR (PGC-1alpha) كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز IA (CPT-1A) عبر عناصر جينية مستقلة. مول. خلية. الغدد الصماء. 2010، 325، 54-63. [المرجع المتقاطع]

58. زيوزنكوفا، أو. Plutzky، J. Retinoid استقلاب واستجابات المستقبلات النووية: رؤى جديدة في التنظيم المنسق لمجمع PPAR-RXR. فيبس ليت. 2008، 582، 32-38. [المرجع المتقاطع]

59. اسبنشيد، بي جيه؛ هيوز، AL تنظيم تخليق ستيرول في حقيقيات النوى. آنو. القس جينيه. 2007، 41، 401-427. [المرجع المتقاطع]

60. فان مير، ج.؛ فويلكر، د. Feigenson، GW Membrane lipids: أين هم وكيف يتصرفون. نات. القس مول. خلية. بيول. 2008، 9، 112-124. [المرجع المتقاطع]

61. أجيلار باليستر، م.؛ هيريرو سيرفيرا، أ؛ فينو، أ؛ مارتينيز هيرفاس، S .؛ Gonzalez-Navarro، H. تأثير استقلاب الكوليسترول في وظيفة الخلايا المناعية وتصلب الشرايين. المغذيات 2020، 12، 2021. [CrossRef] [PubMed]

62. ماميدوفا، إل كيه؛ يوان، ك. لاوديك، آن؛ فليمينغ، SD. ماشك، د.ج. مطلوب إشارات مستقبلات Bradford، BJ Toll-like 4 لتحريض التعبير الجيني للجلوكوز عن طريق بالميتات في خلايا سرطان الكبد البشرية. جي نوتر. الكيمياء الحيوية. 2013، 24، 1499-1507. [CrossRef] [مجلات]

63. سوتو هيريديرو، ج.؛ جوميز دي لاس هيراس، مم؛ غاباندي رودريغيز، إي؛ أولر، J.؛ ميتلبرون، M. تحلل السكر - لاعب رئيسي في الاستجابة الالتهابية. فيبس ج. 2020، 287، 3350–3369. [CrossRef] [مجلات]

64. كومينسكي، دي جي؛ كامبل، إل. Colgan، SP التحولات الأيضية في المناعة والالتهابات. جي إمونول. 2010، 184، 4062-4068. [المرجع المتقاطع]

65. أفاكان، نيوجيرسي؛ يونغ، ال. بينا، أوم؛ هانكوك، RE الإمكانات العلاجية لببتيدات الدفاع المضيف في الالتهابات المقاومة للمضادات الحيوية. العملة. فارم. ديس. 2012، 18، 807-819. [المرجع المتقاطع]

66. أوفينيت، سي؛ Rosenstein، Y. الببتيدات الدفاعية متعددة الوظائف: الببتيدات المضادة للميكروبات، اللاعبون الصغار والكبار في المناعة الفطرية والتكيفية. فيبس جي. 2009، 276، 6497-6508. [المرجع المتقاطع]

67. هيلتشي، AL. ويرث، ك. هانكوك، RE التعديل المناعي عن طريق الببتيدات الدفاعية الكاتيونية متعددة الأوجه (المضادة للميكروبات). نات. الكيمياء. بيول. 2013، 9، 761-768. [المرجع المتقاطع]

68. تشنغ، Z .؛ بوجيوتي، L.؛ سالافاتي، م.؛ ماركيتيلي، C .؛ بالما فيرا، إس؛ ويلي، أ. تاكيدا، ه.؛ تانغ، ل.؛ كرو، MA؛ واثيس، العاصمة؛ وآخرون. الملامح النسخية العالمية للكريات البيض المنتشرة في أبقار الرضاعة المبكرة المصابة بالتهاب الضرع السريري أو تحت الإكلينيكي. مول. بيول. 2021, 48, 4611–4623. [المرجع المتقاطع]

69. فولي، سي. تشابوانيا، أ؛ كالانان، جي جي؛ ويستون، ر. ميراندا كاسو لوينغو، ر.؛ لو، J.؛ ماير، WG. لين، دي جي؛ أوفاريلي، سي؛ Meade، KG تحليل متكامل للتغيرات المحلية والنظامية التي تسبق تطور التهاب بطانة الرحم الخلوي بعد الولادة. بي إم سي الجينوم. 2015، 16، 811. [المرجع المتقاطع]

70. ماتشادو، VS؛ Silva، TH المناعة التكيفية في الرحم بعد الولادة: الاستخدام المحتمل للقاحات للسيطرة على التهاب الرحم. علم التوالد 2020، 150، 201-209. [المرجع المتقاطع]

71. لي، ك.؛ هوفمان، جلالة. كوبيس، ص. كاساتيلا، MA؛ زيشلينسكي، أ؛ هيدريك، CC؛ كاتز، SD العدلات: رؤى جديدة وأسئلة مفتوحة. الخيال العلمي. إيمونول. 2018, 3, إيات4579. [CrossRef] [مجلات]

72. واهل، إس إم؛ فيلدمان، جنرال موتورز؛ مكارثي، JB تنظيم التصاق الكريات البيض والإشارة في الالتهاب والمرض. جيه ليوكوك. بيول. 1996، 59، 789-796. [CrossRef] [مجلات]

73. شوبرت، ك. بولتي، T.؛ بونيش، يو. شادر، S.؛ هولتابلز، ر.؛ هيلدبراندت، ج.؛ ليمان، J.؛ سيمون، جي سي. أنديريج، يو. Saalbach، A. Thy -1 (CD90) ينظم تسرب كريات الدم البيضاء أثناء الالتهاب. يورو. جي إمونول. 2011، 41، 645-656. [CrossRef] [مجلات]

74. دريمويلر، د.؛ بروسماير، J .؛ شوماخر، J.؛ فيليندورف، س.؛ هيس، FM. سيفرت، أ. بابندراير، أ. بارتش، جي دبليو؛ Ludwig، A. إن metalloproteinase ADAM8 يعزز تجنيد الكريات البيض في المختبر وفي التهاب الرئة الحاد. أكون. جي فيسيول. خلية الرئة. مول. فيزيول. 2017، 313، L602 – L614. [المرجع المتقاطع]

75. كوستيلنيك، KB؛ باركر، أ.؛ شولتز، C.؛ ميتشل، TP؛ راجيف، V.؛ الأبيض، آي جي. أوراند-ليونز، م؛ نورشرق، س. كيتيلاس، P.؛ Nightingale، TD يعد الاتجار الديناميكي ودوران JAM-C ضروريًا لهجرة الخلايا البطانية. بلوس بيول. 2019, 17, ه3000554. [CrossRef] [مجلات]

76. ستيلي، ر.؛ فاروق، سم؛ جوردون، جي آر؛ Stadnyk، AW الأهمية الوظيفية وراء التعبير عن نوعين من مستقبلات IL-8 على PMN. جيه ليوكوك. بيول. 2009، 86، 529-543. [المرجع المتقاطع]

77. بوتون، ه. ريجينز، ر.ب. بروس ستاسكال، PJ وظائف البروتين المحول كاس: تقارب الإشارة وتحديد الاستجابات الخلوية. أونكوجين 2001، 20، 6448-6458. [المرجع المتقاطع]

78. تشن، العاشر. تشنغ، Z .؛ تشانغ، S.؛ ويرلينج، D.؛ Wathes، DC إن الجمع بين دراسات الارتباط على مستوى الجينوم وتحليل بيانات التعبير الجيني التفاضلي يحدد الجينات المرشحة التي تؤثر على التهاب الضرع الناجم عن مسببات أمراض مختلفة في بقرة الألبان. افتح J. أنيم. الخيال العلمي. 2015، 5، 358-393. [المرجع المتقاطع]

79. تشانغ، غيغاواط. هسياو، CC؛ بنغ، يم. فييرا براغا، FA؛ كراجتن، NA؛ ريميرسوال ، إب . فان دي غارد، ماريلاند؛ شتراوسبيرج، ر. كونيج، جنرال موتورز؛ كوستينيس، إي. وآخرون. يعد مستقبل التصاق البروتين G GPR56 / ADGRG1 مستقبلًا مثبطًا في خلايا NK البشرية. خلية. 2016، 15، 1757-1770. [المرجع المتقاطع]

80. بي، J.؛ Tian، Z. NK ضعف الخلايا والعلاج المناعي عند نقاط التفتيش. أمام. إيمونول. 2019، 10، 1999. [المرجع المتقاطع]

81. مينوتي، أ. جالو، أ. لوبرياتو، V.؛ بروشي، س. بيتشيولي كابيلي، ف؛ أوبولدي، O.؛ Trevisi، E. تأثير حجم القمامة على التمثيل الغذائي والأحماض الأمينية قبل الولادة في الأرانب. الحيوان 2020، 14، 2109-2115. [CrossRef] [مجلات]

82. كروكيندين، ماساتشوستس؛ مويز، كم. كون-شيرلوك، ب. لينيرت، ك. ووكر، CG. لور، جي جي؛ ميتشل، ماريلاند؛ موراي، أ. دوكيباتي، VSR؛ فايلاتي ريبوني، م.؛ وآخرون. التحليل النسخي للعدلات المنتشرة في أبقار الألبان التي ترعى حول الرعي المجهدة أيضيًا. J. علوم الألبان. 2019، 102، 7408-7420. [CrossRef] [مجلات]

83. شارما، جي إن؛ العمران، ع.؛ Parvathy، SS دور أكسيد النيتريك في الأمراض الالتهابية. علم الالتهابات الدوائية 2007، 15، 252-259. [CrossRef] [مجلات]

84. مارتينو، م.ر. جوتيريز أغيلار، م.؛ يو، NKH. لوتكويت، AJ؛ المغني، JM. ماكوميس، كانساس؛ فيرغسون، د.؛ ليس، KHH؛ يوشينو، J.؛ رينكيماير، عضو الكنيست؛ وآخرون. إن إسكات ناقلة أمين الألانين 2 في الكبد المصاب بالسكري يخفف من ارتفاع السكر في الدم عن طريق تقليل تكوين السكر في الدم من الأحماض الأمينية. مندوب الخلية. 2022، 39، 110733. [CrossRef] [PubMed]

85. طويل القامة، AR؛ Yvan-Charvet، L. الكوليسترول والالتهاب والمناعة الفطرية. نات. القس إيمونول. 2015، 15، 104-116. [المرجع المتقاطع]

86. واثيس، د.؛ تشنغ، Z .؛ مرعي، دبليو؛ Fouladi-Nasht، A. الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة والخصوبة في إناث الثدييات: تحديث. كابي القس. 2013، 8، 1-14. [المرجع المتقاطع]

87. عليبور، أ.؛ فان أوستروم، AJ؛ عزرائيلجان، أ. فيرسيدن، سي؛ كولينز، JM. فراين ، كن. بلوكر، TW. إلت، جي دبليو. كاسترو كابيزاس، M. تنشيط الكريات البيض عن طريق البروتينات الدهنية الغنية بالدهون الثلاثية. تصلب الشرايين. تخثر. فاسك. بيول. 2008، 28، 792-797. [المرجع المتقاطع]

88. كاستولدي، أ. مونتيرو، إل بي؛ فان تيجلينجن باكر، ن.؛ سانين، دي. رنا، ن.؛ كورادو، م.؛ كاميرون، صباحا؛ هاسلر، ف. ماتسوشيتا، م.؛ كابوتا، ج.؛ وآخرون. يعزز تخليق ثلاثي الجلسرين وظيفة البلاعم الالتهابية. نات. مشترك. 2020، 11، 4107. [المرجع المتقاطع]

89. بيل، AW تنظيم استقلاب المغذيات العضوية أثناء الانتقال من أواخر الحمل إلى الرضاعة المبكرة. ج. أنيم. الخيال العلمي. 1995، 73، 2804-2819. [المرجع المتقاطع]

90. مور، دابسو؛ فارجا، ج. بون، ومون: اختبار نيتروجين اليوريا في أبقار الألبان. خلاصة وافية 1996، 18، 712-720.

91. واثيس، العاصمة؛ بورن، ن.؛ تشنغ، Z .؛ مان، جنرال الكتريك؛ تايلور، VJ. كوفي، MP تحليلات الارتباط المتعددة لملامح التمثيل الغذائي والغدد الصماء مع الخصوبة في الأبقار البدائية ومتعددة الولادات. J. علوم الألبان. 2007، 90، 1310-1325. [CrossRef] [مجلات]

92. آبي، ر.؛ دونيلي، SC؛ بنغ، T.؛ بوكالا، ر.؛ ميتز، CN الخلايا الليفية في الدم المحيطية: مسار التمايز والهجرة إلى مواقع الجرح. جي إمونول. 2001، 166، 7556-7562. [CrossRef] [مجلات]

93. شراير، س.؛ Triampo، W. مجموعة الخلايا النادرة المنتشرة في الدم. ما هو وما هو جيد ل؟ الخلايا 2020، 9، 790. [CrossRef] [PubMed]

94. لين، ألاسكا؛ ياناس، الرابع؛ Bonfield، W. المستضدية والمناعية للكولاجين. جيه بيوميد. ماطر. الدقة. 2004، 71، 343-354. [المرجع المتقاطع]

95. روش، جيه آر؛ بيرك، سي آر؛ كروكيندين، MA؛ هيزر، أ.؛ لور، JL. ماير، S .؛ ميتشل، ماريلاند؛ فين، كفك؛ تيرنر، SA الخصوبة والبقرة الحلوب الانتقالية. أعد إنتاجه. خصبة. ديف. 2017، 30، 85-100. [المرجع المتقاطع]

96. جالفاو، كنساس؛ فلامينيو ، إم جي . بريتين، س.ب. سبير، ر. فراغا، م.؛ كايكسيتا، L.؛ ريتشي، أ. الحرس، CL؛ بتلر، WR. جلبرت، RO العلاقة بين أمراض الرحم ومؤشرات العدلات وحالة الطاقة الجهازية في أبقار الهولشتاين المرضعة. J. علوم الألبان. 2010، 93، 2926-2937. [المرجع المتقاطع]

97. دال، MO؛ مونسيل، فب؛ دي فريس، أ. جالفاو، كن. ريسكو، كاليفورنيا؛ هيرنانديز، JA دليل على أن التهاب الضرع يمكن أن يسبب فقدان الحمل في أبقار الألبان: مراجعة منهجية للدراسات الرصدية. J. علوم الألبان. 2017، 100، 8322-8329. [المرجع المتقاطع]

98. هانسن، بي جي. سوتو، ب. Natzke، RP التهاب الضرع والخصوبة في الماشية - احتمال تورط الالتهاب أو تنشيط المناعة في وفيات الأجنة. أكون. جيه ريبرود. إيمونول. 2004، 51، 294-301. [المرجع المتقاطع]

99. مالينوفسكي، إي. Gajewski، Z. التهاب الضرع واضطرابات الخصوبة في الأبقار. بول. جي بيطري. الخيال العلمي. 2010، 13، 555-560.

100. ادمونسون، AJ. العجاف، IJ. ويفر، LD. فارفر، T.؛ Webster، GA مخطط تسجيل حالة الجسم لأبقار الألبان هولشتاين. J. علوم الألبان. 1989، 72، 11. [المرجع المتقاطع]

101. لارسن، ت.؛ رونتفيد، سم؛ إنجفارتسن، كوالالمبور؛ فيلس، L.؛ Bjerring، M. نشاط الإنزيم وبروتينات الطور الحاد في الحليب يستخدم كمؤشرات لالتهاب الضرع الناجم عن الإشريكية القولونية LPS. الحيوان 2010، 4، 1672-1679. [CrossRef] [مجلات]

102. كروغ، MA؛ هوستينز، م. سالافاتي، م.؛ غريليت، C.؛ سورنسن، مونت؛ واثيس، العاصمة؛ فيريس، كب؛ ماركيتيلي، C .؛ سينيوريلي، ف. نابوليتانو، ف. وآخرون. التباين بين وداخل القطيع في المؤشرات الحيوية للدم والحليب في أبقار الهولشتاين في الرضاعة المبكرة. الحيوان 2020، 14، 1067-1075. [CrossRef] [مجلات]

103. بوجيوتي، إل. تشنغ، Z .؛ واثيس، العاصمة؛ Gplus، EC يكشف تعدين القراءات غير المعينة في بيانات RNA-Seq البقري عن انتشار فيروس الهربس البقري -6 في أبقار الألبان الأوروبية والتغيرات المرتبطة بها في النمط الظاهري ونسخة الكريات البيض. الفيروسات 2020، 12، 1451. [CrossRef] [PubMed]

104. بيلتمان، أنا؛ فورد، ن.؛ فورني، ب. كارتر، ف. روش، JF. لونيرجان، ص. كرو، MA توصيف التعبير الجيني لبطانة الرحم والمعلمات الأيضية في عجول البقر التي تنتج أجنة قابلة للحياة أو غير قابلة للحياة في اليوم السابع بعد التلقيح. أعد إنتاجه. خصبة. ديف. 2010، 22، 987-999. [CrossRef] [مجلات]