التأثير الوقائي لتوبولوسيد ب على موت الخلايا المبرمج الناجم عن عامل نخر الورم في الخلايا العصبية

نبذة مختصرة

الهدف: للتحقيق في التأثير الوقائي للأعصاب لـ tubuloside B ، أحد مركبات الفينيثانويد المعزولة من سيقانCistanche الصلصا، على موت الخلايا المبرمج الناتج عن عامل نخر الورم (TNF) في الخلايا العصبية SH-SY5Y.الطريقة: تم تحليل صلاحية الخلية باستخدام مقايسة MTT. تم الكشف عن الخلايا المبرمج باستخدام Hoechst33342staining ، وتم تأكيدها عن طريق تجزئة الحمض النووي وتحليل التدفق الخلوي. تم قياس نشاط كاسباس -3 بمجموعة فحص خاصة. تم تحديد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحر باستخدام probeIndo -1 بواسطة مقياس الطيف. تم تحديد مستوى أنواع الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا وإمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر (LSCM) جنبًا إلى جنب مع مسبار التألق H2DCFDA أو JC -1 على التوالي. النتائج: أظهرت خلايا SH-SY5Y المعالجة بـ TNF 100 ميكروغرام / لتر لمدة 36 ساعة تغيرات شكلية نموذجية لموت الخلايا المبرمج. يمكن ملاحظة سلم DNA بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. تراكمت أعلى نسبة من الخلايا المبرمجة إلى 37.5 في المائة. بعد 36 ساعة من العلاج باستخدام عامل نخر الورم ، لوحظ تراكم ROS داخل الخلايا و [Ca2 plus] I وانخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وزاد نشاط كاسباس -3 بحوالي خمسة أضعاف مقارنةً بالضوابط. ومع ذلك ، فإن المعالجة المسبقة باستخدام tubuloside B (1 ، 10 ، أو 100 مجم / لتر) لمدة ساعتين خففت من موت الخلايا المبرمج بوساطة عامل نخر الورم. العمل المضاد للخلايا من tubuloside Bكان يعتمد جزئيًا على تأثيرات الإجهاد المضادة للأكسدة ، والحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا ، وانخفاض تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، وتثبيط نشاط -3 كاسباس. الخلاصة: Tubuloside B لديه القدرة على حماية الأعصاب لمقاومة موت الخلايا المبرمج الناتج عن TNF في خلايا SH-SY5Y وقد يكون مفيدًا في علاج بعض الأمراض التنكسية العصبية.

المقدمة

يلعب موت الخلايا المبرمج دورًا مهمًا في عملية التماثل الساكن في العديد من العمليات الخلوية وكذلك في تطوير الجهاز العصبي [1]. قد يساهم موت الخلايا المبرمج أيضًا في العديد من الحالات المرضية ، مثل نقص التروية الدماغية [2،3] ، واضطرابات التنكس العصبي ، مثل مرض الزهايمر ، ومرض باركنسون ، ومرض الصيد ، والتصلب الجانبي الضموري [4-7] ؛ وكذلك تأخر اعتلال الدماغ بعد التسمم الحاد بأول أكسيد الكربون [8]. أشارت العديد من الأدلة بقوة إلى أن الإجهاد التأكسدي ، وهو اختلال خلوي بين إنتاج والقضاء على أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، أدى إلى موت الخلايا المبرمج والنخر العصبي [9-11]. لذلك ، من المهم تحديد المركبات التي يمكن أن تقاوم التأثير الضار لـ ROS وتعمل كمضاد للأكسدة لحماية الخلايا العصبية من موت الخلايا المبرمج.

Tubuloside B هو أحد الفينيليثانويد المعزول من سيقانCistanche الصلصا، دواء عشبي صيني ، وهو دواء خام مهم يستخدم كعامل مضاد للسيلينيوم ومضاد للإرهاق [12]. لقد ثبت أن العديد من فينيل إيثانويد يمتلك خصائص كاسحة للجذور الحرة ويحمي الإصابات السامة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي [13-15]. عامل نخر الورم ألفا (TNF) هو عامل تداخل سام بسبب دوره المهم في الأمراض التنكسية العصبية. شوهد الموت إما بسبب النخر أو موت الخلايا المبرمج استجابةً لعامل نخر الورم [16]. تشير العديد من الدراسات إلى أن الإجهاد التأكسدي يلعب دورًا مهمًا في آلية موت الخلايا المبرمج للخلايا بواسطة عامل نخر الورم. تم توثيق مستويات متزايدة من أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا بعد العلاج بعامل نخر الورم [17 ، 18] ويمكن منع الموت بوساطة عامل نخر الورم عن طريق نفايات الجذور الحرة [19]. وهكذا ، درسنا ما إذا كان tubuloside B يمكن أن يحمي من موت الخلايا المبرمج الناجم عن TNF والإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية SH-SY5Y المستزرعة.

المواد والأساليب

الكواشف

تم شراء وسيط النسر المعدل (MEM) ومصل الأبقار الجنيني (FBS) من GIBCO / BRL. صبغة الكروماتين بيسبنزيميد (Hoechst 33342) ، Poly-L-lysine ، 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيل ثيازال- z-yl) -2 ، 5- diphenyltetrazolium (MTT) ، TNF ، و 2 ، 7- ثنائي أسيتات ثنائي كلورو هيدروفلورسيتين (H2DCFDA) تم الحصول عليها من شركة سيجما للكيماويات (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج (FITC) من شركة Boehringer Mannheim (إنديانابوليس ، إنديانا ، ألمانيا). تم شراء 5،5´ و 6،6´-Tetrachloral -1 و 1´ و 3،3´-tetraethyl benzimidazole carbocyanine iodide (JC -1) و Indo -1 / AM من Molecular مجسات (ليدن ، هولندا). تم الحصول على أطقم مقايسة Caspase -3 واستخلاص الحمض النووي من Promega (الولايات المتحدة الأمريكية). Tubuloside B منCistanche الصلصاتم توفيره من قبل الدكتور Peng-fei TU (مركز أبحاث جامعة بكين الحديثة للطب الصيني التقليدي). كان نقاء المركبات أكثر من 98 في المائة على الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). جميع الكواشف أو الأدوية الأخرى كانت من الدرجة التحليلية.

زراعة الخلايا وعلاجها

تم الحفاظ على الخلايا العصبية SH-SY5Y التي تم الحصول عليها من ATCC في MEM مع 10 بالمائة FBS و 100 KU / L benzylpenicillin و 100 مجم / لتر streptomycins في دورق ثقافة مطلي بالبولي- L- ليسين في حاضنة مرطبة مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تم تجديد وسط الثقافة كل 2 إلى 3 D. تم معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة من tubuloside B (1 ، 10 ، أو 100 مجم / لتر) لمدة ساعتين ثم تمت معالجتها بـ 100 ميكروغرام / لتر TNF لمدة 36 ساعة قبل التحليل. اعتبرت الخلايا الطبيعية كعنصر تحكم.

تحليل صلاحية الخلية

تم تحديد صلاحية الخلية باستخدام اختبار MTT [20]. تم زرع الخلايا في 96- ألواح بئر عند 1 × 104 خلية لكل بئر ونمت حتى 70 بالمائة من التقاء في وسط المزرعة. تم استبدال الوسيط بوسط يحتوي على تركيزات مختلفة من tubuloside B لمدة ساعتين ثم مع TNF لمدة 36 ساعة. تمت إضافة ما مجموعه 5 جم / لتر MTT لكل بئر بعد 36 ساعة ، واستمرت الثقافة في الحضانة لمدة 4 ساعات أخرى عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة الوسيط ، تمت إذابة الخلايا وبلورات الصبغة باستخدام 200 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (Me2SO) ، وتم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر باستخدام قارئ فحص الصفيحة الدقيقة ELX -800 النموذجي (One Lambda Inc).

Hoechst 33342 تلطيخ

بعد العلاج باستخدام tubuloside B و / أو TNF ، تم حصاد الخلايا وتثبيتها بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية ، ثم غسلها بمحلول ملحي فوسفات مبرد مسبقًا (PBS) ثلاث مرات وتعريضه لـ 10 مجم / لتر Hoechst33342 في الغرفة درجة الحرارة في الظلام لمدة 10 دقائق. وقد لوحظت العينات تحت المجهر الفلوري (أوليمبوس RX 400) [21].

تحليل تفتيت الحمض النووي

تم استخلاص الحمض النووي باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي (Promega) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم تحميل عينة من الحمض النووي 10 ميكرولتر على مواد هلامية أفقية بنسبة 1.5 في المائة تحتوي على بروميد إيثيديوم. تم تشغيل المواد الهلامية عند 60 فولت لمدة ساعة واحدة وتم تصور شظايا الحمض النووي باستخدام الإضاءة فوق البنفسجية [22].

تجربة ربط Annexin-V

تم استخدام مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا المبرمج AnnexinV-FITC لربط Annexin-V ، والذي له صلة قوية بالفوسفاتيديل سيرين ويمكنه التحقيق في موت الخلايا المبرمج [23]. باختصار ، تم حصاد الخلايا وتعليقها في مخزن مؤقت ملزم بتركيز نهائي للخلية يبلغ 1 × 10 خلية / مل. تم تحضين ما يقرب من 1 × 105 خلية في الظلام باستخدام الملحق الخامس ويوديد البروبيديوم لمدة 15 دقيقة. ثم تم تحليل التعليق باستخدام مقياس تدفق فحص FACS (بكتون ديكنسون ، هايدلبرغ ، ألمانيا). تم تسجيل أنكسين- VFITC و مضان متعلق بأيوديد البروبيديوم على مرشحات FL 1- H (525 نانومتر) و FL 2- H (575 نانومتر) ، على التوالي.

Caspase -3 فحص النشاط

تم اكتشاف نشاط Caspase -3 باستخدام مجموعة اختبار Apo-ONETM HomogeneousCaspase -3 (Promega). باختصار ، تم زرع الخلايا في 96- أطباق جيدة عند 1 × 104 خلية / بئر. بعد التعرض لتركيزات مختلفة من tubulosideB و / أو TNF ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS المثلج. بعد ذلك ، تم خلط 1 ميكرولتر من Z-DEVD-R110 ومخزن الكاسبيز 99 ميكرولتر لعمل كاشف -3 متجانس. تمت إضافة ما مجموعه 100 ميكرولتر من كاشف الكاسبيز المتجانس -3 إلى كل بئر. تم خلط المحتويات برفق واحتضانها لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم قياس شدة تألق الركيزة Z-DEVD-R110 بطول موجة إثارة يبلغ 498 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 521 نانومتر باستخدام مقياس طيفي دقيق (Wallac Victor2TM 1420 Multilabel Counter ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحديد مستوى ROS داخل الخلايا

تم قياس مستويات ROS باستخدام طريقة تلطيخ H2DCFDA الصبغة الفلورية [24]. H2DCFDA هو مركب غير قطبي يتم تحويله إلى مشتق قطبي غير فلوري (H2DCF) بواسطة إسترات خلوية بعد دمجه في الخلايا. H2DCF هو غشاء غير منفذ للنافذة ويتأكسد بسرعة إلى الفلورسنت العالي 2 ، 7- ثنائي كلورو فلورسين (DCF) في وجود ROS داخل الخلايا [25]. تم تحضين الخلايا المزروعة على أغطية زجاجية في كل مجموعة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع H2DCFDA 20 ميكرومتر / لتر مذاب في برنامج تلفزيوني. تم بعد ذلك غسل الأغطية ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني وتحليلها تحت المجهر بالليزر متحد البؤر (لايكا ، ألمانيا). تم تحفيز DCF عند 488 نانومتر ، وكان مرشح الانبعاث عبارة عن مرشح حاجز 510 نانومتر. تم الاحتفاظ بكثافة الفلورسنت والصور المجهرية بالليزر متحد البؤر ثابتة للسماح بمقارنة شدة التألق النسبية بين الخلايا الضابطة والخلايا التجريبية.

الفحص المحتمل لغشاء الميتوكوندريا

كنت متأكدًا من إمكانات غشاء الميتوكوندريا للخلايا باستخدام المسبار JC -1 [26]. يمكن أن تدخل JC -1 الميتوكوندريا بشكل انتقائي ، والتي تظهر خضراء بتركيزات منخفضة أو جهد غشاء منخفض كمونومر. ومع ذلك ، عند التركيزات العالية ، تظهر الميتوكوندريا على أنها مجاميع فلورية حمراء. JC -1 حساس لإمكانات غشاء الميتوكوندريا والتغيرات في النسبة بين التألق الأخضر والأحمر يمكن أن توفر معلومات بخصوص إمكانات غشاء الميتوكوندريا. بعد تحميل الخلايا المعالجة بـ JC -1 1 ميكرولتر / لتر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، تم تحفيز الصبغة الفلورية عند 490 نانومتر ، وتم تسجيل شدة التألق لكل من المونومر والجزيئات المجمعة عند 590 نانومتر تحت البؤر. المسح المجهري بالليزر.

القياسات [Ca2 plus] i

تم تحديد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحر ([Ca2 plus] i) لخلايا SHSYY باستخدام المسبار Indo -1 باتباع الطريقة الموضحة بواسطة Rego et al [27]. بعد معالجة TNF (في وجود أو عدم وجود tubuloside B) ، تم تحميل خلايا SHSYY بـ 3 ميكرولتر إندو -1 / AM في MEM لمدة 45 دقيقة ، عند 37 درجة مئوية ثم حضنت لمدة 15 دقيقة في MEM للسماح بالتحلل المائي لل سلائف استر الأسيتوكسي ميثيل للمسبار. بعد الشطف بمحلول ملحي الصوديوم (مع 1.5 مليمول / لتر CaCl2) ، تم قياس مضان الخلية عند 37 درجة مئوية في مطياف التلألؤ ، مع الإثارة عند 335 نانومتر والانبعاث عند 410 نانومتر. تم حساب [Ca2 plus] وفقًا للمعادلة:

[Ca2 plus] i =250 nmol / L × [(F-Fmin) / (Fmax-F)] (nmol / L) ،

حيث يتوافق 250 نانومول / لتر مع ثابت التفكك للمركب Indo -1 - Ca2 plus ، Fmax هو الحد الأقصى من التألق الذي تم الحصول عليه عند إضافة 3 ميكرو مول / ليونوميسين ، و Fmin هو الحد الأدنى من التألق الذي تم تحديده باتباع المعادلة: Fmin=AF بالإضافة إلى 1/12 (Fmax-AF) ، حيث AF هو التألق الذاتي الذي تم الحصول عليه عند إضافة 3 مليمول / لتر MnCl2.

تحليل احصائي

تم التعبير عن النتائج على أنها ± SD لقيم ثلاثية لكل تجربة. تضمنت المقارنات الإحصائية استخدام اختبار الطالب- S. ص<0.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

النتائج

تأثير tubuloside B على مورفولوجيا الخلية النووية

تم استخدام تلطيخ Hoechst 33342 الحساس للحمض النووي لتقييم التغيرات في التشكل النووي بعد علاج tubuloside B و TNF. كانت النوى في الخلايا الطبيعية طبيعية وأظهرت تلطيخًا منتشرًا للكروماتين (الشكل 1 أ). ومع ذلك ، بعد التعرض لـ TNF 100 ميكروغرام / لتر لمدة 36 ساعة ، خضعت خلايا SH-SY5Y لتغيرات مورفولوجية نموذجية لموت الخلايا المبرمج مثل الكروماتين المكثف والنواة المنكمشة (الشكل 1 ب). لوحظ انخفاض ملحوظ في الخلايا المعالجة بـ tubuloside B (الشكل 1C -1 E).

تأثير اعصاب من tubuloside B على حيوية الخلية

بعد الحضانة باستخدام عامل نخر الورم ، ما يقرب من 45.6 في المائة من الخلايا خضعت لموت الخلايا المبرمج. أدت المعالجة المسبقة باستخدام tubuloside B (1 أو 10 أو 100 ملغم / لتر) إلى خفض معدل موت الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة (كان معدل موت الخلايا 30 بالمائة و 19.5 بالمائة و 6.2 بالمائة على التوالي ؛ الشكل 2) ، ولكن لم يسبب tubuloside B وحده أي سمية خلوية واضحة (البيانات غير معروضة).

تأثير tubuloside B على تفتيت الحمض النووي

بعد التعرض لخلايا SH-SY5Y مع TNF لمدة 36 ساعة ، لوحظ عادة تسلسل الحمض النووي الواضح. ومع ذلك ، فإن الخلايا المعالجة مع tubuloside B تمنع تسلم الحمض النووي بوساطة TNF ، خاصة عند تركيز 100 مجم / لتر ، والذي يمنع تمامًا تفتيت الحمض النووي (الشكل 3).

تأثير tubuloside B على التعرض للفوسفاتيديل سيرين

كما تم تأكيد التأثير المضاد للخلايا لـ tubuloside B عن طريق قياس وجود phosphatidylserine على غشاء الخلية الخارجي. في المجموعة الضابطة ، حوالي 96.3 في المائة من الخلايا تتمتع بصحة جيدة. أظهر الشكل 4 نتائج تجارب الربط الملحق - V لقياس وجود الفوسفاتيديل سيرين على غشاء الخلية الخارجي. كانت النسبة المئوية لموت الخلايا المبرمج 37.5 بالمائة بعد علاج TNF (الشكل 4 ب) ، لكن النسبة انخفضت إلى 28.2 بالمائة و 19.29 بالمائة و 7.9 بالمائة مع المعالجة المسبقة 1 أو 10 أو 100 ملجم / لتر توبولوسيد ب ، على التوالي (الشكل 4 ج -4 ه).

التأثير التثبيطي لـ tubuloside B على تكوين ROS

في هذه الدراسة ، تم الحصول على صور مجهرية ليزر متحد البؤر النموذجية من خلايا SH-SY5Y لمدة 36 ساعة في غياب أو وجود TNF و tubulosideB. زاد مستوى ROS المتولد في الخلايا التي يسببها عامل نخر الورم بشكل ملحوظ مقارنةً بعناصر التحكم (الشكل 5 ب). ومع ذلك ، انخفضت شدة التألق في الخلايا المعالجة بـ Tubuloside B بنسبة 16.2 بالمائة و 56.4 بالمائة و 89.7 بالمائة مع علاج 1،10 أو 100 ملغم / لتر من توبولوزيد ب مقارنةً بالخلايا المعالجة بـ TNF ، على التوالي (الشكل 5 ج -5 ه).

تأثير tubuloside B على إمكانات غشاء الميتوكوندريا

أظهرت خلايا التحكم غير المعالجة العديد من الميتوكوندريا ذات الألوان الزاهية التي تنبعث من الفلور الأحمر البرتقالي ونسبة الأحمر / الأخضر كانت 5.97 ± 0 .21 ، مما يدل على إمكانات الغشاء العالية الطبيعية (الشكل 5 أ). عامل TNF الناجم عن الانتقال في نفاذية الميتوكوندريا وفقدان كبير لإمكانات الغشاء (كانت نسبة الأحمر / الأخضر 0. 35 ± 0. 02) (الشكل 5 ب). منع العلاج TubulosideB انهيار إمكانات غشاء الميتوكوندريا الناجم عن TNF في خلايا SH-SY5Y مع زيادة الجرعة. استأنف Tubuloside B تدريجيًا إمكانات غشاء الميتوكوندريا بتركيزات متزايدة كما هو موضح من خلال ظهور تلطيخ الميتوكوندريا الأحمر (الشكل 6C -6 E).تأثير tubuloside B على نشاط caspase -3

زاد نشاط Caspase -3 بحوالي خمسة أضعاف مقارنةً بعناصر التحكم بعد التعرض لعامل TNF (الشكل 7). على النقيض من ذلك ، أظهرت خلايا SH-SY5Y التي تم معالجتها مسبقًا في وقت واحد باستخدام tubuloside B 1 أو 10 أو 100 mg / L وجود انخفاض كبير في نشاط كاسباس -3 مقارنة بالخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة TNF في نفس النقطة الزمنية (الشكل 7).

تأثير tubuloside B على مستوى [Ca2 plus] i

زاد مستوى [Ca2 plus] I في الخلايا التي يسببها عامل نخر الورم بشكل ملحوظ مقارنةً بعناصر التحكم (التحكم: 105.5 ± 11.2 نانومول / لتر ؛ 100 ميكروغرام / لتر TNF: 238.4 ± 18.9 نانومول / لتر) ، والذي تم تقليله جزئيًا عن طريق المعالجة المسبقة باستخدام tubuloside ب (10 أو 100 مجم / لتر) (الشكل 8).

نقاش

سيستانشالصلصا(CA Mey) G Beck ، نوع واحد منسيستانشالذي ينتمي إلى عائلة Orobanchaceae ، هو نبات طفيلي موطنه شمال غرب الصين. ساق هذا النبات هو دواء صيني تقليدي مهم ويستخدم لعلاج نقص الكلى ، وعقم النساء ، وسيلان الدم المرضي ، والوهن العصبي ، والإمساك الخرف بسبب القصور الذاتي للقولون. المكونات النشطة الرئيسية لهذه العشبة هي جليكوسيد الفينيثانويد [28]. في السنوات الأخيرة ، أبرزت نتائج العديد من الدراسات وظيفة tubuloside B في تعزيز الأنشطة الدوائية والبيولوجية المختلفة [13-15]. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء الإجراءات ليست مفهومة تمامًا. أظهرت الدراسة الحالية أن tubuloside B كان له تأثيرات اعصاب كبيرة على موت الخلايا المبرمج الناتج عن TNF في SH-SY5 الخلايا العصبية من خلال الحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا ، وتقليل إنتاج ROS ، وتقليل مستوى الكالسيوم داخل الخلايا ، وتثبيط نشاط الكاسباس -3 من خلال آلية مضادة للأكسدة. قد تكون هذه الآليات من خلال التأثير الفردي الواقي للأعصاب لـ tubuloside B أو تفاعله مع عوامل أخرى ومن ثم قد يؤدي إلى انخفاض نسبة موت الخلايا المبرمج في الخلايا.

أظهرت الدراسات السابقة أن المواد المؤكسدة أو المؤكسدة هي منظمات مهمة لموت الخلايا المبرمج ويمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج [29 ، 30]. الإجهاد التأكسدي هو عنصر شائع في موت الخلايا المبرمج الناجم عن محفزات مختلفة مثل عامل نخر الورم والتعرض للسموم البيئية ، والتي عادة لا تمارس تأثير مؤكسد مباشر. يتم دعم الدور المركزي للإجهاد التأكسدي في موت الخلايا المبرمج بقوة من خلال قدرة مضادات الأكسدة الخلوية المختلفة على منع موت الخلايا المبرمج الناجم عن عوامل متنوعة [31]. يمكن أن يكون للمركبات ذات الخصائص المضادة للأكسدة تأثير وقائي في حالات مختلفة من الخلل الوظيفي الخلوي من خلال تنظيف الجذور الحرة [32]. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن العديد من جليكوسيدات فينيل بروبانويد تمتلك خصائص كسح الجذور الحرة وتحمي الإصابات السامة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. تمشيا مع هذه الفكرة ، وجدنا أن tubuloside B يقلل من مستوى ROS الناجم عن TNF ، وقد يحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا المبرمج عن طريق مسح أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا مباشرة.

تشير الكثير من الأدلة إلى أن التغييرات الرئيسية في وظيفة الميتوكوندريا كانت متورطة بشكل حاسم في عملية موت الخلايا المبرمج [33]. تم العثور على اضطرابات توازن الكالسيوم والتغيرات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا لتعزيز فتح مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا (MPTP) أو تحفيز إطلاق السيتوكروم ج من خلال آليات MPTP المستقلة ، كونها مسؤولة بشكل مباشر عن تنشيط سلسلة موت الخلايا المبرمج وقد تسبق النووية. علامات موت الخلايا المبرمج [34]. قد تنتج هذه التغيرات البيوكيميائية من التناوب في وظيفة الميتوكوندريا [35]. تشير الحقائق التي تفيد بأن tubuloside B إلى الحد من إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتقليل ارتفاع الكالسيوم داخل الخلايا الناجم عن TNF إلى أن tubuloside B قد يكون لديه القدرة على مواجهة سمية TNF عن طريق تثبيط فتح MPTP وقمع الخلل الوظيفي للميتوكوندريا.

المنبهات الخارجية يمكن أن تبدأ موت الخلايا المبرمج من خلال الآليات المذكورة أعلاه وقد تتقارب على مسار كاسباس لتنفيذ المرحلة النهائية من عملية موت الخلايا المبرمج [36]. تتكون عائلة الكاسبيز من البروتياز من 14 عضوًا من الثدييات على الأقل يتم التعبير عنها بشكل أساسي في جميع أنواع الخلايا تقريبًا على أنها proenzymes غير النشطة (zymogens) التي يتم معالجتها وتنشيطها استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات المؤيدة للاستماتة [37]. }} هو عضو في المصب في سلسلة caspase ويعمل كمستجيب مركزي في مرحلة التنفيذ. عندما يتم تنشيط بروتين كاسباس -3 السلائف CPP32 عن طريق إشارات المنبع مثل إطلاق سيتوكروم ج للميتوكوندريا ، فإن الكاسبيز النشط -3 يشق بقايا الأسبارتات المحددة في البروتينات ذات الوظائف الهيكلية والتنظيمية والتنظيمية المختلفة [{{ 8}}]. يمكن أن تؤدي هذه الأحداث المحللة للبروتين إلى موت الخلايا المبرمج الخلوي وتساهم في تفتيت الحمض النووي والتغيرات الشكلية النووية. وبالتالي ، فإن المواد التي يمكن أن تمنع نشاط الكاسبيز -3 قد تحمي الخلايا من موت الخلايا المبرمج [2،31]. نظرًا لأن tubuloside B يثبط نشاط الكاسباس -3 بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة بعامل نخر الورم ، فإنه يتمتع بقدرة حماية الأعصاب.

في الختام ، كان لـ tubuloside B تأثير وقائي متعدد الوظائف على الخلايا العصبية التالفة. بسبب أنشطته القوية في مكافحة موت الخلايا المبرمج ومضادات الأكسدة ، فقد يكون للاستخدام السريري في الإعاقات التنكسية العصبية والعصبية التي تنطوي على موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية.