تم العثور على البروتينات بتكرار لا يقل عن 2 في كل حالة تم فحصها

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

علاوة على ذلك ، كما هو الحال من الرسوم البيانية الشريطية في الشكلين 5 ب و 6 ب ، فإن توزيع البروتين المميز وفقًا للشرط المسبق لنقص التأكسج لخلية الإفراز يكون ملحوظًا. في هذه الحالة ، للحصول على معلومات كاملة ، تم أيضًا الإبلاغ عن البروتينات التي لا تتجاوز عتبة مجموعة DAve ومجموعة DCI. يحتوي الجنين على نتائج إفرازية مخصبة ببروتين الصدمة الحرارية 60 كيلو دالتون (HSPD1 ، الشكل 5 ب ، اللوحة اليسرى) في صيغته ناقصة التأكسج ، في حين أن النظير قبل الولادة معبر للغاية عن عضلات الميوسين الانقباضية الملساء التنظيمية [52] عديد الببتيد الخفيف 9 (MYL9 ، الشكل 5B ، اللوحة اليمنى). يبدو أن جزءًا مهمًا من الفرق بين مراحل الحمل يعتمد بشكل أكبر على الشروط المسبقة بنقص التأكسج في hAFS. المركبات الكهربائية. تم العثور على f-have-EVs التي تم الحصول عليها من تحضير خلية ناقصة التأكسج معززة بعوامل تشمل Perlecan (HSPG2) و Agrin (AGRN) و Laminin Subunit -5 و -1 (LAMA5 و LAMB1) و Thrombospondin {{17 }} (THBS1 ، الشكل 6 ب ، اللوحة اليسرى). احتوت مركبات p-hAFS-EVs ناقصة التأكسج على سلسلة Ferritin Heavy Chain (FTH1) ، وبروتينات سقالة مثل Flotillin -1 (FLOT1) ، و Fascin (FSCN1) ، و Annexin A6 (ANXA6) ، ومثبط تفكك بيتا Rab GDP (GDI2) ، جنبًا إلى جنب مع Thy -1 بروتين سكري غشائي (THY1) ، نيوروبيلين -1 (NRP1) ومصفوفة ميتالوبروتين 14 (MMP14 ، الشكل 6B ، اللوحة اليمنى).

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

تم العثور على البروتينات بتردد لا يقل عن 2 في كل حالة تم فحصها في f-hAFS. تمت مقارنة EVs و p-hAFS-EVs مع قاعدة بيانات Vesciclepedia [53]. كما هو متوقع ، تم وصف غالبية البروتينات المحددة (96 بالمائة) مسبقًا في EVs و exosomes في قاعدة البيانات المرجعية (الشكل S3A).فوائد cistancheفي هذا الصدد ، تم إجراء تحليل إثراء علم الجينات (GO) عن طريق FunRich [54]. تمت مقارنة وفرة مصطلحات GO في مجموعة البيانات بكميتها الطبيعية في قاعدة البيانات المرجعية للعثور على مجموعات البروتينات ذات التمثيل الإحصائي المفرط ، وفقًا لمشاركتها في العمليات البيولوجية والوظيفة الجزيئية والمكونات الخلوية (بالنسبة لهذه البيانات الجانبية الأخيرة ليست كذلك معروض ، ولكنه متاح عند الطلب). فيما يتعلق بتحليل الوظائف الجزيئية المرتبطة بالبروتينات المحددة ، أشارت أجزاء hAFS-CM إلى التخصيب في مكون هيكلي للمصفوفة خارج الخلية والهيكل الخلوي ، وربط بروتين الهيكل الخلوي ، ونشاط الجزيء الهيكلي (الشكل S2) ، بينما تم إثراء hAFS-EVs بهيكل هيكلي. مكون من الهيكل الخلوي والريبوسوم ، وربط الحمض النووي والحمض النووي الريبي وعوامل ربط GTPase والوصيف (الشكل S3C).

أشار تحليل إثراء العمليات البيولوجية لكل من hAFS-CM و have-EVs إلى أن غالبية البروتينات المعدلة في كسور إفراز hAFS للجنين والفترة المحيطة بالولادة تنتمي إلى نمو / صيانة الخلية واستقلاب البروتين (الشكلان 5C و 6C). في hAFS-EVs ، لاحظنا أن مصطلح "المكونات الهيكلية للمصفوفة خارج الخلية" كان مرتبطًا حصريًا بـ f-hAF-EVs ناقصة التأكسج ؛ تم إثراء المصطلحين "ارتباط أيون الكالسيوم" و "النشاط الجزيئي الهيكلي" بشكل أساسي في عينات f-hAFS و p-hAFS ناقصة التأكسج (الشكل S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I و DCI (ثقة التعبير التفاضلي) اجتازت I5I أو أكبر من أو تساوي المرشحات وتم اعتبارها معبرًا عنها بشكل تفاضلي ؛ انظر الجدول S3 للحصول على القائمة الكاملة والمعلمات التفصيلية للبروتينات المبلغ عنها. (C) تحليل إثراء العمليات البيولوجية للبروتينات المحددة بتردد لا يقل عن 2 في f-hAFS-EVs (اللوحة اليسرى) و p-hAFS-EVs (اللوحة اليمنى) بعد التكييف المسبق ناقص التأكسج. استنادًا إلى أداة FunRich ، يتم عرض مصطلحات علم الجينات في المخططات الشريطية التي توضح النسبة المئوية للجينات المخصبة لكل فئة (أشرطة صفراء داكنة لـ f-hAFS-EVsnormo ، أشرطة حمراء لـ f-hAFS-EVShypo ، أشرطة خضراء فاتحة لـ p-hAFS -EVsnormo وأشرطة خضراء داكنة لـ p-hAFS-EVShypo). فقط مصطلحات علم الوجود الجيني مع تصحيح Bonferroni * p<0.05 are="">

يمكن للكيستانش مكافحة الشيخوخة

2.6 كشف التنميط الخلوي والكيماوي للجنين مقابل ما قبل الولادة عن أنماط توزيع مختلفة

لقد تحققنا سابقًا من القدرة التجديدية لـ f-hAFS-CMhypo على خلايا القلب والأوعية الدموية المصابة عبر تأثيرات paracrine [34،35،49]. قمنا هنا بمقارنة محتوى السيتوكين والكيموكين الخاص بـ f-hAFS-CMHypo بنظيره p-hAFS المقابل (الشكل 7 أ ، الشكل S4A ، والجدول S4) ووجدنا بعض العوامل التمييزية.

تم العثور على ANGIOGENIN ، محفز المصفوفة المعدنية خارج الخلية (EMMPRIN) ، Interleukin 8 (IL -8) ، و Monocyte Chemoattractant Protein -1 (MCP -1) مخصبًا بشكل حصري inf-hAFS-CMNypo ولم يكن كذلك تم الكشف عنها في p-hAFS-CMhypo. تمت زيادة البروتين المرتبط بعامل النمو الشبيه بالأنسولين 2 (IGFBP2) و Osteopontin (OPN) بشكل كبير في f-hAFS-CMhypo على p-hAFS-CMHypo بمقدار 3. 5- و 3. 8- أضعاف (" ص<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

في حين أظهر الجنين مقابل الجنين في الفترة المحيطة بالولادة تعبيرًا تفاضليًا في ملف تعريف السيتوكين والكيموكين الخاص بهم ، تم توزيع نظرائهم من الجنين مقابل الفترة المحيطة بالولادة بشكل أكثر تجانسًا ، على الرغم من وجود ملفات تعريف أقل للتعبير (الشكل 7 ب ، الشكل S4B ، والجدول S5). ومع ذلك ، يمكن تقدير بعض الاختلافات: تم التعبير عن DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV) وعامل النمو / التمايز 15 (GDF -15) و IL -8 فقط بواسطة f-hAFS-EVSHypo ، على الرغم من أنها منخفضة المستويات. تم العثور على ANGIOPOIETIN2 و CD40 LIGAND والبروتين المرتبط بفيتامين D (VDBP) فقط في p-hAFS-EVShypo ، على الرغم من اكتشافه مرة أخرى بكميات منخفضة. السيتوكينات الأخرى مثل العامل العصبي المشتق من الدماغ (BDNF) ENDOGLIN و FGF -19 وعامل النمو الشبيه بالإنسولين والبروتين 3 (IGFBP3) و IL -17 a و MIF OPN و PTX3 والعامل المشتق من Stromal { تم العثور على {23}} alpha (SDF -1 a) في كل من f-hAFS-EVShypo و p-hAFS-EVSHvpo ، حيث تم التعبير عن PAI -1 و EMMPRIN بدرجة أكبر (الشكل 7 ب)

تم إثراء BDNF و ENDOGLIN و IGFBP3 و SDF-lo حصريًا في جميع المركبات الكهربائية التي تعاني من نقص الأكسجين مقارنةً بـ hAFS-CM المقابلة ، بغض النظر عن مرحلة الحمل. علاوة على ذلك ، في حين لم يتم اكتشاف EMMPRIN داخل p-hAFS-CMhypo ، فقد وجد أنه مخصب في الجزء المقابل EV ؛ على العكس من ذلك ، كان OPN أكثر وفرة في f-have-CMhypo منه في f-have-EVShypo ، بينما كان قابلاً للمقارنة بين الكسور الإفرازية p-hAFS المقابلة. تم التعبير عن FGF -19 و MIF و PTX3 بالمثل في كل من الجنين وحوالي الولادة has-CM وفي hAFS-EVs المقابلة. تم إثراء PAI -1 بدرجة عالية في كسور إفرازية ناقصة التأكسج.

الشكل 7. التنميط السيتوكيني والكيموكيني داخل تركيبات إفراز hAFS الجنين والفترة المحيطة بالولادة. (أ) تم الإبلاغ عن التعبير عن السيتوكينات والكيموكينات المكتشفة داخل الجنين ناقص التأكسج مقابل الجنين في الفترة المحيطة بالولادة (f-hAFS-CMHypo مقابل p-hAFS-CMHypo) بكثافة البكسل بواسطة الوحدة التعسفية [AU]. يتم التعبير عن القيم على أنها متوسط ​​± sem للتجارب المستقلة ويتم الإبلاغ عنها في الجدول S4 ؛ * p =0. 0485 ؛ ** p =0. 006. (B) محتوى السيتوكين والكيموكين المكتشف في الجنين ناقص التأكسج- مقابل hAFS-EVs في الفترة المحيطة بالولادة (f-hAFS-EVSHypo مقابل p-hAFS-EVSHypo) ويتم التعبير عنها بكثافة البكسل في الوحدات التعسفية [AU].cistanche الكوليستروليتم التعبير عن القيم على أنها متوسط ​​± sem من n =3 تجارب مستقلة ويتم الإبلاغ عنها في الجدول S5. CST3: Cystatin C ؛ EMMPRIN: محفز للبروتين المعدني خارج الخلية ؛ FCFF -19: عامل نمو الخلايا الليفية -19 ؛ IGFBP2: عامل النمو الشبيه بالإنسولين (IGF) بروتين 2 ؛ IL -8: الإنترلوكين -8؛ IL -17 أ: إنترلوكين -17 أ ؛ MCP -1: Monocyte Chemoattractant Protein -1؛ MIF: عامل مثبط لترحيل البلاعم ؛ PTX3: بنتراكسين 3 ؛ PAI -1: مثبط Plasminogen Activator -1 ؛ BDNF: عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ ؛ DPPIV: Dipeptidyl Peptidase IV ؛ GDF -15: عامل تمايز النمو -15 ؛ IGFBP3: عامل النمو الشبيه بالإنسولين (IGF) بروتين ملزم 3 ؛ SDF -1 أ: عامل مشتق سترومال -1 ألفا ؛ VDBP: بروتين ملزم بفيتامين د.

2.7 يتم إثراء المركبات الكهربائية عند الجنين وفترة ما حول الولادة بمعلومات الحمض النووي الريبي في حمولتها

نظرًا لأن RNAs الصغيرة غير المشفرة تعتبر منظمات رئيسية لتأثير paracrine EV على الخلايا المستهدفة [4،55] ، ركزنا بشكل أساسي تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي على محتوى microRNA (miRNA) داخل f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs. أظهر التنميط الصغير للحمض النووي الريبي إثراء ميرنا في كل من hAFS-EVs الجنينية والفترة المحيطة بالولادة (حوالي 35-36 بالمائة) بالمقارنة مع إجمالي كمية الحمض النووي الريبي الصغيرة (الشكل 8 أ). كان مكون miRNA بالفعل من بين نوعي الحمض النووي الريبي الأكثر تمثيلًا في كل من تركيبات EV ، مع rRNA (*** p) p <0. 0001).="" كانت="" الجزيئات="" المجهرية="" التالية="" هي="" الأكثر="" إثراءً="" في="" عينات="" ev="" التي="" تم="" تحليلها:="" mir="" -31-5="" p؛="" mir="" -196="" a="" -5="" p؛="" ميل="" -93-5="" ص="" ؛="" ميل="" -100-5="" ص="" ؛="" mir="" -125="" a="" -5="" p؛="" mir="" -27="" b="" -3="" p="" ،="" دع="" -7="" a="" -5="" p="" ،="" دع="" -7="" b="" -5="" p="" ،="" دع="" -7="" f="" {="" {27}}="" p،="" let="" -7="" i="" -5="" p،="" mir="" -16-5="" p،="" mir="" -21-5="" p،="" mir="" -29="" a="" -3="" p،="" mir30a="" -5="" p="" و="" mir="" -125="" b="" -5="" p="" و="" mir="" -155-5="" p="" و="" mir="" -191-5="" p="" و="" mir="" -221-3="" ص.="" من="" الجدير="" بالملاحظة="" أن="" المركبات="" الكهربائية="" التي="" تحتوي="" على="" الجنين="" وفي="" الفترة="" المحيطة="" بالولادة="" تشترك="" في="" غالبية="" هذه="" الجزيئات="" الجزيئية="" (أي="" let="" -7="" a="" -5="" p،="" let="" -7="" b="" -5="" p،="" let="" {{47="" }}="" f="" -5="" p="" ،="" دع="" -7="" i="" -5="" p،="" mir="" -16-5="" p،="" mir="" -21-5="" p،="" mir="" -29="" a="" {{54="" }}="" p،="" mir30a="" -5="" p،="" mir="" -125="" b="" -5="" p،="" mir="" -155-5="" p،="" mir="" -191-5="" p="" and="" mir="" -221-3="" p،="" الشكل="" 7="" ب).="" غطت="" أكثر="" 15="" نوعًا="" من="" أنواع="" mirnas="" المخصب="" أكثر="" من="" 60="" بالمائة="" من="" إجمالي="" محتوى="" ميرنا="" في="" كل="" عينة.="" من="" ناحية="" أخرى="" ،="" تم="" العثور="" على="" حوالي="" 100="" mirnas="" في="" الـ="" 30="" بالمائة="" المتبقية="" من="" محتوى="" ميرنا="" الحويصلي="" (الشكل="">

لتوصيف محتوى ميرنا بشكل أكبر داخل hAFS-EVs ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت مرحلة الحمل hAFS أو التكييف المسبق لخلايا ناقصة التأكسج في المختبر يمكن أن يؤثر على إثراء miRNAs معينة. تم العثور على أقوى تعديل بين مراحل الحمل ، حيث تم إثراء جميع miRNAs المعدلة تقريبًا في f-hAFS-EVs على النظير في الفترة المحيطة بالولادة (الشكل 9 أ والجدول 1). كان للتكييف المسبق ناقص التأكسج تأثير أكثر اعتدالًا على حمولة ميرنا ، بينما كان تعديل المقارنة في أي اتجاه ، مع إثراء بعض ميرنا بنقص الأكسجة والبعض الآخر في ظروف التحكم السمية (الشكل 9 أ).

كتحليل تكميلي ، ركزنا على تحديد miRNAs التي تم فحصها مع أدنى تباين عبر المانحين المختلفين وشرط الثقافة المسبقة ، للمركبات الكهربائية المستمدة من كل من مراحل الحمل التي تم فحصها. امتدت miRNAs الناتجة عن هذا التحليل من مستويات التعبير العالية إلى المنخفضة (الشكل 9 ب). ضمن جوهر miRNA الأكثر استقرارًا لبضائع hAFS-EVs ، تم تحديد بعض miRNA المشترك بين f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs (miR -21-5 p، miR -29 a -3 p و miR -16-5 p على مستوى عالٍ ؛ miR -221-3 p و miR -221-5 p و miR -22-3 p عند مستوى خافت ، الجدول 2).

الشكل 9. تحليل التخصيب التفاضلي لل miRNAs في hAFS-EVs الجنين وفي الفترة المحيطة بالولادة. (أ) مؤامرات البركان للتخصيب التفاضلي لشحنة hAFS-EV miRNA وفقًا لمرحلة الحمل (اللوحة اليسرى) وفي حالة نقص الأكسجة في المختبر لخلايا الإفراز (اللوحة اليمنى). للحصول على تفاصيل ميرنا ، يرجى الرجوع إلى الجدول 1. (ب) مخطط مبعثر للعلاقة بين التباين (المحور X) ومستوى الإثراء (المحور Y) من miRNAs المستقرة داخل hAFS-EVs الجنين (اللوحة اليسرى) و hAFS-EVs في الفترة المحيطة بالولادة (اللوحة اليمنى) وفقًا لارتفاع (النقاط الصفراء) ، قاتمة (نقاط خضراء) وإثراء منخفض (نقاط أرجوانية داكنة). للحصول على تفاصيل miRNA ، يرجى الرجوع إلى الجدول 2.RPM: يقرأ لكل مليون.

3. مناقشة

تم تحديد العينات المتبقية من السائل الأمنيوسي البشري كمصدر قيم للخلايا اللحمية ذات الإمكانات الواعدة في الطب التجديدي وهندسة الأنسجة. المخاوف الأخلاقية المرتبطة بعزلهم ضئيلة ، حيث يمكن الحصول عليها من عينات بقايا الفحص الروتيني قبل الولادة بزل السلى ، خلال الثلث الثاني من الحمل (hAFS الجنين) ، أو من السائل الأمنيوسي الذي تم التخلص منه كنفايات إكلينيكية في الثلث الثالث من الحمل المقرر في القسم C الإجراءات (hAFS في الفترة المحيطة بالولادة). في السنوات الأخيرة ، تم اقتراح hAFS كعلاجات محتملة لإصلاح الأنسجة البشرية وتجديدها بالنظر إلى الأدلة المشجعة التي تم الحصول عليها من نماذج الأمراض التجريبية. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم اقتراحها أيضًا في علاج الرحم للأمراض العصبية للجنين والولدان ؛ في الواقع ، اقترحت الدراسات قبل السريرية أن hAFS تدار قبل الولادة عن طريق الولادة داخل السلى يحمي الحبل الشوكي أثناء الحمل عن طريق نشاط paracrine في نموذج الفئران من القيلة النخاعية السحائية [56-58] ، ويقلل من تلف الأمعاء المكشوفة في الانشقاق المعدي التجريبي للقوارض [59] ]. من منظور متعدية ، في زرع الرحم يمكن استبدال hAFS بإدارة أنسب إعداد للسكرتوم (hAFS-CM o hAFS-EVs).الآثار الجانبية cistanche الصحراءستسمح هذه الاستراتيجية بالتدخل السريع وفي الوقت المناسب أثناء الحمل من خلال التغلب على قيود العلاج بالخلايا الكنسية (أي ، توسع الخلايا المختبرية الذي يستغرق وقتًا طويلاً) مع توفير تركيبات صيدلانية جاهزة للاستخدام.

قد يؤدي التطور الأخير لتقنيات التشخيص السابقة للولادة الأقل توغلاً إلى انخفاض إجراءات بزل السلى في المستقبل القريب ، وبالتالي الدعوة إلى hAFS في الفترة المحيطة بالولادة كخيار يسهل الوصول إليه. ومع ذلك ، نظرًا لأن hAFS الجنينية غير ناضجة أكثر من الناحية التطورية ، فقد تحتوي على إمكانات paracrine أكثر فعالية. ضمن هذا السيناريو ، قمنا هنا بمقارنة c-KITt hAFS للجنين والفترة المحيطة بالولادة وركزنا على تنميط الكسور الإفرازية الخاصة بهم. لقد أبرزنا الفروق ذات الصلة التي يجب أخذها في الاعتبار للترجمة السريرية المحتملة لقدرتها على paracrine.

بالاتفاق مع الدراسات المستقلة السابقة ، أظهرنا أن مرحلة الحمل لم تؤثر على مورفولوجيا hAFS غير المتجانسة وملف تعريف مستضد اللحمة المتوسطة [25 ، 26]. قمنا بعد ذلك بتقييم المعلمات التي من المرجح أن تؤثر على إفراز الخلية ونشاط paracrine خارج النمط المناعي اللحمي الكنسي. وتجدر الإشارة إلى أن وجود مجموعة سكانية فرعية موجبة للقرص المضغوط 146- مرتفع CD107a ضمن أسلاف اللحمة المتوسطة لنخاع العظم قد ثبت مؤخرًا أنه يرتبط بنشاط تعديل وعلاجي باراكرين ملحوظ [47]. لقد كشفنا هنا أن كلا من hAFS الجنيني والفترة المحيطة بالولادة يتميزان بقوة بهذا التوقيع الجزيئي الذي يدعم قوتهما الإفرازية مع الآثار الترجمية ذات الصلة. علاوة على ذلك ، تميزت hAFS الجنين بعملية التمثيل الغذائي الهوائي غير الفعال ، بينما أظهرت حالات ما حول الولادة الأكثر نضجًا معدل استهلاك أكسجين أعلى وتخليق ATP. قد يشير هذا إلى صورة استقلابية غير ناضجة أكثر من hAFS في الثلث الثاني من الحمل والتي تشبه خلايا انسجة الحبل السري لحديثي الولادة المبتسرين ، والتي أظهرت نفس الاتجاه [60].

من أجل تحفيز إمكانات paracrine ، تعرضت hAFS لـ 24 ساعة من التحضير لنقص التأكسج الخالي من المصل ، وهي استراتيجية طورناها سابقًا بنجاح [34،35،37] للخلايا الجنينية والتي قمنا هنا بالتحقيق في نظيرتها في الفترة المحيطة بالولادة لأول مرة. أدى التكييف المسبق للجنين والفترة المحيطة بالولادة تحت نقص الأكسجة إلى اتجاه إيجابي في زيادة تركيز إفرازهم وفي كمية المركبات الكهربائية التي تم إطلاقها ، في حين أن مرحلة الحمل لم تمارس أي تأثير على إفراز الخلية ولا على مورفولوجيا EV وتوزيع الحجم.

والجدير بالذكر أن توصيف حمولة hAFS paracrine كشفت عن بعض الاختلافات المحددة ، وفقًا للظروف المختلفة التي قمنا بتقييمها. كشف التنميط البروتيني لمفرز hAFS الجنيني عن توزيعات عامل يمكن تمييزها بناءً على مرحلة الحمل والتهيئة المسبقة لنقص التأكسج في الخلية. يشير هذا إلى أن إمكانات paracrine hAFS يمكن أن تكتسب هوية مميزة أثناء النضج من إلى Ⅲ الثلث من الحمل والذي بدوره يمكن تعديله عن طريق تحفيز الخلايا المفرزة في المختبر. اقترح تحليل إثراء العمليات البيولوجية لـ hAFS-CM و hAFS-EVs أن معظم البروتينات المعدلة قد تتفق مع نمو / صيانة الخلية واستقلاب البروتين ، وبالتالي دعم تأثيرات paracrine المفيدة للخلايا التي تم الإبلاغ عنها بعيدًا. على وجه الخصوص ، تم العثور على الإفراز الكلي hAFS للجنين ناقص التأكسج معززًا ببروتين الصدمة الحرارية HSPD1 (HSP60) ، والذي ثبت أنه يدعم التئام الجروح في نموذج إصابة جلد الفأر السكري ولتعزيز انحراف البلاعم المؤيد إلى النمط الظاهري M2 [61] . وبالمثل ، تم إثراء hAFS-EVs الجنينية التي تعاني من نقص الأكسجين للعوامل التي تعزز تكوين الخلايا العصبية (HSPG2 [62] ، والتجديد الذاتي للخلية ، وتطور الدماغ والقلب والأوعية الدموية (LAMA5 [63] و LAMB1 [64] والهجرة (THBS1 [2])). تم العثور على AGRN أيضًا في المركبات الكهربائية بعد التهيئة الناقصة للأكسجين للجنين hAFS.جرعة cistanche redditتتماشى النتائج التي توصلنا إليها مع الأدلة السابقة على تنظيم AGRN في بروتين الخلايا اللحمية الوسيطة تحت المنبهات الإرشادية الالتهابية ونقص التأكسج [65]. وقد ثبت أيضًا أن AGRN متورط في إشارات المشبك المناعي [66] ويتوافق مع تجديد قلب الفأر الوليدي [67] ، مما يدعم استعدادًا واضحًا لنمو الجنين الصغير النمائي نحو تأثيرات paracrine التجدد. علاوة على ذلك ، تم التأكد من أن hAFS الجنيني أكثر استجابة للتكييف المسبق لنقص التأكسج كما هو موضح من خلال إثراء المنبئات لفعالية تجديد الأوعية الدموية ، مثل ANGIOGENIN و EMMPRIM و IL -8 و MCP -1 السيتوكين [68] ، في وسطهم المشروط. يدعم هذا الدليل السابق على فاعلية paracrine للجنين hAFS-CM في تعزيز تكوين الشرايين الجديدة الذاتية في نماذج القوارض قبل السريرية لاحتشاء عضلة القلب ونقص تروية الأطراف الخلفية والسديلة الجلدية اللفافة الدماغية [34 ، 69-71] علاوة على ذلك ، hAFS الجنين تم العثور على الإفراز الكلي بشكل أكثر ثراءً مع IGFBP2 و OPN مقارنةً بالفترة المحيطة بالولادة ، مما يشير إلى ملف تعريف تعديلي أكثر وضوحًا ومقاومًا للشيخوخة [72-75]. في الفترة المحيطة بالولادة ، كان الـ have-CM ، على الرغم من كونه أقل تعزيزًا في عوامل paracrine ، إلا أنه تم استكماله بالمثل مع عوامل التغذية العصبية والعوامل المعدلة للمناعة ، مثل CST3 [76،77] و MIF [78].

مقارنةً بإجمالي hAFS-CM ، أظهرت النظراء ذات الأوكسجين المنخفض الأوكسجين للجنين والفترة المحيطة بالولادة تعبيرًا أقل عن السيتوكينات والكيموكينات ، باستثناء وسيط إعادة تشكيل الأوعية الدموية EMMPRIN [79] ، والذي تم إثرائه في الغالب في حجرة الحويصلة. تم تأكيد الملف الشخصي النشط للقلب والمؤيد للتجديد الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا لـ hAFS-EVs الجنيني [34،37] هنا من خلال دليل على تعبيرهم الحصري عن IL Cardioprotective [{9}} [80] و GDF -15 ، عامل باراكرين رئيسي يؤدي إلى تكوين الخلايا العصبية للحصين لدى البالغين [81،82] ، بالإضافة إلى مقاومة السمية القلبية التي يسببها الأنثراسيكلين [78]. أظهر كل من hAFS-EVs الجنين وحوالي الولادة تعبيرًا مشابهًا لمنظم تهريب الخلايا الجذعية / السلف -1 [83-85]. أبلغ التحليل البروتيني عن زيادة التعبير عن البروتينات المتعلقة بتكوين الأوعية ، مثل NRP1 [86] و MP14 [87] في hAFS-EVs ناقص التأكسج في الفترة المحيطة بالولادة. قد يفسر هذا الملف التحفيزي النتائج السابقة على الخصائص التجديدية البطانية لـ Ⅲ الثلث الأخير من hAFS في نموذج الفأر قبل السريري لإصابة نقص تروية العضلات والهيكل العظمي [25] ، على الرغم من الدليل على أن hAFS-CM أقل تولدًا للأوعية من الجنين المقابل. بشكل ملحوظ ، تم العثور على عامل النمو العصبي BDNF في كل من شحنة EV للجنين والفترة المحيطة بالولادة ، على الرغم من بكميات منخفضة ، مما يشير إلى نشاط التغذية العصبية المفترض لـ hAFS-EVs في بقاء الخلايا العصبية والعمليات النمائية العصبية ، كما لوحظ أيضًا في الحويصلات خارج الخلية التي يفرزها عظم الإنسان النخاع ودم الحبل السري - MSC [8889]. أظهرت كل من التركيبات الإفرازية المأخوذة من hAFS الجنين وفي الفترة المحيطة بالولادة والتي تخضع لتحفيز نقص التأكسج أنها غنية بـ PAI -1 ، وهو ميسر التنشيط البطاني [90] الذي شارك أيضًا في استقطاب الضامة M2 في القلب ومزود بواقي للقلب ومضاد التليف [91].

تم تناول MicroRNAs (miRNAs) على نطاق واسع كمنظمين أساسيين لنشاط نظير الخلايا الجذعية والخلايا اللحمية المتوسطة EV [92،93]. وجدنا هنا أن أكثر 15 نوعًا من أنواع ميرنا المخصب داخل hAFS-EVs تغطي أكثر من 60 بالمائة من إجمالي محتوى ميرنا في كل عينة. تم الإبلاغ عن هذه الجزيئات الجزيئية لتوصيف الشحنة الجزيئية للمركبات الكهربائية للخلايا اللحمية اللحمية المتوسطة (دع -7 -5 ص [4،95]) ، تحمي من نقص تروية عضلة القلب عن طريق التأثير على تجديد الأوعية الدموية وتثبيط التليف -7 ب -5 p ، دع -7 f -5 p ، miR -21-5 p و miR -155-5 p [96،97]) ، قم بالترقية التئام الجروح من خلال تنظيم وظيفة الخلايا الكيراتينية (miR -16-5 p [98]) ومواجهة موت الخلايا العصبية بعد نقص تروية الدماغ الأمامي (miR -29 a -3 p [99،100]). من ناحية أخرى ، تم العثور على حوالي 1000 ميرنا في 30 في المائة المتبقية من محتوى ميرنا الحويصلي. يتوافق هذا التوزيع غير المتوازن مع الدراسات السابقة [4] ويسلط الضوء على معظم الجزيئات الجزيئية المخصبة باعتبارها المسؤولة المفترضة عن النشاط البيولوجي الرئيسي لـ hAFS-EVs. ومن المثير للاهتمام ، أن hAFS-EVs الجنينية والفترة المحيطة بالولادة تشترك في غالبية 15 miRNAs. من الجدير بالملاحظة ، لاحظنا أيضًا أن كلاً من hAFS-EVs الجنينية وفترة ما حول الولادة تحتوي على مجموعة من الجزيئات المجهرية المستقرة جدًا عبر مستويات تخصيب مختلفة. قد تشير هذه الأدلة إلى مجموعة واسعة من المرشحين "التدبير المنزلي" لاستخدامها كعنصر تحكم مرجعي داخلي في تجارب qPCR على hAFS-EVs. علاوة على ذلك ، هناك مجموعة فرعية متسقة من هذه الجزيئات الدقيقة الثابتة (miR -16-5 p، miR -21-5 p، miR -22-3 p، miR -29 a -3 p، miR { {40}} y miR -221-5 p) تتم مشاركته بين مرحلتي الحمل ويتداخل مع 15 منها في الغالب ، مما يشير إلى سلوك أكثر ثباتًا وتوقيع جزيئي موثوق به مسبقًا ([96 ، {{45 }}]). من الجدير بالملاحظة ، أنه تم الإبلاغ مؤخرًا عن اثنين من المرشحين داخل مثل هذا اللب المميز كمرجع مرجعي داخل المركبات الكهربائية الواقية من الأعصاب التي تم الحصول عليها من خلايا انسجة اللحمة الوسيطة المشتقة من السائل الأمنيوسي في الثلث الثاني من الحمل (miR -29 a -3 p و miR {{{{{{-}}}} -3 49}} ص [95]). ومع ذلك ، لاحظنا أيضًا أن عمر الحمل قد يعدل حمولة ميرنا أكثر من الشروط المسبقة ناقصة التأكسج. تم إثراء المزيد من EVs الأحداث التي تم الحصول عليها من الثلث الثالث من الحمل الجنيني hAFS مع miRNAs التي تم إثباتها سابقًا لدعم قابلية الخلايا الجذعية الجنينية (miR -302-3 p [101]) ، وتكاثر الخلايا ، والتمايز العظمي للخلايا اللحمية لنخاع العظم (miR -217 [102]) ، بينما تحتوي أيضًا على إمكانات مثبط الورم (miR -302-3 p [103،104]) ؛ miR -383-5 ص [105106]).

بناءً على النتائج التي توصلنا إليها ، نؤكد هنا أن hAFS للجنين والفترة المحيطة بالولادة قد يمثلان مصادر باراكرين جذابة لاستغلالها في الطب التجديدي. في حين أن نشاطهم من النوع الظاهري والنشاط الإفرازي كان متشابهًا ، فقد أبرزنا بعض الجوانب الغريبة في تركيباتهم الإفرازية كرؤى مفيدة لترجمتهم العلاجية في المستقبل.

4. المواد والطرق

4.1.عزل الخلايا الجذعية للسائل الذي يحيط بالجنين البشري وزراعة في المختبر

تم عزل الخلايا الجذعية للسائل الذي يحيط بالجنين البشري (hAFS) من عينات بقايا السائل الأمنيوسي (AF) التي تم جمعها عن طريق الفحص الروتيني قبل الولادة عن طريق Ⅱ بزل السلى في الثلث الأخير (hAFS ، f-hAFS) ، أو كنفايات سريرية أثناء الولادة القيصرية المجدولة خلال الأشهر الثلاثة الأخيرة (hAFS ، p-hAFS) في وحدة تشخيص ما قبل الولادة وطب الفترة المحيطة بالولادة ، مستشفى IRCCS San Martino ، في وحدة طب وجراحة الجنين والفترة المحيطة بالولادة ومختبر الوراثة البشرية في مستشفى IRCCS Istituto Gaslini (جينوفا ، إيطاليا). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المانحين وفقًا لتفويض اللجنة الأخلاقية المحلية (بروتوكول PR428REG2 0 15) وبما يتوافق مع إرشادات إعلان هلسنكي. تم الحصول على عينات الرجفان الأذيني للجنين في الثلث الثاني من الحمل من متبرعات بمتوسط ​​عمر يبلغ حوالي 37.42 ± 0.32 عامًا (ن =15 تتراوح من 36- إلى 41 عامًا) ؛ تم الحصول على عينات الرجفان الأذيني في الفترة المحيطة بالولادة من متبرعات يبلغ متوسط ​​أعمارهن 34.25 ± 1.31 عامًا (ن =10 تتراوح أعمارهن بين 26- و 42 عامًا). تم الحصول على hAFS للجنين والفترة المحيطة بالولادة من عينات تم التحقق من صحتها للنمط النووي الطبيعي وتم عزلها عن طريق الفرز المناعي لتعبير c-KIT (CD117 MicroBead Kit ، Miltenyi Biotechnology ، Bologna ، إيطاليا) من الخلايا اللحمية اللحمية اللحمية AF الملتصقة [16].فوائد استخراج cistancheتمت تربية c-KIT * hAFS في Minimal Essential Medium (MEM) -alpha مع 15 بالمائة FBS (مصل بقري جنيني ، Gibco-Thermo Fisher Scientific ، Monza ، إيطاليا) ، 18 بالمائة Chang B ، و 2 بالمائة Chang C Medium (Irvine Scientific ، سانتا آنا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 1 في المائة من L- الجلوتامين و 1 في المائة من البنسلين / الستربتومايسين (Gibco-Thermo Fisher Scientific ، مونزا ، إيطاليا) ، في حاضنة عند 37 درجة مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون و 20 في المائة من الغلاف الجوي للأوز والمزروعة إلى 5 ممرات في المختبر قبل استخدامها لعزل إفرازها.

4.2. التقييم الكيميائي الحيوي لأيض hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) تم استخدام الخلايا لكل تجربة. لتقييم التنفس القاعدي ، تم نفاذية hAFS بـ 0. 03 مجم / مل من الديجيتونين لمدة 10 دقائق وتعليقها في محلول ملحي للفوسفات (PBS). تمت إضافة 10 ملي بيروفات بالإضافة إلى 5 ملي مولار أو 20 ملي سكسينات لتحفيز المسار - تتكون دائمًا من المجمعات I و II و IV أو المجمعات و IV على التوالي [60].

لتقييم المساهمات النسبية لتنفس الجلوتامين وأكسدة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة والجلوكوز ، بعد نفاذية الديجيتونين ، تم تعليق الخلايا في وسط نمو و 4 ميكرومتر من BPTES و 4 ميكرومتر إيتوموكسير و 4 أمتار في المملكة المتحدة 5 {{22} } تمت إضافة 99 لتثبيط الجلوتاميناز ، أو كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز 1A (CPT1A) ، أو حامل بيروفات الميتوكوندريا (MPC) ، على التوالي. تم اكتشاف نشاط Fi-F.ATP synthase (سينسيز ATP) عن طريق قياس إنتاج ATP بواسطة طريقة luciferin / luciferase شديدة الحساسية. تم إجراء الاختبارات عند 37 درجة لمدة دقيقتين ، وتم جمع البيانات كل 3 0 ثانية. في المجموعة الأولى من التجارب ، تم تحضين خلية واحدة 0 درجة لمدة دقيقة واحدة 0 في وسط يحتوي على 50 ملي مولار بوكل ، 1 ملي ميجتا ، 2 م ميدتا ، 5 م KH2PO4 ، 2 م م جك 12،0.6 م مواباين ، 1 م م P1P 5- دي (الأدينوزين -5 ') خماسي الفوسفات ، 0.040 مجم / مل الأمبيسلين ، و 10 ملي مولار من Tris-HCl pH7.4. بعد ذلك ، تم تحفيز تخليق ATP عن طريق إضافة ركائز الجهاز التنفسي (10 مللي مولار بيروفات بالإضافة إلى 5 مللي مولار مالات أو 20 مللي مولار سكسينات) و 0.1 مللي مولار ADP. تم قياس التفاعل باستخدام مجموعة مقايسة التلألؤ البيولوجي لوسيفيرين / لوسيفيراز ATP CLSII (Roche ، بازل ، سويسرا) في مقياس Luminometer (GloMax 20/20 Luminometer ، Promega ، ميلان ، إيطاليا) تتراوح حلول ATP القياسية (روش ، بازل ، سويسرا) {{ تم استخدام 42}} / م للمعايرة. في المجموعة الثانية من التجارب ، تم تقييم تخليق ATP في وجود 4 uM BPTES ، أو 4 uM Etomoxir ، أو 4 uM UK 5099. في هذه الحالة ، تم حضانة 10 خلايا لمدة 10 دقائق في وسط نمو في غياب أو وجود مثبط التمثيل الغذائي ، وتم إحداث تخليق ATP باستخدام 0.1 ملي مولار من ADP. تم حساب كفاءة OxPhos (الفسفرة المؤكسدة) (نسبة P / O) على أنها النسبة بين تركيز ATP المنتج وكمية الأكسجين المستهلك في وجود الركيزة التنفسية و ADP. عندما يتم تخصيص استهلاك الأكسجين بالكامل لإنتاج الطاقة ، يجب أن تكون نسبة P / O حوالي 2.5 و 1.5 بعد إضافة البيروفات بالإضافة إلى المالات أو السكسينات ، على التوالي [48] لتقييم مساهمة التحلل اللاهوائي في التمثيل الغذائي لـ hAFS ، تم تقييم تركيزات الجلوكوز واللاكتات في وسط النمو. تم تقييم استهلاك الجلوكوز عن طريق نظام اقتران هيكسوكيناز (HK) والجلوكوز -6- فوسفات ديهيدروجينيز (G6PD) ، بعد تقليل NADP عند 340 نانومتر. احتوى وسيط الفحص على 100 ملي مولار من تريس- HCl ، ودرجة الحموضة 7.4.2 ملي مولار ATP ، و 10 ملي MNADP ، و 2 ملي MMgC12 ، و 2 وحدة دولية من هكسوكيناز ، و 2 وحدة دولية من الجلوكوز -6- نازعة هيدروجين الفوسفات. تم فحص إطلاق اللاكتات بعد تقليل NAD plus عند 340 نانومتر. احتوى وسيط الاختبار على 100 ملي مولار تريس- HCl (pH8) ، و 5 ملي مولار NAD زائد ، و 1 وحدة دولية / مل من نازعة هيدروجين اللاكتات. تم تحليل العينات قبل وبعد إضافة 4 ميكروغرام من نازعة هيدروجين اللاكتات المنقى. في كلتا الحالتين ، تم تطبيع البيانات إلى رقم الخلية والتعبير عنها في شكل ملي جلوكوز / خلايا 10 درجة أو خلايا ملي مولار لاكتات / خلايا 10 درجات ، على التوالي [107].

4.3. توصيف قياس التدفق الخلوي لـ hAFS

تم فصل مائة ألف (1 0 5) خلية جنينية و p-hAFS واحتضانها باستخدام الماوس المضاد لـ CD107a-Alexa Fluor 647- والقرص المضغوط المضاد للإنسان 146- FITC- الأجسام المضادة المقترنة (eBioscience ، Thermo Fisher Scientific ، Monza ، إيطاليا). تم تقييم موت الخلايا المبرمج باستخدام FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen ، Becton Dickinson ، Mi-lan ، Italy) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم الحصول على الأحداث باستخدام فارز ومحلل BD Bioscience FACS Aria II ، المجهز ببرنامج FACS Diva (BD Bioscience ، Bec-ton Dickinson ، ميلان ، إيطاليا). تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo V9.0 (BD Bioscience ، Becton Dickinson ، Milan ، ايطاليا). 4.4 تلطيخ الشيخوخة

تم تقييم النمط الظاهري للشيخوخة من hAFS المستزرع حتى مرور 5 في الظروف القياسية في المختبر باستخدام مجموعة تلوين Senescence -Galactosidase (تقنية تشوير الخلايا ، Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية): تم إصلاح f-hand p-hAFS بمحلول مثبت 1x بنسبة 70 بالمائة التقاء وملطخ لـ SA - - غال عند 37 درجة بين عشية وضحاها ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم الحصول على أحداث Senescent على مجهر Leica DMil (المجهز ببرنامج Leica Acquire V3.4.4 ، Leica Microsystems ، ميلان ، إيطاليا) وتم تقييمها كنسبة مئوية من الخلايا الإيجابية (SA) - - على إجمالي الخلايا لكل حقل.

4.5 فصل وتركيز الكسور السرية hAFS

تمت تربية f-hAFS و p-hAFS لمدة 24 ساعة في وسط خالٍ من المصل (SF) في 1 في المائة من نقص الأكسجة O2 مقابل 20 في المائة من O2 normoxia (التحكم) ، والتي تم استخدام الأخير منها كمرجع أساسي. تم استخدام استراتيجية الشرط المسبق هذه لتعزيز إطلاق عوامل الباراكرين النشطة بيولوجيًا ، كما ذكرنا سابقًا [34،35،37،49]. تمت تربية hAFS لمدة 24 ساعة في وسط خالٍ من المصل (SF) (متوسط ​​نسبة الجلوكوز Dulbecco's Modified Eagle's Medium ، DMEM ، مع 1 بالمائة L-glutamine و 1 بالمائة من البنسلين / الستربتومايسين ، كلها من Gibco-Thermo Fisher Scientific ، مونزا ، إيطاليا) ، تحت نورموكسيك (20 بالمائة O2 و 5 بالمائة CO2 عند 37 درجة) أو ناقص الأكسجين (1 بالمائة O2 و 5 بالمائة CO2 عند 37 درجة في حاضنات CellXpert C170i و Galaxy 48R CO2 ، من إيبندورف ، ميلان ، إيطاليا).

تم جمع f-hAFS-CM و p-hAFS-CM وطردهما عند 4 درجات عند 3 0 0x g لمدة 10 دقائق و 2 000 × جم لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية ؛ تم تركيز hAFS-CM باستخدام أغشية الترشيح الفائق بقطع انتقائي 3 كيلو دالتون (Amicon Ultra -15 ، Merck Millipore Darmstadt ، ألمانيا) عند 4 درجات عند 3 000 × جم لمدة 90 دقيقة ثم تم التركيز بشكل أكبر عند 4 درجة عند 3 000 × جم لمدة 30 دقيقة. تم فصل hAFS-EVs وتركيزها عن طريق الطرد المركزي الفائق التسلسلي من hAFS-CM. باختصار ، تم جمع hAFS-CM وطرده عند 4 درجات عند 300 × جم لمدة 10 دقائق ، و 2000 × جم لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية. تمت معالجة المادة الطافية بعد ذلك عند 10000 × جم لمدة 40 دقيقة. تم التخلص من الحبيبات وتمت معالجة المادة الطافية بشكل إضافي عن طريق الطرد المركزي الفائق في Optima L -90 K (Beckmann Coulter ، ميلان ، إيطاليا) عند 10000 × جم لمدة 120 دقيقة باستخدام دوارات Beckman Coulter ذات الدلو المتأرجح SW55Ti. تم غسل الحبيبات المحتوية على hAFS-EVs غير المتجانسة في برنامج تلفزيوني مع الطرد المركزي النهائي عند 100000 × جم لمدة 120 دقيقة ثم أعيد تعليقها في برنامج تلفزيوني تم ترشيحه باستخدام غشاء مرشح مسامي 0.22 ميكرومتر. تم قياس تركيزات البروتين في hAFS-CM وعلى سطح hAFS-EVs باستخدام مقايسة حمض BiCinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific ، Monza ، إيطاليا). تم الحصول على عينات من Gen5 Microplate Reader عند 570 نانومتر لتقييم إنتاج hAFS-CM و hAFS-EVs من حيث ug من المحلول / 10 درجة من الخلايا المنتجة.

4.6 توصيف hAFS-EVs عن طريق التحليل المجهري الإلكتروني للإرسال وتحليل تتبع الجسيمات النانوية

تم إجراء تحليل المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) على مجهر Hitachi TEM (سلسلة HT78 0 0 ، Hitachi High Technologies ، مونزا ، إيطاليا). تم التقاط الصور الرقمية بكاميرا Mega view 3 وبرنامج Radius (EMSIS ، Muenster ، ألمانيا). تم إصلاح f-hAFS و p-hAFS في محلول بارافورمالدهيد (PA) بنسبة 3.7 في المائة مخفف بنسبة 1: 1 مع وسط كامل hAFS ، وغسله 0. 0.1 M كاكوديلات عازلة تحتوي على 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد (علم الميكروسكوب الإلكتروني ، هاتفيلد ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تثبيت كريات الخلايا لاحقًا في رابع أكسيد الأوزميوم من أجل lh وفي محلول أسيتات اليورانيل بنسبة 1 في المائة لمدة ساعة واحدة. تم تجفيف العينات لمدة 24 ساعة عند 42 درجة و 48 ساعة عند 60 درجة من خلال سلسلة إيثانول متدرجة ومضمنة في راتنجات الايبوكسي (Poly-Bed ؛ Polysciences Europe GmbH ، Minneapolis ، Germany). تم قطع المقاطع الرقيقة (50 نانومتر) باستخدام مشراح Leica Ultracut (Leica Microsystems ، ميلان ، إيطاليا) وتمت مواجهتها باستخدام 5 بالمائة من أسيتات اليورانيل في محلول إيثانول بنسبة 50 بالمائة. تم تعليق f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs في 20 ميكروليتر من محلول PBS وتثبيتها عن طريق إضافة حجم متساوٍ من 2 في المائة لامتصاص العرق في محلول عازل فوسفات 0.1 مولار (الرقم الهيدروجيني 7.4). تم بعد ذلك امتزاز المركبات الكهربائية لمدة 10 دقائق على شبكات النحاس المطلية بالكربون فورمارفار عن طريق تعويم الشبكات على 5 ميكرولتر قطرات على بارافيلم. بعد ذلك ، تم شطف الشبكات ذات المركبات الكهربائية الملتصقة في برنامج تلفزيوني وتلطيخها سلبًا بواسطة محلول أسيتات اليورانيل بنسبة 2 في المائة لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم دمج الشبكات الملطخة في 2.5 بالمائة ميثيل سلولوز لتحسين الحفظ وتجفيف الهواء قبل الفحص. تم قياس تحليل مورفومتري لـ hAFS-EVs على 10 صورة مجهرية تم التقاطها عشوائيًا عند 40. 000 × g تكبير. تم حساب الحجم باستخدام وظيفة الخط التعسفي المضمنة في مربع حوار القياس لبرنامج Radius (EMSIS ، Muenster Germany). لتصور توزيع حجم hAFS-EVs ، تم رسم النتائج على شكل مخطط نقطة مبعثر وكتوزيع تردد يتم فيه تمثيل كل حجم كنقطة جنبًا إلى جنب مع خطوط القيمة المتوسطة والنطاق.

تم أيضًا تحليل f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs بواسطة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لتقييم الجسيمات الصادرة عن خلايا 10 درجات. تم تخفيف hAFS-EVs بنسبة 1: 100 في محلول PBS وتم الحصول عليها على NanoSight LM10 (Malvern Instruments ، Malvern ، المملكة المتحدة) التي سجلت على الأقل 3 إطارات مختلفة كل منها 60 ثانية. تم تحليل ثلاث عمليات اقتناء مختلفة لكل عينة باستخدام خيار عملية الدُفعات في البرنامج. 4.7. تحليل LC-MS / MS لـ hAFS-CM و hAFS-EVs 4.7.1. الهضم داخل الحل

تم إجراء التحليل البروتيني على 3 مكررات بيولوجية من hAFS-CM و hAFS. EVs من f-hAFS و p-hAFS بعد التكييف المسبق المعياري أو ناقص التأكسج (n {4}} ظروف مختلفة). تم تعليق عينات hAFS-CM و hAFS-EVs في 0. 1 مليون NHCO3 درجة الحموضة 7.9 وتم معالجتها باستخدام RapigestIM كاشف SF (Waters Co ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) بتركيز نهائي قدره 0. 25 بالمائة (وزن / حجم). تم تحضين المعلقين الناتج أثناء التقليب عند 1 0 0 درجة لمدة 2 {{4 0} دقيقة. تم إجراء عملية الهضم على كل عينة عن طريق إضافة التربسين المعدل بالتسلسل (Promega Inc ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية) بنسبة إنزيم / ركيزة تبلغ 1:50 (وزن / وزن) طوال الليل عند 37 درجة في 0.1 متر NH4HCO3 pH7.9 تمت إضافة كمية إضافية من التربسين (1: 100 وزن / وزن) في الصباح ، واستمر الهضم لمدة 4 ساعات. علاوة على ذلك ، أدت إضافة 0.5 في المائة من حمض التريفلوروأسيتيك (TFA) Gigma-Aldrich Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى إيقاف التفاعل الإنزيمي ، وأكملت الحضانة اللاحقة عند 37 درجة لمدة 45 دقيقة التحلل المائي لحمض RapiGest [108]. تمت إزالة منتجات التحلل غير القابل للامتزاج بالماء بواسطة الطرد المركزي عند 13. 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. أخيرًا ، تم تحلية مخاليط الخلطة التربينية باستخدام أعمدة دوران PierceTM C -18 (Thermo Fisher Scientific ، Monza ، إيطاليا) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة ، وتم تعليقها في 0.1 بالمائة من حمض الفورميك (Sigma-Aldrich Inc.، St Louis ، MO ، USA) في الماء (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM ، Honeywell Riedel-de HaenTM ، Muskegon ، MI ، الولايات المتحدة الأمريكية) بتركيز 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر.

4.7.2. الكروماتوغرافيا السائلة

تم تحليل مخاليط التربسين المهضومة عن طريق منصة تتكون من نظام كروماتوجرافي سائل نانو ، نظام Eksigent nanoLC-Ultra [2] ثنائي الأبعاد (Eksigent ، جزء من AB SCIEX Dublin ، دبلن ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم تكوينه في وضع trap-elute ، إلى جانب مطياف الكتلة عالي الدقة. باختصار ، تم تحميل العينات (0. 8 ميكروغرام محقونة) أولاً على مصيدة ببتيد (2 0 0 um × 5 0 0 um ChromXP C 18- CL ، 3 um ، 120 A) وغسلها بمضخة التحميل التي تعمل في وضع متساوٍ مع حمض الفورميك بنسبة 0.1 بالمائة في الماء لمدة 10 دقائق بتدفق 3 ميكرولتر / دقيقة. ثم أدى التبديل التلقائي للصمام ذي العشرة منافذ إلى تصفية الخليط المحاصر على عمود طور معكوس بالنانو (75 ميكرون × 15 سم ChromXP C 18- CL ، 3 um ، 120 A) من خلال تدرج 150 دقيقة من eluent B (eluent A ، 0.1٪ حمض الفورميك في الماء ؛ eluent B ، 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل) بمعدل تدفق 300 نيوتن / دقيقة. بالتفصيل ، كان التدرج: من 5-10 بالمائة Bin 3min ، 10-40 بالمائة Bin 130min ، 40-95 بالمائة Bin 10 min والاحتفاظ عند 95 بالمائة B لمدة 7 دقائق. 4.7.3 قياس الطيف الكتلي

تم إجراء تحليلات MS / MS على مطياف الكتلة LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific ، Monza ، إيطاليا) مجهزًا بمصدر أيون نانوسراي. تم ضبط الجهد الشعري للرش على 1.7 كيلو فولت وتم تثبيت درجة حرارة الشعيرات الدموية الخاصة بنقل الأيونات عند 22 درجة {11}}. تم تسجيل أطياف MS الكاملة على مدى 400-1600 m / z في وضع الأيونات الموجبة ، مع قوة حل تبلغ 60000 (عرض كامل بنصف الحد الأقصى) ومعدل مسح 2 طيف / ثانية. أعقب هذه الخطوة خمسة أحداث MS / MS منخفضة الدقة تم إنشاؤها بالتتابع بطريقة تعتمد على البيانات على الأيونات الخمسة الأولى المختارة من طيف MS الكامل (عند طاقة تصادم 35 بالمائة) ، باستخدام الاستبعاد الديناميكي 0.5 دقيقة لـ تحليل MS / MS. تم التحكم في وظائف مسح مطياف الكتلة وتدرجات المذيبات اللوني السائل عالية الأداء بواسطة نظام بيانات Xcalibur الإصدار 1.4 (Thermo Fisher Scientific ، Monza ، إيطاليا).

4.7.4 معالجة البيانات البروتينية واستخراج البيانات

تم البحث في جميع البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام محرك بحث Sequest HT المتضمن في الإصدار 2.1 من برنامج Thermo Scientific Proteome Discoverer. تم ربط أطياف MS / MS التجريبية بتسلسل الببتيد التجريبي بالمقارنة مع أطياف الكتلة النظرية التي تم الحصول عليها في عملية الهضم السيليكو لقاعدة بيانات بروتين Uniprot Homo Sapiens (746 0 0 إدخالات) ، تم تنزيلها في 2 يناير 0 2 0 (www.uniprot.org ، تم الدخول إليه في 1 0 2 آذار (مارس) 0 21). تم استخدام المعايير التالية لتحديد تسلسل الببتيد والبروتينات ذات الصلة: التربسين كإنزيم ، وثلاثة انقسامات مفقودة لكل ببتيد ، وتحمل كتلة ± 50 جزء في المليون لأيونات السلائف ، و ± 0.8 دا للأيونات الشظوية. تم استخدام عقدة بيركولاتور مع استراتيجية شرك الهدف لإعطاء معدل اكتشاف خاطئ نهائي (FDR) عند مستوى مطابقة طيف الببتيد (PSM) يبلغ 0.01 (صارم) بناءً على قيم q ، مع الأخذ في الاعتبار الحد الأقصى لـ deltaCN وهو 0.05 [109]. تم النظر فقط في الببتيدات ذات الحد الأدنى لطول الببتيد ستة أحماض أمينية والرتبة الأولى. تم تطبيق مجموعات البروتين ومبادئ البخل الصارمة. تم إيداع بيانات MS في ProteomeXchange Consortium عبر مستودع شريك PRIDE [10] (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/ ، تم معالجته في 10 مارس 2021) تمت محاذاة وتطبيع 48 بروتينًا تم الحصول عليها من خوارزمية SEQUEST ، وخالية من الملصقات مقارنة. تم استخدام خوارزمية داخلية ، وهي خريطة البروتين الخوارزمية متعددة الأبعاد (MAProMa) لهذا الهدف ، باستخدام متوسط ​​مطابقات طيف الببتيد (aPSM) [111،112] الذي يتوافق مع متوسط ​​جميع الأطياف المحددة للبروتين ، وبالتالي إلى وفرتها النسبية في كل حالة تم تحليلها. في العمق ، لاختيار البروتينات المعبر عنها تفاضليًا ، تمت مقارنة المجموعات الفرعية (لكل من الجنين - مقابل الفترة المحيطة بالولادة - hAFS-CM و hAFS-EVs ، مع الأخذ في الاعتبار أيضًا تحفيز التكييف المسبق للخلايا ناقصة التأكسج) ، عن طريق تطبيق عتبة 0.4 و 5 على اثنين من MAProMa فهارس DAve (المتوسط ​​التفاضلي) و DCI (مؤشر الثقة التفاضلية) ، على التوالي. تم تعريف DAve ، الذي يقيم التغييرات في تعبير البروتين ، على أنه (XY) / (X ＋ Y) /0.5 ، بينما تم تعريف DCI الذي يقيم ثقة التعبير التفاضلي على أنه (X plus Y) × (XY) / 2 X و Y تمثل المصطلحات PSM لبروتين معين في عينتين مقارنة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إخضاع متوسط ​​قوائم البروتين ، التي تم الحصول عليها من كل حالة تم فحصها ، لتحليل التمييز الخطي (LDA) ، والبروتينات ذات نسبة F الأكبر (أكبر من أو تساوي 4.5) وأصغر قيمة p (أقل من أو يساوي 0.001) من خلال التجميع الهرمي ، وتطبيق طريقة وارد ومقياس المسافة الإقليدية باستخدام برنامج JMP 15.2. على وجه التحديد ، تمثل نسبة F نموذج متوسط ​​المربع مقسومًا على مربع متوسط ​​الخطأ ، بينما تشير القيمة p إلى احتمال الحصول على قيمة F أكبر من تلك المحسوبة إذا لم يكن هناك فرق في الواقع بين متوسط ​​مجموعة السكان. 4.8 التنميط السيتوكيني والكيموكيني لـ hAFS-CM و have-EVs

التنميط الخلوي والكيموكيني لـ hAFS-CM و have-EVs التي تم الحصول عليها بواسطة f-hAFS و p-hAFS بعد تقييم التكييف المسبق لنقص التأكسج عن طريق مجموعة Proteome Profiler TM Human XL Cytokine Array (نظام البحث والتطوير ، مينيابوليس ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لـ تعليمات الشركة الصانعة. تم استخدام عشرين ميكروغرام من عينات hAFS-CM و hAFS-EVs. تم الحصول على صور الأغشية بواسطة Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge ، المملكة المتحدة) تم تقييم محتوى السيتوكين / chemokine المحدد من خلال القياس الكمي لشدة البكسل الإيجابية (عن طريق الوحدة التعسفية) لكل سيتوكين يمكن اكتشافه باستخدام برنامج ImageJ (متاح على https: //imagej.nih.gov/ij/ ، تم الحصول عليها في 10 مارس 2021 [13]). 4.9 استخراج الحمض النووي الريبي من hAFS-EVs والتالي

تسلسل الجيل

تم عزل الحمض النووي الريبي من f-hAFS-EVs و p-have-EVs باستخدام miRNeasy Micro Kit (Qiagen ، ميلان ، إيطاليا) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تقييم تكامل الحمض النووي الريبي وتوزيع الحجم باستخدام Agilent Small RNA Kit مع شريحة RNA صغيرة غير مشفرة من أجل تقييم محتوى RNAs الصغيرة التي تتراوح من 6 إلى 150 نيوكليوتيد (nt). تم استخدام مجموعة Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific ، Monza ، إيطاليا) لقياس محتوى microRNA (miRNAs) ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم إعداد مكتبات تسلسل miRNA وتضخيمها باستخدام مجموعة مكتبة QIAseq miRNA (Qiagen ، ميلان ، إيطاليا) باستخدام 18.5ng من miRNAs المعزولة كمدخلات واتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم تجميع المكتبات بعد إجراء فحص الجودة والتقدير الكمي بواسطة TapeStation (Agilent Technologies ، Foster City ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. تم تقييم المكتبات المجمعة لمراقبة الجودة عن طريق qPCR في الوقت الفعلي باتباع دليل "مكتبة التسلسل الكمي qPCR" (Illumina Inc ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم ترتيبها بواسطة منصة Illumina NextSeq باستخدام High Output Hit v2.5 (75 دورة) ( شركة Illumina ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء الاتصال الأساسي باستخدام سير عمل Illumina NextSeq500 الافتراضي.

4.10. تحليل البيانات المعلوماتية الحيوية لتسلسل ميرنا

تمت معالجة ملفات Fastq أولاً عن طريق قطع المهايئ 3 'والقواعد منخفضة الجودة باستخدام Cutadapt [114]. بعد التشذيب ، تم تحديد تسلسل الإدراج وتسلسل UMI. يقرأ بدون تسلسل محول ، ويقرأ مع أقل من 16 تسلسل إدراج bp ، ويقرأ مع أقل من 10 bp تم تجاهل تسلسل UMI. لتوضيح تسلسل الإدخال ، تمت محاذاة القراءات مع مجموعة الجينوم البشري GRCh38 باستخدام Bowtie [15] لكل عينة ، تم حساب جميع القراءات المخصصة لميرنا معين ، وتم تجميع وحدات UMI المرتبطة لحساب الجزيئات الفريدة. تم إجراء التحليل الثانوي بواسطة نصوص R مخصصة متاحة بناءً على طلب معقول. تم إجراء تحليل التخصيب التفاضلي باستخدام حزم Limma [116] و EdgeR Bioconductor [117].

4.11. تحاليل احصائية

يتم تقديم النتائج على أنها متوسط ​​± نصف من ثلاث ({0}) تجارب مستقلة على الأقل. تم رسم المقارنات بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لـ Tukey بعد الاختبار أو اختبار الطالب t. تم إجراء التحليلات باستخدام Graph-Pad Prism الإصدار 8.0.2 (برنامج GraphPad ، https://www.graphpad.com ، تم الوصول إليه في 10 مارس 2021) مع تعيين دلالة إحصائية عند * p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

في الختام ، تم العثور على hAFS الجنين والفترة المحيطة بالولادة مكافئًا ظاهريًا مع فعالية إفرازية مماثلة وإثراء EV في الحجم والتوزيع ؛ ومع ذلك ، يمكن تقدير بعض الفروق في ملف تعريف Secretome الخاص بهم. على وجه التحديد ، يمكن إعادة تلخيص المظهر الجانبي غير الناضج لنمو hAFS الجنيني من خلال تركيباتها الإفرازية الممنوحة بإفرازات مؤيدة للأوعية أكثر وضوحًا ومؤيدة للتجدد وتجديد الشباب. ومع ذلك ، لا يزال hAFS في الفترة المحيطة بالولادة يحتفظ بملف paracrine ذي صلة من خلال التعبير عن العوامل المتعلقة بهجرة الخلايا البطانية ، وإمكانات تعديل المناعة ، والمضادة للالتهابات ، والتغذية العصبية المشابهة لـ hAFS الجنين. قد توفر هذه النتائج رؤى مفيدة تدعم العلاج الباراكرين في المستقبل للأمراض المرتبطة بالإصابة والالتهابات / الإقفارية. لذلك ، يجب تقييم اختيار hAFS الجنيني أو في الفترة المحيطة بالولادة باعتباره المصدر الأكثر مثالية للخلايا مع الأخذ في الاعتبار السيناريو السريري المحدد.

تم استخراج هذه المقالة من Int. J. مول. علوم. 2021 ، 22 ، 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms