تحليلات البروتيوميات والسيتوكينات تميز حالات التهاب الدماغ والنخاع العضلي/متلازمة التعب المزمن عن الضوابط الجزء الأول

خلاصة

خلفيةالتهاب الدماغ والنخاع العضلي / متلازمة التعب المزمن (ME / CFS) هو مرض معقد وغير متجانس يتميز بالتعب المستمر غير المبرر وميزات أخرى بما في ذلك الضعف الإدراكي، وألم عضلي، والشعور بالضيق بعد الجهد، وخلل في الجهاز المناعي. السيتوكينات موجودة في البلازما ومغلفة في الحويصلات خارج الخلية (EVs)، ولكن لم يكن هناك سوى عدد قليل من التقارير عن خصائص EV والبضائع في ME/CFS. سبق أن وصفت العديد من الدراسات الصغيرة بروتينات البلازما أو مسارات البروتين المرتبطة بـ ME/CFS.

يمكن أن يعمل Cistanche كمضاد للتعب ومعزز للقدرة على التحمل، وقد أظهرت الدراسات التجريبية أن مغلي Cistanche tubulosa يمكن أن يحمي بشكل فعال خلايا الكبد والخلايا البطانية التالفة في الفئران الحاملة للوزن، وينظم التعبير عن NOS3، ويعزز الجليكوجين الكبدي. التوليف، وبالتالي ممارسة فعالية مضادة للتعب. يمكن لمستخلص Cistanche tubulosa الغني بالفينيليثانويد أن يقلل بشكل كبير من مستويات الكرياتين كيناز في الدم، ونازعة هيدروجين اللاكتات، ومستويات اللاكتات، ويزيد من مستويات الهيموجلوبين (HB) والجلوكوز في الفئران ICR، وهذا يمكن أن يلعب دورًا مضادًا للإرهاق عن طريق تقليل تلف العضلات. وتأخير تخصيب حامض اللبنيك لتخزين الطاقة في الفئران. تعمل أقراص Cistanche Tubulosa على إطالة وقت السباحة مع تحمل الوزن بشكل ملحوظ، وزيادة احتياطي الجليكوجين الكبدي، وانخفاض مستوى اليوريا في الدم بعد التمرين في الفئران، مما يظهر تأثيره المضاد للتعب. يمكن لمغلي Cistanchis تحسين القدرة على التحمل وتسريع القضاء على التعب في ممارسة الفئران، ويمكن أيضًا أن يقلل من ارتفاع كيناز الكرياتين في الدم بعد تمرين التحميل والحفاظ على البنية التحتية للعضلات الهيكلية للفئران طبيعية بعد التمرين، مما يشير إلى أن له تأثيرات. لتعزيز القوة البدنية ومكافحة التعب. كما أدى Cistanchis أيضًا إلى إطالة فترة بقاء الفئران المسمومة بالنتريت بشكل ملحوظ وعزز القدرة على التحمل ضد نقص الأكسجة والتعب.

انقر على التعب الشديد

لماذا سنتعب؟ كيف يمكننا حل مشاكل التعب؟

【الاتصال】البريد الإلكتروني: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501

طُرققمنا بإعداد حويصلات خارج الخلية (EVs) من عينات البلازما المجمدة من مجموعة من حالات التهاب الدماغ والنخاع العضلي / متلازمة التعب المزمن (ME / CFS) وضوابطها مع بيانات السيتوكينات البلازمية وبروتينات البلازما المنشورة مسبقًا. تم تحديد محتوى السيتوكين في الحويصلات خارج الخلية المشتقة من البلازما عن طريق اختبار متعدد وتم تقييم الاختلافات بين المرضى والضوابط. قمنا بعد ذلك بإجراء تحليلات إحصائية متعددة الأوميات لم تأخذ في الاعتبار هذه البيانات الجديدة فحسب، بل أيضًا البيانات السريرية الشاملة التي تصف صحة الأشخاص.

نتائجفي حالات ME/CFS أظهرت حجمًا وتركيزًا أكبر للمركبات الكهربائية في البلازما. كشفت فحوصات محتوى السيتوكين في المركبات الكهربائية أن IL2 كان أعلى بكثير في بعض الحالات. لاحظنا ارتباطات عديدة بين السيتوكينات EV، وسيتوكينات البلازما، وبروتينات البلازما من بروتينات قياس الطيف الكتلي. تشير الارتباطات الكبيرة بين البيانات السريرية ومستويات البروتين إلى أدوار بروتينات ومسارات معينة في المرض. على سبيل المثال، ارتبطت المستويات الأعلى من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات، عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة وحيدة الخلية (CSF2) وعامل نخر الورم (TNF) مع زيادة الأعراض الجسدية والتعب في حالات ME/CFS. ارتبط ارتفاع بروتياز سيرين SERPINA5، والذي يشارك في الإرقاء، بارتفاع درجات الصحة العامة SF-36 في ME/ CFS. تمكنت مصنفات التعلم الآلي من تحديد قائمة مكونة من بروتينين0 يمكنهما التمييز بين الحالات والضوابط، مع توفير XGBoost أفضل تصنيف بدقة 86.1% وقيمة AUROC تم التحقق من صحتها بقيمة { {15}}.947. ميزت Random Forest الحالات عن الضوابط بدقة 79.1% وقيمة AUROC تبلغ 0.891 باستخدام 7 بروتينات فقط.

الاستنتاجاتتضيف هذه النتائج إلى العدد الكبير من الاختلافات الموضوعية في الجزيئات الحيوية التي تم تحديدها لدى الأفراد الذين يعانون من ME/CFS. الارتباطات الملحوظة للبروتينات المهمة في الاستجابات المناعية والإرقاء مع البيانات السريرية تشير أيضًا إلى حدوث اضطراب في هذه الوظائف في ME / CFS.

الكلمات الدالةالتهاب الدماغ والنخاع العضلي/متلازمة التعب المزمن، الحويصلات خارج الخلية، البلازما، البروتينات، السيتوكينات

خلفية

التهاب الدماغ والنخاع العضلي/متلازمة التعب المزمن (ME/CFS) هو مرض خطير يمكن تشخيصه بعد 6 أشهر من التعب المنهك الجديد، والشعور بالضيق بعد الجهد، والنوم غير المنعش، وأحد أو كليهما من الأعراض الإضافية، صعوبة إدراكية أو عدم تحمل الانتصابي. 1]. أفاد معظم المرضى أن أعراضهم نشأت بعد مرض فيروسي، لكن هوية العدوى السابقة تكون دائمًا غير معروفة تقريبًا، على الرغم من أن عائلة الفيروسات المعوية متورطة في بعض الأحيان [2، 3]. قبل عام 2020، قُدر أن 65 مليون فرد في جميع أنحاء العالم يعانون من متلازمة التعب المزمن/متلازمة التعب المزمن [4]. منذ انتشار جائحة SARS-COV2، ظلت مجموعة فرعية من الأفراد الذين عانوا من فيروس كورونا الحاد-19 يعانون من الأعراض [5]، وبعض ضحايا فيروس كورونا طويل الأمد-19 يستوفون تشخيص ME/CFS المعايير الموضحة أعلاه [6]. وبالمثل، فإن الأفراد الذين يعانون من مرض حرب الخليج لديهم أعراض تتداخل مع كل من مرض كوفيد الطويل الأمد ومتلازمة التعب المزمن/متلازمة التعب المزمن [7]. ومع ذلك، فإن العديد من الاختبارات، مثل التصوير العصبي [8]، تميز بين مرض حرب الخليج ومتلازمة التعب المزمن/متلازمة التعب المزمن. ما إذا كان فيروس كورونا الطويل ومتلازمة التعب المزمن/متلازمة التعب المزمن غير المرتبطين بعدوى السارس-CoV-2 سيتم تمييزهما بالمثل من خلال التصوير أو تدابير أخرى غير معروف حتى الآن.

تم الإبلاغ عن إثراء البروتينات المرتبطة بجهاز المناعة الفطري والمشاركة في السلسلة التكميلية وكذلك في المسارات المتعلقة بإشارات الدوبامين لدى مرضى ME/CFS مقارنةً بالضوابط في الدراسات التي تحلل السائل النخاعي [9, 10 ]. من خلال تحليل قياس الطيف الكتلي للبلازما، تم الإبلاغ أيضًا عن خلل في تنظيم الطاقة والدهون واستقلاب الأحماض الأمينية في ME/CFS [11-13]. ولكن في الآونة الأخيرة، حدد تحليل بروتينات البلازما المرتبطة بـ ME/CFS باستخدام تحليل كروماتوجرافي سائل فائق الأداء غير مستهدف - قياس الطيف الكتلي جنبًا إلى جنب، ملفات تعريف مختلفة بين مرضى ME/CFS، بالإضافة إلى مجموعات فرعية من ME/CFS (مع أو بدون IBS)، وعناصر التحكم و مجموعة من البروتينات التي قد تتنبأ بحالة ME/CFS بدرجة عالية من الدقة بشكل معقول (المنطقة تحت المنحنى (AUC)=0.774–0.838) [14].

من المعروف أن الوظيفة المناعية والاستجابات الالتهابية يتم تنظيمها بواسطة السيتوكينات التي تعمل كمعدلات وأن إفرازها يمكن أن يحدث بطريقة إفراز كلاسيكية أو عن طريق التغليف في الحويصلات خارج الخلية، مما يحميها من الإنزيمات المهينة [15]. تعد المركبات الكهربائية أحد المشاركين الرئيسيين في الاتصال من خلية إلى أخرى وتؤدي إلى أمراض الالتهابات والمناعة الذاتية والأمراض المعدية [16-19] وقد أظهرت التقارير السابقة زيادة في أعداد المركبات الكهربائية المنتشرة، ليس فقط في حالات السرطان ومرض الزهايمر [17، 20–22]، ولكن أيضًا في ME/CFS [23–25]. تمكنت دراسة حديثة أجريت على EVs المعزولة من مرضى ME/CFS ومن الأشخاص الذين يعانون من التعب المزمن مجهول السبب والاكتئاب السريري من التمييز بين المجموعتين مع AUC يبلغ 0.802 فقط باستخدام أرقام EV المنتشرة، مما سمح بالتشخيص الصحيح في 90-94٪ من المرضى. حالات ME/CFS [24].

هناك حاجة ماسة إلى مزيد من التوصيف الجزيئي لـ ME/CFS لتقديم نظرة ثاقبة للاضطرابات التي تحدث في المرض. تتمتع الدراسات متعددة الأوميات التي يتم إجراؤها على نفس المجموعة من الموضوعات بإمكانية عالية لتقديم فرضيات جديدة. علاوة على ذلك، فإن القدرة على التمييز بين الأشخاص الذين يعانون من ME/CFS والضوابط الصحية بحساسية وخصوصية عالية من شأنها أن تسمح بمراقبة تأثير العلاجات التجريبية. سيكون استخدام عينات الدم لتقييم التشوهات المرتبطة بـ ME/CFS ذا قيمة خاصة بالمقارنة مع الطرق الأكثر تدخلاً أو مرهقة.

في هذه الدراسة، قمنا بعزل الحويصلات خارج الخلية (EVs) من عينات الدم التي تم جمعها قبل عام 2020 من الأشخاص الذين يعانون من ME/CFS والضوابط الصحية وقاسنا محتوى السيتوكينات فيها. تم استخدام هذه البيانات التي تم إنشاؤها حديثًا بالإضافة إلى البيانات المنشورة بالفعل من التحليل البروتيني للبلازما لقياس الطيف الكتلي [14] وتحديد مستويات السيتوكينات في البلازما [26] على نفس العينات معًا لإجراء تحليلات إحصائية متعددة. لقد حددنا مجموعة من السيتوكينات EV التي تختلف بشكل كبير في المستويات بين الأشخاص وعناصر التحكم في ME/CFS. لاحظنا الارتباطات بين مستويات السيتوكينات EV المختلفة، وبين مستويات السيتوكينات البلازما، بين السيتوكينات EV والسيتوكينات البلازما، وبين السيتوكينات وبروتينات البلازما الأخرى. اكتشفنا أيضًا العلاقات بين السيتوكينات البلازمية وشدة بعض أعراض ME/CFS. في الضوابط، كانت مستويات أربعة بروتينات البلازما مرتبطة بالتدابير الصحية. ارتبط البروتين المتورط في عملية الإرقاء، SERPINA5، بشكل إيجابي مع درجات وظيفة SF-36 الأعلى. باستخدام التعلم الآلي، حددنا البروتينات العشرين ذات أعلى قيم أهمية للميزات. باستخدام هذه التحليلات العشرين وXGBoost، يمكننا التمييز بين ME/CFS وموضوعات التحكم بحساسية وخصوصية عالية للغاية (AUC=0.947).

طُرق

دراسة السكان

تم تحليل مجموعة سكانية فرعية مكونة من 49 حالة من حالات ME/CFS و49 من الضوابط الصحية من مجموعة مبادرة التعب المزمن [27] في إطار هذه الدراسة الحالية. استوفت جميع الحالات معايير مركز السيطرة على الأمراض في فوكودا لعام 1994 [28] و/أو معايير الإجماع الكندية لعام 2003 الخاصة بـ ME/CFS [29]. في يوم جمع الدم، تم تقييم الأعراض السريرية والحالة الصحية الأساسية باستخدام النموذج القصير 36 للمسح الصحي (SF-36) ​​[30] ومقياس جرد التعب متعدد الأبعاد (MFI) [31]. تم سحب الدم المحيطي في أنابيب تحضير الخلايا BD VacutainerTM من سيترات الصوديوم وتم طرده بالطرد المركزي لتكوير خلايا الدم الحمراء. تم استلام عينات البلازما الناتجة من أربعة مواقع من الأطباء المشرفين كما هو موضح: مدينة سولت ليك، يوتا (لوسيندا بيتمان)، قرية إنكلاين، نيفادا (دانيال بيترسون)، ميامي، فلوريدا (نانسي كليماس)، ومدينة نيويورك، نيويورك (سوزان ليفين) ويتم تخزينه عند - 80 درجة ويتم شحنه من جامعة كولومبيا إلى جامعة كورنيل على الثلج الجاف وتخزينه عند - 80 درجة قبل المعالجة لعزل الحويصلات خارج الخلية. تم الحصول على موافقة كتابية من جميع المشاركين وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في مركز إيرفينغ الطبي بجامعة كولومبيا.

تنقية الحويصلات خارج الخلية

تم عزل الحويصلات خارج الخلية (EVs) من عينات البلازما عن طريق الترسيب باستخدام كاشف ExoQuick ™ (System Biosciences، Palo Alto، CA، USA) كما هو موضح سابقًا [25]. باختصار، تم إذابة عينات البلازما من كل موضوع على الجليد وطردها عند 3000 × جم لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة لإزالة الخلايا والحطام. تمت إضافة الثرومبين (611 وحدة / مل) (System Bioscience، Palo Alto، CA، USA) وتم تحضين العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الفيبرينوجين، وطرده عند 10،000 × جم لمدة 5 دقائق، و تم جمع طاف. تم بعد ذلك تحضين العينات باستخدام ExoQuick™ لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات، وطردها عند 12000 × جم لمدة 5 دقائق، وتم إعادة تعليق الحبيبة الناتجة في 250 ميكروليتر من محلول ملحي معقم للفوسفات 1X، ودرجة الحموضة 7.4. تم قسامة العينات لتقدير كمية السيتوكينات/الكيموكينات وعوامل النمو.

حجم وكمية الحويصلات خارج الخلية

تم تقييم تركيز وتوزيع حجم المركبات الكهربائية المعزولة في عينات باستخدام أداة NanoSight NS300 (Malvern، Worcestershire، UK) في مرفق كورنيل للعلوم والتكنولوجيا بمقياس النانو. تمت إذابة العينات وتخفيفها إلى 1: 2000 في PBS 1X وتم حقن 1 مل من خلال غرفة الليزر (NanoSight Technology، لندن، المملكة المتحدة). تم الحصول على تسجيلات شجرة لـ 60 مقطع فيديو رقمي لكل عينة وتحليلها بواسطة برنامج NanoSight NTA 2.3 لتحديد حجم وتركيز الجسيمات النانوية. تم حساب متوسط ​​النتائج معًا.

التنميط المناعي للبلازما والحويصلات خارج الخلية

تم قياس الجزيئات المناعية في البلازما مسبقًا باستخدام اختبار مناعي 61- قائم على الخرز المغناطيسي (اختبار مناعي ProcartaTM مخصص، Affymetrix) [26]. تم إجراء التنميط المناعي للحويصلات خارج الخلية في مختبر خدمات الكيمياء الغذائية البشرية في جامعة كورنيل باستخدام مجموعة الخرز المغناطيسي 48-plex البشرية (Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel, 48-plex, Bio-Rad ). قبل التحليل، تمت معالجة عينات EV باستخدام Triton 1% للسماح بإطلاق السيتوكينات المغلفة [32]. تم قياس كل عينة في نسختين على نظام MAGPIX® Multiplexing System (شركة Luminex). لكل بئر، استخدمنا كثافة الفلورة المتوسطة لجميع الخرزات المقاسة لحليلة معينة وبلغ متوسط ​​التكرارات اثنين، وتم قبول النتائج عندما كان معامل التباين (CV) أقل من 15%.

بروتينات البلازما

تم إجراء التنميط البروتيني للبلازما في جامعة كولومبيا كما هو موضح سابقًا [14]. تم تشغيل عينات من 49 حالة ME/CFS و49 حالة تحكم مدرجة في هذه الدراسة على دفعتين من 20 عينة (11 حالة ME/CFS، 9 عناصر تحكم) و78 عينة (38 حالة ME/CFS، 40 تحكم). تم اختيار 20 عينة من الدفعة الأولى بشكل عشوائي. تمت مطابقة الحالات والضوابط على نفس المتغيرات المطابقة مثل إجمالي مجتمع الدراسة. تم قياس إجمالي 257 و279 بروتينًا مشروحًا في 20- مجموعة عينة الموضوع و78- مجموعة عينة الموضوع، على التوالي، مع تداخل 207 بروتينات مشروحة في كلتا مجموعتي العينات.

تحليل احصائي

تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام الإصدار R 4.0.2 (2020-06-22) عبر RStudio. بالنسبة لكل تحليل بروتين، تم استبدال القيم غير القابلة للاكتشاف بنصف قيمتها الدنيا. تم بعد ذلك تحويل مستويات البروتين إلى القاعدة 2 وتوحيدها لمزيد من التحليل. تم حساب درجات Z وقيم P للتحليل الخارجي. تم إجراء اختبارات رتبة موقعة ويلكوكسون غير البارامترية لاختبار أهمية الاختلافات (ص<0.05) between cases and controls for age, BMI, SF-36 survey scores, and EV sizes and concentrations. The robust linear regression was performed using the lm function in the MASS package for determining the significance of differences for each analyte in control and ME/CFS groups with age, BMI, Irritable Bowel Syndrome (IBS), and sex as confounding variables. Robust linear regression was performed to eliminate contamination with outliers or influential observations. Robust linear regression is a form of weighted least squares regression, and we chose M-estimation with Huber weighting [33, 34] for further analysis.

تم استخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA) لتبسيط البيانات وزيادة قابلية التفسير عن طريق تقليل أبعاد مجموعات بيانات مستويات البروتين. تم إجراء PCA باستخدام حزمة الإحصائيات في R. كما تم تقدير معاملات ارتباط رتبة سبيرمان ضمن تحليلات البروتين وبين البروتينات والبيانات الوصفية (العمر، مؤشر كتلة الجسم، الجنس، درجات SF-36، IBS). تم استخدام الارتباطات النقطية الثنائية عندما يكون أحد المتغيرات ثنائيًا (على سبيل المثال، أنثى مقابل ذكر، مع مقابل بدون IBS). تم ترميز المتغيرات الفئوية على النحو التالي: الفوج: التحكم =0؛ ME/ CFS=1; الجنس: أنثى =0؛ ذكر=1; القولون العصبي: لا يوجد القولون العصبي =0؛ مع القولون العصبي =1. طوال الوقت، تم تعديل جميع القيم p لفرضيات متعددة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg (FDR) [35، 36].

تم استخدام نهج التعلم الآلي لتحديد المتغيرات التي تميز مجموعتي العينات (اختيار الميزة). تم إجراء تصنيف العينات على أنها ME/CFS أو عناصر تحكم صحية باستخدام ثلاث خوارزميات تعلم خاضعة للإشراف: غابة عشوائية [37] تم تنفيذها باستخدام وظيفة R's Random Forest؛ XGBoost [38] باستخدام حزمة xgboost الخاصة بـ R وعقوبة مشغل الانكماش والاختيار الأقل (LASSO) [39] المطبقة على الانحدار اللوجستي باستخدام وظيفة R glmnet. كميزات، استخدمت الخوارزميات جميع تحليلات البروتين البالغ عددها 353، وسيتوكينات EV، وسيتوكينات البلازما، وبروتينات البلازما. تم حساب أهمية الميزة لكل مصنف. بالنسبة إلى LASSO، يتم تقليص معاملات الميزات "غير المهمة" إلى الصفر، ومن ثم يمكن تقييم أهمية الميزة من خلال "النسبة المئوية" (من أصل 250 تكرارًا عشوائيًا لإعادة التحقق من الصحة) حيث يكون تقدير معلمة المتنبئ في أفضل نموذج مناسب غير صفر. بالنسبة لمجموعة التفرعات العشوائية، فإن "متوسط ​​دقة التخفيض (MDA)" للميزة هو الانخفاض في دقة التصنيف بسبب تبديل القيم في تلك الميزة بشكل عشوائي. بالنسبة للتنبؤات غير المهمة، يجب أن يكون للتبديل تأثير ضئيل أو معدوم على دقة النموذج، في حين أن تبديل قيم المتنبئات المهمة يجب أن يقللها بشكل كبير. لذلك، كلما زادت أهمية الميزة، زاد الانخفاض في الدقة عند تبديل قيمها. أخيرًا، بالنسبة إلى XGBoost، يشير مقياس "الكسب" إلى متوسط ​​الكسب عبر جميع الأشجار التي يتم استخدام الميزة فيها، وهو ما يصف المساهمة النسبية لكل ميزة.

تم حساب أهمية الميزة بمتوسط ​​أكثر من 250 تكرارًا للتحقق المتبادل بخمسة أضعاف. تم تركيب تحليلات البروتين التي تم تصنيفها ضمن أفضل 20 تحليلًا من حيث الأهمية في جميع المصنفات الثلاثة (الجدول 5) كتنبؤات في نفس المصنفات مرة أخرى. تم حساب منحنيات خصائص تشغيل المستقبِل (ROC) والمساحة الموجودة أسفل المنحنى (AUC) المستخدمة لتحسين اختيار الميزة باستخدام علامة إقحام الحزمة R. تم تحويل البيانات وقياسها تلقائيًا قبل إنشاء منحنيات ROC. يتم استخدام عقوبة اللاسو عند اختيار العديد من المتنبئين والمتغيرات المهمة للتنبؤ. نظرًا لأننا كنا نستخدم متغيرات تم تحديدها بالفعل على أنها مهمة، فقد تم استخدام الانحدار اللوجستي غير المنظم بدلاً من عقوبة اللاسو في الشكل 8. وتم حساب متوسط ​​AUCs بـ 250 تكرارًا للتحقق المتبادل بخمسة أضعاف، والذي يهدف إلى استخلاص تقدير أكثر دقة للنموذج أداء التنبؤ. تم حساب أهمية الميزات لكل من خوارزميات التعلم الآلي الثلاث.

نتائج

دراسة الخصائص السكانية

ضمن مجتمع الدراسة، كان هناك 41 أنثى و8 ذكور و4 0 إناث و9 ذكور في مجموعات ME/CFS والضوابط الصحية على التوالي (الجدول 1). جميع المرضى الذين تم اختيارهم استوفوا تعريف فوكودا لعام 1994 لـ ME/CFS. كان متوسط ​​العمر ومؤشر كتلة الجسم (BMI) متشابهين بين ME/CFS والأشخاص الخاضعين للمراقبة وأيضًا عند المقارنة بين الجنسين بين المجموعات (الجدول 1). كان تسعة وسبعون بالمائة من مرضى ME/ CFS قادرين على التعرف على حالة حادة، غالبًا مثل المرض الذي يسبق ظهور المرض مباشرة، في حين أن 20% لم يكونوا على علم بالحدث البادئ واعتبروا ظهوره أمرًا تدريجيًا (الجدول 1)، وكان 45 من أصل 49 مريضًا يعانون من مرضهم لأكثر من 3 سنوات. تصور درجات مؤسسات التمويل الأصغر -20 الاتجاه المعاكس لحالة الأشخاص الذين يعانون من ME/CFS مقابل عناصر التحكم، مع درجة أعلى تعكس المستوى الوظيفي الأدنى للمرضى مقارنة بالدرجة الأصغر لعناصر التحكم التي تعمل بكامل طاقتها (الجدول 1، p <0.001) ). علاوة على ذلك، كانت كل من درجات المكونات البدنية والعقلية (PCS وMCS على التوالي) المستمدة من المسح القصير SF -36، كما هو متوقع، أعلى في المجموعة الضابطة (P <0.001، الجدول 1).

تم إجراء تحليل المكون الرئيسي الموضح في الشكل 1 على البيانات التي تم الحصول عليها من استبيانات SF-36 وMFI-20. تم شرح أول مكونين رئيسيين 86.9% (PC-1 75.1%؛ PC-2 11.8%، الشكل 1أ) و92.6% (PC-1 86. 89٪؛ PC -2 5.73٪، الشكل 1 ب) من التباين الإجمالي ضمن مجموعة البيانات لـ SF -36 وMFI -20 على التوالي، وقد لوحظت مجموعتان مهمتان تفصلان مجموعة ME/CFS من المجموعة الضابطة. لا الموسم ولا الموقع الذي تم جمع الدم فيه يمكنه التمييز بين المجموعات (ملف إضافي 1: الشكل S1).

حجم وتركيزات الحويصلات خارج الخلية تختلف بين ME/CFS والضوابط الصحية

تمت تنقية الحويصلات خارج الخلية من عينات البلازما من مرضى ME/CFS والأفراد الأصحاء عن طريق هطول الأمطار وتم تحليل حجمها وتركيزاتها بواسطة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) للتحقيق فيما إذا كانت هناك اختلافات بين المجموعات السريرية. كانت جميع الجسيمات النانوية المنقاة أصغر من 500 نانومتر، وكان معظمها في نطاق حجم الإكسوسوم النموذجي الذي يتراوح بين 30-130 نانومتر [40]. كشفت NTA أن حجم جزيئات EV يختلف بين الأفراد الأصحاء (136.2 ± 18.3 نانومتر، النطاق 97-188 نانومتر) ومرضى ME / CFS (145.3 ± 16.6 نانومتر، النطاق 113-177 نانومتر) (ص =0.01 ، الشكل 2 أ). متوسط ​​​​التركيز الإجمالي للجزيئات / مل من البلازما (عناصر التحكم: 8.0 ± 3.8 × 108؛ ME / CFS: 10.5 ± 3.9 × 108، ص<0.001, Fig. 2b), the mean concentration of EVs that ranged from 30 to 130 nm in size (controls:4.3±1.8× 108,  ME/CFS:5.3±2.4× 108, p=0.05, Fig. 2c) and the mean concentration of particles greater than 130 nm (controls: 3.7±2.9× 108; ME/CFS: 5.6±2.7× 108, p<0.001, Fig. 2d) also exhibited a statistically significant difference between groups.

يؤدي التحليل الخارجي إلى إزالة بيانات موضوعات معينة من مزيد من الدراسة

قمنا بفحص عدد التحليلات الخارجية عبر مجموعات البيانات. تم التخلص من أي مادة تحليلية تحتوي على أكثر من نصف القيم غير القابلة للاكتشاف، وبالتالي تمت إزالة 6 من السيتوكينات البلازمية البالغ عددها 61. تم حساب درجة z لكل موضوع وكل تحليل. أي زوج موضوع/تحليل له قيمة q على الوجهين (القيمة p المعدلة لـ FDR) أقل من 0.05 تم اعتباره قيمة متطرفة. تشير قيم q الناتجة إلى أن اثنين من مرضى ME/CFS قدموا ملفات تعريف خارجية لم تكن مشتبهًا بها في البداية من خلال سماتهم السريرية وبالتالي يجب إزالتها من مجموعة بيانات السيتوكينات EV لأنها تمثل 43٪ و 50٪ من القيم المتطرفة على التوالي (21 و 24 من القيم المتطرفة من أصل 48 سيتوكينات). بالنسبة لمجموعة بيانات السيتوكينات البلازمية، لم يكن لدى أي موضوع نسبة عالية بشكل خاص من القيم المتطرفة، وبالنسبة لبروتينات البلازما، قدم مريض ME/CFS 35٪ من القيم المتطرفة (73 من القيم المتطرفة من 208 بروتينات البلازما)، وبالتالي لم يتم استخدامها في مزيد من التحليل.

تختلف مستويات معينة من السيتوكينات EV وسيتوكينات البلازما بين ME/CFS ومجموعات التحكم

قمنا بدراسة الاختلافات في مستويات التحاليل بين مرضى ME/CFS والضوابط باستخدام اختبارات ويلكوكسون ذات الرتبة الموقعة غير البارامترية. من بين السيتوكينات EV، كانت مستويات Interleukin 2 (IL2) مختلفة بشكل كبير بين الضوابط والمرضى (q=0.007) والسيتوكينات الـ 16 EV التالية التي أظهرت {{32} }.1 < ف < 0.2: IL12P40، TNF، IL1، CXCL8، CXCL1، IL15، CCL7، IL17، IL4، GM-CSF/CSF2، IL3، CCL5، NGF، IL1، IL7، IL1R1. يوضح الشكل 3 مخططات مربعة لمستويات البروتين المحولة بالسجل لهذه السيتوكينات الـ 17. بالنسبة لسيتوكينات البلازما [41] وبروتينات البلازما [14]، لم يكن هناك اختلاف كبير في الحليلة بين الحالات والضوابط بعد التصحيح لإجراء مقارنات متعددة (FDR <0.2). يمكن العثور على القيم p التفصيلية، وقيم q، ونسب متوسط ​​مستوى تحليل البروتين لمجموعة ME/CFS مقابل عناصر التحكم في الملف الإضافي 2: الجداول.

بالإضافة إلى ذلك، قمنا بمقارنة أنواع العينات ضمن المواضيع مع تحليل المكونات الرئيسية. تم استخدام إجمالي 36 تحليلًا شائعًا من المقايسة المناعية للبلازما 48-plex EV و55-مناعة البلازما في هذا التحليل. وكانت نسبة التباين التي أوضحها كل بعد 46.2% للمحور الأول و15% للمحور الثاني، ولوحظت مجموعتان مهمتان (الشكل 4).

توجد ارتباطات عديدة داخل وبين مجموعات بيانات البروتين

تم إجراء تحليلات ارتباط سبيرمان بين مجموعات البيانات وتم رسمها على شكل مخططات ارتباطية تظهر فقط الارتباطات المهمة مع معامل معامل r أكبر من أو يساوي 0.6 (الشكل 5). تم العثور على ما مجموعه 316 ارتباطًا إيجابيًا مهمًا في الأشخاص الذين يعانون من ME/CFS و300 في عناصر التحكم بين مستويات السيتوكينات في عينات EV (ف<0.01) and 88 and 73 had strong Spearman correlation coefcients (r ≥0.6) in the ME/CFS and control groups, respectively (Fig. 5a). Tirty-four of them were common to both groups (pink squares, Fig.  5a). When correlating plasma cytokines to each other, the ME/CFS cohort had 710 signifcant correlations including 327 at r ≥0.6 (q<0.01), and the control group had 394 with 146 at r ≥0.6 (q<0.01); 136 were common to both groups (Fig. 5b). In both EV and plasma cytokine correlation analysis, no signifcant negative correlations were found, and there was a higher number of positive correlations in the ME/CFS cohort as compared to the healthy individuals (Fig. 5a, b).

لقد قمنا أيضًا بالتحقق من الارتباطات بين مستويات السيتوكينات 55 بلازما و 48 EV (ملف إضافي 1: الشكل S2). لم يتم العثور على ارتباطات هامة سلبية وإيجابية قليلة في كلا المجموعتين (15 و 13 لـ ME/CFS والضوابط على التوالي عند r أكبر من أو يساوي 0.5، مع 4 مشتركة لكلتا المجموعتين). من بين هذه الارتباطات الهامة، ترتبط مستويات LIF في EVs بـ 8 سيتوكينات بلازما في ME/CFS (CCL3، IL15، LIF، IL17، IL21، IFN، TGF، وTGF) و5 في مجموعة التحكم (CCL3، IL1، IL17، IL21، وIFN ) (الشكل التكميلي 2).

بالنسبة لبروتينات البلازما، تم العثور على 160 و130 ارتباطات إيجابية هامة في ME/CFS ومجموعات التحكم، على التوالي، مع معامل سبيرمان r أكبر من 0.8 (q < 0.01) (الشكل 5 ج) و42 كانت شائعة في كلا المجموعتين (المربعات الوردية، الشكل 5 ج). ارتبطت ستة أزواج من البروتينات بشكل كبير وسلبي في مجموعة ME/CFS فقط (المربعات البرتقالية، الشكل 5 ج)، مع 3 منها بما في ذلك SERPINA7، وواحد فريد لمجموعة التحكم (SERPINA1/KNG1، r=− 0.82 ، ف <0.01، مربع أزرق فاتح، الشكل 5 ج).

عند تحليل العلاقات بين مجموعة بيانات بروتينات البلازما مع مجموعات بيانات سيتوكينات EV أو سيتوكينات البلازما، تم العثور على ارتباط مهم واحد فقط بين بروتين EV وبروتين تم اختباره بواسطة قياس الطيف الكتلي في مجموعة التحكم (CXCL12-ev/PROZ ، ص =0.69، ف =0.014).

【الاتصال】البريد الإلكتروني: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501