كيرسيتين مع الليكوبين يعدل مسار الجينات المضادة للأكسدة الإنزيمية في سمية القلب الأيزوبروتيرينول في الفئران الجزء 1

يرجى الاتصالoscar.xiao@wecistanche.comلمزيد من المعلومات

تجريدي

كيرسيتين (QN) هو مركب فينولي يحدث بشكل طبيعي يوجد إلى حد كبير في الخضروات والفواكه. الليكوبين (LY) هو مركب نباتي طبيعي آخر ، موجود بكثرة في الفواكه والخضروات ذات اللون الأحمر. وقد تم الإبلاغ عن أن كلاهما لديه أنشطة مفيدة في البشر. في هذه الدراسة ، نوثق في الجسم الحي النموذج التجريبي لايزوبروتيرينول(ISO) سمية إصابات القلب في الفئران Sprague-Dawley (SD) والعلاج مع تركيز محسن مشترك من كيرسيتين والليكوبين (QL). عولجت ذكور الفئران SD من مجموعات مختلفة ب QL (80 مجم / كجم QN و 3 mg / kg LY معا p.o.) لمدة 10 أيام مع إدارة ISO (100 mg / kg i.p.) في اليومين 7 و 8. بعد الفترة التجريبية ، تم تقدير CK-MB ، TROP ، AST ، ALT ، LDH ، GST ، GPx ، CAT ، SOD ، Vit. E ، Vit. C ، GSH ، GSSG ، و MDA. أظهرت الفئران SD التي أجريت باستخدام ISO ارتفاعا واضحا في مستويات إنزيم علامة المصل وعلامات الإجهاد التأكسدي للأنسجة (MDA و GSSG). علاوة على ذلك ، لوحظت انخفاضات ملحوظة في وزن الجسم وزيادة مستويات مضادات الأكسدة الإنزيمية وغير الإنزيمية. كما أشارت السمات النسيجية للقلب إلى حدوث اضطراب في بنية myofibrils القلبية للفئران المخمورة ب ISO. أيضا ، كشف تحليل PCR الكمي عن تورط جينات مضادة للأكسدة والجينات ذات الصلة مثل Nrf2 و HO-1 و NQO1 و GSTμ و SOD1 و SOD2 و CAT و BCl-2. QLالمعالجه المسبقهمنع كل هذه الآثار الضارة لسمية القلب ISO وخفض بشكل كبير من تلف عضلة القلب. لوحظ انخفاض في الإجهاد التأكسدي ، ربما من خلال تغييرات في مستويات التعبير عنإنزيميالجينات المضادة للأكسدة (GSTμ و SOD1 و SOD2 و CAT). بشكل عام ، يمارس QL تأثيرا وقائيا قويا من خلال التعديلات في الإنزيماتمضادات الاكسدهالنشاط وما يرتبط به من تأثير تنظيم المسارات الجزيئية في أمراض القلب والأوعية الدموية.

يرجى الضغط هنا لمعرفة المزيد

1. مقدمة

أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) هي مجموعة من الأمراض التي تنطوي على الأوعية الدموية في القلب والدماغ والذراعين والساقين. يتم تقديم الأشخاص الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية مع أشكال مختلفة من المضاعفات مثل تصلب الشرايين وفشل القلب والسكتة الدماغية. عادة ، يحدث كل من قصور القلب والسكتات الدماغية بسبب انسداد الرواسب الدهنية على الجدران الداخلية للأوعية الدموية التي تزود القلب أو الدماغ بالدم. يرتبط هذا الانسداد بالعديد من الأنشطة السلوكية مثل اتباع نظام غذائي غير صحي ، وعدم ممارسة الرياضة ، والإفراط في تناول الكحول والتبغ ، فضلا عن تاريخ مرض السكري وارتفاع ضغط الدم (Turer، A. T.and Hill، J.A.2010). في كثير من الأحيان ، تبرز العديد من التحذيرات المقلقة من الأمراض القلبية الوعائية ، والتي تشمل خدر أو ألم في منطقة الوجه والصدر ، وضيق في التنفس ، والغثيان ، وكسر العرق البارد ، وفقدان التنسيق. قد يؤدي ظهور مضاعفات الأمراض القلبية الوعائية غير المعالجة إلى نتائج مميتة فيعضلة القلباحتشاء (مل).

يشير نقص تروية عضلة القلب (MI) إلى تفاقم إصابة أنسجة القلب بسبب انخفاض إمدادات الأكسجين و / أو انخفاض إمدادات الدم إلى أنسجة القلب (Kocak et al.، 2016).

ذكرت منظمة الصحة العالمية (WHO) أنه من المتوقع أن يكون MI هو السبب الرئيسي للوفيات ، مع زيادة معدل الوفيات إلى 20 مليون حالة. في الوقت الحاضر ، يعيش 130 مليون شخص مع أمراض القلب والأوعية الدموية مع حالات أكثر في الذكور (68 ٪) من الإناث (32 ٪). تقريبا ، ثلاثة أرباع وفيات الأمراض القلبية الوعائية هي من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل مثل إندونيسيا وباكستان والفلبين وبنغلاديش (Fajobi et al، 2020). وقد قيد معظم الأشخاص من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل إمكانية الحصول على علاجات الرعاية الصحية للاستجابة لاحتياجاتهم. نتيجة لذلك ، يتم تشخيص الأشخاص الذين يعانون من عوامل الخطر في مرحلة لاحقة ويموتون أصغر سنا بسبب الأمراض القلبية الوعائية. يبلغ متوسط عمر الوفاة الناجمة عن الأمراض القلبية الوعائية في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل حوالي 40 عاما بينما يبلغ حوالي 80 عاما في البلدان المتقدمة. ومع ذلك ، فإن الارتفاع السريع في حالات الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية وانتشارها عبر البلدان المتقدمة يسلط الضوء على الخاصية المحددة لمرحلة التغريب ، مما يعالج قلقا مثيرا للقلق في إدارة الأمراض القلبية الوعائية على الرغم من التقدم السريع في خدمات الرعاية الصحية (Ricardo et al.، 2019).

Cistanche يمكن أن يحسن المناعة

وأدى تقدم معدل الإصابة، وربط الإعاقة ونوعية الصحة المخيفة مع زيادة معدل الوفيات في البلدان النامية والمتقدمة النمو على حد سواء، إلى إثارة اهتمام كبير ببحوث الإدارة العلاجية باستخدام مركب مناسب لتنظيم الأمراض القلبية الوعائية من حيث كفاءة الأدوية وسلامتها. على الرغم من أن بعض الأدوية تمنع الأمراض القلبية الوعائية ، إلا أن هذه الأدوية إما ليست فعالة جدا في مكافحة المرض أو مرتبطة بآثار جانبية شديدة. تشير الدراسات إلى أن الالتهاب يلعب دورا مهما في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية (Pantazi et al,2016). تؤدي الاستجابة الالتهابية المتزايدة إلى سلسلة من التقلبات الأيضية والكيميائية الحيوية غير الطبيعية في خلايا القلب والدماغ. الحرمان المطول من الأكسجين يؤدي إلى تراكم حمض اللاكتيك وانخفاض في درجة الحموضة داخل الخلايا. هذه الظروف الحمضية تؤدي إلى تحفيز أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تراكم ROS في وقت لاحق ينشط الاستجابة الالتهابية التي تزيد من ارتفاع الخلل الوظيفي الانقباضي ، والتضخم ، والتليف ، وموت الخلايا. قد تتفاعل هذه التشوهات بشكل مشترك مع عملية الأمراض القلبية الوعائية بأكملها (Tsutsui et al، 2011).

يمكن لمزيج من مضادات الأكسدة والإجراءات المضادة للالتهابات تجنب هذه الأحداث الضارة والتخفيف من الأمراض القلبية الوعائية والمضاعفات المرتبطة بها. مع هذه النظرية ، اقترح أن استخدام بعض المركبات النشطة بيولوجيا من المنتجات الطبيعية قد يدافع عن الفرد من الأمراض القلبية الوعائية. كيرسيتين (QN) والليكوبين (LY) هي مضادات أكسدة طبيعية موجودة بشكل رئيسي في الفواكه والخضروات ، في تركيبة لها خصائص بيولوجية فريدة من نوعها مثل مضادات الالتهاب ، ومضادة لارتفاع ضغط الدم ، ومضادة للأكسدة ، ومضادة للسرطان (Twinkle et al، 2019). على الرغم من أن كلا من QN و LY لديهما معيار ما قبل سريري رائع في مجال علم الأدوية ، إلا أن الاستراتيجيات التي تهدف إلى تثبيط الاستجابة الالتهابية في مزيج من QN و LY(QL) لم يتم استكشافها بعد ضد الأمراض القلبية الوعائية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون تحسين الأمراض القلبية الوعائية من خلال الإدارة العلاجية ل QL نهجا واعدا ضد الأمراض القلبية الوعائية. مع هذه المعلومات ، في هذه الدراسة ، تم إجراء تجربة في الجسم الحي لتقييم الفعالية القلبية ل QL ضد سمية القلب الناجمة عن الأيزوبروتيرينول (ISO) في الفئران.

2. المواد والأساليب

2.1.المواد الكيميائية والكواشف

تم شراء QN و LY من الدرجة التحليلية للتحقيق الحالي وتم إعدادهما في 80٪ من الإيثانول. تم شراء المواد الكيميائية التالية من سيغما ألدريش: تم إذابة ISO في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) ، محلول تلطيخ كلوريد رباعي الفينيل ثلاثي الفينيل (TTC) ، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ،

(CDB) ، ميتا-1-كلورو ، 2،4-دينيتروبنزين 2 حمض الفوسفوريك (MPA) ، سلفونات الفلورو ميثان (M2VP) ، الهيماتوكسيلين ، ومحلول تلطيخ الإيوسين (H & E). جميع المواد الكيميائية الأخرى المستخدمة في التجربة كانت من الدرجة التحليلية.

3. البروتوكول التجريبي 3.7. نموذج حيواني

تم حبس ما مجموعه 32 فأرا من Sprague-Dawley (7-9 أسابيع ؛ 170-190 جم) خالية من أي مرض في الأقفاص تحت بيئة مختبرية خاضعة للرقابة وسمح لها بحرية شرب الماء وكريات القوارض. تم إجراء التأقلم مع الظروف التجريبية لمدة سبعة أيام في بيت الحيوان قبل بدء التجارب. تم تنفيذ جميع البروتوكولات الأخرى لتقليل المعاناة. تم تصميم البروتوكول التجريبي وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية (IAEO).

4. التصميم التجريبي وإدارة الدواء

تم تجميع الفئران SD في أربع مجموعات مع ثمانية لكل منها (n = 8). تم تحديد الجرعة الفعالة من QL بناء على أنشطة مصل الكرياتين كيناز-MB (CK-MB) في الدراسة الأولية لتحسين الجرعة (البيانات غير معروضة) وكانت 80 ملغ / كغ QN جنبا إلى جنب مع 3mg / kg LY. تلقت الفئران في المجموعة الأولى (السيطرة) 0.1٪ كلوريد الصوديوم طوال التجريب (10 أيام). تلقت الفئران في المجموعة ll إعطاء عن طريق الفم من QL لمدة عشرة أيام. وفي اليوم السادس والسابع، أعطيت الفئران في المجموعتين ll وIV داخل الصفاق باستخدام الأيزوبروتيرينول (100 مغ/كغ من وزن الجسم). أيضا ، تم إعطاء الفئران المجموعة الرابعة QL في وقت واحد كما هو الحال في المجموعة Il. وفيما يلي معلومات المجموعة المعينة:

المجموعة الأولى: التحكم (0.1٪ كلوريد الصوديوم)

المجموعة Il: QL (كيرسيتين [QN] 80 مغ/كغ و lyco-pene LY] 3 مغ/كغ p.0.)

المجموعة الأولى: الأيزوبروتيرينول (ISO؛ 100 مغ/كغ i.p.) المجموعة الرابعة: ISO + QL (كما هو الحال في المجموعة III.l والمجموعة الثانية) تم تسجيل أوزان الجسم للفئران يوميا حتى نهاية التجربة. في اليوم العاشر ، تم التضحية بجميع الحيوانات عن طريق قطع رأس عنق الرحم تحت التخدير مع الصوديوم بنتوباربيتال (40 مجم / كجم). تم إعداد عينات الدم وأنسجة القلب بسرعة لمختلف التحليلات.

5. تقييم مؤشرات الأعضاء (وزن القلب إلى وزن الجسم) في الفئران التجريبية تم غسل عينات أنسجة القلب بكلوريد البوتاسيوم البارد (KCl) وتم مسحها بورق ترشيح للجفاف التام ووزنها. تم حساب مؤشرات الأعضاء (وزن القلب إلى وزن الجسم) باستخدام هذه القيم.

6. تقييم العلامات البيوكيميائية في المصل في الفئران التجريبية

وبعد قطع الرأس، جمعت عينات دم لإعداد عينات المصل عن طريق الطرد المركزي. تم تحديد أنشطة إنزيم علامة القلب في المصل (CK-MB) ، والتروبونين القلبي T (TROP) ، ونازعة هيدروجيناز اللاكتات (LDH) بطرق Okinaka et al. [1957]. تم تنفيذ أنشطة ترانساميناس أسبارتات المصل (AST) وألانين أمينوترانسفيراز (ALT) بطريقة ريتمان وفرانكل [1961]. تم إجراء جميع التحليلات باستخدام مجموعات الفحص ووفقا للتعليمات الواردة في بروتوكول الشركة المصنعة. تم تسجيل قيم الامتصاص باستخدام قارئ microplate. تم تحديد البروتين الكلي في العينات بطريقة لوري وآخرون [1951].

7. تقييم علامات الإجهاد التأكسدي باستخدام المصل وأنسجة القلب المتجانسة في الفئران التجريبية MDA:

تم تحليل محتوى Malondialdehyde (MDA) بحثا عن المادة التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) في المصل وأنسجة القلب المتجانسة. تم تحضير متجانسات أنسجة القلب عن طريق تجانس كل عينة من عينات القلب ثم الطرد المركزي بسرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة. بالنسبة ل TBARS ، تمت إضافة supernatants المستردة والمصل مع 0.1 مل من 8.1 ٪ SDS ، و 1 مل من 20 ٪ من حمض الخليك ، و 1 مل من 8 ٪ TBA. تم تسخين خليط التفاعل لمدة ساعة. بعد الحضانة ، تم تبريد الأنابيب وطردها مركزيا لمدة 15 دقيقة. تم استخدام supernatant لقياس الامتصاص عند طول موجي يبلغ 532 نانومتر. تم التعبير عن مستويات TBARS على أنها nmol من MDA لكل لتر في المصل و nmol من MDA لكل غرام في أنسجة القلب.

GSSG:

تم تحديد مستوى GSSG وفقا للطريقة التي وصفها Li et al. [2012] مع تعديل. لتحديد GSSG ، تم خلط عينة الاختبار مع MPA و M2VP لمزيد من الأكسدة. تم تحديد قيم امتصاص خليط العينة عند 370 نانومتر وتم التعبير عنها على أنها أنسجة نانومول/غرام.

8. تقييم تركيز الميوغلوبين (MYO) في الفئران التجريبية

لتحديد تركيز MYO ، تم تثبيت عينات القلب أولا في بارافورمالديهايد وبعد ذلك في محلول الجلوتارالدهيد لمدة 15 دقيقة. ثم ، تم تحضين العينات لمدة 1 ساعة في المخزن المؤقت Tris / 80 mM KCl ، O-toluidine ، 90٪ الإيثانول ، و 70٪ من هيدروبيروكسيد البوتيل الثالث عند 50 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم قياس الامتصاص عند 436 نانومتر وتم التعبير عنه ب ug / L.

9. تقييم مضادات الأكسدة الأنزيمية ومضادات الأكسدة غير الأنزيمية في الفئران التجريبية

تم استخدام Supernatants من الأنسجة المتجانسة لتحديد أنشطة الإنزيمات المضادة للأكسدة.

ديسموتاز السوبروكسيد (SOD):

تم قياس قيمة SOD وفقا لطريقة Marklund و Marklund [1974]. في المقام الأول ، تم تحديد تركيز SOD على قدرته على منع التخفيض بوساطة الأكسيد الفائق. تم افتراض وحدة واحدة من SOD كنشاط إنزيمي لتثبيط 50٪ من أكسدة البيروغالول. تم خلط عينة الاختبار مع محلول معد ومخزن مؤقت. تم خلط الخليط جيدا قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم تسجيل الامتصاص عند 450 نانومتر وتم التعبير عن نشاط SOD على أنه U / mg من البروتين.

كاتالاس (CAT):

تم تحديد نشاط الكاتالاز (CAT) بطريقة Aebi [1983]. تم احتضان عينة الاختبار مع الركيزة (H و O و NaCl) عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة. تم إيقاف التفاعل الأنزيمي عند تكوين مركب أصفر في المحلول وتم قياس الامتصاص عند 405 نانومتر. تم تعريف وحدة واحدة من CAT على أنها نشاط الإنزيم الضروري لتحلل 1 uM من H2O2 في الدقيقة.

لكل دقيقة لكل ملغ من البروتين.

الجلوتاثيون بيروكسيديز (GPx):

تم الانتهاء من نشاط الجلوتاثيون بيروكسيديز (GPx) وفقا للطريقة التي وصفها فلوهي وغونزلر [1984]. تم خلط supernatant مع PBS و GSH و Azde الصوديوم و HO ، لصنع 1 مل من خليط التفاعل. بعد الحضانة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، تم إيقاف رد الفعل بإضافة 5٪ TCA. تم طرد الأنابيب مركزيا عند 1000 غرام لمدة 8 دقائق وتم الحصول على السوبر نات الناتج. تم قياس الامتصاص عند 420 نانومتر وتم التعبير عن نشاط GPx على أنه μM من GSH مؤكسد لكل دقيقة لكل ملغ من البروتين.

الجلوتاثيون-إس-ترانسفيراز (GST):

تم قياس إجمالي نشاط ضريبة السلع والخدمات وفقا لطريقة Habig et al.[1974]. تم خلط عينة الاختبار مع 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) وعولجت ب 10 نانومتر TCDD لمدة 24 ساعة. تم قياس اقتران CDNB عند 340 نانومتر وتم التعبير عن النشاط بالنانومتر من CDNB مقترن لكل دقيقة لكل ملغ من البروتين.

انخفاض الجلوتاثيون (GSH):

تم تحليل مستويات GSH بطريقة Aebi [1983]. تم تخفيف عينة الاختبار باستخدام المخزن المؤقت للفوسفات-EDTA وتحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد الخلط المستمر والحضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تم قياس المحلول عند 350 نانومتر وتم التعبير عنه على أنه ملغم / ديسيلتر في المصل وميكرومول / غرام في الأنسجة.

فيتامين E وفيتامين C:

تم تحديد مستويات فيتامين E وفيتامين C بطريقة Quaife et al.[1949] باستخدام مبدأ قياس الألوان. فحص يعتمد على انخفاض تركيز توكوفيرولز بسبب تحويل الحديديك إلى أيونات حديدية (حمراء معقدة). تمت إضافة عينة الاختبار مع الإيثانول وخلطها بقوة. ثم ، تم خلط الخليط مع الزيلين وحمايته من الضوء. بعد الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة ، تمت إضافة محلول كلوريد الحديديك. بعد الخلط الكامل ، تم تسجيل الامتصاص عند 562 نانومتر وتم التعبير عنه كميمول لكل لتر لكل من الفيتامينات.

10. تقييم الإصابة النسيجية المرضية في الفئران التجريبية

تم غمر قسم أنسجة القلب في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ لمدة يومين ثم تم تجفيفه بشكل متسلسل في سلسلة من الإيثانول المتدرج. بعد مزيد من الجفاف مع الفورمالين ، تم ترسيخ الأنسجة في البارافين. باستخدام الميكروتوم ، تم تقطيع جزء من الأنسجة بسماكة 5 ميكرومتر وتلطيخ ب H & E للتحليل باستخدام المجهر الضوئي. تم تصوير أقسام الأنسجة عند تكبير 40X لتقييم التغيرات النسيجية المرضية.

11. تم التحقيق في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الفئران التجريبية Nrf2 / HO-1 الجينية ومستويات التعبيرات الجينية المرتبطة بها مثل Nrf2 و HO-1 و BCl-2 و GSTμ و SOD1 و SOD2 و CAT و NQO1 باستخدام RT-PCR. تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من تجانس الأنسجة باستخدام كاشف TRIZOL متبوعا بعلاج DNase-I لإزالة آثار الحمض النووي وفقا لدليل الشركة المصنعة. تم تحديد نقاء الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة مقياس الطيف الضوئي عند 260 نانومتر وتخزينه عند -70 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. تم استخدام ميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي لتوليف cDNA باستخدام مجموعة توليف cDNA تجارية. تم إجراء تعبيرات جميع الجينات باستخدام مزيج رئيسي من Maxima SYBR الأخضر qPCR. تم فحص البيانات وتم التطبيع ضد جين GAPDH. تم حساب تغيير الطي باستخدام طريقة 2-△ACT لكل جين. تم سرد الاشعال المستخدمة أدناه:

12. التحليل الإحصائي

وقدمت البيانات على أنها متوسط ±SD لكل مجموعة وحسبت باستخدام حزمة برمجيات SPSS 17.0. تم حساب مستوى الأهمية من خلال اختبار t للطالب مع التحليل اللاحق المناسب. واعتبرت ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية.

هذا المقال مقتبس من المجلة الليبية للطب2021، المجلد 16، 1943924https://doi.org/10.1080/19932820.2021.1943924