الحث السريع للمناعة الواقية ضد الطاعون الرئوي بواسطة Yersinia Pestis Polymeric F1 and LcrV Antigens

خلاصة:

في دراسة حديثة ، أظهرنا أن التطعيم بمستضد الكبسولة البوليمرية F1 لمسببات الطاعون Yersinia pestis أدى إلى الحث السريع للاستجابة المناعية الخلطية الواقية من خلال التنشيط المحوري لخلايا B1b الشبيهة بالفطريات. على العكس من ذلك ، فشلت النسخة الأحادية من F1 في حماية الحيوانات المحصنة على الفور في هذا النموذج من الطاعون الدبلي. في هذه الدراسة ، قمنا بفحص قدرة F1 على منح البداية السريعة للمناعة الوقائية في نموذج الماوس الأكثر تحديًا للطاعون الرئوي. أدى التطعيم بجرعة واحدة من F1 الممتز على هيدروكسيد الألومنيوم إلى حماية فعالة ضد التعرض القاتل اللاحق داخل الأنف لسلالة Y. pestis شديدة الضراوة في غضون أسبوع. ومن المثير للاهتمام أن إضافة مستضد LcrV قللت من الوقت اللازم لتحقيق هذه المناعة الوقائية السريعة إلى 4-5 أيام بعد التطعيم. كما وجد سابقًا ، كان التركيب البوليمري لـ F1 ضروريًا في توفير الاستجابة الوقائية المتسارعة التي لوحظت عن طريق التطعيم بـ LcrV. أخيرًا ، في دراسة طول العمر ، أدى التطعيم الفردي بالبوليمر F1 إلى استجابة خلطية أعلى وأكثر اتساقًا من التطعيم المماثل مع F1 الأحادي. ومع ذلك ، في هذا الإعداد ، تم تكرار المساهمة المهيمنة لـ LcrV في المناعة طويلة الأمد ضد التحدي الرئوي المميت.

هناك علاقة وثيقة بين الاستجابات المناعية الخلطية الواقية والمناعة. الاستجابة المناعية الخلطية الواقية هي استجابة دفاعية للجسم ضد مسببات الأمراض الغريبة ، والتي تشارك بشكل أساسي بواسطة الأجسام المضادة. تشير المناعة إلى قدرة الجسم على مقاومة غزو مسببات الأمراض الأجنبية. يمكن للاستجابة المناعية الخلطية الواقية أن تعزز التأثير القاتل للخلايا المناعية ، وتعزز مقاومة الجسم ، وبالتالي تحسن المناعة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للاستجابة المناعية الخلطية الواقية أيضًا تنظيم توازن جهاز المناعة ، والتحكم في نشاط الجهاز المناعي ، وتجنب المبالغة في رد الفعل وحدوث أمراض المناعة الذاتية. لذلك ، فإن الاستجابة المناعية الخلطية الواقية ضرورية للحفاظ على صحة الجسم وتعزيز المناعة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مناعة الإنسان مهمة جدًا أيضًا ، والتي يمكن أن تمنعنا من التعرض لهجمات الفيروسات. يمكن أن يعزز cistanche المناعة. الكستانش غني بالعديد من المواد المضادة للأكسدة ، مثل فيتامين ج ، وفيتامين ج ، والكاروتينات ، وما إلى ذلك. هذه المكونات يمكن أن تزيل الجذور الحرة ، وتقلل من الإجهاد التأكسدي وتحسن مقاومة الجهاز المناعي.

انقر فوق فوائد cistanche tubulosa

الكلمات الدالة:

تلقيح؛ طاعون رئوي؛ حماية سريعة البوليمرية F1 ؛ أحادي F1 ؛ LcrV. نموذج الفأر.

1 المقدمة

تشكل بكتيريا اليرسينيا الطاعونية سالبة الجرام العامل المسبب للمرض من الطاعون الدبلي والطاعون الرئوي. مئات الملايين ماتوا بسبب الطبيعة المميتة للعدوى التي يسببها هذا العامل الممرض المدمر في ثلاث أوبئة رئيسية وفي العديد من الفاشيات المحلية المسجلة في الألفي سنة الماضية [1 ، 2]. نظرًا لارتفاع معدل العدوى والفتك ، تم تصنيف Y. pestis كعامل إرهابي بيولوجي محتمل (https://www.cdc.gov/plague/ bioterrorism / index.html ، تم الوصول إليه في 9 يوليو 2021). منذ اكتشاف واستخدام المضادات الحيوية على نطاق واسع ، انخفض معدل الانتشار والوفيات الناجمة عن الطاعون بشكل حاد [3،4].

ومع ذلك ، فإن العلاج بالمضادات الحيوية ضد الطاعون له حدود ؛ لكي يكون العلاج فعالاً ، يجب أن يتم تناوله بعد فترة وجيزة من ظهور الأعراض التي تشبه في البداية تلك الخاصة بعدوى الجهاز التنفسي العلوي الشائعة ، وبالتالي غالبًا ما يتم تشخيصها بشكل خاطئ. أي تأخير في إعطاء المضادات الحيوية المحددة لعلاج الطاعون قد يضعف فعاليتها ويؤدي إلى وفيات كبيرة بين الأفراد المعالجين [5]. إن العزل الأخير لسلالات Y.pestis الخبيثة المقاومة لمضادات حيوية متعددة ، بما في ذلك تلك الموصى بها للعلاج ، والقلق من أن مثل هذه الأنماط الظاهرية المتغيرة قد يتم إدخالها بشكل ضار في السلالات الفتاكة للحرب البيولوجية أو الإرهاب البيولوجي يستلزم تطوير تدابير مضادة إضافية [6-8] . في الواقع ، يُظهر التطبيق الأخير للمضادات الحيوية من الخط الثاني ، والطرائق العلاجية الإضافية ، والجمع بين العلاج بالمضادات الحيوية والعاثية نتائج واعدة في نموذج الفأر للطاعون الرئوي [9،10].

لقد أثبتنا مؤخرًا باستخدام نموذج الفأر للطاعون الدبلي أن إعطاء المستضد المحفظي F1 لـ Y. pestis يولد مناعة وقائية في غضون أيام ، وبالتالي يمكن أن يكون بمثابة تدخل علاجي للوقاية من المرض [11 ، 12]. انطوت هذه البداية السريعة للحماية على التنشيط السريع لخلايا B1b الشبيهة بالفطريات والموجودة في التجاويف البريتونية والجنبية ، مما أدى إلى إنتاج أضداد الدورة الدموية المضادة لـ F1 IgM و IgG [11،12]. كان التركيب البوليمري لـ F1 ضروريًا للتحريض السريع للمناعة المضادة للطاعون ، كما يتضح من الملاحظة أنه ، على عكس البوليمر F1 ، فشل بروتين F1 الدائري الأحادي التفاضل (monoF1) في الارتباط بخلايا B1b البريتونية مباشرة بعد التحصين ، و وفقًا لذلك ، تأخر إنتاج الأجسام المضادة لـ F1 [12]. في هذه الدراسة ، باستخدام نموذج فأر لعدوى Y. pestis داخل الأنف ، قمنا بفحص قدرة مستضد F1 على توفير مناعة وقائية سريعة ضد الطاعون الرئوي ، والذي يمثل أشد مظاهر المرض.

تثبت هذه الدراسة أنه ، كما في حالة المناعة ضد الطاعون الدبلي ، كانت الطبيعة البوليمرية لـ F1 ضرورية للمناعة السريعة وكذلك طويلة الأمد بعد التطعيم بجرعة واحدة من المستضد. نظرًا لأن مستضدات F1 و LcrV تمثل اللقاحات الفرعية الأكثر احتمالًا لمقاومة الطاعون وقد ثبت أنها تثير مناعة وقائية سريعة في نموذج فأر للطاعون الرئوي [13] ، قمنا بتوسيع هذه الدراسة من خلال معالجة إمكانية زيادة تسريع تصاعد الحماية ضد الطاعون الرئوي بواسطة F1 مع تركيبة LcrV.

2. المواد والأساليب

2.1. بيان الأخلاق

تم إجراء هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع توصيات رعاية واستخدام حيوانات المختبر من المعهد الوطني للصحة. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بموجب القانون الإسرائيلي وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات للتجارب على الحيوانات في المعهد الإسرائيلي للبحوث البيولوجية (أرقام التصريح: IACUC-IIBR M -50-18 ، IACUC-IIBR M -36-19 ، IACUC -IIBR M -64-19، IACUC-IIBR M -73-20). بعد تحدي الأنف ، تمت مراقبة الفئران يوميًا. تم استخدام نقاط النهاية الإنسانية في دراسات البقاء على قيد الحياة. تم التخلص من الفئران التي تظهر فقدان المنعكس الصحيح عن طريق خلع عنق الرحم.

2.2. الحيوانات

تم شراء الفئران الإناث C67BL / 6 الفطرية التي يتراوح عمرها من ستة إلى ثمانية أسابيع من Envigo (القدس ، إسرائيل). تم شراء الأقراص المضغوطة للذكور والإناث -1 من نفس العمر من Charles River (المملكة المتحدة).

2.3 تحصين الحيوانات مع المستضدات النقية

PolyF1: تمت تنقية البروتين البوليمري F1 من المادة الطافية المزروعة لخلايا الإشريكية القولونية التي تعبر عن أوبرون caf1 لسلالة Y. pestis Kimberley53 ، كما هو موضح سابقًا في [14]. تم تحديد الوزن الجزيئي لـ F1 المنقى ليكون أعلى من 1000 كيلو دالتون بواسطة كروماتوجرافيا استبعاد الحجم باستخدام عمود Superdex 200 (Cytiva ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

MonoF1: ​​تم الحصول على ترميز البلازميد pAH34L للأحادي F1 (cpCaf1) من الدكتور دانيال بيترز والبروفيسور جيريمي إتش لاكي ، جامعة نيوكاسل ، المملكة المتحدة [15]. تم إدخال pAH34L في Lemo21 (DE3) E. coli تم شراؤه من New England Biolabs (إبسويتش ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت زراعة المحولات المختارة عشوائياً عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في مرق رائع مدعم بالأمبيسيلين (200 ميكروغرام / مل). تم إحداث التعبير في منتصف اللوغاريتم عن طريق إضافة إيزوبروبيل - ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG ؛ 1 مم) ، وتم حضانة الثقافات لاحقًا عند 18 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة لمدة 19 ساعة إضافية. تم وزن الكريات البكتيرية (الوزن الرطب) وتم إذابتها باستخدام كاشف تحلل الخلايا CelLytic ™ B وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة (Merck-Sigma ، Rehovot ، إسرائيل).

تمت تنقية بروتين الانصهار المؤتلف Tol3 – cpCaf1 عن طريق تحليل كروماتوجرافي سائل بالضغط الميسر (PFLC) على عمود HisTrap ™ HP وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة (Cytiva ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم فصل جزء Tol3 عن cpCaf1 عن طريق الانقسام مع الثرومبين (Merck-Sigma ، ريهوفوت ، إسرائيل) وإعادة امتصاص الأول على عمود HisTrap ™ HP المجدد. تم جمع جزء cpCaf1 (monoF1) من جزء التدفق وتم غسله على نطاق واسع مقابل 1 × PBS. تمت إزالة السموم الداخلية بواسطة طريقة الفصل الطوري Triton X -114 ، كما هو موضح سابقًا في [16]. تم قياس كمية البروتين باستخدام طريقة حمض البيسينشونينيك (Pierce ™ BCA Protein Assay Kit ، Thermo). تم التحقق من نقاء المونومري F1 بواسطة SDS-PAGE متبوعًا بتلوين Coomassie الأزرق وتحليل اللطخة الغربية باستخدام أضداد الأرانب المضادة لـ F1 ، كما هو موضح سابقًا في [11].

LcrV: تم استنساخ تسلسل ترميز LcrV كامل الطول من سلالة Y. pestis Kimberley53 الخبيثة في ناقل تعبير pGEX (GE Healthcare ، Chicago ، IL ، USA) وتم إدخاله في خلايا E. coli. تم العثور على تسلسل تشفير LcrV ليكون مطابقًا لـ LcrV لسلالة Y. pestis CO92. تم إنتاج وتنقية LcrV المؤتلف كما وصفه Leary et al. [17]. تمت إزالة السموم الداخلية من LcrV المنقى كما هو موضح أعلاه.

تم امتصاص ما مجموعه 2 0 إلى 160 ميكروغرام من polyF1 و LcrV أو 80 ميكروغرام من monoF1 على 2 بالمائة من هلام الألومنيوم هيدروكسيد (AlOH) هلام (Brennentag Biosector ، الدنمارك) لتركيز نهائي بنسبة 0.36 بالمائة. تم تحصين الفئران الفردية تحت الجلد باستخدام حجم ثابت من 200 ميكرولتر تدار في أسفل الظهر.

2.4 توصيف الاستجابة المصلية

تم تفريخ الفئران ، وتم تحديد عيار IgG الفردي المتولد ضد F1 و LcrV في المصل بواسطة ELISA ، كما ورد سابقًا في [11]. تم قياس التتر IgG1 و IgG3 باستخدام الأجسام المضادة للفوسفاتيز القلوية المترافقة مع الفوسفاتاز الماعز (Jackson Laboratories ، Farmington ، CT ، USA).

غسل القصبات الهوائية (BAL): تم تخدير الفئران بمحلول كيتامين / زيلازين ، وتم تعريض القصبة الهوائية ، مع الحرص الشديد على عدم التسبب في أي نزيف. تم إجراء شق صغير وإدخال قنية مرنة قياس {0} (BD Neoflon ™) وتأمينها بخياطة جراحية. تم غسل الرئتين بـ 1 × PBS باستخدام حقنة 1 مل luer-lock التي تم توصيلها بالقنية المضمونة. تم التخلص من سائل الغسيل الملوث بأي علامة على وجود دم. تم تنقية سائل الغسل بالطرد المركزي (4 0 0 × جم ، 4 درجة مئوية) ، وتم ترشيح المادة الطافية قبل ELISA. تم تحديد تركيزات الأجسام المضادة لـ F1 والمضادة لـ LcrV في سائل BAL (BALF) للحيوانات التي تم تلقيحها باستخدام Mab 57 المخفف (F1) و Mab 59 (LcrV) الذي تم الإبلاغ عنه مسبقًا في [18] كمنحنيات قياسية مضمنة في كل {{14} } لوحة اختبار البئر. تم تحديد حدود الكشف (LODs) للأجسام المضادة لـ F1 IgG والأجسام المضادة لـ LcrV في BALF لتكون 0.8 نانوغرام / مل و 0.15 نانوغرام / مل ، على التوالي.

2.5 عدوى الفأر

تم إجراء الالتهابات داخل الأنف كما هو موضح سابقًا في [19]. باختصار ، حلقة مليئة بالمستعمرات البكتيرية Y. pestis Kim53 النموذجية تم حصادها وتخفيفها في مرق ضخ القلب (HIB ، Difco) مكمل بـ 0. 2٪ زيلوز و 2.5 ملي مولار CaCl2 (Sigma-Aldrich، St. MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى OD66 0 من 0. 0 1 ونمت لمدة 22 ساعة عند 28 درجة مئوية و 1 0 0 دورة في الدقيقة. في نهاية فترة الحضانة (OD660 ≈ 4) ، تم غسل الثقافة وتخفيفها في محلول ملحي (0.9 بالمائة كلوريد الصوديوم) إلى الجرعة المعدية المرغوبة التي تم التحقق منها عن طريق حساب وحدات تشكيل المستعمرة بعد الطلاء والحضانة على ألواح BHIA (48 ساعة). عند 28 درجة مئوية). تم تخدير الفئران بمزيج من 0.5 بالمائة كيتامين هيدروكلورايد و 0.1 بالمائة زيلازين ثم أصيبت عن طريق الأنف بـ 35 ميكرولتر / فأر من المعلق البكتيري. إن LD50 داخل الأنف لسلالة Kim53 تجاه C57BL / 6 الفئران هو 1100 cfu و 2100 cfu تجاه الفئران CD -1. تم حساب قيم LD50 وفقًا للطريقة التي وصفها Reed و Muench [20]. تم رصد مراضة الفئران ووفياتها يوميًا لمدة 21 يومًا. في نهاية هذه الفترة ، تم التحقق من إزالة العامل الممرض عن طريق طلاء متجانسات الطحال من الحيوانات الباقية على ألواح BHIA المكملة بـ 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (48 ساعة عند 28 درجة مئوية).

2.6. توصيف نموذج الفأر للطاعون الرئوي

تم تخدير الفئران المصابة عن طريق الأنف في النقطة الزمنية المحددة بعد التعرض بمحلول من الكيتامين / زيلازين ، وتم سحب الدم الهيبارين عن طريق ثقب القلب. بعد ذلك ، تم استئصال العقدة الليمفاوية المنصفية (mdLN) والرئتين والطحال وهرسها لتعليق خلية واحدة على شبكة نايلون 7 0 ميكرومتر (مصفاة الخلية ، فالكون ، كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) في 1 × PBS . تم تحديد عدد Y. pestis Kim53 في مختلف الأعضاء والدم عن طريق تصفيح المعلقات الخلوية المخففة تسلسليًا على ألواح BHIA المكملة بـ 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. للتحليل النسيجي ، تم تخدير الفئران ، وتم حقن قصباتها الهوائية كما هو موضح أعلاه. تم توصيل عمود (0.7 × 30 سم ، KONTES ، St. تم الاحتفاظ بالرئتين المملوءتين بالتثبيت في نفس المخزن المؤقت لمدة 14 يومًا ثم معالجتها لتشكيل كتل بارافين مضمنة. تم تلطيخ أقسام من واحد إلى ثلاثة ميكرومتر بصبغة إيوزين / هيماتوكسيلين (H&E) وبمجموعة تلوين Masson-Goldner (Merck ، Rehovot ، Israel) للكشف عن التليف. بالإضافة إلى ذلك ، تم تلطيخ أقسام الرئة لـ Y. pestis باستخدام أجسام مضادة للأرنب المضادة لـ F1 IgG (1:10 ، 000) ومجموعة Histostain®-SP (ZYMED® ، Invitrogen ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية ). تم تصوير المقاطع الملطخة باستخدام كاميرا ICC3 مقترنة بمجهر Axioscope A1 (زايس ، ألمانيا).

2.7. تحليل احصائي

تم تحديد الأهمية بين التتر المسجلة في الفئران التي تنتمي إلى أكثر من مجموعتين بواسطة Kruskal-Wallis اللامعلمي مع اختبار Dunn اللاحق. تم استخدام اختبار رتبة السجل (Mantel-Cox) للمقارنة بين منحنيات البقاء على قيد الحياة التي تم الحصول عليها في مجموعات التطعيم المختلفة. تعتبر الاختلافات كبيرة إذا كانت p أقل من أو تساوي 0. 05. تم إجراء الحسابات باستخدام برنامج GraphPad Prism.

3. النتائج

في دراسة سابقة ، أوضحنا أن تلقيح الفئران بالشكل البوليمري الأصلي لمستضد المحفظة F1 من Yersinia pestis أدى إلى استنباط سريع للحماية من الطاعون الدبلي. وفقًا لذلك ، تم اقتراح أن إعطاء F1 قد لا يُنظر إليه على أنه إجراء وقائي فحسب ، بل أيضًا كتدخل علاجي في حالات الطوارئ مثل حالات تفشي السلالات المقاومة للمضادات الحيوية التي تحدث بشكل طبيعي أو التي تم تصميمها بشكل ضار [12]. في هذا التقرير ، تم استجواب استنباط الحماية السريعة في حالة الطاعون الرئوي باستخدام نموذج الفئران الراسخ الذي يتكون من تعرض الفئران للممرض عن طريق التلقيح داخل الأنف. تم إثبات أن هذا النموذج يحافظ على الإمراضية التي تميز المظاهر التنفسية للطاعون الرئوي الأولي (الشكل التكميلي S1) [10،19،21-24].

3.1. المناعة الوقائية السريعة التي يوفرها F1 و LcrV في نموذج الفأر المصاب بالطاعون الرئوي

تم اختبار قدرة مستضد F1 على الحصول على حماية سريعة من خلال التجارب التي تم فيها تلقيح الفئران C57BL / 6 بإعطاء واحد من polyF1 الممتز AlOH (20 و 80 و 160 ميكروغرام / فأر) ، في حين تم حقن حيوانات التحكم فقط باستخدام المساعد. تم تقييم قدرة الفئران الملقحة على النجاة من العدوى القاتلة داخل الأنف مع سلالة Y. pestis Kim53 (10LD 50=11 ، 000 cfu) بعد ثلاثة وسبعة أيام من التطعيم مقارنةً بالحيوانات الضابطة (الشكل 1 ). بعد ثلاثة أيام ، لوحظ فقط تمديد متواضع للوقت حتى الموت والبقاء على قيد الحياة (ذات دلالة إحصائية غير مرضية) (الشكل 1 أ). أدى تمديد الوقت بين التطعيم والتحدي بمقدار 4 أيام أخرى فقط (7 أيام في المجموع) إلى تمكين إنقاذ جميع الفئران التي تم تلقيحها بجرعات عالية من polyF1 (80 و 160 ميكروغرام / فأر) بالإضافة إلى 87 في المائة من الفئران التي تم تلقيحها باستخدام اللقاح. جرعة منخفضة من polyF1 (الشكل 1B).

إن قدرة مستضد F1 على إحداث استجابة مناعية وقائية سريعة ضد الطاعون الرئوي شجعتنا على فحص ما إذا كان التحصين بمولد مضاد وقائي إضافي ، LcrV ، سيحسن الحالة المناعية للحيوانات عن طريق تسريع بدء المناعة الوقائية. في الواقع ، عندما تم تنفيذ تحدي Y. pestis المميت بعد 3 أيام من التطعيم المشترك ، كان إعطاء الصيغة المختلطة LcrV و polyF1 (80 ميكروغرام أو 160 ميكروغرام من كل من المستضدات) قادرة على إنقاذ 30-50 في المائة من الفئران (الشكل 1C). وعلى وجه الخصوص ، فإن تمديد الفترة بين التطعيم والتحدي إلى سبعة أيام يوفر الحماية الكاملة لجميع الحيوانات المحصنة في جميع جرعات المستضدات (الشكل 1 د). لم تتأثر قدرة polyF1 بمفرده أو بالاشتراك مع LcrV على منح مناعة وقائية سريعة ضد الطاعون الرئوي خلال أسبوع بزيادة جرعة التحدي للتعرض عبر الأنف بمقدار عشرة أضعاف (الشكل 1E) ، مما يؤكد متانة الحالة المحمية.

3.2 حركية الاستجابة الخلطية بعد التطعيم بـ F1 و LcrV

تشير الملاحظة التي مفادها أن لقاح LcrV و F1 المشترك الذي تسبب في مناعة وقائية سريعة إلى أن الاستجابة الخلطية قد تم استنباطها بعد ذلك بوقت قصير. لمعالجة هذا الاحتمال ولتحديد مساهمة الاستجابة الخلطية ضد كل من المستضدات في الحماية ضد Y. pestis ، تم تحليل حركية الأجسام المضادة IgG المحددة ضد المستضدين الفرديين من 5 إلى 9 أيام بعد التطعيم بجرعة واحدة C57BL / 6 الفئران بتركيبة مختلطة من polyF1 و LcrV (الشكل 2A). كما هو متوقع ، بناءً على الملاحظات السابقة ، كان من الممكن بالفعل اكتشاف عيار الأجسام المضادة لـ F1 IgG (GMT=1. 35 × 103) في مصل جميع الحيوانات المحصنة في اليوم الخامس بعد التطعيم (الشكل 2 ب).

لوحظت زيادة تدريجية في عيار الجسم المضاد IgG المضاد لـ F1 في الأيام التالية ، ووصلت إلى ~ 60- أضعاف المستويات الأعلى في اليوم التاسع بعد التطعيم (GMT=8. 26 × 104 ، الشكل 2 ب). يمكن أيضًا اكتشاف الأجسام المضادة لـ F1 IgG في سائل الرئة بدءًا من يوم 7 بعد التطعيم ، لتصل إلى تركيز يصل إلى ~ 1 ميكروغرام / مل في اليوم 9 (الشكل 2C). ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من تأخر الاستجابة الخلطية المضادة لـ LcrV مقارنةً بتلك التي أثارها polyF1 (اليوم 7 بتوقيت جرينتش=613 ، الشكل 2 د) ، تم قياس زيادة أعلى في مستويات الأجسام المضادة لـ LcrV IgG في الأيام التالية ، مما يدل على الزيادة الإجمالية بمقدار ~ 160- ضعف (GMT=1 × 105 ، الشكل 2D). يمكن أيضًا اكتشاف الأجسام المضادة لـ LcrV IgG في سائل الرئة للفئران المحصنة بدءًا من اليوم الثامن ، وإن كان بتركيز أقل مقارنة بمستويات مكافحة F1 (الشكل 2E).

لا يبدو أن الزيادة الحادة في عيار IgG المضاد لـ LcrV ، التي لوحظت في الأيام 8-9 بعد التطعيم ، تتضمن تنشيط خلايا B1b الشبيهة بالفطريات ، كما تشير الملاحظة إلى أن جزء IgG3 من هذه الأجسام المضادة كان أقل من الاكتشاف مقارنةً بـ جزء الجسم المضاد لـ F1 IgG3 ([12] والشكل التكميلي S2). لذلك ، تشير البيانات إلى أن LcrV يمكن أن يولد أيضًا استجابة خلطية سريعة توفر ، بالاشتراك مع F1 ، حماية فعالة ضد الطاعون الرئوي في وقت مبكر بعد أسبوع واحد من التطعيم. علاوة على ذلك ، تشير ملاحظة أن الأجسام المضادة IgG المضادة لـ F1 ومضادة LcrV المتراكمة في رئتي الحيوانات الملقحة تشير إلى أن الاستجابة المحلية في الرئتين قد تكون مهمة لتحقيق مناعة ضد الطاعون الرئوي.

3.3 أهمية البنية البوليمرية F1 في الظهور السريع للمناعة الوقائية

لقد نشرنا سابقًا نتائج تدعم بقوة فكرة أن البنية البوليمرية الرباعية لـ F1 ضرورية لقدرتها على إحداث استجابة وقائية سريعة ضد الطاعون الدبلي [12]. وبالتالي ، في هذه الدراسة ، تم تناول هذه القضية أيضًا في حالة الحماية من الطاعون الرئوي. تم تحصين الفئران باستخدام F1 أحادي أو بوليمري ، في كلتا الحالتين تستلزم التناول المتزامن لـ LcrV (80 ميكروغرام من كل مستضد / فأر). بعد ثلاثة وأربعة وخمسة أيام ، تم تحدي الفئران عن طريق الأنف بجرعة قاتلة من Y. pestis Kim53. أشارت بيانات البقاء الموضحة في الشكل 3 إلى أن التطعيم بمزيج من polyF1 و LcrV يحمي 25 بالمائة و 62.5 بالمائة و 87.5 بالمائة من الفئران ، على التوالي (الشكل 3 أ) ، من التحدي المميت.

في المقابل ، استسلمت جميع الفئران التي تم تحصينها بخليط monoF1 و LcrV للعدوى باستثناء المجموعة التي تم تلقيحها قبل 5 أيام من التحدي ، والتي أظهرت مستوى منخفضًا من الحماية بنسبة 25 بالمائة (الشكل 3 ب). التطعيم بتركيبات غير مختلطة تتكون من polyF1 أو monoF1 أو LcrV (8 0 ميكروغرام / فأر) قبل 4 أيام من التحدي لم يحمي الحيوانات. ومع ذلك ، فإن التطعيم مع polyF1 أتاح تأخيرًا كبيرًا في معدل الوفيات مقارنة بجميع المجموعات التجريبية الأخرى (P <0.001 ؛ الشكل 3C). مجتمعة ، تُظهر هذه النتائج بوضوح أن الشكل البوليمري لـ F1 ضروري للحصول على استجابة وقائية سريعة بالاشتراك مع LcrV.

3.4. توصيف المناعة الوقائية طويلة الأمد الناتجة عن التطعيم الفردي باستخدام F1 و LcrV

أخيرًا ، قمنا بفحص ما إذا كانت المناعة الوقائية التقليدية طويلة الأمد ضد الطاعون الرئوي تختلف في الفئران التي تم تلقيحها بواسطة monoF1 أو polyF1. وفقًا لذلك ، تم تلقيح الفئران CD1 مرة واحدة باستخدام monoF1 أو polyF1 وحده ، وكذلك عن طريق إعطاء الصيغ التي تضمنت توليفة مع LcrV. تم قياس مستوى الأجسام المضادة المحددة في مصل الحيوانات الملقحة بعد ستة أشهر. تُظهر البيانات الموضحة في الشكل 4 أ أن عيارات الأجسام المضادة لـ F1 IgG كانت أعلى في جميع المجموعات التي تم تلقيحها بـ polyF1 مقارنةً بتلك التي تم تحصينها باستخدام monoF1. تم قياس عيارات IgG عالية ومتسقة من LcrV في جميع الفئران التي تم تلقيحها بـ LcrV.

فترة 6 أشهر بعد التحصين (3 أيام بعد سحب الدم لتحديد العيار) ، تم تحدي الفئران عن طريق الأنف بجرعة قاتلة تتكون من 100LD50 من Y. pestis Kim53 ، وتمت مراقبة البقاء على قيد الحياة لمدة 21 يومًا (الشكل 5). كانت الفئران التي تم تحصينها باستخدام polyF1 كمستضد واحد محمية جزئيًا فقط ، في حين استسلمت جميع الفئران التي تم تحصينها باستخدام monoF1 للعدوى ، على غرار الفئران الساذجة الضابطة (الشكل 5 أ). والجدير بالذكر أن التتر المضاد لـ F1 IgG الذي تم قياسه في مصل الحيوانات المحصنة بـ polyF 1- لم يُظهر ارتباطًا قويًا بالبقاء على قيد الحياة ضد التحدي الرئوي (الشكل 5 ب). أتاحت إضافة LcrV الحماية الكاملة للفئران التي تم تحصينها باستخدام monoF1 وكذلك تلك التي تم تطعيمها بـ polyF1 (الشكل 5A) ، مما يشير إلى أن الاستجابة المضادة لـ LcrV مكنت من إظهار القيمة الوقائية للاستجابة المضادة لـ F1 بشكل كامل. تم الحصول على نتائج مماثلة فيما يتعلق بالاستجابات الخلطية والبقاء على قيد الحياة عند التحدي الرئوي في الفئران الملقحة للذكور -1 (الشكل التكميلي S3) ، مما يشير إلى أن الدراسة ليست متحيزة حسب الجنس الحيواني (لاحظ أن التجارب الأولية أجريت مع إناث الحيوانات) .

مجتمعة ، تُظهر هذه النتائج أن F1 في حد ذاته يمكن أن يحفز بداية سريعة للحماية من الطاعون الرئوي ، والذي يعتمد على هيكله البوليمري الطبيعي. لم تقصر إضافة LcrV إلى polyF1 الوقت اللازم لتحقيق مثل هذه الحماية السريعة فحسب ، بل وفرت أيضًا مناعة وقائية طويلة الأمد وفعالة ضد المظاهر الرئوية للطاعون ، كما هو موضح سابقًا.

4. مناقشة

يُعزى العزلة الأخيرة لسلالات Y. pestis الخبيثة المقاومة للعديد من المضادات الحيوية بما في ذلك تلك الموصى بها للعلاج [8،25،26] ، إلى البحث عن تدابير مضادة إضافية ضد الطاعون الرئوي ، مثل اللقاحات التي تحفز المناعة السريعة ، عالية الصحة العامة والأهمية السريرية. تعتبر اللقاحات بشكل عام تدابير وقائية مضادة للأمراض المعدية ، وبالتالي يتم تسليمها إلى الأشخاص الأصحاء قبل سنوات. ووفقًا لذلك ، فإن غالبية الدراسات قبل السريرية التي تفحص تطوير لقاح ضد الطاعون تضمنت أنظمة تطعيم مطولة قبل تحدي قاتل [13،27-29]. لقد أبلغنا سابقًا أن التطعيم بالشكل البوليمري الطبيعي لمستضد F1 المحفظي يؤدي إلى استجابة مناعية سريعة جدًا وقوية تعتمد على الخلايا B والتي تحمي الحيوانات حتى بعد عدة ساعات من تحدي Y. pestis القاتل تحت الجلد [11،12].

في هذه الدراسات ، أظهرنا أن لقاحًا واحدًا مع F1 يحث على تراكم الأجسام المضادة لـ F1 (IgM و IgG) في المصل خلال عدة أيام عن طريق تنشيط الخلايا B1b الشبيهة بالفطريات. تتواجد هذه المجموعة السكانية الفرعية من الخلايا البائية في التجويف البريتوني للفئران وعادةً ما تولد استجابات مصلية ضد المستضدات البوليمرية غير البروتينية ، مثل LPS والسكريات المتعددة التي تشكل كبسولة للعديد من مسببات الأمراض (المكورات الرئوية ، المكورات السحائية ، إلخ) [30]. تتميز هذه الاستجابات المناعية السريعة باستقلال الخلايا التائية وتوليد النمط المصلي لجسم الفئران IgG3 المضاد. لقد أظهرنا أن جميع الميزات المذكورة أعلاه تنطبق أيضًا على الاستجابة الوقائية السريعة الناتجة عن F1. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن الطبيعة البوليمرية لـ F1 ضرورية لهذه الاستجابة المناعية السريعة ، حيث فشل أحادي F1 (الناتج عن التقليب الدائري لجين caf1) في تنشيط خلايا B1b ، التي تأخرت بعد البوليمر F1 في حركية عيار IgG ، لا تولد النمط المصلي IgG3 ، وفشلت في توفير بداية سريعة للحماية. هذه الاستجابة السريعة مصحوبة باستجابة تكيفية تقليدية أبطأ تعتمد على الخلايا التائية ضد F1. ومن ثم ، فإننا نفترض أن البوليمر F1 يولد استجابتين مصليتين تعملان بالتوازي: واحدة تكون مستقلة عن الخلايا التائية عبر خلايا B1b والثانية تتضمن خلايا B مسامية بطريقة تعتمد على الخلايا التائية [12].

في هذا التقرير ، تم تمديد الدراسة السابقة من خلال معالجة قدرة مستضد F1 على منح استجابة وقائية سريعة في نموذج الفأر الأكثر تحديًا للطاعون الرئوي. نظهر أن إدارة واحدة من البوليمر F1 الممتز بـ AlOH ، قبل سبعة أيام من التحدي القاتل داخل الأنف مع سلالة Y. pestis الخبيثة ، يمكن أن تحفز استجابة وقائية فعالة (الشكل 1). هذه الملاحظة المفاجئة ليس لها سابقة تقريبًا ، ليس فقط فيما يتعلق بسرعة التفاعل ولكن أيضًا من حيث حقيقة أن قدرة مستضد F1 على توفير الحماية في نموذج فأر للطاعون الرئوي لم يتم تناولها إلا نادرًا [31]. الملاحظة الواردة هنا تتماشى مع تلك التي وثقتها ديربيز وزملاؤها [32] فيما يتعلق باكتشاف الأجسام المضادة لـ F1 بعد التطعيم بوقت قصير. نوضح هنا أن إضافة LcrV إلى polyF1 لم يكن مفيدًا فقط على المدى الطويل ، كما ورد سابقًا [33،34] ، ولكنه أدى أيضًا إلى تسريع الاستجابة المناعية الوقائية ضد Y. pestis intranasal Challenge إلى بضعة أيام فقط (الأشكال 2 و 5).

إن القدرة على توليد حماية سريعة ضد الطاعون الرئوي عن طريق التطعيم بـ F1 و LcrV تقوي النتائج المماثلة التي أبلغ عنها سابقًا Williamson وزملاؤه [13] ، حيث وفر التطعيم بـ F1 و LcrV حماية سريعة ضد تحدي الهباء الجوي مع Y. pestis. تشير الزيادة الحادة في عيار LcrV IgG المضاد في اليومين الثامن والتاسع إلى أنه تم تنشيط آليات مناعية قوية جدًا بواسطة LcrV في وقت مبكر بعد التحصين. يشير نقص الأجسام المضادة IgG3 المضادة لـ LcrV في المصل ، وخصائصها الحركية المختلفة ، والمستويات المنخفضة من الأجسام المضادة لـ LcrV IgG الموجودة في سائل الرئة بقوة إلى أن الآليات المناعية المنفصلة قد تم تنشيطها بواسطة مستضدات F1 و LcrV ، وكلاهما أكثر ساهم على الأرجح في الاستنباط السريع للاستجابة الوقائية (الشكل 3 ج).

على غرار ملاحظاتنا السابقة في نموذج فأر الطاعون الدبلي ، فإن القدرة على إحداث استجابة مناعية وقائية سريعة ضد الطاعون الرئوي تعتمد على التركيب البوليمري لمستضد F1 (الشكل 3). تشير هذه الملاحظة إلى أن لقاح الوحدة الفرعية السائد والمرشح لمكافحة الطاعون ، والذي يتكون من مونومري F1 و LcrV كبروتين اندماج [35 ، 36] ، لا يُتوقع أن يوفر بداية سريعة للمناعة ضد الطاعون الرئوي ؛ ومع ذلك ، فإن هذا الافتراض يحتاج إلى دراسة تجريبية. لا تزال الاستجابة المصلية الناتجة عن LcrV ، على الرغم من كونها أبطأ من استجابة polyF1 (الشكل 2) ، تسمح بالاستجابة التكيفية الوقائية السريعة التي حالت دون التأثير المميت للطاعون الرئوي. ربما نشأت هذه الاستجابة المصلية السريعة نسبيًا من قدرة مستضد LcrV على تكوين ثنائيات أو رباعيات في المحلول ، كما تم العثور عليه في الدراسات السابقة [37 ، 38] وبياناتنا غير المنشورة. في ضوء النتائج التي توصلنا إليها حول تأثير البنية المتعددة لـ F1 في تسريع توليد استجابة مناعية خلطية ، فإن الهندسة المؤتلفة لبروتين LcrV التي تتيح التعددية المتعددة إلى حد أكبر قد تزيد من تسريع الاستجابة. تماشياً مع هذا الافتراض ، تجدر الإشارة إلى التقرير الأخير الذي وثق أن البلورات الدقيقة التي تحتوي على F1 و LcrV كانت أكثر حماية من لقاح مماثل يتكون من هذه المستضدات في شكل قابل للذوبان [39]. تشير هذه الملاحظة إلى أن زيادة كثافة المستضدات ، والتي تحدث بطبيعتها في بوليمر F1 ، قد تحسن وربما تسرع الاستجابات الخلطية الواقية.

بالإضافة إلى قدرته على إحداث تحريض سريع للمناعة ، في التجارب التي تتناول طول عمر الحالة الوقائية ، أدى التحصين الفردي باستخدام البوليمر F1 إلى توليد عيار IgG أكثر استقرارًا وتوحيدًا من ذلك مع أحادي F1 (الشكل 4). ومع ذلك ، فإن التطعيم باستخدام polyF1 وحده يوفر حماية جزئية فقط من مرض الالتهاب الرئوي. من الجدير بالذكر أن التتر المضاد لـ F1 IgG المقاس في الفئران الفردية يرتبط ارتباطًا ضعيفًا بقدرتها على النجاة من التحدي (الشكل 5 ب). أدى تلقيح الفئران بمزيج من كل شكل من أشكال F1 مع LcrV إلى إنشاء مستويات أعلى من الحماية (الشكل 5). تتماشى هذه النتائج مع الدراسات السابقة التي أظهرت أن التطعيم بلقاح الخلية الكاملة المقتولة (KWC) ، الذي يحفز مضاد F1 IgG ولكن ليس مضاد LcrV IgG ، كان غير فعال في توفير المناعة ضد الطاعون الرئوي [13،40] .

بينما ، في دراسة طول العمر ، قدم polyF1 مناعة جزئية متأخرة فقط ، أظهر هذا البروتين القدرة على الحماية الكاملة للفئران بعد وقت قصير من التطعيم ، مما يشير إلى مشاركة آليات مناعية إضافية قصيرة العمر ساهمت في إزالة العامل الممرض في تجارب المناعة. لقد أظهرنا مؤخرًا أن التطعيم بسلالة Y.pestis الموهنة EV76 أدى إلى تشغيل آلية دفاع تغذوي ألغت آليات الفوعة التي تتوسطها حامض الحديد لدى العامل الممرض الذي يتنافس على أيونات الحديد المتوفرة في المضيف ، مما يساهم في الظهور السريع للمناعة ضد الطاعون [ 41]. قد يساعد توضيح الآليات الداعمة قصيرة العمر التي تتآزر مع الاستجابة المناعية الخلطية المضادة لـ F1 في تطوير لقاحات محسنة ضد الطاعون الرئوي وكذلك ضد الأمراض المعدية المميتة الأخرى.

المواد التكميلية:

يمكن تنزيل المعلومات الداعمة التالية على https: //https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1 ، الشكل S1: توصيف الطاعون الرئوي بعد التلقيح داخل الأنف لـ Y. pestis Kim53. الشكل S2: توصيف النمط المتماثل للأجسام المضادة لـ F1 والأجسام المضادة لـ LcrV في مصل الفئران المحصنة. الشكل S3: طول عمر الاستجابة المصلية وبقاء ذكور الفئران بعد تلقيح واحد باستخدام F1 الأحادي والبوليمر F1 إما بمفرده أو مع LcrV.

الكاتب الاشتراكات:

المفاهيم ، EM ، و YL ؛ تنظيم البيانات ، YL ؛ التحليل الرسمي ، YL ؛ التحقيق ، ماجستير ، AT ، DG ، YV ، AZ ، و YL ؛ المنهجية ، YL ؛ الموارد ، TH ، و AM ؛ الإشراف ، EM ؛ الكتابة — المسودة الأصلية و EM و YL ؛ الكتابة - المراجعة والتحرير ، TC و EM و YL لقد قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

التمويل:

تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الإسرائيلي للأبحاث البيولوجية ، رقم المنحة SB / 07.

بيان مجلس المراجعة المؤسسية:

غير قابل للتطبيق.

بيان الموافقة المستنيرة:

غير قابل للتطبيق.

بيان توفر البيانات:

البيانات المقدمة في هذه الدراسة متاحة عند الطلب من المؤلفين المطابقين.

تضارب المصالح:

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

مراجع

1. بتلر والطاعون والتهابات يرسينيا الأخرى ؛ Greenough، W.، Merigan، TC، Eds.؛ شركة Plenum Medical Book Company: نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 1983.

2 - راندريمانانا ، ر. أندريانايفواريمانانا ، ف. نيكولاي ، ب. راماسيندرازانا ، ب. بييرو ، ياء ؛ عشرة بوش ، QA ؛ راكوتوندرامانجا ، جي إم ؛ Rahajandraibe، S. Rahelinirina، S.؛ راكوتومانانا ، ف. وآخرون. الخصائص الوبائية لوباء الطاعون الحضري في مدغشقر ، أغسطس - نوفمبر ، 2017: تقرير عن الفاشية. لانسيت تصيب. ديس. 2019 ، 19 ، 537-545. [CrossRef]

3 - Kugeler، KJ ؛ ستابلز ، JE ؛ هينكلي ، AF ؛ غيج ، كوالا لمبور ؛ ميد ، ب. س. علم وبائيات الطاعون البشري في الولايات المتحدة ، 1900-2012. ايمرج. تصيب. ديس. 2015 ، 21 ، 16-22. [CrossRef]

4 - Kugeler، KJ ؛ ميد ، PS ؛ كامبل ، إس بي ؛ نيلسون ، كاليفورنيا أنماط العلاج بمضادات الميكروبات ونتائج المرض بين مرضى الولايات المتحدة المصابين بالطاعون ، 1942-2018. كلين. تصيب. ديس. 2020 ، 70 ، S20 – S26. [CrossRef]

5. Godfred-Cato، S. كولي ، KM ؛ فليك دردريان ، إس. بيكستيد ، ها. راسل ، زي. ميني دلمان ، د. ميد ، PS ؛ نيلسون ، كاليفورنيا علاج الطاعون البشري: مراجعة منهجية للبيانات المجمعة المنشورة حول فعالية مضادات الميكروبات ، 1939-2019. كلين. تصيب. ديس. 2020 ، 70 ، S11 – S19. [CrossRef]

6. Galimand، M .؛ جويول ، أ. جيربود ، ج. Rasoamanana ، ب. ؛ شانتو ، إس. كارنيل ، إي. Courvalin، P. المقاومة للأدوية المتعددة في اليرسينيا الطاعونية بوساطة بلازميد قابل للتحويل. إنجل. جيه ميد. 1997 ، 337 ، 677-680. [CrossRef]

7. ويلش ، تي جيه ؛ فريك ، WF ؛ ماكديرموت ، PF ؛ أبيض ، DG ؛ روسو ، مل ؛ راسكو ، دا ؛ ماميل ، م. إيبينجر ، م. روزوفيتز ، إم جي ؛ واغنر ، د. وآخرون. المقاومة المتعددة لمضادات الميكروبات في الطاعون: خطر ناشئ على الصحة العامة. بلوس وان 2007 ، 2 ، e309. [CrossRef]

8. Lei، C. كومار ، S. Yersinia pestis المقاومة للمضادات الحيوية: مراجعة منهجية. أوسونغ الصحة العامة الدقة. وجهة نظر. 2022 ، 13 ، 24-36. [CrossRef]

9. Zauberman، A .؛ جور ، د. ليفي ، واي. أفتاليون ، م. فاجيما ، واي. تدهار ، أ. شيتلارو ، تي. ممرود ، إ. إعطاء لقاح حي يرسينيا بيستيس بعد التعرض لقاح حي يرسينيا بيستيس لتقوية الخط الثاني من العلاج بالمضادات الحيوية ضد الطاعون الرئوي. J. تصيب. ديس. 2019 ، 220 ، 1147-1151. [CrossRef]

10. فاجيما ، واي. جور ، د. أفتاليون ، م. موسى ، س. ليفي ، واي. ماكوفيتسكي ، أ. هولتزمان ، تي. أورين ، زي. سيغولا ، واي. فاتليفيتش ، إي. وآخرون. العلاج بالعاثيات يعزز علاج الخط الثاني بالمضادات الحيوية ضد الطاعون الرئوي. الفيروسات 2022 ، 14 ، 688. [CrossRef]

11. ليفي ، واي. فلاشنر ، واي. تدهار ، أ. زوبرمان ، أ. أفتاليون ، م. لازار ، س. جور ، د. شافيرمان ، أ. تلعب الخلايا التائية محمود دورًا أساسيًا في الحماية السريعة المضادة لـ F1 ضد الطاعون الدبلي. لقاح 2011، 29، 6866–6873. [CrossRef]

12. ليفي ، واي. فاجيما ، واي. تدهار ، أ. أفتاليون ، م. جور ، د. نيلي ، يو ؛ شيتلارو ، تي. زوبرمان ، أ. محمود ، ي. إن استهداف مستضد Yersinia pestis F1 المحفظي بواسطة خلايا B1b الشبيهة بالفطريات يؤدي إلى استجابة وقائية سريعة ضد الطاعون الدبلي. لقاحات NPJ 2018 ، 3 ، 52. [CrossRef]

13. Williamson، ED؛ Stagg ، AJ ؛ إيلي ، SM ؛ تايلور ، ر. أخضر ، م ؛ جونز ، إس إم ؛ Titball، RW Kinetics للاستجابة المناعية للقاح (F1 plus V) في نماذج الطاعون الدبلي والطاعون الرئوي. لقاح 2007 ، 25 ، 1142-1148. [CrossRef]

14. هولتزمان ، ت. ليفي ، واي. ماركوس ، د. فلاشنر ، واي. ممرود ، إي. كوهين ، إس. Fass، R. إنتاج وتنقية الأوليغومرات عالية الوزن الجزيئي لمستضد المحفظة Yersinia pestis F1 المنطلق عن طريق زراعة كثافة الخلايا العالية لخلايا Escherichia coli المؤتلفة التي تحمل أوبرا caf1. ميكروب. مصانع الخلايا 2006 ، 5 ، P98. [CrossRef]

15. شالتون ، د. موسون ، جا. فليك سميث ، هـ. ووكر ، ن. ماكجريجور ، أ. لامب ، هونج كونج ؛ وليامسون ، إد ؛ ميلر ، ياء ؛ روبنسون ، ج. Lakey ، JH مناعة مستضد لقاح يرسينيا بيستيس أحاديًا عن طريق التقليب الدائري. تصيب. مناعة. 2006 ، 74 ، 6624-6631. [CrossRef]

16- بيتش ، د. Anspach، FB إزالة السموم الداخلية من محاليل البروتين. J. Biotechnol. 2000 ، 76 ، 97-119. [CrossRef]

17. Leary، SE؛ وليامسون ، إد ؛ غريفين ، KF ؛ راسل ، ب. إيلي ، SM ؛ Titball، RW التحصين النشط مع مستضد V المؤتلف من Yersinia pestis يحمي الفئران من الطاعون. تصيب. مناعة. 1995 ، 63 ، 2854-2858. [CrossRef]

18. ميشالي ، أ. فيتنر ، إب ؛ ليفي ، واي. جور ، د. بارليف جروس ، م. سيتنر ، أ. كورين ، م. ليفي ، هـ. محمود ، أ. فيشر ، إم. Epitope Binning للأجسام المضادة الجديدة أحادية النسيلة المضادة F1 والأجسام المضادة LcrV وتطبيقاتها في اختبار HTRF بسيط وقصير للكشف عن الطاعون السريري. مسببات الأمراض 2021 ، 10 ، 285. [CrossRef]

19. تدهار أ. فلاشنر ، واي. كوهين ، إس. ليفي ، واي. زوبرمان ، أ. جور ، د. أفتاليون ، م. الحناني ، إي. تسفي ، أ. شافيرمان ، أ. وآخرون. البروتين الدهني NlpD هو عامل ضراوة جديد لـ Yersinia pestis ضروري لتطور الطاعون. بلوس وان 2009 ، 4 ، e7023. [CrossRef]

20. ريد ، ل. Muench، H. طريقة بسيطة لتقدير خمسين بالمائة من نقاط النهاية 12. أكون. ياء Epidemiol. 1938 ، 27 ، 493-497. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com