التأثيرات المعدلة لـ ROS لـ Lingonberry (Vaccinium Vitis-idaea L.) بوليفينول على تضخم الخلايا الشحمية السمنة والخلل البطاني الوعائي ، الجزء الأول

من فضلك اضغطoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:يؤدي الإجهاد التأكسدي وإفراز الخلايا الدهنية غير المنتظم المصاحب للنسيج الدهني المتضخم إلى حدوث التهاب مزمن ، مما يؤدي إلى ضعف بطانة الأوعية الدموية. بحثت الدراسة الحالية في قدرة الأنثوسيانين (ACN) والغير أنثوسيانين بوليفينول (PP) من ثمار عنب الثور على التخفيف من تضخم الأنسجة الدهنية والخلل البطاني باستخدام الخلايا الدهنية 3T 3- L1 والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). أظهرت هذه الدراسة أن جزء PP يقلل من توليد ROS داخل الخلايا في الخلايا الدهنية المتضخمة عن طريق تعزيز التعبير عن إنزيم مضادات الأكسدة (SOD2) وتثبيط التعبير عن إنزيم الأكسدة (NOX4 ، iNOS). علاوة على ذلك ، خفضت كسور PP و ACN محتوى الدهون الثلاثية في الخلايا الشحمية مصحوبًا بالتنظيم السفلي للتعبير عن الجينات المولدة للدهون مثل aP2 و FAS و DAGT1. عدل العلاج مع كلا الكسور تعبير الرنا المرسال وإفراز البروتين للأديبوكينات الرئيسية في الخلايا الشحمية المتضخمة. كان التعبير عن إفراز اللبتين والأديبونكتين وإفرازهما ، على التوالي ، منخفضًا ومنتظمًا. علاوة على ذلك ، خففت كسور PP و ACN الاستجابة الالتهابية في TNF - - التي تسببها HUVEC عن طريق تثبيط التعبير عن الجينات المسببة للالتهابات (IL -6 و IL -1) وجزيئات الالتصاق (VCAM {{ 14}} ، ICAM -1 ، SELE). تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن تناول فاكهة عنب الثور الغنية بالبوليفينول قد يساعد في منع وعلاج السمنة والخلل البطاني بسبب مضادات الأكسدة والمضادة للالتهابات.

الكلمات الدالة:بوليفينول. الأنثوسيانين.لينجونبيري; إمكانات مضادات الأكسدة؛ مكافحة السمنة. مضاد التهاب؛استخراج cistanche tubulosa؛ 3T 3- Ll adipocytes؛ تضخم في حجم الخلايا؛الأديبوكينات؛ الخلايا البطانية

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

1 المقدمة

السمنة هي عامل خطر مستقل لأمراض القلب والأوعية الدموية وأحد الأسباب الرئيسية لزيادة خطر الإصابة بعسر شحميات الدم ، ومقاومة الأنسولين ، وارتفاع ضغط الدم ، وتصلب الشرايين في كل من البالغين والأطفال [1]. في السمنة ، يصبح النسيج الدهني الأبيض (WAT) الناتج عن التراكم المفرط للدهون في الخلايا الشحمية المتضخمة مختلًا وظيفيًا ، مما يؤدي إلى الالتهاب المزمن والإجهاد التأكسدي وإفراز الأديبوكين غير المنتظم الذي يساهم في الإصابة بداء السكري من النوع 2 ويرتبط أيضًا بشكل مستقل بخلل وظيفي في الشرايين التاجية [2 ، 3]. الخلايا الشحمية الضخامية هي العامل الأساسي الذي يربط بين توازن الطاقة الإيجابي والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية [2]. يعمل WAT كعضو في الغدد الصماء ومن خلال إفراز الأديبوكينات والسيتوكينات يتوسط الحديث المتبادل بين WAT الحشوي أو تحت الجلد وأنسجة القلب والأوعية الدموية.cistanche tubulosa redditالأديبوكينات مثل اللبتين والأديبونكتين والريسستين والسيتوكينات و TNF- و IL -1 و IL -6 و IL -8 و MCP -1 وأنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية ( ROS و RNS) تؤثر على تطور الخلل البطاني من خلال آليات مباشرة وغير مباشرة [4]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) ، وخاصة من الأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة ، تعزز الالتهاب الموضعي وضعف وظيفة البطانة.

يساهم PVAT في استتباب الأوعية الدموية عن طريق إنتاج مركبات فعالة في الأوعية مثل adipokines و ROS وأكسيد النيتريك (NO). من خلال إفراز مجموعة واسعة من الجزيئات النشطة بيولوجيًا ، يؤثر PVAT على تقلص خلايا العضلات الملساء الوعائية وتكاثرها وانتقالها [4].

يمكن أن يحسن cistanche المناعة

تنظم الخلايا البطانية التي تبطن الجدار الداخلي للأوعية الدموية وظائف الاستتباب ، كما أن ضعفها هو مؤشر مبكر لتصلب الشرايين وأمراض القلب والأوعية الدموية. يساهم الإجهاد التأكسدي في تنشيط الخلايا البطانية ، مما يؤدي إلى تنشيطها للالتصاق والتسلل وتنشيط الخلايا المناعية ، مما يؤدي إلى نمط ظاهري التهابي منخفض الدرجة في الأوعية الدموية [5،6]. يمكن أن يغير ROS إعادة تلين الأوعية الدموية المعتمدة على البطانة من خلال التحلل المعزز لـ NO [6]. يمكن عكس الخلل البطاني ، مما قد يؤخر أو حتى يمنع تطور تصلب الشرايين ويحسن وظائف الشرايين ويقلل من حدوث أحداث القلب والأوعية الدموية I5]. أظهرت الدراسات السريرية الحديثة أن العلاجات غير الدوائية والدوائية التي تستهدف السمنة ومقاومة الأنسولين تعمل على تحسين وظيفة البطانة وتقليل الالتهاب منخفض الدرجة [7]. وقد أظهرت هذه النتائج العلاقة بين السمنة ومقاومة الأنسولين والخلل البطاني. لذلك ، يجب أن يكون الحد من وظيفة الخلايا الشحمية المرضية في السمنة هدف الوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية. قد تصبح الاستراتيجيات العلاجية والتغذوية التي تقلل الإجهاد التأكسدي والالتهاب في الأنسجة الدهنية المتضخمة هدفًا رئيسيًا للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية [7].

يعتبر التوت مصادر غنية بالبوليفينول ، مثل الفلافونول والأحماض الفينولية والأنثوسيانين ، وقد أفادت الدراسات الوبائية بوجود ارتباط بين زيادة تناول ثمار التوت مع انخفاض في السمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية] 8]. تُعرف ثمار التوت بمضادات الأكسدة الطبيعية ، وبسبب إمكاناتها العالية كمضادات الأكسدة ، غالبًا ما يشار إليها على أنها أطعمة طبيعية وظيفية [9]. يُصنف التوت البري على أنه "فواكه خارقة" لكونه غنيًا بشكل خاص بمضادات الأكسدة مثل الفيتامينات C و A و E (توكوفيرول) والبوليفينول [10]. أشارت الدراسات التي أجريت في المختبر وفي الجسم الحي إلى العديد من الآثار المفيدة الصحية للتوت البري مثل مضادات الالتهاب [11] ومضادات الأكسدة [11] والأنشطة المضادة للتكاثر [8،9]. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن التوت البري يمنع السمنة التي يسببها النظام الغذائي والالتهابات منخفضة الدرجة في الحيوانات المصابة بداء السكري [12]. أظهرت دراستنا السابقة الإمكانات المضادة للالتهابات للمستخلص المائي لفاكهة عنب الثعلب بالتجميد والتجفيف [11]. ينظم المستخلص التعبير الجيني المؤيد للالتهابات (IL -6 و MCP -1 و IL -1) ومضاد الالتهاب (IL -10) في TNF الملتهبة {{20} } تسبب في 3T 3- L1 adipocytes وقمع الاستجابة الالتهابية في RAW 264.7 الضامة المنشط عن طريق تنظيم التعبير عن الوسطاء الالتهابي (TNF- ، IL -1 ، IL -6 ، MCP {{30 }} ، iNOS ، COX -2). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ وجود تأثيرات كبيرة مضادة للأكسدة في الخلايا الشحمية الملتهبة المعالجة بمستخلص فاكهة عنب الثعلب. انخفض تراكم ROS داخل الخلايا نتيجة للتعبير المحسن عن إنزيمات الدفاع المضادة للأكسدة (SOD ، الكاتلاز ، GPx) وتثبيط الإنزيم المؤيد للأكسدة (NADPH أوكسيديز 4) [11].

بحثت الدراسة الحالية في جزء أنثوسيانين فاكهة عنب الثعلب (ACN) وقدرة الكسر غير الأنثوسيانين بوليفينول (PP) على منع وعلاج السمنة الضخامية والخلل البطاني الذي تم تقليده في النماذج المختبرية. تم تحليل تأثير كسور ACN و PP على المسارات الجزيئية في الإجهاد التأكسدي والالتهاب وإفراز الأديبوكين غير المنظم في الخلايا الشحمية 3T المتضخمة السمنة 3- L1. تم تقييم إمكانات الحماية ضد الخلل البطاني باستخدام TNF- الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs).

2. المواد والأساليب

2.1 تحضير كسور أنثوسيانين وغير أنثوسيانين بوليفينول

تم تجانس فاكهة عنب الثعلب المجمدة (Vaccinium Vitis-idea L.) التي تم الحصول عليها من شركة DANEX (PHU "DANEX" ، فيلين ، بولندا) إلى لب الفاكهة ، والتي تم تجميدها لاحقًا عند درجة -80 وتعريضها للتجميد والتجفيف وفقًا للإجراء الموصوف سابقًا [11]. تم تعليق مسحوق الفاكهة في محلول مائي مكون من 0. 75 بالمائة (حجم / حجم) حمض أسيتيك. كانت نسبة المواد الصلبة (غ) والمستخلص (مل) 1:10. بعد الخلط في خلاط دوامة لمدة 30 ثانية ، تم وضع المعلق في حمام صوتي (5 دقائق ، 20 درجة). مرة أخرى ، تم تقليب خليط الاستخلاص في خلاط دوامة لمدة 30 ثانية وتركه ليقف عند 20 درجة.

بعد 10 دقائق ، تم طرد العينة عند 3600 × جم (10 دقائق ، 20 درجة) ، وتم جمع المادة الطافية التي تم الحصول عليها. تم صب المستخلص الطازج في المواد الصلبة المتبقية لبدء مرحلة الاستخلاص الثانية. كان إجراء المرحلة الثانية هو نفس الإجراء الأول. تم دمج مستخلصات كلتا المرحلتين وطردهما عند 12 ، 000 × جم لإزالة بقايا الفاكهة الصغيرة.

في الخطوة التالية من تحضير الكسر ، تم إجراء إزالة السكريات والأحماض العضوية من المستخلص. تم إجراء الفصل باستخدام نظام كروماتوغرافيا الهواء AKTA Explorer 1 0 0 المجهز بعمود زجاجي XK 26/20 (GE Healthcare، Chicago، IL، USA) ). كان العمود مملوءًا بـ 40 مل من Amberlite XAD -7 راتينج HP macroporous الممتز (DuPont ، Wilmington ، DE ، الولايات المتحدة الأمريكية). قبل الإصابة بالعمود ، تم ترشيح المحلول (50 مل من المستخلص الذي تم الحصول عليه في مرحلة الاستخراج) باستخدام 0. 45- مرشح حقنة بحجم المسام (Millex-HV Durapore PVDF) مع مرشح مسبق من الألياف الزجاجية (Merck ميليبور ، برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيق ثلاثة شطفات: أ - 5 بالمائة (ت / س) حمض الفورميك ، ب - ميثانول ، و ج - 0.1 بالمائة (ش / س) حمض الفورميك. تم تحضير محاليل حمض الفورميك بخلط كمية مناسبة من حمض الفورميك مع الماء منزوع الأيونات. تم تعديل معدل التدفق eluent عند 5 مل / دقيقة. أثناء الفصل ، تم استخدام البرنامج الكروماتوغرافي التالي: موازنة العمود: 95 بالمائة A ، 5 بالمائة B ، 3 CV (حجم العمود) ؛ حقن عينة -50 مل من المستخلص ؛ غسل المواد غير المربوطة -1: 100 بالمائة C ، 6 CV ؛ غسل المواد غير المربوطة -2: 100 بالمائة أ ، 1 سيرة ذاتية ؛ شطف: 20 بالمائة أ ، 80 بالمائة ب ، 5 سلالم ؛ غسيل العمود: 100 بالمائة ب ، 2.5 سيرة ذاتية.

تم تبخير التدفق الكامل لمرحلة الشطف التي أظهرت الامتصاصية (التي تمت مراقبتها عند λ {0}} و 320 و 520 نانومتر إلى الجفاف عند 30 درجة باستخدام مبخر دوار (Laborota 4003 HB control ، Heidolph ، ألمانيا). تم إذابة المواد الصلبة في محلول مائي بنسبة 0.75 في المائة (o / o) حمض أسيتيك. تم نقل المحلول إلى قوارير زجاجية وتجميدها عند -85 درجة ، ثم وضعها في مجفف تجميد بيتا {{8) }} (Martin Christ ، ألمانيا). تم إجراء التجفيف بالتجميد لمدة 48 ساعة. تم التجفيف الفعلي تحت ضغط 10 باسكال لمدة 40 ساعة (20 ساعة عند درجة حرارة الرف -15 درجة و 20 ساعة عند تم إجراء التجفيف النهائي عند درجة حرارة 22 درجة لمدة 8 ساعات بدون تحكم في الضغط. تم تخزين المستحضرات الصلبة في قوارير محكمة الإغلاق تحت جو النيتروجين عند -85 درجة مئوية.

تمت إذابة المحتوى الصلب للقنينة في محلول مائي بنسبة 5 بالمائة (o / o) من حمض الفورميك وتم ترشيحه باستخدام 0. 45- مرشح حجم مسام ميكرومتر （Merck Millipore）. تم إجراء فصل الأنثوسيانين عن مركبات البوليفينول الأخرى في العينات باستخدام كروماتوجراف الهواء AKTA Explorer 100 ، المجهز بكاشف UV / VIS وعمود Agilent Zorbax SB C18 (250 × 21.2 مم). تم الفصل عند درجة 20. كان معدل تدفق الطور السائل 21 مل / دقيقة. تم استخدام شطفين: -5 بالمائة (حجم / حجم) حمض الفورميك في الماء و ب ميثانول. بعد موازنة العمود (95 بالمائة A ، 5 بالمائة B ، 3 CV) وحقن العينة بحجم 2 مل ، تم إجراء الفصل في تدرج معقد. كان برنامج التدرج على النحو التالي: 5 بالمائة ب -0. 5 سيرة ذاتية ؛ 20 بالمائة ب -2 سيرة ذاتية ؛ 20 بالمائة ب -1. 2 سيرة ذاتية ؛ 30 بالمائة ب -3. 5 سيرة ذاتية ، 30 بالمائة ب -1. 2 سيرة ذاتية ، 45 بالمائة ب -3. 5 سيرة ذاتية ، 45 بالمائة ب -1. 2 سيرة ذاتية ، 100 بالمائة ب -2. 5 سيرة ذاتية ، 100 النسبة المئوية ب -2. 5 السيرة الذاتية. تم جمع النفايات السائلة ذات الامتصاص عند λ =520 نانومتر وتم الإشارة إليها على أنها جزء من الأنثوسيانين - ACN -. تم أيضًا جمع التدفق الخارج الذي يظهر الامتصاص عند 入 =320 نانومتر وتم الإشارة إليه على أنه جزء بوليفينول غير الأنثوسيانين (PP). تم تبخير كلا الجزأين ، وتم إذابتهما في محلول مائي من حمض الأسيتيك ، ثم تجفيفهما بالتجميد ، وتخزينهما كما هو موصوف أعلاه. تم شراء جميع المواد الكيميائية المستخدمة في تحضير كسور ACN و PP من Sigma-Aldrich (Merck Group ، بوزنان ، بولندا).

2.2 تحديد البوليفينول وتحديد الكمي في كسور ACN و PP

تم تحليل تركيبة البوليفينول لكسور ACN و PP بواسطة طريقة HPLC-DAD-ESI-MS على نظام HPLC من سلسلة Agilent 1200 (Agilent Technologies، Inc. مع نظام Agilent 6224 وقت الرحلة MS. تم إجراء عمليات الفصل الكروماتوغرافي على عمود 150 × 2.1 مم ، 3- ميكرومتر C18 （تقنيات الكروماتوغرافيا المتقدمة ، أبردين ، اسكتلندا). توضح دراسة منشورة سابقًا شروط الفصل (الطور المتحرك ، برنامج شطف التدرج ، معدل التدفق ، حجم حقن العينة) [11].

تم تسجيل كروماتوجرام HPLC عند 280،325،355 ، و 520 نانومتر ، موصى به للكشف عن مركبات الفلافان ، ومشتقات حمض الهيدروكسي سيناميك ، والفلافونول ، والأنثوسيانين ، على التوالي.

تم قياس كمية مركبات البوليفينول في كسور ACN و PP كمكافئات لـ cyanidin -3- O-glucoside (anthocyanins) ، catechin ((epi) catechin and procyanidins) ، 4- حمض الهيدروكسي بنزويك (مشتقات حمض الهيدروكسي بنزويك) ، حمض الفيروليك (مشتق حمض الفيروليك) ، وحمض الكلوروجينيك (3- O-caffeoylquinic acid) ، وحمض p-coumaric (مشتق حمض الكوماريك) ، وحمض الغاليك ثلاثي الهيدروكسي (حمض البنزويك ومشتقات أربوتين) ، وكيرسيتين (كيرسيتين جليكوسيدات) . تم حقن جميع العينات في ثلاث نسخ من محاليل معدة بشكل مستقل لكسور ACN و PP.

بعد المرور عبر كاشف DAD ، تم توجيه شطف العمود إلى نظام MS المزود بمصدر تأين بالرش الكهربائي (ESI) يعمل في وضع الأيونات الموجبة والأيونات السالبة. تعرض مقالة منشورة مسبقًا معلمات ESI-MS المستخدمة لتحديد المركبات الفينولية في كسور ACN و PP [11]. تم تحقيق التحكم في الأدوات وجمع البيانات والتحليل باستخدام برنامج MassHunter B.04. 00 (Agilent Technologies، Inc.، Santa Clara، CA، USA). قدمت Sigma-Aldrich معايير الفينول وكواشف أخرى لتحليل HPLC / DAD / MS.

2.3 3T 3- المستوى 1 ثقافة الخلايا الشحمية وعلاجها

تم الحصول على خلايا L1 السابقة للماوس 3T 3- من American Type Culture Collection (ATCC ، CL -173). تمت زراعة الخلايا عند 37 درجة تحت نسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، الغلاف الجوي في وسط نسر Dulbecco المعدل (DMEM) (Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا) مع 1 0 بالمائة (س / س) مصل بقري جنيني (FBS) (Gibco ، Thermo Fisher Scientific Polska ، وارسو ، بولندا). 3T 3- خضعت الخلايا الأولية L1 لعملية التمايز باتباع البروتوكول الموصوف سابقًا [11]. تم بذر الخلايا الأولية بكثافة 2.5 × 1 0 4 خلايا / سم 2 في 12- أطباق جيدة وزرعتها حتى وصلت إلى نقطة التقاء. ثم تم تحفيزهم لمدة يومين بخليط تمايز يحتوي على 0.25 ميكرومتر من ديكساميثازون (سيغما-ألدريتش ، بوزنان ، بولندا) ، 0.5 ملي مولار 3- أيزوبوتيل -1- ميثيل زانثين （سيجما-ألدريتش ، بوزنان ، بولندا） و 1 ميكرومتر من الأنسولين （Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا） في DMEM مع 10 بالمائة FBS. تم استبدال الوسيط بـ DMEM مع 10 بالمائة من FBS و 1 ميكرومتر من الأنسولين. بعد يومين ، تم استبدال وسط الثقافة بـ DMEM مع إضافة 10 بالمائة من FBS وتم تحديثه على فواصل زمنية 2- يومًا حتى تمت معالجة الخلايا الشحمية L1 في اليوم 12.3T 3- لمدة 24 ساعة باستخدام كسور ACN و PP عند بتركيزات 5 و 10 و 20 ميكروغرام / مل.

2.4.HUVEC الثقافة والعلاج

تم الحصول على الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) من ATCC (CRL {{0}}). تم زراعة HUVECs في F -12 Kmedium (ATCC) مع 10 بالمائة FBS (Gibco) ، مكمل نمو الخلايا البطانية من الأنسجة العصبية البقري (30 ميكروغرام / مل) (Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا) ، والهيبارين ( 100 ميكروغرام / مل) (سيغما الدريش ، بوزنان ، بولندا). تم زرع بذور HUVEC بكثافة 6 × 103 خلية / سم 2 على 24- ألواح جيدة مغطاة بمحلول كولاجين ذيل الفئران (Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا). ثم تم تعريض 24- من مزارع HUVECs لمدة 3 ساعات لكسور ACN و PP بتركيزات 0.1 ، و 10 ميكروغرام / مل وتم معالجتها لاحقًا بـ TNF- (10 نانوغرام / مل) (سيغما-ألدريتش ، بوزنان ، بولندا) لمدة 3 ساعات إضافية للحث على الالتهاب.

2.5 فحص جدوى الخلية

تم تحليل قابلية بقاء الخلايا الشحمية المتضخمة 3T 3- L1 و TNF - - HUVECs المستحثة ، غير المعالجة والمعالجة باستخدام كسور ACN و PP ، باستخدام MTT (3- (4 ، {{7 }} dimethylthiazol -2- yl) -25- diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich، Poznan، Poland) باتباع الإجراء الموضح سابقًا [13]. لم تؤثر التركيزات المنخفضة من جزيئات ACN و PP المطبقة في معالجة الخلايا على لون الوسط وقراءة الامتصاصية في اختبار MTT.

2.6 تحديد إنتاج ROS داخل الخلايا

تم قياس توليد ROS في الخلايا الدهنية L1 3T 3- باستخدام مقايسة تترازوليوم نيترو الأزرق (NBT) بناءً على الإجراء الموصوف سابقًا [14]. بعد 90- دقيقة من الحضانة في محلول 0. 2٪ NBT (Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا) ، تم غسل الخلايا بمحلول ملحي مخزون الفوسفات وتثبيته بالميثانول. بعد استخراج الفورمازان باستخدام KOH و DMSO ، تمت قراءة الامتصاصية عند 620 نانومتر Tecan Infinite M200 ، Tecan Group Ltd. ، Männedorf ، سويسرا).

2.7.قياس محتوى الدهون داخل الخلايا

تم تحديد تأثير جزيئات PP و ACN على محتوى الدهون في الخلايا الشحمية المتضخمة بواسطة طريقة تلطيخ الزيت الأحمر O (Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا) الموصوفة سابقًا [13] ومن خلال قياس إجمالي الدهون الثلاثية (TG) باستخدام مجموعة اختبار تكوين الشحم ( Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد محتوى TG داخل الخلايا بمقايسة إنزيم. تم قياس المنتج اللوني المقابل لـ TG الحالي عند 570 نانومتر. تم حساب تركيز TG بناءً على المنحنى المرسوم لمعيار TG.

2.8 استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل PCR في الوقت الحقيقي

تمت معالجة 3 T 3- L1 adipocytes و HUVECs باستخدام TRI-Reagent (Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا) لعزل إجمالي الحمض النووي الريبي. تم إجراء تخليق أول حبلا (كدنا) باستخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة توليف أول ستراند (كدنا) للناسخ ، تشخيص روش ، بولندا) بناءً على تعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء التقدير الكمي للتعبير الجيني باستخدام نظام PCR في الوقت الفعلي (SmartCycler DX في الوقت الحقيقي نظام PCR Cepheid ، Sunnyvale ، CA ، USA）. يحتوي خليط PCR في حجم نهائي قدره 25 ميكرولتر على عينة cDNA （1 ميكرولتر） ، محددة للأمام و الاشعال العكسي （5 ميكرومتر / 1 ميكرولتر） ، و SYBR⑧ اختر Master Mix （12.5 ميكرولتر） （Life Technologies ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية）. يتم عرض تسلسل التمهيدي في الجدول S1. تضمنت ظروف ركوب PCR تمسخًا أوليًا عند 94 درجة لـ 10 دقائق ، تليها 40 دورة PCR: 40 ثانية عند 95 درجة ، و 30 ثانية عند 59 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 72 درجة. تم حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2- △ ACT. تم تطبيع مستويات النص إلى -أكتين بالنسبة للخلايا الشحمية 3T 3- L1 و GAPDH لـ HUVECs. تم التعبير عن تعبير mRNA النسبي كتغيير أضعاف مقارنة بخلايا التحكم (غير المعالجة). تم إجراء جميع التفاعلات في ثلاث نسخ.

2.9- تحديد إنتاج الأديبوكين

تم قياس تركيزات اللبتين والأديبونكتين باستخدام مجموعات ELISA (Sigma-Aldrich ، بوزنان ، بولندا) باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة. تم إجراء القياس الكمي باستخدام معايرة المعايير. تم فحص كل معيار وعينة في ثلاث نسخ. تم حساب معاملات التباين بين المقايسة وداخل المقايسة على التوالي عند 12.5 في المائة و 9.3 في المائة للبتين و 11.2 في المائة و 7.9 في المائة للأديبونكتين.

2.10 التحليل الإحصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج STATISTICA الإصدار 13.3 (Stat-soft ، Inc. ، تولسا ، أوكلاهوما ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) واختبار Tukey اللاحق لتقدير الاختلافات بين القيم المتوسطة للمجموعات المتعددة. تحقق اختبار ليفين من المساواة في افتراض التباينات. تم تعيين الدلالة الإحصائية عند p<>

3. النتائج والمناقشة

3.1. تكوين البوليفينول في Lingonberry ACN و PP كسور

ركزت الدراسة على مستحضرين بوليفينول منفصلين عن فاكهة عنب الثور: جزء الأنثوسيانين ACN والجزء غير الأنثوسيانين PP. يتم عرض ملفات تعريف البوليفينول في كسور ACN و PP المحددة بناءً على تحليل HPLC-DAD-ESI-MS في الجدول 1. يتكون جزء ACN من ثلاثة مركبات أنثوسيانين رئيسية ، موجودة في مستخلص فاكهة عنب الثور [11] ، وهي مشتقات أساسها السياندين ، بما في ذلك 3- O-galactoside (82.5 بالمائة) و ​​3- O-arabinoside (13. 0 بالمائة) و ​​3- O-glucoside (4.5 بالمائة) (الجدول 1 أ) .

الجدول 1. تم الحصول على المركبات المحددة في جزء الأنثوسيانين (ACN) (A) وجزء البوليفينول غير الأنثوسيانين (PP) (B) من فاكهة عنب الثعلب.

The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5 في المائة): بروسيانيدين من النوع أ وب ، كاتشين ، 3- حمض الكافويلكوينيك ، حمض الفيروليك ، هيكسويد ، كيرسيتين ومشتقاته (3- O-galactoside ، 3- O- arabinofuranoside ، 3- O-rhamnoside). يوضح الجدول 1 ب البيانات الطيفية الجماعية لجميع مركبات البوليفينول التي تم تحديدها مبدئيًا في جزء PP من فاكهة عنب العنب.

تم استخلاص هذه المقالة من Nutrients 2021، 13، 885 7