يظهر الليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز المفرز قدرة أقوى على منع تضخم الكيس في خلايا ADPKD مقارنة بالشكل غير المفرز Ⅱ

3. النتائج

3.1. مقارنة تعبير NGAL وتكاثر الخلايا بين خلايا M-1 Wild Type و2L3 ADPKD

تم إنشاء خط الخلايا 2L3 عن طريق نقل فيروس SV40 للخلايا الظهارية الكلوية الأولية من الفئران Pkd1L3 / L3 [17]. تم استخدام خلايا M -1 (خط الخلايا الظهارية الكلوية من النوع البري للماوس) التي تم شراؤها من BCRC (هسينشو ، تايوان) كعنصر تحكم. تم إجراء التنميط الجيني PCR لنصوص Pkd1 لخلايا 2L3 وM-1 للتحقق من الأنماط الجينية باستخدام الاشعال قبل وبعد موقع loxP الأول في الإنترون 30 من الأليل المستهدف (الشكل 1A). تم استخدام أنسجة الفأر Pkd1+/+ وPkd1L3/+ وPkd1L3/L3 كعناصر تحكم في التنميط الجيني. أظهرت منتجات PCR من خلايا M -1 نطاقًا واحدًا من النوع البري (WT) Pkd 1+/+ (473 نقطة أساس)، بينما أظهرت منتجات PCR من خلايا 2L3 نطاقًا واحدًا Pkd1L3/L3 (507 نقطة أساس) بسبب قطعة loxP إضافية (34 نقطة أساس) (الشكل 1B).

لتحديد ما إذا كانت الخلايا M-1 و2L3 تنتمي إلى هذه الخلاياالأنابيب الكلوية من أصول مماثلة، قمنا أولاً بمقارنة الشكل بين خطي الخلايا؛ أظهرت الخلايا M -1 والخلايا 2L3 شكلًا مشابهًا جدًا (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تلوين الكتين باستخدام لوتس تيتراجونولوبوس ليكتين (LTL، علامة على الأنابيب القريبة المتمايزة، الموسومة بالفلوريسئين) وDolichos biflorus agglutinin (DBA، علامة على الأنابيب البعيدة المتمايزة والقنوات المجمعة، المسمى بالرودامين) للتحقق من أصولها. من الأنابيب الكلوية (الشكل 1D). أظهرت نتائج التلطيخ أن الخلايا M -1 و2L3 كانت على حد سواء LTL- (متحدة في الغالب مع DAPI) وإيجابية DBA (مترجمة في السيتوبلازم) (الشكل 1D). تشير هذه النتيجة إلى أن الخلايا M-1 و2L3 نشأت منالأنابيب الكلويةمن أصول متشابهة وقد يكون لها خصائص متشابهة. أظهرت نتائج PCR في الوقت الحقيقي أن خلايا 2L3 قد خفضت بشكل كبير مستويات تعبير Pkd1 mRNA مقارنة بخلايا M -1 (الشكل 1E)، وهو ما كان متسقًا مع البيانات من الفئران 2L3 مع مستويات تعبير بروتين Pkd1 بنسبة 25٪ فقط من تلك الخاصة بالفئران البرية [17]. ثبت أن الفئران 2L3 لديها مستويات أعلى من بروتين مستقبلات NGAL وNGAL (NGAL-R) في كليتيها مقارنةً بالفئران البرية [31]. أظهرت نتائج PCR في الوقت الحقيقي أن مستوى تعبير Lcn2 mRNA كان 15.96- ضعفًا أكبر في 2L3 منه في خلايا M-1 (الشكل 1F)، بما يتوافق مع البيانات المُبلغ عنها لفئران 2L3 [31]، بينما لم يكن هناك فرق كبير في التعبير Slc22a17 مرنا بين المجموعتين (الشكل 1G). أظهرت نتائج اللطخة الغربية أيضًا أن خلايا 2L3 لديها مستوى تعبير أعلى من NGAL مقارنة بخلايا M-1، ​​بينما لم يكن هناك فرق كبير في مستوى التعبير عن NGAL-R بين المجموعتين (الشكل 1H). تم حصاد الخلايا والمواد الطافية للخلايا M -1 و 2L3 بعد الاستزراع لمدة 48 ساعة لتحديد كمية NGAL في المحللات الخلوية والمواد الطافية (التي تمثل NGAL المفرز) بواسطة ELISA. تمشيا مع نتائج اللطخة الغربية، أظهرت ELISA أن 2L3 يحتوي على NGAL أعلى بكثير داخل الخلايا وإفراز NGAL في طاف من M -1 (الشكل 1I).

لقد ثبت أن الفئران 2L3 تظهر تكاثرًا أعلى للخلايا مقارنة بالفئران البرية [17]. وأجريت فحوصات دمج MTT وBrdU لمعرفة ما إذا كان خط الخلية 2L3 أظهر أيضًا قابلية البقاء والتكاثر بشكل أفضل من الخلايا البرية (الشكل 2A-C). كشفت الصور التمثيلية عن التقاء أكبر لخلايا 2L3 مقارنة بخلايا M -1 بعد الثقافة لمدة 48 ساعة بنفس أرقام البذر الأولية (الشكل 2A). أظهرت فحوصات MTT أن خلايا 2L3 تتمتع بصلاحية أفضل بكثير من خلايا M -1 المستنبتة لمدة 24 و48 ساعة (الشكل 2B). لمقارنة قدرة تكاثر الخلايا M-1 و2L3، تم استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة بعد اختبار دمج BrdU، والذي أظهر أن خلايا 2L3 لها تكاثر أفضل بكثير من الخلايا M-1 (الشكل 2C) .

أعشاب جديدة لأمراض الكلى

3.2. آثار إضافة mNGAL على صلاحية وانتشار خلايا 2L3

ثبت أن إدارة NGAL خارجي المنشأ يقلل من نمو الكيس في المختبر [25]. أظهرت دراستنا السابقة أن الإفراط في التعبير عن NGAL في نموذج الفأر ADPKD (Pkd1L3/L3؛ NGALTg/Tg الفئران) قلل من تطور الكيس مصحوبًا بتغييرات في سلسلة من المسارات الجزيئية المشاركة فيتكاثر الخلايا, موت الخلايا المبرمج، وتليف[31]. ولذلك، نحن التحقيق في آثار mNGAL المؤتلف على بقاء الخلية 2L3 باستخدام مقايسة MTT (الشكل 3). تم تحديد نقاء mNGAL المؤتلف (بدون إشارة الببتيد) المنقى من E. coli لأول مرة بواسطة SDS-PAGE وتلطيخها باللون الأزرق Coomassie، الذي كشف عن نطاق 20- كيلو دالتون واحد ونطاق باهت خفيف جدًا بتركيزات عالية ( الشكل 3أ). وبالإضافة إلى ذلك، تم تحليل استقرار mNGAL في وسط زراعة الخلايا عن طريق النشاف الغربي، مما أظهر استقرار mNGAL في الوسط لمدة 48 ساعة على الأقل (الشكل 3B). لاحظنا أن mNGAL انخفض بشكل كبير من صلاحية خلايا 2L3 مقارنة بالمجموعة الضابطة بعد العلاج لمدة 8 ساعات (الشكل 3C). تم استخدام Rapamycin كعنصر تحكم إيجابي في هذه التجربة، والذي يُعرف بأنه مثبط لـ mTOR ومن المعروف أنه يمنع تكاثر الخلايا الظهارية ونمو الكيس في نموذج الفأر PKD [32]. بالإضافة إلى ذلك، أظهر اختبار دمج BrdU أيضًا أن علاج mNGAL لمدة 24 ساعة يمنع بشكل كبير تكاثر خلايا 2L3 (الشكل ثلاثي الأبعاد). يعد تكاثر الخلايا سمة رئيسية لـ ADPKD، واكتشاف أن تكاثر خلايا 2L3 يمكن تقليله بواسطة mNGAL يشير إلى أن mNGAL قد يمنع تكوين الكيس في خلايا 2L3.

3.3. مسارات الإشارة المتأثرة بإضافة mNGAL إلى خلايا 2L3

لقد ثبت أن اقتران NGAL وNGAL-R يعزل الحديد داخل الخلايا ويحفز موت الخلايا المبرمج [29]. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات أن NGAL يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج في نموذج ADPKD في المختبر وفي الجسم الحي [25،31]. لاستكشاف ما إذا كان mNGAL يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج للخلايا 2L3، قمنا بتحليل موت الخلايا المبرمج للخلايا 2L3 عن طريق قياس التدفق الخلوي. بناءً على النتيجة التي مفادها أن mNGAL يمنع تكاثر خلايا 2L3 بعد علاج mNGAL لمدة 8 ساعات (الشكل ثلاثي الأبعاد)، قمنا بتحليل تأثيرات mNGAL على خلايا 2L3 في كل من النقاط الزمنية السابقة (4 ساعات) واللاحقة (12 ساعة).

لتحليل التدفق الخلوي، كانت هناك حاجة إلى أعداد خلايا أعلى بكثير ومدة ثقافة أقصر من تلك التي أجريت سابقًا في فحوصات MTT؛ ولذلك، تم زرع خلايا 2L3 على 6-ألواح جيدة، وتم تطبيق تركيز أعلى من mNGAL (600–1200 ميكروغرام/مل) على الخلايا. وأظهرت النتائج أن 1200 ميكروغرام/مل منجال يمنع بشكل كبير بقاء الخلية بعد 4 و 12 ساعة من العلاج، في حين أن 600 ميكروغرام/مل منجال يمنع بقاء الخلية فقط بعد 4 ساعات من العلاج (الشكل 3ه). وأجريت فحوصات موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي للكشف عن الخلايا الملطخة Annexin V-FITC وPI. يحتوي Annexin V على درجة تقارب عالية للفوسفاتيديل سيرين (PS) ويستخدم لتحديد الخلايا المبرمج ذات الفوسفاتيديل سيرين المكشوف [33]. وفقا لنتائج تلطيخ، يمكن تصنيف الخلايا على أنها طبيعية (AV− / PI−)، وموت الخلايا المبرمج المبكر (AV + / PI−)، وموت الخلايا المبرمج المتأخر (AV + / PI +)، ونخر (AV− / PI +)، وتظهر في المخططات الرباعية (الشكل 3F). تحتفظ الخلايا في مرحلة موت الخلايا المبرمج المبكرة بأغشية سليمة، والتي تختلف عن الخلايا في مرحلة موت الخلايا المبرمج المتأخرة ذات الأغشية المتحللة [34]. أظهرت النتائج أن معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا 2L3 (بما في ذلك موت الخلايا المبرمج المبكر AV+/PI− والمتأخر AV+/PI+) قد زاد بشكل ملحوظ مقارنة مع مجموعة التحكم بعد 12 ساعة من العلاج بـ mNGAL (1200 ميكروغرام/مل؛ الشكل 3F، G). ).

الشكل 1. مقارنة تعبير NGAL بين النوع البري M-1 وخلايا 2L3 ADPKD. (أ) بنية النوع البري وأليلات L3 لجين Pkd1. تم إجراء التنميط الجيني PCR باستخدام الاشعال قبل وبعد أول loxP داخل intron 30 من Pkd1. المثلثات المملوءة: loxP؛ تم إدراج جين مقاومة النيومايسين الذي يحركه مروج mc1 (mc1-neo) محاطًا بموقعين loxP في الإنترون 34 من Pkd1. (B) التنميط الجيني PCR لنصوص Pkd1 لخلايا M-1 (473 نقطة أساس) وخلايا 2L3 (507 نقطة أساس). تم استخدام نسخ Pkd1 للفئران البرية (+/+)، متغايرة الزيجوت (L3/+)، والمتجانسة (L3/L3) كعنصر تحكم. أظهر RT – qPCR أن 2L3 يحتوي على Pkd1 (C) M -1 أقل بشكل ملحوظ وأن خلايا 2L3 أظهرت مورفولوجيا مماثلة. شريط النطاق: 100 ميكرومتر. (D) تم تلوين خلايا M -1 و2L3 باستخدام Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL، المسمى بـ Fluorescein، الأخضر) وDolichos biflorus agglutinin (DBA، المسمى بمنجم Rhoda، الأحمر) وDAPI (الأزرق) ولاحظه مجهر متحد البؤر. شريط النطاق: 50 ميكرومتر. أظهر RT – qPCR أن 2L3 يحتوي على مستويات تعبير Pkd1 (E) وأعلى Lcn2 (NGAL) (F) أقل بكثير من تلك الموجودة في الخلايا البرية من النوع M -1. ( G ) لا يوجد فرق كبير في مستويات التعبير Slc22a17 (NGAL-R) بين الخلايا M -1 و 2L3. RQ: القياس الكمي النسبي=2 −ΔΔCt؛ تم استخدام Gapdh كعنصر تحكم داخلي لكل عينة. تم تطبيع القيم إلى M-1. (ح) أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن 2L3