يظهر الليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز المفرز قدرة أقوى على منع تضخم الكيس في خلايا ADPKD مقارنة بالشكل غير المفرز

الكلمات الرئيسية: أدبكد؛العدلات الجيلاتيناز المرتبطة بالليبوكالين; ثقافة ثلاثية الأبعاد

أعشاب جديدة ل

1. مقدمة

يتميز مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD)، وهو أحد الأمراض الوراثية الأكثر شيوعًا، بتطور كيسات مملوءة بالسوائل على طول أجزاء متعددة من النيفرون [1]. ADPKD هو الشكل الأكثر شيوعًا لـ PKD، وهو مرض PKD يصيب البالغين ولا تظهر أعراضه على معظم المرضى حتى يبلغوا الأربعينات من العمر [2]. ADPKD هو نتيجة طفرات في جينات PKD1 (85%) أو PKD2 (15%) التي تشفر البوليسيستين -1 (PC1) والبوليسيستين -2 (PC2)، على التوالي [3،4]. ترتبط العيوب في PC1 أو PC2 بزيادات غير طبيعية في تكاثر الخلايا الظهارية الكلوية وتتسبب أيضًا في تكوين الكيس [5-7]. مع تقدم ADPKD، تتضخم الأكياس وتعطل بنية الكلى الطبيعية، مما يؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي. ومع ذلك، فإن الآلية المشاركة في ADPKD معقدة ولا يزال يتعين استكشافها. يؤدي الفقد الوظيفي لـ PC1 و/أو PC2 في ADPKD إلى انخفاض تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا، مما يخفف من إنزيم محلقة الأدينيل (AC) الحساس للكالسيوم ويؤدي أيضًا إلى زيادة مستوى الأدينوزين أحادي الفوسفات الحلقي داخل الخلايا (cAMP) [8،9]. يحفز cAMP تكاثر الخلايا الظهارية وإفراز السوائل لتعزيز تضخم الكيس عن طريق تنشيط بروتين كيناز A (PKA) ومسار Ras/B-Raf/MEK/ERK [10،11]. لقد ثبت أن الخلل الوظيفي في الالتهام الذاتي يحدث في أسماك الزرد ADPKD والفئران في المختبر [12] والفئران في نماذج الجسم الحي [13]. تعد الالتهام الذاتي آلية حاسمة تحافظ على توازن الخلايا والأعضاء عن طريق تحلل وإعادة تدوير العضيات والبروتينات طويلة العمر والمواد المغذية [14،15]. يحدث الحديث المتبادل بين مسار mTOR للالتهام الذاتي ومسارات موت الخلايا المبرمج، والذي يكون غير منظم في PKD [16]. العلاج بمنشطات الالتهام الذاتي، مثل الراباميسين والكاربامازيبين، يمكن أن يخفف بشكل كبير من تكوين الكيس [12]. في السابق، أنشأنا نموذج فأر ADPKD يسمى Pkd1L3/L3 (في الخلفية الجينية C57BL/6) [17] عن طريق إدراج موقع loxP وكاسيت mc1-neo محاط بـ loxP في الإنترونات 30 و34 من جين Pkd1 ، على التوالي (L3 يعني ثلاثة مواقع loxP داخل الأليل)، لتوليد طفرة الجين الشرطية. أنتجت الفئران Pkd1L3/L3 مستويات منخفضة (20٪ من السيطرة) من PC1، مما أدى إلى نمو الكيس العدواني وتوسيع حجم الكلى مع زيادة العمر [17]. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء نموذج خلية ADPKD (خط خلية 2L3) عن طريق نقل فيروس SV40 للخلايا الظهارية الكلوية الأولية من الفئران Pkd1L3/L3 للحث على خطوط الخلايا الخالدة [18].

يعتبر الليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز (NGAL)، وهو بروتين يفرز 22- كيلو دالتون، كمؤشر حيوي لإصابات الكلى، بما في ذلك PKD لدى البالغين [19] (ولكن ليس لدى الأطفال [20])، وأمراض الكلى المزمنة [21] ]، ونقص تروية الكلى الحاد [22]. آلية زيادة بروتين NGAL في بول المريض ليست واضحة، وقد اقترح أن NGAL المتراكم في البول يرتبط بتدهور الخلايا الظهارية الكلوية نتيجة للإصابة [23]. أشارت بعض الدراسات إلى أن NGAL يلعب دورًا وقائيًا ضد إصابات الكلى، وموقع نقص التروية [24]، وقمع تطور الكيس [25]، في حين أشارت بعض الدراسات إلى أن NGAL قد يكون متورطًا في تطور الكيس [26] وتطور الورم [27] ]. يتم التعبير عن مستقبل NGAL (NGAL-R، Slc22a17) في الأنسجة الظهارية المتعددة، بما في ذلك النيفرونات الكلوية [28]. يمكن أن يقوم اقتران NGAL وNGAL-R باحتجاز الحديد داخل الخلايا وتحفيز موت الخلايا المبرمج [29]، والذي يرتبط باستراتيجية استنفاد الحديد في الجهاز المناعي الفطري ضد العدوى البكتيرية [30].

ثبت أن إدارة NGAL الخارجية تزيد من موت الخلايا المبرمج للخلايا Pkd1 - / - وتقلل من نمو الكيس في المختبر [25]. في العمل السابق، أنشأنا فئران Pkd1L3/L3 × NGAL−/− وفئران Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg عن طريق تهجين فئران Pkd1L3/L3 مع فئران NGAL المعطلة والفئران المعدلة وراثيًا، على التوالي [31]. لقد وجدنا أن الإفراط في التعبير عن NGAL في نموذج الفأر ADPKD (الفئران Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg) قلل من تطور الكيس وأطال عمر الفئران Pkd1L3/L3، مصحوبًا بتغييرات في سلسلة من المسارات الجزيئية المشاركة في الانتشار وموت الخلايا المبرمج والنمو. التليف [31]. ومع ذلك، فإن الآلية الأساسية لتأثيرات NGAL في التخفيف من تطور ADPKD تظل غامضة.

في هذه الدراسة، تم إنشاء منصة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لاختبار تطور الكيس للخلايا الظهارية الكلوية Pkd1L3/L3 (خلايا 2L3) مع إضافة بروتين NGAL (mNGAL) الماوس المؤتلف أو الإفراط في التعبير عن NGAL المعدل وراثيًا في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، تم استكشاف آثار العقلية على الانتشار، وموت الخلايا المبرمج، والمسارات المرتبطة بالالتهام الذاتي. علاوة على ذلك، تم توضيح آلية NGAL في خلايا 2L3 من خلال فحص آثار الإفراط في التعبير عن NGAL المفرز (pN + LS) وNGAL غير المفرز (pN - LS) في خلايا 2L3. تم استكشاف التأثير والآلية التي يمكن تصورها لبروتين NGAL في خلايا ADPKD جزئيًا في هذه الدراسة.

2. المواد والأساليب

2.1. خطوط الخلايا

تم إنشاء خط الخلايا Pkd1L3/L3 (2L3) عن طريق نقل فيروس SV40 للخلايا الظهارية الكلوية الأولية من الفئران 2L3، وهو نموذج فأر ADPKD، للحث على خط خلية مخلّد [17،18]. تم إصابة خلايا الكلى الأولية في مرورها الثاني باستخدام مجموعة تخليد فيروس Lenti SV40 (Capital Biosciences Inc.، Gaithersburg، MD، USA). تم تحضين الخلايا في 5% من ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتم معالجتها بمادة البوليبرين (8 ميكروجرام/مل) طوال الليل في طبق مكون من ستة آبار. وفي اليوم التالي، تم التخلص من المادة الطافية الفيروسية، وحضنت الخلايا في وسط جديد. بعد الوصول إلى التقاء، تم زراعة الخلايا فرعيًا في طبق 10- سم مع وسط استنبات واعتبرت خلايا مرور واحدة (P1). تم اختيار الحيوانات المستنسخة المحولة SV 40- وعزلها باستخدام حلقات الاستنساخ [17،18]. تم استخدام خط الخلية M -1 (Pkd 1+/+) الذي تم شراؤه من BCRC (هسينشو، تايوان) كخط الخلايا البرية.

2.2. ثقافة الخلية

تم تمرير الخلايا كل ثلاثة أيام. لاختبار IC50 من mNGAL في خلايا ADPKD، تم زرع خلايا 2L3 في 24- صفائح جيدة (6000 خلية/بئر) مع 500 ميكرولتر من الوسط الموصوف أعلاه واحتضانها لمدة 16 ساعة. تمت معالجة الخلايا بعد ذلك باستخدام mNGAL المؤتلف (0، 20، 40، 80، 160، 320 ميكروغرام / مل) أو الراباميسين (1 ميكرومتر، من سيجما، سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية) مقابل 0 أو 8،24 أو 48 أخرى. ح (ن=4).

2.3. تلطيخ الليكتين

للتحقق مما إذا كانت خلايا M{{0}} و2L3 من الأنابيب الكلوية ذات أصول مماثلة، تم تلوين الكتين باستخدام لوتس تيتراجونولوبوس لكتين (LTL، وهو علامة متباينة للنبيبات القريبة الموسومة بالفلوريسئين) ودوليتشوس بيفلوروس آغلوتينين (DBA). ، وهو عبارة عن علامة قناة تجميع متباينة تحمل علامة رودامين). تم شراء LTL وDBA من Vector Laboratories (Burlingame، CA، USA). لمراقبة الخلايا، تم غسل الخلايا المزروعة على ساترة بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS) ثلاث مرات لمدة 10 دقائق ثم تم تثبيتها باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في PBS لمدة 30 دقيقة. بعد النفاذية بنسبة 0.4% Triton X-100 في PBS (PBST) لمدة 20 دقيقة، تم حظر الخلايا باستخدام مصل حصان 10% في PBST لمدة 1.5 ساعة. كانت الخلايا ملطخة بـ LTL (20 ميكروغرام/مل) وDBA (20 ميكروغرام/مل) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. كانت النوى ملطخة بـ DAPI (1 ميكروغرام/مل) لمدة 5 دقائق. تم غسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق بين الخطوات.

2.4. الحمض النووي المحللة والتنميط الجيني

بالنسبة للتنميط الجيني لجين Pkd1، تم استخدام PCR للأمام (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30) والعكس (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30) لتضخيم تسلسل الحمض النووي الجينومي. تم تسخين العينات عند درجة حرارة 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تم إجراء 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 56 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة) تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و25 درجة مئوية ج لمدة 5 دقائق. بعد التضخيم بواسطة PCR، تم خلط منتجات الحمض النووي مع 6 × صبغة تحميل وتم تحليلها باستخدام هلام agarose Tris-borate-EDTA (TBE) بنسبة 1%.

2.5. تفاعل البلمرة المتسلسل للنسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي (RT – qPCR)

تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي من خط الخلية باستخدام مجموعة استخراج MagQu gDNA (MagQu، مدينة تايبيه الجديدة، تايوان) متبوعة بمعالجة DNase I (Worthington، Lakewood، NJ، USA) وتخزينها في ddH2O عند -80 درجة مئوية. تم تحديد جودة وتركيز الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام هلام الاغاروز TBE 1٪ ومقياس الطيف الضوئي NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). تم نسخ قالب RNA إلى cDNA باستخدام مجموعة توليف RevertAid First Strand cDNA (Thermo Fisher Scientific) بحضور مثبط RNaseOUTTM RNase (G-Biosciences، St. Louis، MO، USA). تم إعداد كل تفاعل بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر، بما في ذلك إجمالي الحمض النووي الريبي (100 نانوغرام)، أوليجو (dT) 18 تمهيدي (1 ميكرولتر)، 5X Reaction Buffer (4 ميكرولتر)، مثبط RiboLock RNase (20 U)، dNTP Mix ( 1 ملم)، والنسخ العكسي RevertAid (200 U)، والمياه خالية من نوكلياز. لتخليق [كدنا] أول حبلا، تم تسخين العينات عند 42 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم تم إنهاء التفاعل بالتسخين عند 70 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.

تم إجراء القياس الكمي للتعبير الجيني باستخدام نظام PCR StepOne ™ في الوقت الحقيقي (Applied Biosystems، Norwalk، CT، USA). تم إعداد كل عينة بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر، بما في ذلك الاشعال الأمامي الخاص بالجينات (100 نانومتر)، والبادئات العكسية (100 نانومتر) (الجدول 1)، وقالب [كدنا] (100 نانوغرام)، ORATM SEE qPCR Green ROX H Mix (1 × ، High GmbH، Kraichtal، ألمانيا) ومياه PCR. تم تسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين، تليها 40 دورة (95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، 65 درجة مئوية لمدة 25 ثانية) ثم تحليل منحنى الانصهار (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة) ، 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية) باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي من StepOne™. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج StepOne™ (الإصدار 2.3). تم استخدام التعبير الجيني لـ Gapdh للتطبيع.

2.6. فحص صلاحية الخلية

تم تحديد قابلية الخلية للخلايا باستخدام بروميد التترازوليوم الأزرق (مقايسة MTT) (سيجما). تمت إضافة محلول MTT (0.5 مجم/مل) إلى كل بئر وحضن عند درجة حرارة 37 ◦ مئوية لمدة ساعتين. لإذابة بلورات فورمازان الأرجوانية، تمت إضافة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO، Sigma) إلى كل بئر بعد الإزالة الحل المتوسطة وMTT. تم قياس الكثافة البصرية (OD) لكل عينة عند 570 نانومتر باستخدام قارئ ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.7. فحص تكاثر الخلايا

تم إجراء اختبار تكاثر خلايا بروموديوكسيوريدين (BrdU) (ميليبور، برلنغتون، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحليل تكاثر خلايا M-1 و2L3. لمقارنة قدرة تكاثر الخلايا M-1 و2L3، تم استزراع الخلايا في 96- صفائح جيدة (5 × 10 خلية / بئر) لمدة 24 ساعة. تمت إضافة BrdU إلى الوسط لمدة ساعتين قبل نهاية فترة الحضانة. لاستكشاف تأثير mNGAL على تكاثر خلايا 2L3، تمت زراعة خلايا 2L3 لأول مرة في 96- أطباق جيدة (2 × 10 خلية / بئر) لمدة 16 ساعة تليها معالجة mNGAL لمدة 8 و24 و48 ساعة أخرى. تمت إضافة BrdU إلى الوسط لمدة ساعتين قبل نهاية فترة حضانة الوجبة. تم بعد ذلك تثبيت الخلايا بمحلول التثبيت (200 ميكرولتر / بئر) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تليها الحضانة باستخدام الجسم المضاد للكشف عن BrdU (100 ميكرولتر / بئر) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة والجسم المضاد للفأر الماعز المترافق مع البيروكسيديز. (100 ميكرولتر/جيد) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام Wash Buffer وتجفيفها على مناشف ورقية بين الخطوات الموصوفة أعلاه.

بعد الحضانة مع الركيزة TMB بيروكسيديز (100 ميكرولتر / بئر) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام، تم إيقاف التفاعل بمحلول التوقف (100 ميكرولتر / بئر). وأخيراً، تم قياس OD450 لكل عينة باستخدام قارئ ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.8. فحص موت الخلايا المبرمج

لتحليل موت الخلايا المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي، تم زرع خلايا 2L3 في 6- صفائح جيدة (1.8 × 1 0 5 خلايا / بئر) مع وسط 2 مل واحتضانها لمدة 16 ساعة. تمت معالجة الخلايا بعد ذلك باستخدام mNGAL (0، 600، 1200 ميكروغرام / مل) لمدة 0 أو 4 أو 12 ساعة أخرى، وتم جمعها وصبغها باستخدام Annexin V-FITC وPI (BD Biosciences، San Jose، CA، USA). ) للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي عند 4 و12 ساعة، على التوالي (n=3، للتحكم وmNGAL). لإنشاء التعويض والأرباع قبل التحليل، تم استخدام الخلايا غير الملوثة، والخلايا الملطخة بـ Annexin V-FITC فقط، والخلايا الملطخة بـ PI فقط.

2.9. تحليل لطخة غربية

تم حصاد الخلايا وإزالتها باستخدام RIPA المكمل بكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (1: 1 0 0) والفوسفاتيز (1: 100). بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية، تم الطرد المركزي لمحلول الخلية لمدة 15 دقيقة عند 13400 × جم (إيبندورف 5415R، هامبورغ، ألمانيا) عند 4 درجات مئوية. تم قياس تركيزات البروتين باستخدام اختبار BCA. تم فصل الكميات المتساوية من البروتين (25 ميكروغرام من البروتين مع صبغة تحميل 1:2/بئر) كهربائيًا بواسطة SDS-PAGE (10٪) وتم نقلها لمدة ساعة واحدة إلى أغشية PVDF. تم بعد ذلك حجب الأغشية بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي تريس مع 0.1٪ توين -20 (TBST) لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل باستخدام TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق، تم تحضين الأغشية بالأجسام المضادة الأولية (الجدول 2) طوال الليل عند 4 درجات مئوية، تليها حضانة 1- ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP (الجدول 3).

2.10. ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد (ثقافة ثلاثية الأبعاد)

تم إجراء الثقافة ثلاثية الأبعاد باستخدام مصفوفة Matrigel (كورنينج، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقييم تكوين الكيس. تم زرع خلايا 2L3 في 96-ألواح بئر (1000 خلية/بئر) على مادة Matrigel مسبقة التشكيل (40% في الوسط). بعد أن تم ربط الخلايا بالهلام، تمت إضافة المزيد من الماتريجيل إلى الخلايا لتشكيل نمط يشبه الساندويتش (الشكل 6). تم الحفاظ على الخلايا في ثقافة ثلاثية الأبعاد عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. عولجت الخلايا بالفورسكولين (20 مم، سيجما) من اليوم الأول إلى اليوم الثالث للحث على تكوين الكيس. بعد تحفيز تكوين الكيس باستخدام الفورسكولين، عولجت الخلايا باستخدام أو بدون mNGAL (2 ملغم/مل) من الأيام 4 إلى 8، وتم تغيير الوسيط كل يوم. تمت ملاحظة تكوين الكيس تحت المجهر كل يوم، وتم قياس قطر الكيس ومساحته وعدده باستخدام ImageJ. تم إجراء الكيمياء المناعية (ICC) في اليوم الثامن على اللوحة أو الأغطية. تم إجراء مراقبة الخراجات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (ZEISS، Oberkochen، Germany).

2.11. الكيمياء المناعية (ICC)

لمراقبة الخراجات، تم غسل الأكياس المزروعة باستخدام Matrigel في الآبار أو على الأغطية ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 1 0 دقيقة ثم تم تثبيتها باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في PBS لمدة 30 دقيقة. بعد النفاذية بنسبة 0.4% PBST لمدة 20 دقيقة، تم حظر الخراجات باستخدام 10% مصل حصان في PBST لمدة ساعتين. تم تلطيخ الأكياس بالأجسام المضادة الأولية ضد E-cadherin (1: 500؛ Cell Signaling Technology، Danvers، MA، USA) والأكتين (1: 1000؛ Millipore) طوال الليل عند 4 درجات مئوية ثم صبغها بجسم مضاد ثانوي فلوري (الجدول 3). في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. كانت النوى ملطخة بـ DAPI (1 ميكروغرام/مل) لمدة 5 دقائق. تم غسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق بين الخطوات.

2.12. المجهر متحد البؤر

للتأكد من أن التركيبات الكروية التي لوحظت في الثقافة ثلاثية الأبعاد كانت عبارة عن خراجات، تم تركيب ساترة من الثقافة ثلاثية الأبعاد على شرائح باستخدام وسط تركيب Fluoromount-G (SouthernBiotech، Birmingham، AL، USA) وتم تصويرها باستخدام مجهر متحد البؤر. تم إجراء التصوير متحد البؤر بهدف غمر الزيت 63 ×. تم الحصول على أقسام z بصرية مختلفة لكيس 2L3 في ثقافة ثلاثية الأبعاد باستخدام وحدة Z-stack في برنامج المجهر ZEISS ZEN (Oberkochen، ألمانيا). تمت إعادة بناء المقاطع البصرية للخراجات إلى فيديو Z-stack أو ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج المجهر ZEISS ZEN.

2.13. البناء البلازميد والعدوى الفيروسية

تم إدراج تسلسل NGAL للماوس (534 نقطة أساس) في ناقل pSecTag2B (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) في الإطار وفي أسفل مجرى تسلسل زعيم سلسلة Igκ الفئران للتعبير الزائد عن بروتين NGAL المفرز. على العكس من ذلك، تمت إزالة تسلسل زعيم سلسلة Igκ الفئران في البلازميد الموصوف أعلاه لزيادة التعبير عن بروتين NGAL غير المفرز. تم تصميم pSecTag2B-NGAL مع أو بدون التسلسل القائد (pN + LS أو pN - LS، على التوالي) لدراسة الارتباط بين NGAL ومستقبل NGAL. لضمان الإدراج الصحيح للبنيات، تم استخدام NheI وNotI لهضم pN + LS أو pN - LS مع NEBuffer 2 (New England Biolabs، Ipswich، MA، USA) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين متبوعًا بالتحليل باستخدام 1٪ جل تي بي إي.

لتوليد الحيوانات المستنسخة المستقرة، تم تحضين خلايا 2L3 في وسط DMEM/F12 (300 ميكرولتر/جيد) مكمل بـ 10% FBS غير نشط للحرارة، و1% P/S، والبوليبرين (8 ميكروغرام/مل)، والفيروس البطيء (200 ميكرولتر) في 6-صفيحة جيدة عند درجة حرارة 37 ◦ مئوية لمدة 24 ساعة. تم بعد ذلك التخلص من طاف الفيروس، وتم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضانها بوسيط جديد يحتوي على بلاستيسيدين (4 ميكروغرام/مل) لاختيار الخلايا المصابة. تم تغيير وسيلة الاختيار كل 3 أيام. تم حصاد الخلايا المصابة بعد أسبوع واحد من اختيار البلاستيدين للنشاف الغربي وRT-QPCR لتحليل مستوى التعبير mNGAL.

2.14. مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

تم إجراء القياس الكمي للـ NGAL الذي تفرزه الخلايا باستخدام مجموعة ELISA ذات الطور الصلب من شطيرة lipocalin {{0}} (Lcn2) (Thermo Fisher Scientific). تم جمع الوسط الطافي للخلايا وطرده لإزالة حطام الخلية وتخزينه عند -8 0 ◦C. بالنسبة للمنحنى القياسي، تم إعداد تخفيفات سلسلة 8 × من بروتين NGAL القياسي للماوس (0، 0.024، 0.195، 1.563، 12.5، 100 نانوغرام/مل). تمت إضافة المعايير (100 ميكرولتر / بئر) والعينات (100 ميكرولتر / بئر من 10 ميكروغرام من البروتين الكلي من محللة الخلية أو طاف غير مخفف) إلى طبق البئر 96- وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. تم تحضين كل بئر مع البيوتين (100 ميكرولتر / بئر) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم بمحلول الستربتافيدين-HPR (100 ميكرولتر / بئر) عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف. تم التخلص من المحلول وغسل البئر به

بعد الحضانة مع الركيزة TMB (100 ميكرولتر / بئر) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام، تم إيقاف التفاعل بإضافة محلول التوقف (50 ميكرولتر / بئر). وأخيراً، تم قياس OD450 لكل عينة باستخدام قارئ ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.15. التحليل الإحصائي

يتم عرض جميع البيانات على أنها الانحراف المعياري المتوسط ​​(SD). لإجراء مقارنات متوسطة متعددة، تم تحليل البيانات باستخدام اختبار الطالب وتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع اختبارات توكي اللاحقة في استوديو R. واعتبرت الاختلافات ذات دلالة إحصائية عندما تكون القيمة p <0.05.