شيخوخة الجلد هي ظاهرة بيولوجية معقدة بسبب الانخفاض الفسيولوجي

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:كان الهدف من هذه الدراسة هو اختبار التأثير التثبيطي لمستخلصات الفاكهة من الواشنطون فيليفيرا على الإنزيمات المرتبطة بالشيخوخة الجلدية. لم تقم مستخلصات اللب بتثبيط إنزيم معنوي بينما أظهرت مستخلصات بذور دبليو فيليفرا أنشطة مضادة للإيلاستاز ، ومضادة للكولاجيناز ، ومضادة للتيروزيناز. تم تثبيط التيروزيناز بشكل معتدل بينما لوحظ تأثير أقوى فيما يتعلق بتثبيط الإيلاستاز والكولاجيناز. قدمت المستخلصات الكحولية نتائج أفضل من المستخلصات المائية. من بينها ، أظهرت مستخلصات الميثانول الأنشطة المثبطة للإنزيم البارزة حيث كانت قيمة IC5o للإيلاستاز والكولاجيناز قابلة للمقارنة وحتى أفضل من المركب المرجعي. تم التحقيق في وضع التثبيط لأكثر المستخلصات نشاطًا بواسطة تحليل مؤامرة Lineweaver-Burk. تم فحص مستخلصات البذور من دبليو فيليفيرا أيضًا لتأثيرها الواقي من الضوء بواسطة معادلة المنصور وتم تقييم النشاط المضاد للأكسدة لمستخلص دبليو فيليفيرا في الخلايا المؤكسدة. لتقييم سلامة المستخلص ، تم تحليل التأثير على حيوية خلايا الخلايا الكيراتينية البشرية.فقدت الإمبراطوريةقدم مستخلص الميثانول أفضل تأثير وقائي من الصور ونشاط مضاد للأكسدة في نظام خلوي بدون أي تأثير سام للخلايا. توضح النتائج الإجمالية أن مستخلصات دبليو فيليفيرا هي مصادر واعدة للمركبات النشطة بيولوجيًا التي يمكن استخدامها في مستحضرات التجميل والمستحضرات الصيدلانية.

الكلمات الدالة:تثبيط الانزيم كولاجيناز. الإيلاستاز. التيروزيناز. المستخلصات النباتية؛ بذور؛ شيخوخة الجلد؛ واشنطونيا فيليفيرا

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

1 المقدمة

شيخوخة الجلد هي ظاهرة بيولوجية معقدة بسبب الانخفاض الفسيولوجي في وظائف الجلد والعديد من العوامل البيئية الخارجية ، مثل الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). الجلد هو أكبر جزء من الجسم وأكثره تعرضًا للأشعة فوق البنفسجية ، ويمثل التعرض للأشعة فوق البنفسجية الشمسية أحد أهم العوامل الخارجية المسببة للإجهاد: شيخوخة الجلد الناتجة عن الصور المرتبط بالإجهاد التأكسدي. يمكن أن تؤدي أنواع الأكسجين التفاعلية التي يسببها التشعيع فوق البنفسجي إلى بدء مسارات جزيئية معقدة ، بما في ذلك تنشيط الإنزيمات التي تعمل على تحلل بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) في الأدمة ، مما يؤدي إلى تغيير سلامة الجلد [1]. واحدة من الخصائص الرئيسية لشيخوخة الجلد هي في الواقع لوس لبنية ECM ، والتي تتكون من العديد من البروتينات ، بما في ذلك الكولاجين والإيلاستين ، والتي تلعب جميعها دورًا رئيسيًا في الحفاظ على مرونة الجلد [2]. يرجع تدهور ECM بشكل أساسي إلى النشاط المعزز للإنزيمات المحللة للبروتين ، مثل الكولاجيناز والإيلاستاز. قد يكون تثبيط هذه الأنشطة الأنزيمية بمركبات نباتية طبيعية طريقة واعدة لمنع شيخوخة الجلد [3]. ينتمي كولاجيناز (EC 3.4.24.3) إلى عائلة البروتينات المعدنية المصفوفة ويمكن أن يحط من المنطقة الحلزونية الثلاثية للكولاجين في ظل الظروف الفسيولوجية.استخدامات الفلافونويد المنقى المجهرية 1000 مجمالكولاجين هو المكون الليفي لـ ECM والبروتين الهيكلي الرئيسي في جلد الإنسان ، ويوفر الدعم الهيكلي للعظام والأوتار والأربطة والأوعية الدموية. Elastase (EC3.4.21.36) هو إنزيم محلل للبروتين يشارك في التحلل الفسيولوجي للإيلاستين ، وهو بروتين ECM المسؤول عن مرونة الجلد. تم العثور على زيادة في نشاط الإيلاستاز في العديد من الأمراض ، على سبيل المثال ، الصدفية والتهاب الجلد والعمليات الالتهابية وشيخوخة الجلد المبكرة ، والتي ترتبط ارتباطًا وثيقًا بتكوين التجاعيد [4].

يمكن للكيستانش مكافحة الشيخوخة

علاوة على ذلك ، فإن أحد التغييرات الرئيسية المرتبطة بالتجاعيد لدى كبار السن هو ظهور بقع مفرطة التصبغ ، والتي تُعرف أيضًا باسم نمش الشيخوخة أو بقع الشيخوخة. ترتبط ارتباطًا مباشرًا بالتصبغ غير المتكافئ بسبب نشاط إنزيم آخر مرتبط بالشيخوخة يسمى التيروزيناز. Tyrosinase (EC 1.14.18.1) هو إنزيم يحد من معدل التمثيل الغذائي للميلانين. إنه يحفز الهيدروكسيل لـ L-tyrosine إلى 3 ، 4- dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ، متبوعًا بأكسدة L-DOPA إلى dopaquinone. تؤدي البلمرة المؤكسدة لمشتقات الدوباكينون إلى ظهور الميلانين [5]. توليف صبغات الميلانين هي عملية فسيولوجية تلعب دورًا مهمًا في منع تلف الجلد الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية عن طريق امتصاص أشعة الشمس فوق البنفسجية. على الرغم من مزاياها ، فإن الإفراط في إنتاج الميلانين أو التراكم غير الطبيعي له يسبب مشاكل جلدية مثل البقع العمرية النموذجية. نظرًا لأن الجلد هو العضو الأكثر وضوحًا في الجسم ، فإن الظهور المبكر للتجاعيد وفرط التصبغ يمكن أن يسبب أيضًا اضطرابًا عاطفيًا لبعض الأشخاص.

وبالتالي ، قد تمثل مثبطات جميع الإنزيمات الموصوفة أعلاه مكونات ذات أهمية متزايدة في مستحضرات التجميل والأدوية لمنع شيخوخة الجلد [6]. يمكن أن تكون المنتجات النباتية الطبيعية مصدرًا واعدًا للمركبات النشطة بيولوجيًا. ذات أهمية خاصة للتطبيقات المضادة للشيخوخة ، تمتلك المستخلصات وظائف مفيدة متعددة ، مثل تثبيط الإنزيمات المرتبطة بالشيخوخة والقدرة على إزالة الجذور الحرة.

في عملنا السابق ، وصفنا القدرة المضادة للأكسدة والعديد من الأنشطة البيولوجية لمستخلصات بذور دبليو فيليفيرا [7]. واشنطن فيليفيرا (Lindl.) H. Wendl. ، والمعروفة باسم نخيل مروحة كاليفورنيا أو نخيل مروحة الصحراء ، هي شجرة نخيل دائمة الخضرة موطنها جنوب كاليفورنيا وأريزونا والمكسيك والمناطق الصحراوية.oteflavonoidهذه النخلة ، التي يبلغ ارتفاعها 15-20 م ، لا تنتج التمر ولكنها تمتلك ثمارًا حلوة ولذيذة صالحة للأكل. تحتوي هذه التوت على بذرة بنية كبيرة جدًا محاطة بلب رقيق (الشكل 1). تمت دراسة دبليو فيليفيرا فيما يتعلق ، على سبيل المثال ، باستخدامه كمصدر محتمل للألياف السليلوزية الجديدة [8] والقيمة الغذائية لثمارها [9] ؛ تم الإبلاغ أيضًا عن التركيب الفينولي والنشاط المضاد للأكسدة للأجزاء الهوائية [10]. في دراستنا السابقة ، أبلغنا عن النشاط الجيد المضاد للأكسدة لـ W.البيوريتان فيتامين جمستخلصات بذور الفليفرا ، والتي يبدو أنها مصدر لجزيئات الفينول والفلافونويد [7]. نفس المستخلصات لها تأثير مثبط على إنزيمات زانثين أوكسيديز وكولينستريز ، والتي تمثل الإنزيمات الرئيسية في علاج مرض النقرس ومرض الزهايمر ، على التوالي.

كان الهدف من هذا العمل هو توسيع توصيف هذا النبات وتقييم الاستخدام المحتمل لمستخلصاته كعامل مضاد للشيخوخة. لذلك ، تم فحص مستخلصات اللب والبذور لأنشطتها التثبيطية تجاه نشاط الإيلاستاز والكولاجيناز والتيروزيناز ، لأنها تمثل الإنزيمات المستهدفة الرئيسية للوقاية من شيخوخة الجلد وعلاجها ؛ علاوة على ذلك ، تم تحليل مستخلصات دبليو فيليفرا التي تُظهر أفضل الأنشطة الواعدة من حيث السمية الخلوية في المختبر ، ونشاط مضادات الأكسدة الخلوية ، وتأثيراتها الواقية من الضوء.

2. النتائج والمناقشة

2.1. تثبيط الانزيم

تم اختبار مستخلصات بذور ولب W. filifera أولاً بتركيز 50 ميكروغرام / مل.سيستانشلم تقم جميع مستخلصات اللب بتثبيط إنزيم كبير (البيانات غير معروضة). تم حساب الأنشطة المثبطة للإنزيم لمستخلصات البذور والتعبير عنها بتركيز مثبط نصف الحد الأقصى (أيضًا). يوضح الجدول 1 قيم ICso التي تم الحصول عليها من مستخلصات البذور مقارنةً بالمثبطات القياسية ، من أجل تقييم القوة المثبطة للعينات. كما يمكن ملاحظته ، فإن جميع المستخلصات تمنع نشاط التيروزيناز بشكل ضعيف ، مع قيم ICso أعلى من تلك الموجودة في حمض الكوجيك القياسي. لوحظ تثبيط أفضل ضد أنشطة الإيلاستاز والكولاجيناز ، كما أن المستخلصات الإيثانولية (EEG و EES) والميثانولية (MEG و MES) كانت لها أفضل التأثيرات. كان النشاط المثبط لهذه العينات ضد الإيلاستاز مشابهًا ؛ تراوحت قيم ICso من 10.75 إلى 19.75 ميكروغرام / مل وكانت مماثلة لقيم التحكم الإيجابي （حمض الأولينوليك ؛ ICso =11. 75 ميكروغرام / مل）.

بدلاً من ذلك ، تم إعاقة نشاط الكولاجيناز بشدة بواسطة المستخلصات ، والتي أظهرت فاعلية أعلى من epigallocatechin gallate القياسي ، حيث كان ICso أقل بثلاثة أضعاف من التحكم الإيجابي. بالنظر إلى أن المستخلصات كانت عبارة عن مزيج من عدة مركبات ، كان تركيز الجزيئات النشطة المفردة أقل من قيمة IC ، مما يجعل المستخلصات مصادر واعدة أكثر للمركبات المثبطة.

2.2 التحليل الحركي بواسطة مؤامرة Lineweaver-Burk

ركزنا اهتمامنا على مستخلصات الإيثانول والميثانول من أجل التحقيق في طريقة تثبيط هذه الإنزيمات حيث كان لها تأثير أفضل ضد أنشطة الإيلاستاز والكولاجيناز. تم تحديد حركية التثبيط بواسطة مؤامرة Lineweaver-Burk المزدوجة المتبادلة. تم إجراء الاختبارات عن طريق زيادة تركيز الركيزة المعنية في غياب ووجود المستخلصات بتركيزات مختلفة.

يوضح الجدول 2 أن EEG و EES كانا بمثابة مثبطات غير قادرة على المنافسة ضد الإيلاستاز. في الواقع ، أنتج التحليل الحركي لهذه المقتطفات عائلة من الخطوط المتوازية لزيادة تركيزات المستخلص (الشكل 2 أ ، ب). يشير هذا التحليل الكيريتيك إلى أن هذه المقتطفات يمكن أن ترتبط بمركب الركيزة الإنزيمية. تم حساب ثابت الاتزان (Krs) من إعادة تسريع الاعتراضات (1 / Vmax) مقابل تركيز المثبط ، مما أدى إلى قيمة 3.91 و 8.89 ميكروغرام / مل لـ EEG و EES ، على التوالي. كشفت طريقة تثبيط المستخلصات الميثانولية بالفعل أن هذه المستخلصات تعمل كمثبط غير تنافسي. في الواقع ، من خلال زيادة تركيز المستخلصات ، تم العثور على عائلة من الخطوط المستقيمة ذات المنحدرات المختلفة ، وكلها متقاطعة على الحد الفاصل (الشكل 2C ، D). يشير هذا التحليل إلى أن المستخلصات يمكن أن ترتبط ليس فقط بمركب الركيزة الإنزيمية ولكن أيضًا بالإنزيم الحر. تم الحصول على ثوابت التوازن للارتباط مع الإنزيم الحر (Kj) ومع مركب الركيزة الإنزيمية (Kis) إما من المنحدر (Km / Vmax) أو قيم 1 / Vmax (تقاطعات y) المرسومة مقابل تركيز المثبط ، على التوالى.أخيرًا ، يظهر السلوك الحركي للكولاجيناز بتركيزات مختلفة من المستخلصات في الشكل 3 أ-د. عملت جميع المقتطفات كمثبطات غير تنافسية مع قيم Krs في نطاق 7. 58-13. 04 ميكروغرام / مل （الجدول 2）.

في عملنا السابق ، قمنا بتحليل المستخلصات الكحولية لبذور W. filifera ، باستخدام HPLC-DAD-ESI / MS. لقد أوضحنا أن المركبات الفينولية الرئيسية لهذه المستخلصات تتكون من فلافان -3- أول [7]. من بينها ، كانت بروسيانيدينات من النوع ب هي المركبات الرئيسية في مستخلصات بذور دبليو فيليفيرا. لوحظ وجود علاقة إيجابية بين درجة بلمرة البروسيانيدين وقدرة البروسيانيدين على تثبيط الإيلاستاز في ورقة سابقة [11 ، 12]. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن نشاط مثبط ضد الإيلاستاز والكولاجيناز بواسطة بعض مركبات البروسيانيدين [13 ، 14]. يمكن أن يسهم العمل التآزري لهذه المركبات في تفسير التثبيط الكبير لمستخلص الميثانول دبليو فيليفرا ضد كلا الإنزيمين.

2.3 عامل الحماية من الشمس

يعتبر النشاط الواقي من الضوء مهمًا جدًا للمركبات التي يمكن استخدامها على الجلد ، لذلك حددنا عامل الحماية من الشمس (SP) لمستخلصاتنا. يشير عامل الحماية من الشمس إلى قدرة المادة على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، مما يحمي الجلد من التأثيرات السامة الناتجة عن هذه الأشعة. تمتلك مستحضرات التجميل النباتية إمكانات كبيرة في امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لأن المستخلصات النباتية تحتوي على مادة البوليفينول ، مثل الفلافونويد أو الكاروتينات. هذه المركبات ، التي لها حلقات عطرية ، يمكنها امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، وبالتالي يمكن أن تعمل كمرشح للشمس. نظرًا لأن مستخلصات البذور الكحولية لـ W.filifera تحتوي على مركبات الفينول والفلافونويد [7] ، فقد تم تقييم تأثيرات الحماية من الصور لهذه المستخلصات. كما هو مبين في الجدول 3 ، أظهرت جميع المستخلصات التي تم تحليلها ، بتركيز 100 ميكروغرام / مل ، قيم SPF تتراوح من 1.52 إلى 3.35. تم الكشف عن أن مستخلصات الميثانول تمتلك أفضل تأثيرات الحماية من الضوء. الأشعة فوق البنفسجية هي المسؤولة عن أمراض الجلد وتؤدي إلى ظهور العمليات التي تؤدي إلى شيخوخة الجلد والإجهاد التأكسدي وتكوين التجاعيد. وبالتالي ، فإن تقليل امتصاص هذا الإشعاع يعزز ، بطريقة غير مباشرة ، الأنشطة المضادة للأكسدة وتثبيط الإنزيمات المرتبطة بالشيخوخة.

2.4 حيوية الخلية ومستوى ROS داخل الخلايا

نظرًا لأن الإجهاد التأكسدي هو عامل رئيسي في التسبب في الشيخوخة والضرر المرتبط بالعمر ، فقد فحصنا أيضًا ما إذا كانت مستخلصات W. filifera تمنع HO 2- من إحداث ROS في النظام الخلوي. في ورقة سابقة ، وصفنا الأنشطة المضادة للأكسدة لمستخلصات البذور باستخدام طريقة القياس الطيفي (مقايسة ABTS) [7]. تم الكشف عن أن العينات مصدر جيد للمركبات الفينولية ذات الخصائص المضادة للأكسدة ، حيث أظهر MEG أفضل نشاط. نظرًا لأن هذا المستخلص يحتوي على أفضل نشاط مضاد للأكسدة وإمكانات كبيرة أيضًا ، مع الأخذ في الاعتبار الأنشطة التثبيطية ضد الإنزيم الذي تم اختباره (الكولينستيراز ، الزانثين أوكسيديز ، والإنزيمات الشيخوخة المعروضة هنا) ، قررنا تأكيد قدرة مضادات الأكسدة لـ MEG في نموذج خلوي.

أولاً ، تم التحقيق في آثار مستخلص دبليو فيليفيرا على حيوية الخلية في خلايا هاكات. تم استخدام خط الخلايا الكيراتينية البشرية الخالد على نطاق واسع كنموذج لدراسة توازن البشرة [15]. من أجل تحديد سلامة هذا المستخلص ، تمت معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة من العينة لمدة 24 ساعة وفحصها باستخدام اختبار MTT. تشير النتائج إلى أن المستخلص لم يكن سامًا للخلايا في خلايا HaCaT ولوحظ انخفاض طفيف فقط (قابلية البقاء بنسبة 80 بالمائة) عند 100 ميكروغرام / مل (الشكل 4). نظرًا لأن الجدوى لم تتأثر حتى 50 ميكروغرام / مل صلاحية 96 في المائة ، قررنا إجراء مزيد من التجارب الخلوية باستخدام ما يصل إلى تركيز المستخلص هذا. قمنا بتقييم مستويات ROS في الخلايا قبل وبعد الإجهاد التأكسدي ، وبعد العلاج باستخدام MEG. أجريت الدراسة باستخدام 21.7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) ، والذي ينتشر بسهولة عبر غشاء الخلية ويتحلل بالماء بواسطة الإسترات الذاتية إلى DCFH. تشير الزيادات السريعة في DCF إلى أكسدة DCFH بواسطة ROS داخل الخلايا ، مثل H2O2. كما هو مبين في الشكل 5 ، أدى حضانة H2O2 إلى زيادة تكوين ROS في خلايا HaCaT بشكل ملحوظ ، ولكن العلاج بالمستخلص كان قادرًا على تثبيط إنتاج H2O {17}} المستحث ROS بطريقة الاستجابة للجرعة. وبالتالي ، تؤكد هذه النتائج فحوصات مضادات الأكسدة وتشير إلى أن MEG قد يقلل أيضًا من تكوين ROS في الخلايا.

أظهر المستخلص الميثانولي الذي تم تحليله في هذه الورقة خصائص عالية مضادة للأكسدة. يتكون التركيب الفينولي لهذا المستخلص من فلافان -3- ol ، وكانت مركبات بروسيانيدين من النوع ب هي المركبات الفينولية الرئيسية [7]. تم الإبلاغ عن بروسيانيدينز ، وهي مجموعة من مادة البوليفينول فلافونويدس ، تعرض مجموعة واسعة من الخصائص البيولوجية والدوائية والكيميائية ضد الجذور الحرة للأكسجين [16 ، 17]. أظهرت دراسة سابقة أن النشاط المضاد للجذور للبروسيانيدين قوي بتركيزات عالية [18]. علاوة على ذلك ، فإن مستخلصات البروانثوسيانيدين هي أكثر فاعلية في تنظيف جذور الأكسدة الفائقة من فيتامين سي المضاد للأكسدة وترولوكس [19].

3. المواد والطرق

3.1 المواد الكيميائية

تم الحصول على جميع الكواشف الكيميائية كمنتجات تجارية نقية من شركة سيجما للكيماويات (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ما لم يُذكر خلاف ذلك ، واستخدمت دون مزيد من التنقية.

3.2 تحضير عينة النبات

جمعت ثمار فليفيرا في تونس في منطقتي قابس (ج) وسوسة (س) ، وتم تحضير المواد النباتية وفق الإجراء الموصوف سابقاً [7]. تم تجفيف اللب والبذور بشكل منفصل ثم تم استخلاص المواد النباتية (25 جم) في 100 مل من الماء (AE ، مستخلص مائي) ، أو الإيثانول (E ، مستخلص الإيثانول) ، أو الميثانول (ME ، مستخلص الميثانول) لمدة 72 ساعة ، في الغرفة درجة الحرارة ، في التحريك المستمر. بعد الترشيح والطرد المركزي عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة ، تم بعد ذلك تجميد المستخلصات المائية ، بينما تم تركيز مستخلصات الإيثانول والميثانول التي تم الحصول عليها تحت التفريغ ، باستخدام مبخر دوار لمزيد من التحليل. تم إذابة القوى المجففة (1 مجم / مل) في DMSO قبل الاستخدام.

3.3 المثبط الأنزيمي

تم التعبير عن نتائج جميع المقايسات الموضحة أدناه كنسبة مئوية من عنصر التحكم الفارغ. تم تحديد تركيزات المستخلصات التي أدت إلى تثبيط نشاط الإنزيم بنسبة 50٪ (ICso) عن طريق الاستيفاء لمنحنيات الاستجابة للجرعة. تم تحديد نموذج التثبيط عن طريق إجراء فحوصات بتركيزات مختلفة من الركيزة وغياب ووجود المستخلصات عند تراكيب مختلفة. تم تحليل بيانات الخواص الحركية باستخدام مؤامرة Lineweaver-Burk. تم تسجيل البيانات من فحوصات النشاط باستخدام مقياس الطيف الضوئي Ultrospec 2100 (Biochrom Ltd. ، كامبريدج ، المملكة المتحدة).

3.3.1. مقايسة تثبيط التيروزيناز

تم تحديد تثبيط نشاط التيروزيناز بواسطة مستخلصات دبليو فيليفرا باستخدام 3 ، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين (L-DOPA) كركيزة [2 0]. احتوى خليط التفاعل على 25 ملي مولار من محلول فوسفات (pH 6.8) ، تيروزيناز فطر (100 وحدة / مل ، تركيز نهائي) ، مع أو بدون محلول مستخلص نباتي. بعد ذلك ، تمت إضافة L-DOPA (0.5 ملي مولار) إلى الخليط وتم تحديد النشاط باتباع الزيادة في الامتصاص عند 492 نانومتر ، الناتجة عن تكوين منتج الدوباكروم. كان نطاق تركيز المستخلص المستخدم في مقايسة تثبيط إنزيم الفطر 0-0. 3 مجم / مل. في الاختبارات التي أجريت بدون مستخلصات نباتية ، تمت إضافة DMSO إلى خليط التفاعل كعنصر تحكم فارغ. تم استخدام حمض كوجيك كعنصر تحكم إيجابي.

3.3.2. مقايسة تثبيط الإيلاستاز

تم تقييم تثبيط Elastase من خلال مراقبة إطلاق p-nitroaniline خلال عمر الانقسام من الركيزة N-succ- (Ala) 3- nitroanilide (SANA) من خلال عمل الإنزيم بالطريقة الموصوفة [21] ، باستخدام تعديلات طفيفة. تم إجراء الفحص في 0. 1 M Tris-HCl buffer (pH8. 0). تم تحضين الإيلاستاز البنكرياس الخنازير (3.3 ميكروغرام / مل) مع أو بدون المستخلص لمدة 20 دقيقة ، وبعد التحريض ، تمت إضافة الركيزة (1.6 ملي مولار) ، وتمت مراقبة نشاط الإنزيم عند 410 نانومتر. تم إجراء التحكم باستخدام DMSO ، بينما تم استخدام حمض الأولينوليك كعنصر تحكم إيجابي.

3.3.3 مقايسة تثبيط كولاجيناز

تم تحضير كولاجيناز من Clostridium histolyticum في محلول Tricine {0}}. 0 5 M ، pH 7.5 ، يحتوي على 0. 4 M NaCl و 0.01 M CaClz ، وحضنت (1 U / مل) مع عينات اختبار بتركيزات مختلفة لمدة 15 دقيقة. تمت إضافة الركيزة الاصطناعية N - (3- [2- Fury]] - acryloyl) -Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) ، المحضرة في نفس محلول المخزن المؤقت ، لبدء التفاعل ( بتركيز نهائي قدره 0.8 ملي مولار). تمت مراقبة الامتصاص عند 340 نانومتر [21]. تم إجراء التحكم باستخدام DMSO ، بينما تم استخدام epigallocatechin gallate كعنصر تحكم إيجابي.

3.4. تحديد عامل الحماية من الشمس في المختبر

تم تحديد عامل الحماية من الشمس لمستخلصات W. filifera باستخدام طريقة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، وفقًا للمنهجية التي وصفها منصور وآخرون. (1986) [22]. تم قياس امتصاص المستخلصات (0. 1 مجم / مل) في نطاق 290-320 نانومتر ، بزيادات قدرها 5 نانومتر ، وتم إجراء ثلاثة تحديدات في كل نقطة. تم حساب SPF من خلال تطبيق معادلة المنصور: حيث CF=عامل تصحيح (10)؛ EE (A)=التأثير الحمضي للإشعاع بطول الموجة λ ؛ I （）=طيف كثافة الشمس ؛ Abs （λ=قيم الامتصاص الطيفي عند الطول الموجي λ. قيم EE （A） × I A） ثابتة. تم تحديدها من قبل Sayre et al. (1979) [23] وهي موضحة في الجدول 4.

3.5.ثقافة الخلية ومستويات ROS داخل الخلايا

تم استنبات خط الخلايا الكيراتينية لجلد الإنسان HaCaT في Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) الذي يحتوي على 10 في المائة من مصل بقري جنيني (FBS ، Gibco ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 1 في المائة بنسيلين / ستربتومايسين عند 37 درجة ، في جو مرطب ، مع 5 تم اكتشاف قابلية بقاء الخلية في المئة من ثاني أكسيد الكربون من خلال المقايسة اللونية 3- (4) 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2. 5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) ، مثل سبق وصفها ، مع تعديل طفيف [24]. بعد فترة حضانة لمدة 24 ساعة مع MEG بتركيزات مختلفة (0-100 ميكروغرام / مل) ، تم تصنيف الخلايا بمحلول MTT لمدة 3 ساعات عند 37 درجة. تم إذابة رواسب فورمازان البنفسجي الناتجة في DMSO وتم تحديد امتصاص كل بئر عند 560 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية بمرجع 630 نانومتر.

تم تحديد مستويات ROS الخلوية باستخدام طريقة DCFH-DA [25]. عولجت خلايا HaCaT بتركيزات مختلفة من MEG (0-50 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا باستخدام DCFH-DA (10 ميكرومتر) عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تمت إضافة 1 ملي مولار HzO2 إلى الآبار ، وتم قياس شدة التألق لـ DCF على الفور باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت بطول موجة إثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 530 نانومتر ، مع أخذ قراءات على فترات من 5 دقائق لمدة 50 دقيقة.

3.6 تحليل البيانات

تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ وتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري （SD） وتم تقييم الفروق الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism الإصدار 8 (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء المقارنة بين المجموعات عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Tukey للمقارنات المتعددة. قيمة Ap أقل من 0. 05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية.

4 - نتائج

في الختام ، أبلغنا ، ولأول مرة ، أن مستخلصات بذور دبليو فيليفيرا فعالة في تثبيط الإنزيمات الرئيسية المتورطة في شيخوخة الجلد. الشيخوخة الطبيعية أو "الجوهرية" هي ظاهرة فسيولوجية تحدث في جميع الأنسجة البشرية نتيجة لمرور الوقت. ومع ذلك ، تتعرض البشرة أيضًا لعوامل خارجية مسببة للتوتر والتي تمثل سببًا رئيسيًا لشيخوخة الجلد المبكرة. الشيخوخة "الخارجية" ترتبط بشكل أساسي بالضرر الذي تسببه الأشعة فوق البنفسجية للنسيج الضام للجلد. تسبب الأشعة فوق البنفسجية الإجهاد التأكسدي ، وهو المسؤول عن تنشيط الإنزيمات التي تؤدي إلى تدهور ECM ، وظهور التجاعيد والبقع العمرية. توضح هذه المخطوطة الأهمية التي يمكن أن تكون لبذور دبليو فيليفرا في هذا السياق. كما هو مبين في الشكل 6 ، يمكن أن تعمل المستخلصات في الوقاية من الشيخوخة المبكرة ، حيث تعمل في نفس الوقت على عدة جبهات.

أولاً ، يمكن أن تعمل المستخلصات في بداية العملية من خلال تأثيراتها الواقية من الضوء ، وبالتالي تقلل من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك ، أظهروا تأثيرًا جيدًا مضادًا للأكسدة مع مستخلص الميثانول ، مما يمنع تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية في الجهاز الخلوي ، دون سمية الخلية. أخيرًا ، يمكن لجميع المستخلصات ، على وجه الخصوص ، العينات الميثانولية ، أن تمنع الكولاجيناز ، والإيلاستاز ، والتيروزيناز (الأخير إلى حد طفيف). بشكل عام ، أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها أن دبليو فيليفيرا يمكن أن يكون مصدرًا للجزيئات النشطة بيولوجيًا وتشجع المزيد من التجارب من أجل عزل المكونات النشطة الوحيدة المسؤولة عن الأنشطة المرصودة.

تم استخراج هذه المقالة من النباتات 2021 ، 10 ، 151. https://doi.org/10.3390/plants10010151 https://www.mdpi.com/journal/plants