الخلايا الجذعية للطب التجديدي ومكافحة الشيخوخة الجزء 1

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:لاستكشاف طرق تحسين معالجة فضلات الخنازير ، تم تحلل جلد الخنازير باستخدام أنواع مختلفة من البروتياز المتاحة تجاريًا (Alcalase و Flavorzyme و Neutrase و Bromelain و Protamex و Papain) في ظل العديد من الظروف المثلى. بعد التحلل المائي الأنزيمي ، تم تجزئة تحلل الكولاجين (CHs) بالوزن الجزيئي (3 كيلو دالتون) عبر الترشيح الفائق الغشائي. تم تحليل CHS للخصائص الفيزيائية (الأس الهيدروجيني ، واستعادة البروتين ، ومحتوى المجموعة الأمينية الحرة ، وتوزيع الوزن الجزيئي ، والتركيب الأميني) وكذلك للخصائص الوظيفية (الأنشطة المضادة للأكسدة وأنشطة مكافحة الشيخوخة). من بين CHs ، أظهرت CHs المتحللة بواسطة Alcalase (CH-Alcalase) أعلى درجة من التحلل المائي مقارنة بمركبات الميثان الأخرى. كلا "CH-Alcalase" و "CH-Alcalase<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

الكلمات الدالة:التحلل المائي؛ البروتياز التجاري تحلل الكولاجين. مضادات الأكسدة. مكافحة الشيخوخة

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

1 المقدمة

مع زيادة متوسط ​​العمر المتوقع ، تحظى إجراءات مكافحة شيخوخة الجلد باهتمام كبير. يستخدم الكولاجين في منتجات العناية بالبشرة كعنصر تجميلي لمكافحة الشيخوخة ، على نطاق واسع في سوق مستحضرات التجميل. الكولاجين هو بروتين ليفي ذو وزن جزيئي مرتفع ، يوجد بكثرة في الأنسجة الضامة والجلد والأوتار والغضاريف والأربطة والأسنان والأظافر وشعر البشر والحيوانات. تظل الثروة الحيوانية المصدر الرئيسي للكولاجين الصناعي [1]. سنويًا ، يتم التخلص من كميات كبيرة من المنتجات الثانوية للماشية في جميع أنحاء العالم ، كنفايات ، بواسطة صناعات معالجة الأغذية واللحوم. ومع ذلك ، يمكن استخدامها كمصادر بروتين مهمة لمواد غذائية جديدة أو تحويلها إلى منتجات ذات قيمة مضافة عبر التحلل المائي ، والذي يتم تطبيقه على نطاق واسع لتحسين الخصائص الوظيفية والتغذوية للبروتينات [2،3] والارتقاء بها. يُنظر إلى الكولاجين أيضًا بشكل متزايد كمصدر للببتيدات النشطة بيولوجيًا ، والتي أظهرت واعدة كمركبات مفيدة للاستخدام في التطبيقات الغذائية أو الصيدلانية.فوائد cistanche ،لذلك ، قد يلعب التحلل المائي للكولاجين دورًا مهمًا في تحسين التوافر البيولوجي ومدى ملاءمته للاستخدام في العمليات التجارية المختلفة.

الأنشطة الفسيولوجية للببتيدات النشطة بيولوجيًا ، والتي تحتوي عادةً على 2-20 مخلفات الأحماض الأمينية (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">cistanche الكوليسترولتؤثر درجة التحلل المائي بشكل مباشر على الوزن الجزيئي وتكوين الأحماض الأمينية للمحللات المائيّة [8]. لذلك ، قد تكون عملية التحلل المائي ضرورية لإنتاج ببتيدات جديدة نشطة بيولوجيًا.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

يمكن إجراء التحلل المائي للبروتين ، الذي يؤدي إلى انقسام روابط الببتيد ، عبر عمليات إنزيمية أو كيميائية [9]. العمليات الكيميائية ، بما في ذلك التحلل المائي القلوي أو الحمضي باستخدام الاستخلاص بالمذيبات ، ضارة ليس فقط بالبيئة ولكن أيضًا للإنسان الذي يستهلك المنتجات الناتجة [4،10]. تنتج العمليات الكيميائية ، التي يصعب التحكم فيها ، منتجات تحتوي على أحماض أمينية معدلة [9]. في المقابل ، يمكن إجراء التحلل المائي الأنزيمي في ظل ظروف معتدلة ، وبالتالي تجنب البيئات القاسية التي تتطلبها المعالجات الكيميائية. علاوة على ذلك ، لا تنتج العمليات تفاعلات جانبية ولا تقلل من القيمة الغذائية لمصدر البروتين [8]. العديد من البروتياز ، بما في ذلك Alcalase و Pepsin و Protamex و trypsin و Neutrase ، تستخدم بشكل شائع لتحليل البروتينات ، مما ينتج عنه أنواع مختلفة من تحلل البروتين والببتيدات مع مجموعة متنوعة من الأنشطة الحيوية الوظيفية. ذكرت إحدى الدراسات إنتاج تحلل الكولاجين مع نشاط مضاد للأكسدة من جيلاتين جلد الخنازير باستخدام التحلل الأنزيمي بواسطة البيبسين والبنكرياتين [11].الآثار الجانبية cistanche الصحراءتم تحلل منتجات السلمون الثانوية لإنتاج تحلل هضمي باستخدام بروتياز مختلفة ، حيث أظهرت الببتيدات النهائية خصائص ممتازة مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات [12].

كان الهدف من البحث هو: (أ) تحديد تحلل الكولاجين الأكثر نشاطًا الناتج عن التحلل المائي الأنزيمي باستخدام البروتياز المختلفة المتاحة تجاريًا (Alcalase و Flavorzyme و Neutrase و Protamex و Bromelain و Papain) ؛ (ب) لتأكيد تأثير تجزئة تم الحصول على تحلل الكولاجين من التحلل المائي الأنزيمي ، و (ج) لتحديد أنشطتها المضادة للأكسدة في المختبر ومكافحة الشيخوخة.

2. النتائج والمناقشة

2.1. تأثير التحلل الأنزيمي على تحلل الكولاجين

2.1.1.pH

يمكن تعزيز الخصائص الوظيفية للبروتينات من خلال التحلل المائي بواسطة بروتياز معينة. في هذه الدراسة ، تم استخدام ستة أنواع مختلفة من البروتياز (Alcalase و Flavorzyme و Neutrase و Bromelain و Protamex و Papain) لتحليل الكولاجين من جلد الخنازير من أجل الحصول على تحلل الكولاجين النشط مع أوزان جزيئية منخفضة.جرعة cistanche redditيظهر تغير الأس الهيدروجيني في محللات الكولاجين (CH) في الشكل 1. كان الرقم الهيدروجيني لتعليق الكولاجين (5 بالمائة من خليط جلد الخنزير) مبدئيًا 6. 39-6 55 (عند 0 ساعة). وصل CH-Alcalase و CH-Flavorzyme إلى الرقم الهيدروجيني الأمثل (الرقم الهيدروجيني 8. 0) عند 12 ساعة من الحضانة. وصل CH- Protamex و CH-Bromelain و CH-Papain إلى الرقم الهيدروجيني الأمثل (الرقم الهيدروجيني 7. 0) عند 6 ساعات من الحضانة ، بينما استمر CH-Flavorzyme في الانخفاض من الرقم الهيدروجيني 6.39 إلى الرقم الهيدروجيني 5.69 لمدة 24 ساعة (الشكل 1). يعتبر الرقم الهيدروجيني لبروتين التحلل المائي عاملاً مهمًا ينظم تفاعلات التحلل الأنزيمي [13]. لذلك ، قد يكون توليد التحلل المائي للكولاجين في ظل ظروف مختلفة من الأس الهيدروجيني ناتجًا عن التغيرات المعتمدة على الرقم الهيدروجيني في تشكيل الإنزيم ، مما قد يؤثر على التنشيط الحيوي والخصائص الفيزيائية والكيميائية.

2.1.2. الرحلان الكهربائي جل دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE)

يتم عرض ملامح الرحلان الكهربي للهلام الدوديسيل كبريتات الصوديوم-بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) من الميثان الميثان المعالجة ببروتياز مختلف لمدة 24 ساعة (الشكل 2). أظهر ملف الببتيد لتعليق الكولاجين (عند 0 ساعة) نطاقًا مرئيًا في نطاق الوزن الجزيئي المنخفض إلى العالي. أشارت النتائج إلى التحلل المائي السريع في CH-Alcalase و CH-Neutrase و CH-Bronneline و CH-Protamex ، حيث لم تكن هناك نطاقات بعد الحضانة لمدة 3 ساعات. انخفضت نطاقات نطاق الوزن الجزيئي العالي لـ CH-Alcalase و CH-Neutrase و CH-Protamex بطريقة حضانة تعتمد على الوقت. ومع ذلك ، لم يتغير CH-Bromeline مع وقت الحضانة لأنه يحتوي على بيرة متحللة تمامًا بعد حضانة ساعة واحدة فقط. ومن المثير للاهتمام أن CHs اختفت تمامًا عندما تفاعلت العينة مع Alcalase أو Neutrase لمدة 6 ساعات ، مما يشير إلى أن الكولاجين كان بمثابة ركيزة مناسبة لبعض الإنزيمات الأخرى التي تم اختبارها.فوائد استخراج cistanche ،ومع ذلك ، ظهرت مجموعات من CH-Flavorzyme و CH-Papain في نطاق الوزن الجزيئي المنخفض إلى العالي بعد 24 ساعة. يمكن تحلل البروتينات جزئيًا إلى ببتيدات أو أحماض أمينية عن طريق التحلل المائي الأنزيمي ، اعتمادًا على نوع الأنزيم البروتيني ، ووقت الحضانة ، ونسبة البروتياز إلى الركيزة (كمية البروتين) [14]. يتم تحديد عملية التحلل الأنزيمي بشكل أساسي من خلال ما إذا كان نوع الأنزيم البروتيني المتضمن هو إندوبيبتيداز أو إكزوبيبتيداز [15،16]. نظرًا لأن Alcalase و Neutrase و Protamex عبارة عن ببتيدات داخلية ، فمن المتوقع أن تكسر عمليات التحلل المائي روابط الببتيد من الأحماض الأمينية غير الطرفية بشكل عشوائي ، مما يسهل مزيدًا من التحلل المائي للبروتينات. من ناحية أخرى ، فإن Flavorzyme عبارة عن endo- و exopeptidase ، الذي يكسر غير أو N- الطرفية من سلاسل الببتيد. في هذه الدراسة ، احتوى بروتين الكولاجين على مواقع ربط ، والتي كانت أكثر عرضة لنشاط exopeptidase من نشاط endopeptidase في Flavorzyme. وهكذا ، بسبب نشاط exopeptidase ، تضمن التحلل المائي لبروتينات الكولاجين بواسطة Flavorzyme كسر روابط الببتيد خطوة بخطوة من طرف N للأحماض الأمينية ، مما أدى إلى إبطاء التحلل المائي للبروتين.

2.1.3. استعادة البروتين ومحتوى المجموعة الأمينية المجاني

يظهر استرداد البروتين من الميثانول التي تم الحصول عليها عن طريق البروتياز التجاري المختلفة (الشكل 3 أ). يحتوي عنصر التحكم (تعليق الكولاجين) على محتوى استرداد البروتين 1.19 مجم / مل. إن استرجاع البروتين هو أحد معايير كفاءة التحلل المائي الأنزيمي. تدل نسبة استرداد البروتين المنخفضة في الميثان على زيادة تكسير البروتين. علاوة على ذلك ، يرتبط استرجاع البروتين جيدًا بقابلية ذوبان البروتين. قد يكون سبب النشاط المائي العالي هو زيادة السلاسل الجانبية المكشوفة للماء ، مما يؤدي إلى زيادة التفاعلات الكارهة للماء بين البروتينات و / أو الببتيدات. قد تؤدي هذه السلاسل الجانبية الكارهة للماء إلى انخفاض قابلية ذوبان البروتين ، مما يؤدي إلى زيادة استرجاع البروتين من التحلل المائي. في دراستنا ، كان محتوى استرداد البروتين مرتبطًا جيدًا بالتغيرات في أنماط SDS-PAGE. تم تسجيل أدنى وأعلى مستويات محتوى استعادة البروتين في التحلل المائي Alcalase و Flavorzyme على التوالي. من أجل كفاءة التحلل المائي المتعلقة بوقت الحضانة ، انخفض CH-Alcalase و CH-Bromelain و CH-Protamex بشكل كبير خلال ساعة واحدة من الحضانة مقارنةً بالتحكم. أظهر الانخفاض في محتوى استعادة البروتين الناتج عن التحلل المائي للبروتين علاقة عكسية مع محتوى المجموعة الأمينية. علاوة على ذلك ، أظهرت معظم CHs ، باستثناء CH-Neutrase ، محتوى منخفضًا من البروتين بين 3 ساعات و 12 ساعة. بعد 24 ساعة ، زاد محتواها من البروتين مرة أخرى في CH-Alcalase و CH-Flavorzyme و CH-Neutrase و CH-Bromeline و CH-Protamex و CH-Papain على النحو التالي: 0. 83 مجم / مل ، 1.29 مجم / مل ، 0. 75 مجم / مل ، 0. 97 مجم / مل ، 0. 77 مجم / مل ، و 1.11 مجم / مل على التوالي. تشير بعض التقارير إلى أن الوقت الأمثل للتحلل المائي يعتمد على عدة عوامل مثل الأنواع المختارة ، والمواد الخام ، والإنزيم المستخدم ، ومعدل المادة الخام / الإنزيم ، وتركيز الإنزيم ، ودرجة التحلل المائي ، وما إلى ذلك. ]. تشير بعض التقارير إلى أن التحلل المائي الأنزيمي الممتد (أكثر من 24 ساعة) قد يؤدي إلى انخفاض في نشاط الأنزيم البروتيني ؛ وبالتالي ، يجب إجراء التحلل المائي الأنزيمي في غضون 24 ساعة من التحلل المائي الأنزيمي [17 ، 18].

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated(Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase (1.00 mg/mL)>CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0.53 mg/mL)>CH-Papain (0. 40 مجم / مل): قد تكون الاختلافات الشائعة في إجمالي البروتين أو محتوى المجموعة الأمينية الحرة للعينات المتحللة إنزيمياً مرتبطة بخصوصية الإنزيم. يعتمد على خصائص الإنزيم أثناء عملية التحلل المائي الأنزيمي [16 ، 17]. على سبيل المثال ، يُظهر البروتياز القلوي (مثل Alcalase) أنشطة تحلل مائي أعلى مقارنة بالبروتياز الحمضي أو المحايد.

2.2. تأثير الترشيح الفائق على خصائص تحلل الكولاجين

قد تكون عملية الترشيح الفائق طريقة مفيدة وصناعية مفيدة لإنتاج أجزاء صغيرة من الببتيد مع الحجم الجزيئي المطلوب والنشاط الحيوي المرتفع ، اعتمادًا على تركيبة التحلل المائي الأولي والنشاط الذي تتم دراسته [19]. يظهر الذوبان ، ومحتوى المجموعة الأمينية الحرة ، وعائد الميثان بعد التجميد (الجدول 1). كانت القابلية للذوبان ومحتوى المجموعة الأمينية الحرة لعنصر التحكم 11.95 في المائة و 0. 79 في المائة ، على التوالي. بعد التحلل الأنزيمي والترشيح الفائق بوزن جزيئي 3 كيلو دالتون ، لوحظت أعلى قابلية للذوبان (21.17 بالمائة) ومحتوى المجموعة الأمينية الحرة (14.17 بالمائة) في CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

يُعد متوسط ​​الوزن الجزيئي لتحلل البروتين عاملًا مهمًا في تحديد خصائصها البيولوجية [19]. بشكل عام ، متوسط ​​الكسر بالميغاواط<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw=""> 50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 كيلو دالتون يمثل الكولاجين [20،21]. توزيع الوزن الجزيئي النسبي لعينة التحكم (عينة المعالجة) و CH-Alcalase و CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

يظهر تكوين الأحماض الأمينية في CHs (الجدول 2). يحتوي CHS بواسطة أنواع مختلفة من البروتياز على تركيبات مختلفة من الأحماض الأمينية وخصائص مضادة للأكسدة [23]. كان تكوين الأحماض الأمينية للكولاجين غنيًا بالجليسين (Gly) والبرولين (Pro) وحمض الجلوتاميك (Glu). محتوى الأحماض الأمينية في CHs (CH-Alcalase و CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">

تم استخراج هذه المقالة من Molecules 2019 ، 24 ، 1104 ؛ دوى: 10.3390 / جزيئات 24061104 www.mdpi.com/journal/molecules