التوصيف الهيكلي وتقييم الأنشطة المضادة للالتهابات ومضادات التيروزيناز للبوليفينول من الورم الميلاني العادي الجزء 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

يحتوي المركب 3 على نفس الصيغة الجزيئية للمركب 2 ، كما هو محدد بواسطة بيانات HRESIMS الخاصة به. كشفت المقارنة بين بيانات NMR لـ 3 و 2 (الجدول 2) أن مجموعة الميثوكسيل في galloyl-C -4 في 2 تحولت إلى galloyl-C -3 'في 3. وقد تم تأكيد ذلك من خلال ارتباطات HMBC (الشكل 2) لبروتونات الميثوكسيل (8y 3.88) والبروتون العطري (bH7.24) مع galloyl-C -3 '(6c 149.1) في 3 ، والتحولات الكيميائية لمجموعة الميثوكسيل ، galloyl-C { {24}} و galloyl-C -4 و galloyl-C -3 'التي انتقلت من BC60.8 و151.5 و141.3 و 146.5 في 2tobc56.7 و146.6 و140.7 و 149.1 بوصة 3 على التوالي. يشير تأثير القطن عند 237 نانومتر والتأثير السلبي عند 262 نانومتر في طيف القرص المضغوط إلى التكوين (S) لمجموعة HHDP لـ 3 [24]. تم استنتاج تكوين جزء السكر من ثابت الاقتران (=8. 5 هرتز) للبروتون الشاذ لشق الجلوكوزيل. أسفر التحلل المائي الحمضي لـ 3 مع 1 مولار من حمض الهيدروكلوريك عن D-glucose ، وهو ما أكده تحليلات TLC و GC. ومن ثم ، تم تحديد المركب 3 على أنه 1- O-galloyl -6- O - (3- methoxygalloyl) -2 ، 3- O- (S) -hexahydroxydiphenoyl {{ 66}} د-جلوكوز.

تم استنتاج الصيغة الجزيئية لـ 4 من طيف HRESIMS (m / z 783.1032 ، [MH] -) مثل C35 H28 O21. كان وزنه الجزيئي 16 وحدة كتلة أقل من 3 ، والذي يمكن أن يُعزى إلى عدم وجود هيدروكسيل ووجود بروتون عطري (6H6.87) في الفانيويل- C -5 'في 4 (الجدول 2) . تم تأكيد ذلك من خلال وجود جزء عطري 1،2 ، 4- trisubstituted aromatic （μ7.60 （dd ، J =8. 3،1.8 Hz）، 6.87 （d، J =8 .3 هرتز） و 7.57 （د و J =1. 8 هرتز）） وتغير التحول الكيميائي لـ galloyl-C -5 'عند δc 145.8 في 3 إلى vanilloyl-C -5 'في 115.9 في 4. بروتونات الميثوكسيل (6H 3.90) والبروتونات العطرية (H 6.87) مع الفانيويل- C -3' في طيف HMBC (الشكل 2) أكدت كذلك البروتون العطري (H 6.87) في vanilloyl-C -5 '. تم إثبات أن الأيزومرية لـ HHDP هي تكوين S من خلال ظهور تأثيرات القطن الإيجابية والسلبية عند 239 نانومتر و 263 نانومتر على التوالي [24]. كانت ثوابت اقتران البروتون الشاذ في 4 8.5 هرتز تذكرنا بالتكوين الأحادي. أظهر التحلل المائي للحمض أن 4 تحتوي على نفس وحدات السكر مثل 3. وبالتالي ، تم تحديد المركب 4 على أنه 1- O-galloyl -6- O-vanilloyl -2 ، 3- O- (S) -hexahydroxydiphenoyl - - D- الجلوكوز.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

2.2. فحوصات النشاط المضادة للالتهابات

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50uM. تم الإبلاغ عن أن مركبات الفلافونول المعروفة kaempferol (7) [26 [و quercetin (10) [27l و myricetin -3- O - - L-rhamnopyranoside (12) 28 لها نشاط مضاد للالتهابات ، لكن كايمبفيرول -3- rhamnoside (8) [26] و quercetin -3- O - - L-rhamnoside (11) [29] ليس لهما نشاط مضاد للالتهابات. من النتائج التجريبية وبيانات الأدبيات ، فإن مركبات الفلافونويد الموجودة في نبات العنوان لها نشاط مضاد للالتهابات أفضل من الإيلاغيتانين ، وقد يكون العنصر النشط المقابل للتأثير المضاد للالتهابات لهذا النبات.

2.3 فحوصات النشاط التثبيطي للتيروزيناز

تم فحص جميع المركبات من أجل النشاط التثبيطي المحتمل للتيروزيناز. كما هو مبين في الجدول 3 ، فإن المركبات الجديدة 2-4 تعرض أنشطة معتدلة لتثبيط إنزيم التيروزيناز. أظهر المركب الجديد 1 نشاطًا مثبطًا ضعيفًا للتيروزيناز. يحتوي Quercetin (10) [30] على نشاط مثبط لانزيم التيروزيناز ، كما أن نشاطه المضاد لتيروزيناز أفضل من كيرسيتين -3- OwL-rhamnoside (11) [26] و kaempferol (7) [26] ، وهو ما يتوافق مع بيانات الأدب. يشير هذا إلى أن مجموعات 3'-و 4 /-hydroxy على الحلقة B و 3- مجموعات هيدروكسي على الحلقة C في مركبات الفلافونول كانت حاسمة في أنشطتها. يعتبر النشاط المضاد للتيروزيناز في kaempferol (7) [26] أفضل من kaempferol -3- rhamnoside (8) [26] والمركبان 8 و 12 [31] ليس لهما نشاط هام مضاد للتيروزيناز ، والذي يدعم بشكل أكبر ما سبق علاقات الهيكل والنشاط.

3. التجريبية 3.1. المواد

تم جمع جذور M. تم إيداع عينة قسيمة (20180912) في مختبر Guangxi Key لأبحاث واستخدام المواد الكيميائية النباتية الوظيفية ، معهد Guangxi لعلم النبات ، الصين.

يمكن أن يحسن القدر من المناعة

3.2 الإجراءات التجريبية العامة

تم قياس الدوران البصري باستخدام ADP44 0 بالإضافة إلى مقياس القطبية （λ 589 نانومتر ، وطول المسار 1. 0 سم). تم الحصول على أطياف NMR على مطياف Bruker Advance 5 0 0 （Bruker Biospin AG ، Fällanden ، سويسرا） ، وتم استخدام قمم المذيبات المتبقية كمراجع. تم إعطاء ثوابت الاقتران والتحولات الكيميائية بوحدة هرتز وعلى مقياس δ （جزء في المليون ، على التوالي. تم تسجيل بيانات ESIMS و HIRESIMS على مطياف الكتلة BRUKER HCT ومطياف LCMS-IT-TOF (شيمادزو ، كيوتو ، اليابان) ، على التوالي. تم إجراء GC على نظام Agilent 7890ON (Agilent Technologies ، Inc. Chandler ، AZ ، الولايات المتحدة الأمريكية) بعمود 0.32 مم id × 25 mL-Chirasil-Val. تم تشغيل HPLC التحليلي على نظام Shimadzu LC -2030 C HPLC (شيمادزو ، كيوتو ، اليابان) باستخدام عمود Agilent Eclipse XDB-C18 مقاس 4.6id × 250 مم (5 ميكرون). تم إجراء HPLC شبه التحضيري على نظام Shimadzu LC -20 AT HPLC باستخدام عمود 20.0id × 250 mm Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) بمعدل تدفق 4 مل / دقيقة. تم إجراء كروماتوغرافيا العمود (CC) باستخدام Sephadex LH -20 （25-100 ميكرومتر ؛ GE Healthcare Bio-Science AB ، Uppsala ، Sweden） ، عمود هلام السيليكا (200-300 mesh، Qingdao Marine Chemical Co. Ltd.، Qingdao، China)، MCI gel CHP 20P (75-150 um؛ Mitsubishi Chemical Co. ، طوكيو ، اليابان) ، وأعمدة Chromatorex ODS (50 um ، Merck ، Darmstadt ، ألمانيا).

3.3 الاستخراج والفصل

تم استخراج مسحوق الجذور المجففة بالهواء (1 0 كجم) من M. normale مع 8 {{2 0} بالمائة من الأسيتون المائي (3 × 7 أيام) عند درجة حرارة الغرفة وتم ترشيح كل مستخلص. تم تجفيف نواتج الترشيح تحت ضغط منخفض للحصول على مستخلص خام (0. 6 كجم). تم تعليق المستخلص في H2O (1 لتر) وتقسيمه على التوالي باستخدام أثير البترول (3 × 2 لتر) ، EtOAc (3 × 2 لتر). تم تقسيم EtOAcextract (8 {{4 0}} جم) إلى عشرة كسور ( الأب 1-10) بواسطة هلام السيليكا CC (8 معرف × 2 0 سم) تمت التصفية التتابعية بتدرج CH2Cl-MeOH (100: 0،95: 5،90: 10،80: 20، 70 : 30،50: 50،0: 100 ، ت / ت). تم تحميل Fr.4 (32 جم) على عمود جل MCI (6i.d. × 20 سم) وتمت التصفية التتابعية بتدرج MeOH-H ، O （0∶ 100-100 ∶0 ، v / ø） إلى تحمل ثمانية عشر جزءًا فرعيًا （Fr 4-1-4-18）. تم فصل الجزء الفرعي Fr 4-14 (3.0 جم) بواسطة عمود جيل سيليكا آخر (3i.d. × 20 سم) تمت التصفية التتابعية باستخدام تدرج CH2Cl {{48 }} MeOH (97: 3-80: 20، o / v) و Sephadex LH -20 CCeluting باستخدام CH2Cl 2- MeOH (1: 1، v / o) لتوفير 7 (11.3 مجم) ) و 8 (10.6 مجم) و 9 (9.3 مجم) و 10 (20.6 مجم) و 11 (7.6 مجم) و 12 (6.2 مجم). تم تطبيق Fr 6 (4.2 جم) على عمود ODS C18 وتمت التصفية التتابعية باستخدام MeOH-H2O (20: 80-80: 20) للحصول على 9 كسور (Fr 6-1-6-9). مزيد من الفصل للجزء الفرعي Fr 6-4 (1.2 جم) باستخدام Sephadex LH -20 CC (تمت التصفية التتابعية باستخدام MeOH-H2O ، 10: 90-100: 0) ينتج عنه مركبات 1 (9.6 مجم) ، 5 ( 7.2 مجم) و 6 (7.3 مجم) على التوالي. تم الحصول على المركبات 2 (tR 130.5 min ، 5.2mg) ، 3 (tR 146.8min ، 9.6 mg) ، و 4 (tR 177.2min ، 15.3mg) من Fr7 (2.5g) عبر HPLC شبه التحضير مع تدرج MeOH-H2O ( 20: 80-40: 60، / u، 0-250 دقيقة).

3.4 البيانات الطيفية

الويسكي التانين C (1): مسحوق بني غير متبلور ؛ [] -12. 6 درجات (c=0. 16، MeOH) ؛ الأشعة فوق البنفسجية （MeOH） λmaxnm （log e） ∶2 0 3 （2.02）، 276 （1.19） ​​؛ قرص مضغوط （MeOH） λmax （△ e） 263 （-7. 8）، 240 （10.9）، 225 (2.9) .1 بيانات HAND 13C NMR ، انظر الجدول 1 ؛ HRESIMSm / z: [MH] {{24} } .1240 (calcd for C4sH33O 27- ، 1005.1215). 1- O - (4- methoxygalloyl) -6- O-galloyl -2 ، 3- O- (S) -hexahydroxydiphenoyl - - D-glucose ( 2): مسحوق بني غير متبلور مسحوق غير متبلور. 【】 5-5. 5 درجات （ج =0. 17، MeOH）؛ الأشعة فوق البنفسجية （MeOH） 入 ماكس نانومتر تسجيل البريد） ∶203 （2.52） ، 275 （2.01） ؛ القرص المضغوط MeOH） λ ماكس （△ 8） 264 （-8. 0 ، 238 （30.6） ، 218 （1.3）. 'بيانات H و 13 C-NMR ، انظر الجدول 2 ؛ HRESIMS m / z: 799.0983 [MH] - (calcd for C3sH2O 22- ، 799.099).

{0} O-galloyl -6- O - (3- methoxygalloyl) -2 ، 3- O- (S) -hexahydroxydiphenoul -6- د-الجلوكوز (3) ؛ مسحوق بني غير متبلور ؛ 【】 7-33. 5 درجات （ج =0. 12، MeOH）؛ الأشعة فوق البنفسجية （MeOH） 入 ماكس نانومتر تسجيل البريد） ∶203 （2.40） ، 273 （1.68） ؛ القرص المضغوط （MeOH） λmax （△ e） 262 （-3. 1）، 237 （11.1）، 210 （-2. 7）. 'بيانات Hand13CNMR ، انظر الجدول 2 ؛ HRESIMS m / z: 799.1006 [MH] - (calcd لـ C35H2O 22- ، 799.0999). 1- O-galloyl -6- O-vanilloyl -2 ، 3- O- (S) -hexahydroxydiphenoyl - - D-glucose (4): مسحوق بني غير متبلور ؛ 【】 7-20. 6 درجات （ج =0. 15، MeOH）؛ الأشعة فوق البنفسجية （MeOH） λmax nm （log e） ∶203 （2.42） ، 278 （1. 86） ؛ قرص مضغوط （MeOH） λ ماكس （△ e） 263 （-12. 1） ، 239 （42.5） ، 219 0.9）. 'بيانات H و 13 CNMR ، انظر الجدول 2 ؛ HRESIMS m / z: 783.1032 [MH] - (calcd لـ C35H27O 21- ، 783.1050).

3.5 التحلل الحمضي لـ 2-4

تمت معالجة المركب 2 (2 مجم) بـ 1 مولار هيدروكلوريد (5 مل) عند 8 0 درجة لمدة 4 ساعات ، ثم تم استخلاصه باستخدام أسيتات إيثيل (3 × 5 مل). تم تجفيف الطور المائي تحت تيار من N2 لتوليد بقايا متعادلة تم تحليلها باستخدام TLC (SiO2) باستخدام EtOAc-pyridine-EtOH-H ، O (7: 1: 1: 2) كنظام مذيب. كانت قيمة R للبقايا المحايدة هي نفس قيمة D-glucose الأصلية التي تشير إلى أن مكون السكر في 2 كان جلوكوز. تم إذابة المتبقي المحايد و 5 مجم L- سيستين ميثيل إستر هيدروكلوريد على التوالي في 3 مل من بيريدين اللامائي وتم تسخينه عند 80 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد إزالة المذيب عن طريق التبخر تحت ضغط منخفض ، يتفاعل خليط التفاعل لاحقًا مع 0.6 مل من N-trimethylsilylimidazole عند 80 درجة لمدة ساعة واحدة. تم تقسيم خليط التفاعل باستخدام n-hexane و H ، O ، ثم تم تحليل طبقة n-hexane بواسطة أداة GC. تم ضبط درجة حرارة الحاقن والكاشف عند 250 درجة و 280 درجة على التوالي. تم الاحتفاظ بدرجة حرارة العمود الأولية عند 160 درجة لمدة دقيقة واحدة ، ثم زادت إلى 280 درجة مئوية عند 5 درجة / دقيقة ، واستمر لمدة 10 دقائق. تم تحلل جلوكوز D الأصلي و L-glucose الأصلي وتحليلهما بنفس الطريقة ، وكانت أوقات الاحتفاظ بهما 19.09 و 19.25 دقيقة على التوالي. أشارت نتائج تحليل GC إلى أن مكون السكر في 2 كان D-glucose (t 19.1 min). تم تحديد مكونات السكر في 3 و 4 باستخدام نفس الإجراء.

3.6 نشاط مضاد للالتهابات

3.6.1.NO الإنتاج عن طريق خلايا RAW 264.7 LPS-Stimulated

تمت زراعة خلايا RAW 264.7 في DMEM مع 10 بالمائة من FBS عند 37 درجة في جو رطب بنسبة 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. تم معالجة الخلايا الموجودة في 24- لوحة بئر (5 × 104 خلية / بئر) بـ 200 نانوغرام / مل LPS ومركبات الاختبار. بعد 22 ساعة ، تم جمع الوسائط وقياس مستوى النتريت باستخدام نظام Griess Reagent System (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية).

3.6.2. حيوية الخلية

تم إجراء اختبار MTT لقياس السمية الخلوية لعينات الاختبار على خط الخلايا RAW264.7. تم زرع الخلايا التي كانت في مرحلة النمو اللوغاريتمي في 96- صفيحة بئر بكثافة 5 × 10 بالإضافة إلى -6 × 10 * خلية / بئر وحضنت عند 37 درجة مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 24 ح. بعد ذلك ، عولجت الخلايا بـ 100 ميكرولتر من وسط المزرعة بتركيزات مختلفة من عينات الاختبار لمدة 24 ساعة. تم التخلص من الوسط وتمت إضافة 100 ميكروليتر من الوسط الخالي من FBS المحتوي على MTT (1 مجم / مل) إلى كل بئر. بعد الحضانة في الحاضنة لمدة 4 ساعات ، تم التخلص من المادة الطافية وأضيف 100 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لحل فورمازان. تم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.

3.7 مكافحة Ty / نشاط روزيناز

تم فحص الأنشطة المضادة للتيروزيناز للعزلات وفقًا للإجراء الموصوف بواسطة Aoki et al. مع تعديلات طفيفة [21]. تم استخدام L-DOPA وحمض kojic كعنصر تحكم ركيزة وإيجابي ، على التوالي. تم تحضير محلول L-DOPA عند 5. 0 ملي مولار ، تيروزيناز الفطر عند 100 وحدة / مل ، بالإضافة إلى عينات بتركيزات مختلفة في محلول الفوسفات （6.8） .20 ميكرولتر من محلول العينة و 10 ميكرولتر من محلول التيروزيناز بغرفة الهريسة تم خلطه واحتضانه مسبقًا عند 37 درجة لمدة 10 دقائق ، ثم تمت إضافة 40 ميكرولتر من محلول L-DOPA واحتضانها عند 37 درجة لمدة 5 دقائق. يظهر نظام التفاعل لتجربة النشاط المضاد للتيروزينيز في الجدول 4. تم قياس الامتصاصية عند 475 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة Spark 10M (Tecan Trading AG ، زيورخ ، سويسرا). تم تكرار جميع المقايسات ثلاث مرات وفي كل مرة في ثلاث نسخ. تم حساب نسبة تثبيط نشاط التيروزيناز باستخدام الصيغة التالية:

حيث تمثل T الامتصاصية مع العينة والتيروزيناز ؛ لتمثيل الامتصاصية بعينة ولكن بدون التيروزيناز ؛ يمثل C الامتصاص مع التيروزيناز ولكن بدون عينة ؛ يمثل Co الامتصاص بدون التيروزيناز والعينة.

4 - نتائج

تهدف الدراسة إلى استكشاف المزيد من الأنشطة المضادة للالتهابات والمثبطة للأنزيمات للبوليفينول من جذور M. normal على أساس أعمالنا السابقة [20]. كما هو متوقع ، تم الحصول على اثني عشر بوليفينول من مصنع البلاط لأول مرة وكان المركب 1-4 عبارة عن إيلاجيتانين جديد. يوفر العزل الناجح وتحديد هيكل الإيلاغيتانين مواد لفحص الأدوية المضادة للالتهابات ومثبطات الإنزيم ويساهم أيضًا في تطوير واستخدام M. لا يحتوي Ellagitannins 1-4 على أنشطة مثبطة لإنزيم التيروزيناز وأنشطة مضادة للالتهابات ، مما يجعله أقل احتمالًا أن يكون عقارًا محتملًا مضادًا للالتهابات أو مثبطًا للإنزيم. لحسن الحظ ، لديهم تأثيرات جديدة ، مثل مكافحة السمنة [6،7]. تتمتع مركبات الفلافونويد بنشاطات إنزيمية مثبطة ومضادة للالتهابات أفضل من الإيلاجيتانين الموجود في جذور M. normale ، ومن المرجح أن تكون مضادات الالتهاب ومثبطات الإنزيم. تساعد دراسة العلاقة بين البنية والنشاط في إيجاد أدوية جديدة مضادة للالتهابات ومثبطات الإنزيم.

تم استخراج هذه المقالة من جزيئات 2021 ، 26 ، 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules