استنساخ الجينات والتحديد الوظيفي والتحليل الهيكلي والتعبيري لسينثاز السكروز من Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 تحليل تعبير CtSus في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa ونظام زراعة الخلايا تحت ضغط الجفاف

4.1 تحليل تعبير CtSus في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa

في المختبر، أكدت تجارب تحويل الخلية الكاملة وتجارب التفاعل التحفيزي الأنزيمي أن البروتين المشفر بواسطة جين CtSus يمكنه تحفيز تخليق الجلوكوز UDP. لمزيد من استكشاف العلاقة بين هذا الجين والتخليق الحيوي لمركبات الجليكوسيد في Cistanche tubulosa، تم تحليل مستوى التعبير لهذا الجين في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa.

أعشاب سيستانش عالية الجودة تحتوي على 10-98% إكيناكوسيد

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>الجزء الجوي من بينها، محتوى إكيناكوسيد في haustoria هو الأعلى.

تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام [كدنا] من أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa كقوالب، وتم تحليل النتائج بواسطة طريقة 2 – ΔΔCT وتم إجراء التحليل التفاضلي. وتظهر النتائج في الشكل 4A. كان مستوى التعبير لجين CtSus في الهستوريا هو الأعلى، 1.5 مرة من الجزء الجوي، وكان مستوى التعبير في الجزء تحت الأرض أعلى بكثير من ذلك الموجود في الجزء الجوي، وهو ما يتوافق مع نمط تراكم جليكوسيدات الفينيليثانويد. ويمثلها echinacoside في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa.

الشكل 4: مستويات التعبير النسبي لـ CtSus في أجزاء مختلفة من C. tubulosa والخلايا المعلقة التي تم علاجها بواسطة PEG6 0 0 0. ج: مستوى التعبير النسبي لـ CtSus في أجزاء مختلفة من C. tubulosa؛ ب: مستوى التعبير النسبي لـ CtSus في خلايا تعليق C. tubulosa التي تمت معالجتها بواسطة PEG6000 في نقاط زمنية مختلفة. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0.05,***P ＜ 0.001

4.2 تحليل تعبير CtSus في خلايا تعليق Cistanche deserticola تحت ظروف إجهاد الجفاف

أظهرت الأبحاث الأولية للمشروع أن إجهاد الجفاف الناجم عن PEG6000 يمكن أن يزيد بشكل كبير من تراكم جليكوسيدات فينيل إيثانول في خلايا تعليق Cistanche deserticola. من 3 إلى 9 أيام بعد التحريض، زاد محتوى إشنساسيد بشكل ملحوظ. من اليوم الثاني عشر إلى اليوم الخامس عشر، تباطأ معدل نمو محتوى الإكيناكوسيد ووصل إلى القيمة القصوى في اليوم الخامس عشر. وبعد ذلك، مع زيادة وقت الاستزراع، زاد محتوى الإكيناكوسيد بشكل ملحوظ. محتوى الفركتوسيد انخفض تدريجيا [24]. بناءً على هذا البحث، استخدمت هذه الورقة [cDNA] لخلايا تعليق Cistanche deserticola غير المعالجة وخلايا تعليق Cistanche deserticola المستحثة بـ PEG 6000- كقوالب لإجراء اكتشاف PCR كمي مضان في الوقت الحقيقي لفحص جين CtSus في خلايا تعليق Cistanche deserticola تحت ظروف الإجهاد الجفاف. التغيرات في مستويات التعبير. وتظهر النتائج في الشكل 4B. في خلايا تعليق Cistanche deserticola المستحثة بـ PEG6000، زاد التعبير عن CtSus بشكل ملحوظ في اليوم السادس بعد الحث، ووصل إلى أعلى قيمة في اليوم التاسع، ثم انخفض مرة أخرى إلى نفس مستوى التحكم. مجموعات من نفس المستوى. تظهر النتائج المذكورة أعلاه أن إجهاد الجفاف يمكن أن يزيد بشكل كبير من التعبير عن جين CtSus في خط الخلايا المعلقة Cistanche deserticola، وهو ما يتوافق مع نمط تراكم الإشناسيسيد تحت إجهاد الجفاف. ومع ذلك، فإن ذروة التعبير عن جين CtSus تظهر في وقت أبكر من ذروة محتوى الإشنساسيد، لأن المتبرع النشط بالجليكوزيل المُصنَّع بواسطة التحفيز CtSus هو مقدمة مهمة مطلوبة لتفاعل الارتباط بالجليكوزيل متعدد الخطوات في المسار الحيوي اللاحق للإشنساسيد. ، من المتوقع أنه بعد تعرضها لإجهاد الجفاف، ستقوم الكائنات الحية بشكل تفضيلي بتعبئة الجينات المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي الأولي لتحقيق تراكم الجهات المانحة النشطة، ومن ثم تحقيق تراكم استقلابي ثانوي مهم للمنتجات الأيضية.

5 دراسة التركيب ثلاثي الأبعاد لبروتين CtSus وتحليل المواقع النشطة الرئيسية

استنادًا إلى وظيفة CtSus في تحفيز إنتاج الجلوكوز UDP المتبرع بالجليكوزيل، تمت دراسة الأساس الهيكلي للنشاط التحفيزي لـ CtSus. تم استخدام أداة SOPMA عبر الإنترنت للتنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين. أظهرت النتائج أن البنية الثانوية لـ CtSus تحتوي على 55.28% حلزونية، 25.47% لفائف عشوائية، 12.80% خيوط ممتدة، و6.46% لفات (الشكل 5A)، مما يشير إلى أن الحلزونات هي أهم الوحدات الهيكلية الثانوية في بروتين CtSus، تليها الملفات العشوائية، والتي تمثل أيضًا نسبة كبيرة من البروتين. يتم توزيع الخيوط والمنعطفات الممتدة في جميع أنحاء البروتين. وفقا للدراسات الموجودة، عادة ما يوجد سينسيز السكروز في شكل رباعي، والذي يعتبر شكله النشط. لذلك، استخدمت هذه الورقة أيضًا AlphaFold2 للتنبؤ ببنية بروتين CtSus وحصلت على بنيتها ثلاثية الأبعاد لرباعيات البروتين. وجدت مقارنة قاعدة بيانات PDB (بنك بيانات البروتين) أن التشابه التسلسلي بين Arabidopsis thaliana sucrose Synthase AtSus1 (PDBID 3S28) وCtSus يمكن أن يصل إلى 77.93٪. تمت مقارنة هيكل CtSus المتوقع مع هيكل AtSus1 ثلاثي الأبعاد، وكانت قيمة انحراف مربع متوسط ​​الجذر (RMSD) بعد تراكب البروتين 1.11 Å، مما يشير إلى أن الهياكل المكانية للاثنين متسقة للغاية (الشكل 5B).

الشكل 5: التحقيق الهيكلي لـ CtSus. ج: الهيكل الثانوي المتوقع لـ CtSus باستخدام SOPMA.Blue: اللولب؛ الأرجواني: ملف عشوائي. الأحمر: حبلا ممتد؛ الأخضر: ورقة. ب: محاذاة الهيكل ثلاثي الأبعاد لـ AtSus1 (باللون الأزرق) وCtSus (باللون الأخضر). تم عرض كلاهما على شكل tetramer.C: المخلفات الرئيسية في جيب ربط الركيزة لـ AtSus1 (باللون الأزرق) وCtSus (باللون الأخضر مع المخلفات المسمى)؛ D: محاذاة المطابقات الملزمة لـ UDP والفركتوز في AtSus1 (باللون الأزرق) وCtSus (باللون الأخضر)؛ E: التفاعلات بين UDP وCtSus الموضحة في رسم تخطيطي ثنائي الأبعاد تم تحليلها بواسطة Discovery Studio Client

تم استخدام البنية المعقدة البلورية للبروتين يجند لـ Arabidopsis AtSus1 مع UDP والفركتوز (PDBID3S29) كقالب [16] لتحليل وضع الربط لـ CtSus مع UDP والفركتوز. وتظهر نتائج الالتحام الجزيئي في الشكل 5C. يمكن ملاحظة أن جيوب ربط الركيزة في AtSus1 وCtSus متشابهة جدًا من حيث نوع الأحماض الأمينية والتوزيع المكاني والتكوين، والتداخل مرتفع، مما يثبت أن تسلسل سينسيز السكروز محفوظ بدرجة عالية في النباتات. تظهر في الشكل 5D توافقات الرابطين، UDP والفركتوز، في جيب ربط ركيزة البروتين. يتداخل الالتحام الجزيئي الأكثر فائدة لـ UDP وCtSus جيدًا مع تشكيل UDP في مجمع AtSus 1- UDP البلوري، مما يثبت دقة نتائج الالتحام الجزيئي. يظهر التفاعل بين UDP وبقايا الأحماض الأمينية الرئيسية في جيب ربط ركيزة البروتين في الشكل 5E. يرتبط UDP وCtSus معًا بشكل أساسي بروابط هيدروجينية وتفاعلات كارهة للماء. تشمل بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية في جيب ربط الركيزة Leu294، وGly301، وMet576، وArg578، وLys583، وGln646، وAsn652، وLeu677، وThr678، وGlu681.

مناقشة

يعد تعديل الغليكوزيل أحد الوسائل المهمة لتحسين الخواص الفيزيائية والأنشطة البيولوجية للمنتجات الطبيعية أو سلائف الأدوية. بالمقارنة مع الطرق الكيميائية التقليدية، يتميز تعديل الغليكوزيل الأنزيمي بمزايا ظروف التفاعل المعتدل والانتقائية القوية والود البيئي. ومع ذلك، فإن تفاعل الغليكوزيل لنواقل الجليكوزيل يتطلب كمية كبيرة من الجهات المانحة للسكر UDP، وهي باهظة الثمن ويصعب الحصول عليها، مما يؤدي إلى عدم إمكانية استخدام ناقلات الجليكوزيل على نطاق واسع في الإنتاج الصناعي. يمكن أن يحفز سينسيز السكروز التفاعل العكسي: سكروز + UDP ⇌ UDP-جلوكوز + فركتوز ويمكن أن يشكل دورة UDP-جلوكوز متجددة من خلال تفاعل اقتران مع ناقلة الجليكوزيل. تعتبر Cistanche tubulosa غنية بمجموعة متنوعة من مركبات الجليكوسيد من أنواع هيكلية مختلفة، ممثلة بمركبات جليكوسيد فينيل إيثانول، مما يشير إلى أن مسار تخليق الجليكوزيل النشط في جسمها والذي يشتمل على سينسيز السكروز لديه استقلاب قوي، لكن سينسيز السكروز ذي الصلة من نباتات Cistanche لم تم الإبلاغ عنها. في هذه الدراسة، تم استنساخ جين سينسيز السكروز CtSus من Cistanche tubulosa لأول مرة. يحتوي البروتين المشفر بواسطة هذا الجين على المجال المحفوظ من سينسيز السكروز النباتي. ومن خلال مقارنة تسلسل إنزيمات السكروز من النباتات الأخرى وجد أن تشابه تسلسل الأحماض الأمينية بينها وبين إنزيمات السكروز من النباتات من نفس الرتبة كان أكثر من 90% مما يدل على درجة عالية من حفظ تسلسل إنزيمات السكروز من النباتات. أظهر تحليل التطور الجزيئي أن CtSus ينتمي إلى فرع سينسيز السكروز النباتي ثنائي الفلقة وهو الأكثر ارتباطًا بسينسيز السكروز PrSus من P. ramosa من عائلة Orobanchaceae.

لاستكشاف النشاط التحفيزي لـ CtSus، جمعت هذه الدراسة بين إنزيم ناقلة الغليكوزيل UGT71BD1، الذي تم التحقق من نشاطه مسبقًا من قبل مجموعة البحث، لبناء نظام تعبير مشترك ثنائي البلازميد. من خلال التجارب التحفيزية للخلية الكاملة، تم تحقيق الظروف دون إضافة متبرعين إضافيين بالسكر UDP. تفاعل الغليكوزيل لمركب الكومارين والقرفة ومركب الستيلبين ريسفيراترول. بالمقارنة مع مجموعة التحكم، أدت إضافة CtSus إلى زيادة كبيرة في معدل تحويل تفاعلات UGT71BD1- المحفزة بالجليكوزيل. على هذا الأساس، قامت هذه الدراسة أيضًا ببناء بلازميد التعبير المؤتلف CtSus وحققت تعبيرًا قابلاً للذوبان للبروتين المؤتلف في E. coli. في المختبر، تظهر التفاعلات التحفيزية الأنزيمية أنه في وجود السكروز وUDP، يمكن لـ CtSus تحفيز توليد UDP-glucose، وبعد إزالة علامة تقارب عامل الزناد الموجودة في البروتين المؤتلف، يحفز منتج CtSus توليد UDP -يتم الحصول على الجلوكوز. وقد تحسن المعدل بشكل ملحوظ. أكدت نتائج تحول الخلية الكاملة والتفاعل التحفيزي الأنزيمي في المختبر نشاط CtSus باعتباره سكروز سينسيز محفزًا نشطًا للسكر UDP-glucose. لمزيد من استكشاف العلاقة بين جين CtSus والتخليق الحيوي للجليكوسيدات في Cistanche tuberosum، تم تحليل التعبير عن CtSus في أجزاء مختلفة من Cistanche tuberosum من خلال تجارب PCR الكمية في الوقت الحقيقي. وأظهرت النتائج أن الجين تم التعبير عنه في haustoria من Cistanche tuberosum. أعلى مستوى من التعبير. Cistanche deserticola نبات طفيلي ولا يمكنه الحصول على العناصر الغذائية اللازمة للنمو والتطور من خلال عملية التمثيل الضوئي. لذلك، يجب أن تكون طفيلية على جذور النبات المضيف وتعتمد على النبات المضيف للحصول على العناصر الغذائية للحفاظ على النمو. في النباتات، يوفر السكروز في الغالب الجهات المانحة لمصدر الطاقة والكربون [12]. ومع ذلك، لا يمكن للخلايا استخدام السكروز مباشرة ويحتاج إلى مزيد من التحلل. الهستوريا هي الجسر الذي يربط بين Cistanche deserticola والنبات المضيف، وتلعب دورًا حيويًا في عملية نموها. مهم

[25]، وبالتالي فإن التعبير العالي عن سينسيز السكروز في haustoria من Cistanche deserticola أمر معقول. يتوافق التعبير العالي عن CtSus في الهستوريا أيضًا مع نمط التراكم الكبير لجليكوسيدات فينيليثانويد في الهستوريا. بالإضافة إلى ذلك، من خلال التحليل الكمي PCR للتغيرات في مستويات التعبير الجيني CtSus في خلايا تعليق Cistanche deserticola في نقاط زمنية مختلفة تحت ضغط الجفاف، وجد أن إجهاد الجفاف يمكن أن يزيد بشكل كبير من التعبير عن جينات CtSus في خط الخلية المعلقة، وهو متوافق مع إشنساسيد. نمط التراكم في خطوط الخلايا المعلقة تحت ضغط الجفاف ثابت. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أن CtSus متورط في مسار التخليق الحيوي لجليكوسيدات فينيلثانويد التي يمثلها إشنسا في Cistanche tulipis في الجسم الحي. إنها واحدة من العديد من مسارات التخليق الحيوي. يوفر تفاعل الغليكوزيل في الخطوة الأولى الجلوكوز UDP- الجلوكوز المتبرع النشط. باختصار هذه الدراسة

حددت الدراسة جينًا جديدًا لسينثاس السكروز في Cistanche deserticola، والذي مكن من التوليف الأنزيمي في المختبر لمتبرعي الجليكوسيل النشطين وقدم عناصر وراثية جديدة لبناء البكتيريا الهندسية للتخليق الحيوي لجليكوسيدات Cistanche deserticola.

مساهمات المؤلف: كان Tian Weisheng مسؤولاً عن تحليل المعلوماتية الحيوية، وتحليل التعبير، وتحليل نشاط الإنزيم، وكتابة المسودة الأولى لجين CtSus؛ كان يان يارو مسؤولاً عن فحص الجينات واستنساخها. شارك Cui Xiaoxue وHuang Wenqian في تحليل المعلوماتية الحيوية وتحليل التعبير؛ شارك Wang Yingxia وZhao Saijing في بناء المتجهات وتحليل نشاط الإنزيمات؛ قام لي جون وشي شيبو بتوجيه تحليل نشاط الإنزيم وتحليل التعبير بشكل أساسي؛ كان Tu Pengfei وLiu Xiao مسؤولين عن تصميم فكرة الورقة، وتوجيه التجارب، وكتابة الورقة ومراجعتها. شارك جميع المؤلفين في مراجعة الورقة.

مراجع

[1] سونغ زد إتش، لي إل، تو بي إف. التقدم في أبحاث النشاط الدوائي في نباتات CistancheHoffing. وآخرون الرابط [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药)، 2003، 34: 113-115.

[2] ليو دبليو جيه، ليو واي، سونغ كيو كيو، وآخرون. مقارنة كيميائية بين Cistanchetubulosa المزروعة والبرية باستخدام التحليل الطيفي ¹H-NMR [J]. الصين جي تشين ماتر ميد (中国中药杂志)، 2018، 43:3506-3512.

[3] سونغ واي، تسنغ كي، جيانغ واي، وآخرون. Cistanches Herba، من الأنواع المهددة بالانقراض إلى علامة تجارية كبيرة للطب الصيني [J]. Med Res Rev، 2021، 41: 1539-1577.[4] ليو واي، وانغ إتش، يانغ إم، وآخرون. تعمل عديد السكاريد Cistanche deserticola على حماية خلايا PC12 من الإصابة الناجمة عن OGD/RP [J]. بيوميد فارماكوثر، 2018، 99: 671-680.

[5] يين واي، هوانغ جي، غو إكس، وآخرون. تطور إنزيمات التحويل البيني للنيوكليوتيدات والسكر في النبات [J].PLoS One، 2011، 6: e27995.

[6] بار بيليد م، أونيل إم إيه. تكوين سكر النوكليوتيدات النباتية والتحويل البيني والإنقاذ عن طريق إعادة تدوير السكر [J]. آنو ريف بلانت بيول، 2011، 62: 127-155.

[7] قوه إتش، لي إل، وانغ بي جي. التوصيف الكيميائي الحيوي لـ UDP-GlcNAc/Glc4- epimerase من الإشريكية القولونية O86:B7 [J]. الكيمياء الحيوية، 2006، 45: 13760-13768.

[8] دونغ إس، تشيسنوكوفا أون، تيرنبوغ سي إل جونيور، وآخرون. تحديد إنزيم UDP-N-acetylglucosamine4-epimerase المتورط في غليكوزيل بروتين exosporium في Bacillus anthracis [J]. جي باكتريول،2009، 191: 7094-7101.

[9] لي إل إن، كونغ جي كيو. تحديد النسخ على نطاق واسع لجينات سينسيز السكروز في Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv، 2016، 6: 18778-18792.

[10] شمولزر ك، جوتمان أ، ديريكس إم، وآخرون. سينسيز السكروز: تطوير عملية نقل الغليكوزيل الفريدة من نوعها من أجل التحفيز الحيوي [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. التخليق الحيوي للسكروز [J]. جي بيول كيم، 1955،214: 149-155.