استهداف اللاكتات ديهيدروجينيز أ مع كاتشين يعيد تحسس خلايا سرطان المعدة SNU620 / 5FU إلى 5- فلورويوراسيل الجزء 1

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:تحدث مقاومة العلاجات المضادة للسرطان تقريبًا في كل نوع من أنواع السرطان وتصبح من الصعوبات الرئيسية في علاج السرطان. على الرغم من أن 5- فلورويوراسيل (5FU) هو الخيار الأول للعلاج المضاد للسرطان لسرطان المعدة ، إلا أن فعاليته محدودة بسبب مقاومة الأدوية. في الآونة الأخيرة ، تم قبول تغيير التمثيل الغذائي للسرطان ، بما في ذلك تأثير واربورغ ، وهو تفضيل لتحلل السكر بدلاً من الفسفرة المؤكسدة لإنتاج الطاقة ، كآلية محورية تنظم مقاومة العلاج الكيميائي. وهكذا ، قمنا بالتحقيق في الآلية التفصيلية والفائدة المحتملة لعوامل تحلل السكر في تحسين مقاومة 5FU باستخدام خطوط خلايا سرطان المعدة الراسخة ، SNU620 و SNU620 / 5FU.SNU620 / 5FU ، وهي خلية سرطانية معدية تحتوي على مقاومة لـ 5FU ، أظهرت إنتاج وتعبير اللاكتات أعلى بكثير. منالإنزيمات المرتبطة بتحلل السكر، مثل اللاكتات ديهيدروجينيز أ (LDHA) ، من تلك الموجودة في خلايا SNU620 الأم. للحد من تحلل السكر ، قمنا بفحص مادة الكاتشين ومشتقاتها المعروفةمضاد التهابوالمنتجات الطبيعية المضادة للسرطان لأن epigallocatechin gallate قد تم الإبلاغ عنه سابقًا كمثبط لتعبير LDHA. الكاتشين ، أبسط مركب بينها ، كان له أعلى تأثير مثبط على إنتاج اللاكتات ونشاط LDHA. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الجمع بين 5FU والكاتشين سمية خلوية إضافية وأنواع الأكسجين التفاعلي المستحثة (ROS) بوساطة موت الخلايا المبرمج في خلايا SNU620 / 5FU. وبالتالي ، بناءً على هذه النتائج ، نقترح الكاتشين كمرشح لتطوير دواء مساعد جديد يقلل المقاومة الكيميائية إلى 5FU عن طريق تقييد LDHA.

الكلمات الدالة:5- فلورويوراسيل ؛مقاومة كيميائية; تحلل السكر; نازعة هيدروجين اللاكتات؛ كاتشين

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

1 المقدمة

تم إحراز تقدم ملحوظ في علاج سرطان المعدة من خلال الاستئصال الجراحي للورم الأساسي و 5- العلاج الكيميائي التوافقي القائم على الفلورويوراسيل (5FU) ، مثل الإبيروبيسين ، والسيسبلاتين ، والفلورويوراسيل ، والدوسيتاكسيل ، والأوكساليبلاتين ، و 5 FU [1 ، 21 حتى الآن ، لا يزال 5FU ، وهو نظير من اليوراسيل الذي يمنع تخليق الحمض النووي عن طريق تثبيط سينثيز ثيميديلات [3] ، دواء علاج كيميائي شائع الاستخدام لعلاج سرطان المعدة [1 ، A4]. ومع ذلك ، فإن الفعالية السريرية للعلاج الكيميائي كانت غير مرضية بسبب انتكاس السرطان الأولي أو النقيلي المتعلق بمقاومة الأدوية [1،5].

يمكن أن يحسن cistanche المناعة

تعتبر العديد من العمليات الخلوية من الآليات الرئيسية الكامنة وراء المقاومة الكيميائية ، بما في ذلك تنشيط الأدوية أو تعطيلها ، وآلية إصلاح تلف الحمض النووي ، والتعديلات في أهداف الأدوية ، وتعطيل مسارات موت الخلايا المبرمج ، وزيادة الالتهام الذاتي [6،7]. السرطان غير متجانس والعديد من السرطانات تستخدم كلا من تحلل السكر والفسفرة المؤكسدة من أجل استقلاب الطاقة [8]. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن إعادة البرمجة الأيضية ، وخاصة تحلل السكر الهوائي غير الطبيعي ، كلاعب رئيسي في تطوير مقاومة أدوية العلاج الكيميائي ، بما في ذلك 5FU ، في سرطان المعدة [9]. يُعرف اللاكتات ديهيدروجينيز أ (LDHA) وكينازات البيروفات ديهيدروجينيز (PDKs) كمنظمين رئيسيين لتحلل السكر الهوائي الذي ينتج اللاكتات من البيروفات [10،11]. مزيج ثنائي كلورو أسيتات ، وهو مثبط راسخ لـ PDK ، يعيد الحساسية تجاه 5FU [12]. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن LDHA ، وهو إنزيم رئيسي يحفز تحويل البيروفات إلى اللاكتات ، كهدف محتمل لعلاج سرطان المعدة [13 ، 14]. ضربة قاضية لتعبير LDHA في الخلايا السرطانية تمنع تكون الأورام من خلال زيادة تنفس الميتوكوندريا وتقليل حيوية الخلية [15]. تعمل العديد من مثبطات LDHA ، مثل FX11 و PSTMB و GSK 2837808A ، على تقليل مستويات ATP وتوليد الإجهاد التأكسدي ، وفي النهاية تسبب موت الخلايا المبرمج [16-18]. على الرغم من أن إحدى الدراسات أظهرت أن تثبيط LDHA بواسطة microRNA -34 استعاد مقاومة 5FU في سرطان القولون [19] ، لم تبلغ أي دراسة سابقة عن تأثيرات مثبطات LDHA الوراثية أو الدوائية على المقاومة الكيميائية.

بوليفينول الشاي الأخضر ، بما في ذلك كاتشين (CA) ، وإبيكاتشين (EC) ، وجالوكاتشين (GC) ، وإبيغالوكاتشين (EGC) ، وإبيكاتشين -3- غاليت (ECG) ، وإبيغالوكاتشين -3- غاليت (EGCG) ، الصحة عن طريق منع وعلاج العديد من الأمراض ، بما في ذلك الالتهاب والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان الخبيث [20،21]. من بين البوليفينول ، يعزز EGCG الحساسية الكيميائية 5FU في خلايا سرطان القولون والمستقيم وسرطان الخلايا الكبدية عن طريق تنشيط مسارات AMPK وتقييد جذعية السرطان [22،23]. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن EGCG لتثبيط LDHA عن طريق قمع تعبيراتها في خلايا سرطان الثدي والبنكرياس [24،25].

في هذه الدراسة ، افترضنا أن CA قد يكون مرشحًا لعقار مساعد لتقليل مقاومة 5FU في خلايا سرطان المعدة. تم فحص أن التأثير المثبط لـ CA ، و / أو دمجه مع 5FU ، على نشاط LDHA يؤدي بالتالي إلى تحفيز أنواع الأكسجين التفاعلي للميتوكوندريا (ROS) وموت الخلايا المبرمج في الخلايا المقاومة لـ 5FU.

2. النتائج

2.1. خصائص حال السكر للخلايا المقاومة 5FU

الانتشار المحسن هو سمة من سمات المقاومة الكيميائية بما في ذلك الخلايا السرطانية المقاومة لـ 5FU [26،27]. أولاً ، أكدنا مقاومة 5FU ومعدلات النمو طويلة الأجل لخلايا SNU620 و SNU620 / 5FU. عندما تمت زراعة هذه الخلايا بالتركيزات المحددة من 5FU لمدة 48 ساعة ، كانت الجرعة المقدرة التي تسبب تثبيط نمو بنسبة 50 في المائة (Gl50) في خلايا SNU620 / 5FU (100.63 ميكرومتر) أعلى بكثير من تلك التي تسبب GIso في خلاياها الأبوية SNU620 （28.88 ميكرومتر ） （الشكل 1 أ والشكل التكميلي S1）. بالإضافة إلى ذلك ، كانت معدلات نمو خلايا SNU620 / 5FU أسرع من تلك الموجودة في خلايا SNU620 (الشكل 1B والشكل التكميلي S2). نظرًا لأن المقاومة الكيميائية والخصائص سريعة النمو يمكن أن تكون مرتبطة بخصائص تحلل السكر المرتفعة في خلايا سرطان المعدة [28] ، تم قياس معدلات التحميض خارج الخلية (ECAR) ومعدلات استهلاك الأكسجين (OCR) في كلا الخليتين في وجود أوكسامات ، وهو معروف جيدًا مثبط تحلل السكر أم لا. أظهرت النتائج أن خلايا SNU620 / 5FU تفرز اللاكتات بشكل كبير أكثر من تلك التي تفرزها خلايا SNU620 وبالتالي تحمض وسط الثقافة (الشكل 1C والشكل التكميلي S3). ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تغيير كبير في التعرف الضوئي على الحروف بين هذه الخلايا (الشكل 1 د). تم قياس مستويات التعبير عن mRNA والبروتين من LDHA. كان تعبير LDHA أعلى في خلايا SNU620 / 5FU مقارنة بخلايا SNU620 (الشكل 1E ، F). علاوة على ذلك ، قمنا بفحص مستويات التعبير عن mRNA والبروتين لأنماط PDK ووجدنا أن تلك الخاصة بـ PDK2 و PDK3 كانت أعلى في خلايا SNU620 / 5FU عنها في خلايا SNU620 (الشكل التكميلي S4A ، B). تم أيضًا تقييم الفسفرة للوحدة الفرعية E1 من نازعة هيدروجين البيروفات (PDHA1) ، والتي تمت زيادتها بواسطة PDKs ، ووجد أنها أعلى في خلايا SNU620 / 5FU عنها في خلايا SNU620 (الشكل التكميلي S4C). oxamate كمثبط LDHA للتغلب على مقاومة 5FU في خلايا SNU620 / 5FU. منع هذا المركب نمو الخلية في كل من خلايا SNU620 و SNU620 / 5FU (الشكل التكميلي S5). علاوة على ذلك ، قام العلاج باستخدام oxamate و 5FU بقمع نمو الخلايا ، مقارنةً بالعلاج الفردي باستخدام خلايا oxamate أو 5FUin SNU620 / 5FU (الشكل 1G). تشير هذه البيانات إلى أن خلايا SNU620 / 5FU تعبر بشدة عن LDHA ، وأن تثبيط نشاط LDHA يمكن أن يتغلب على مقاومة خلايا SNU / 5FU إلى 5FU.

الشكل 1. وفقًا للنتائج ، 5- الخلايا المقاومة للفلورويوراسيل (5FU) لها خاصية تحلل مرتفعة للجلوكوز: (A) تم معالجة خلايا SNU620 و SNU620 / 5FU بالتركيزات المحددة من 5FU لمدة 48 ساعة. تم تقييم جدوى هذه الخلايا عبر مقايسة MTT ؛ تم قياس مستويات النمو (ب) لخلايا SNU620 و SNU620 / 5FU كل يوم لمدة 4 أيام بمقايسة MTT ؛ (C ، D) تم علاج خلايا SNU620 و SNU620 / 5FU باستخدام oxamate ( 5 مللي متر) أو ليس لمدة 24 ساعة ، وتم تقييم قيم ECAR و OCR بواسطة محلل Seahorse XF ؛ (E ، F) تم اكتشاف تعبيرات LDHA في خلايا SNU620 و SNU620 / 5FU عبر qRT-PCR وتحليل لطخة ويسترن ؛ (G) SNU620 و SNU620 / 5FU عولجت بخلايا oxamate (25 ملم) و / أو 5FU （10μM） لمدة 48 ساعة ، وتظهر النتائج على أنها تعني ± SEM. ** p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA يمنع نشاط LDHA

تم تحليل إنتاج اللاكتات باستخدام CA ومشتقاته ، بما في ذلك EC و GC و EGC و EGCG في خلايا SNU620 / 5FU. بالمقارنة مع هذه المشتقات ، خفضت CA إنتاج اللاكتات بشكل أكثر فعالية (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، في المختبر ، تم تأكيد نشاط LDHA كما هو موضح ، وأظهر CA تأثيرًا مثبطًا أقوى على نشاط LDHA من مشتقاته (الشكل 2B). تم قياس التأثيرات المثبطة لـ CA على أنشطة LDHA و LDHB في المختبر بطريقة تعتمد على الجرعة. منع CA نشاط LDHA دون التأثير على نشاط LDHB (الشكل 2C ، D). بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس أنشطة LDHA و LDHB باستخدام EGCG ، المعروف بتثبيط نشاط LDHA ، ووجد أنه تم تقليل الجرعة اعتمادًا على الجرعة (الشكل التكميلي S6A ، B). علاوة على ذلك ، تم تقييم أنشطة LDHA و LDHB داخل الخلايا بالتركيزات المشار إليها من CA في خلايا SNU620 / 5FU. منع CA نشاط LDHA بطريقة تعتمد على الجرعة في نتائج المختبر ولكن ليس نشاط LDHB (الشكل 2E ، F). تم أيضًا قياس مستويات التعبير البروتيني لـ p-PDHA1 و PDK2 و PDK3 و LDHA في خلايا SNU620 / 5FU بعد علاج CA (الشكل التكميلي S7) ، ولاحظنا أن تلك الخلايا لم تتأثر بهذا العلاج. تشير هذه النتائج إلى أن CA ينظم نشاط LDHA دون التأثير على تعبيره.

2.3 طريقة عمل تثبيط LDHA بواسطة CA

لتحليل آلية تثبيط نشاط LDHA على CA ومشتقاته ، أجرينا النمذجة الجزيئية للتفاعل الملزم بين LDHA المؤتلف البشري و CA (الشكل 3 أ ، ب). أظهرت النتائج أن CA قد يتفاعل مع بقايا T94 و A95 و Q99 و R105 و S136 و R168 و H192 و T247 من LDHA. من بينها ، تعتبر R105 و S136 و R168 ضرورية لربط الركيزة (البيروفات). وبالتالي ، افترضنا أن CA قد يتداخل مع مواقع ربط الركيزة. على العكس من ذلك ، فإن EGCG مرتبطة بـ LDHA عبر موقع مختلف. للتحقق من طريقة عمل تثبيط LDHA بواسطة CA بشكل أكبر ، تم تأكيد مؤامرات Michaelis-Menten و Lineweaver-Burk بتركيزات مختلفة من البيروفات و CA. تمت زيادة نشاط LDHA بطريقة تعتمد على جرعة البيروفات. ومع ذلك ، تم عكسه من خلال زيادة CA. وهكذا ، أظهرت نتائج مؤامرات Michaelis-Menten و Lineweaver-Burk أن CA هو مثبط غير تنافسي لـ LDHA (الشكل 3C ، D). قيمة 197 ميكرومتر (الشكل التكميلي S8). توفر هذه النتائج رؤى مفادها أن CA يمنع نشاط LDHA من خلال ربط موقع ربط الركيزة لـ LDHA.

2.4 CA يحسس مقاومة 5FU من خلال تقليل نشاط LDHA

قمنا بتقييم التأثيرات السامة للخلايا لـ CA على خلايا SNU620 و SNU620 / 5FU ووجدنا أن CA كبح النمو في كلتا مجموعتي الخلايا (الشكل 4 أ). للتحقق من أن تثبيط النمو كان مرتبطًا بقمع نشاط LDHA ، تم إلغاء التعبير عن LDHA بواسطة حمض الريبونوكلييك قصير الشعر (shRNA) لـ LDHA (shLDHA) وتم استرداد تعبيره عن طريق تعداء LDHA معربًا عن البلازميد (الشكل التكميلي S9A ، B في خلايا SNU620 / 5FU المنقولة بواسطة shLDHA ، لم يتم تغيير إنتاج اللاكتات وصلاحية الخلية بشكل ملحوظ بواسطة علاج CA ، مقارنةً بالخلايا الوهمية المنقولة (الشكل 4B ، C). بالإضافة إلى ذلك ، كان التأثير المثبط للنمو لـ CA زاد من خلال استرداد تعبير LDHA في خلايا LDHA-knockdown SNU620 / 5FU (الشكل 4D). علاوة على ذلك ، تم فحص خلايا SNU620 و SNU620 / 5FU بعد علاج CA و 5FU بشكل فردي أو مزيج من الاثنين معًا. أعاقت المعالجة باستخدام CA و 5FU بشكل كبير نمو خلايا SNU620 / 5FU (الشكل 4E). بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص التأثيرات المركبة لـ CA و 5FU في العديد من خطوط الخلايا الأخرى ، مثل سرطان المعدة البشري AGS ، وذعر سرطان البنكرياس -1 ، و MIA PaCa -2 ، وسرطان القولون LS174T وخلايا RKO ، مقارنة بخلايا سرطان القولون SNU620 و SNU620 / 5FUcells. أظهر إنتاج اللاكتات وتعبير LDHA ارتباطًا جيدًا مع بعضهما البعض ، وكانت خصائص حال السكر هذه مرتفعة نسبيًا في SNU620 / 5FU و AGS و RKO (الشكل التكميلي S10A ، B). علاوة على ذلك ، قلل العلاج المركب لـ CA و 5FU بشكل كبير من قابلية الخلايا للحياة ، مقارنةً بمعالجة واحدة لـ 5FU في خلايا حال السكر بما في ذلك AGS و RKO (الشكل التكميلي S10C). ومع ذلك ، فإن المعالجة باستخدام CA و 5FU لم تثبط بشكل كبير النمو في خلايا SNU620 و Panic -1 و MIA PaCa -2 و LS174T ، والتي أظهرت تعبيرات LDHA منخفضة. تشير هذه النتائج إلى أن تأثير التحسس للخلايا المقاومة لـ 5FU قد يكون مرتبطًا بتأثيره المثبط على نشاط LDHA.

الشكل 2. كاتشين (CA) يثبط نشاط LDHA ولكن ليس تعبيره: (أ) تم قياس إنتاج اللاكتات من SNU620 / 5FU بعد العلاج بمشتقات CA 10 ميكرومتر） لمدة 24 ساعة ؛ B في المختبر تم تقييم نشاط LDHA عند العلاج مع مشتقات CA (10 ميكرومتر) والأكسامات (20 ملي مولار) ؛ (C ، D) في المختبر ، تم تقدير أنشطة LDHA و LDHB بالتركيزات المحددة من CA ؛ (E ، F) عولجت الخلايا بتركيزات محددة من CA لمدة 24 ساعة. تم قياس أنشطة LDHA و LDHB داخل الخلايا باستخدام محللات الخلية كمصدر إنزيم. تظهر النتائج على أنها تعني ± SEM. ** ص<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

الشكل 4. تم إعاقة قابلية بقاء الخلية عن طريق المعالجة باستخدام الكاتشين (CA) و 5- فلورويوراسيل (5FU) في الخلايا المقاومة 5FU: (أ) تم تقييم قابلية بقاء خلايا SNU620 و SNU620 / 5FU بعد العلاج بالتركيزات المشار إليها من CA لمدة 48 ساعة ؛ （B） SNU620 / 5FU-pLKO.1 و SNU620 / 5FU-shLDHA عولجت بخلايا CA 10 ميكرومتر） لمدة 24 ساعة. تم قياس إنتاج اللاكتات في وسائط الثقافة لخلايا SNU620 / 5FU-pLKO.1 و SNU620 / 5FU-shLDHA ؛ (C ، D) SNU620 / 5FU-pLKO.1 ، SNU620 / 5FU-shLDHA ، SNU620 / 5FU-shLDHA plus EV ، و SNU620 / 5FU-shLDHA بالإضافة إلى خلايا LDHA # 2 بالتركيزات المشار إليها من CA لمدة 48 ساعة. تم قياس صلاحية الخلية باستخدام اختبار MTT ؛ تمت معالجة خلايا （E） SNU620 و SNU620 / 5FU باستخدام CA 10 μM） و / أو 5FU （10μM） لمدة 48 ساعة. تم قياس جدوى هذه الخلايا عن طريق مقايسة MTT. تظهر النتائج على أنها تعني ± SEM. * p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

تم استخراج هذه المقالة من Int. J. مول. علوم. 2021، 22، 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms