الفعالية الحساسة للتقدم في العمر لتقييد السعرات الحرارية على التكوُّن الحيوي للميتوكوندريا وتلف MtDNA في كبد الفئران 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.4.تأثير العمر و CR على محتوى mtDNA والضرر

نظرًا لأن ديناميكيات الميتوكوندريا ترتبط ارتباطًا وثيقًا بصيانة mtDNA [16،18] ، فقد حددنا محتوى mtDNA في جميع الفئران من خلال تفاعل سلسلة البوليميراز الكمي (qPCR) (الشكل 8).

تم العثور على انخفاض متعلق بالعمر في محتوى mtDNA في AL -28 (-27 بالمائة) و ​​AL -32 الفئران (-23 بالمائة) مقارنة مع AL {{ 5}} من الحيوانات ، بينما لم يكن هناك فرق إحصائي بين مجموعة AL -28 ومجموعة AL -32. كان CR فعالًا جدًا في منع الانخفاض المرتبط بالعمر في محتوى mtDNA فقط عند 28 شهرًا مما أدى إلى زيادة (زائد 19 بالمائة) في مجموعة CR -28 مقارنةً بنظير AL-fed المطابق للعمر. علاوة على ذلك ، لم يكن هناك فرق إحصائي بين قيمة AL -18 وقيمة مجموعة CR -28. كما رأينا بالنسبة للعلامات الأخرى في العمل الحالي ، لم تكن CR فعالة للغاية في 32 شهرًا حيث لم يكن هناك فرق بين قيمة AL -32 وقيمة CR -32 المقابل. من أجل تعميق التحليل عند مستوى تلف mtDNA ، قمنا بقياس المحتوى النسبي لـ 4.8 كيلو بايت "الحذف المشترك" بواسطة qPCR (الشكل 9).

لم يتم العثور على تغييرات كبيرة مع تقدم العمر ولا مع CR في المحتوى النسبي لحذف 4.8 كيلو بايت في جميع المجموعات المختبرة.

أخيرًا ، قمنا بفحص ثلاث مناطق محددة من mtDNA لوقوع البيورينات المؤكسدة ، بشكل رئيسي 8- oxo-deoxyguanosine (8- أكسيد) ، باستخدام إنزيم البيورينات الحساسة المؤكسدة formamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg). تشمل المناطق الثلاث ، على التوالي ، حلقة الإزاحة (حلقة D) ، وأصل تكرار الضوء الخيطي (Ori-L) ، وأجزاء من كل من NADH dehydrogenase (ND) الوحدة الفرعية 1 و 2 (ND1 / ND2) ( الشكل 10).

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

كما هو موضح في الشكل 10 ، كانت النسبة المئوية لحدوث أكسيد 8- مختلفة اختلافًا كبيرًا بين مجموعات الفئران في كل منطقة تم تحليلها ، على الرغم من وجود نمط مماثل. كشف اختبار ما بعد المستند عن أهمية انخفاض وجود أكسيد 8- في جرذان CR -28 مقارنة بمجموعتي AL -18 و AL -28 ({{7} } بالمائة CR -28 مقابل AL -18 و -43 بالمائة CR -28 مقابل AL -28 في D-loop ؛ -48 بالمائة CR -28 مقابل AL -18 و -49 بالمائة CR -28 مقابل.مستخلص سيستانش المضاد للإشعاعAL -28 في Ori-L ؛ -54 بالمائة CR -28 مقابل AL -18 و -56 بالمائة CR -28 مقابل AL {{ 7}} في ND1 / ND2). أظهر CR أنه فعال في منع الضرر التأكسدي لـ mtDNA لمدة تصل إلى 28 شهرًا ، في حين أن حدوث نفس الضرر لم يكن مختلفًا بين AL -32 و CR -32 الفئران. تم اكتشاف البيورينات المؤكسدة بالفعل في فئران AL -18 دون إظهار زيادة مرتبطة بالعمر في حيوانات AL -28. المقارنة بين مجموعة AL -32 ومجموعة CR -32 لم تظهر فرقًا كبيرًا. بالنظر إلى قيم المنطقة المحددة ، من المثير للاهتمام تسليط الضوء على أن حدوث الحلقة D كان الأعلى بين القيم من المناطق التي تم اختبارها في كل مجموعة ، وبالتالي دعم النتائج السابقة التي تشير إلى هذه المنطقة كنقطة ساخنة للأضرار التأكسدية [17 ، {{ 20}}].

الشكل 10: حدوث تلف البيورينات المؤكسدة في مناطق D-loop و Ori-L و ND1 / ND2 mtDNA في الكبد من AL -18 و AL -28 و CR -28 و AL -32 ، و CR -32- فئران عمرها شهر. (أ). تمثل القضبان البيانات التي تم الحصول عليها من تجربتين مستقلتين أجريتا في ثلاث نسخ وتم تحليلها باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه واختبار Tukey للمقارنة المتعددة. في التمثيل الرسومي ، تم تطبيع البيانات مقابل قيمة AL -18 الفئران ، وتم إصلاحها على أنها 1 ، وتظهر على أنها متوسط ​​القيمة و SD. * p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche هيرباتم تحميل قسامة من كل تضخيم PCR على هلام ملطخ ببروميد الاغاروز وتحليلها لشدة النطاق.

تم تلخيص جميع النتائج التي تم الإبلاغ عنها حول فعالية CR في الفئات العمرية المتطابقة في الجدول 1.

3. مناقشة

في البحث طويل الأمد عن طرق قادرة على مواجهة التدهور التدريجي للشيخوخة ، اكتسب CR أهمية قصوى بسبب آثاره الإيجابية ، التي تم الإبلاغ عنها في سلسلة واسعة من الكائنات الحية تتراوح من الخميرة إلى الرجل [22]. لقد ثبت أن CR يؤثر على عدد كبير من المسارات الجزيئية. من بينها ، بعضها فعال بشكل خاص في تعديل التكوين الحيوي للميتوكوندريا ونشاطها ، مثل تلك التي تستشعر العناصر الغذائية و / أو مستويات الطاقة مثل الكيناز المعتمد على AMP (AMPK) والسيرتوين ، حيث تتعاون جميعها مع إعادة برمجة الميتوكوندريا التي يسببها CR. التمثيل الغذائي [23]. من خلال تحسين التمثيل الغذائي التأكسدي ، يقلل CR من إنتاج الميتوكوندريا لـ ROS والأضرار الجزيئية الناجمة عن الزيادة المرتبطة بالعمر لهذه الأنواع التفاعلية [8-10]. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد بحثت في تأثيرات CR على مستوى الميتوكوندريا [3 ، 13-15 ، 24] ، لا يزال هناك عمل شامل حول تأثيرات هذا التدخل الغذائي على العضيات مفقودًا. لذلك ، سعت هذه الدراسة إلى اختبار وجود حدود لفعالية CRs في مجموعة كبيرة من علامات الميتوكوندريا. على وجه الخصوص ، ركزنا على المقارنة بين التأثيرات التي يسببها هذا النظام الغذائي في الجرذان البالغة من العمر (28- شهرًا) والفئران البالغة من العمر (32- شهرًا) للتحقق مما إذا كان هناك تفاعل بين CR وتطور الشيخوخة. كشف تحليل النتائج عن صورة معقدة لفعالية CR على التولد الحيوي للميتوكوندريا وتلف mtDNA ، والتي تم تلخيصها في الجدول 1.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

3.1.علامات الميتوكوندريا في 28- فئران عمرها شهر

تأثر عدد كبير من علامات الميتوكوندريا إيجابيًا بـ CR في فئران عمرها 28- شهر. على وجه التحديد ، تم الإبلاغ عن انخفاض مرتبط بالعمر في نشاط سينسيز السترات ، وكميات البروتين من TFAM و MFN2 و DRP1 ، وفي محتوى mtDNA الذي يقارن مجموعة التحكم AL -18 مع AL -28 واحد . تم منع جميع هذه التغييرات بواسطة CR في 28- فئران عمرها شهر (CR -28). تدعم هذه النتائج التأثير المضاد للشيخوخة لـ CR حتى هذا العمر في كبد الفئران. وبالمثل ، فإن الانخفاض في حدوث البيورينات المؤكسدة في جميع مناطق mtDNA الثلاثة التي تم فحصها ، والتي يسببها CR ، يعزز هذا الرأي بشكل أكبر. من الجدير بالملاحظة أن هذا الضرر التأكسدي كان موجودًا بالفعل في حيوانات AL -18 مع عدم وجود زيادة مرتبطة بالعمر في الفئران AL -28 مما يشير إلى أنه يمكن التعرف على مظهرها كعلامة مبكرة للشيخوخة. يجب إيلاء اهتمام خاص لعلامات الميتوكوندريا الخمسة التي لم تتأثر بـ CR في الفئران البالغة من العمر 28- شهرًا وهي كميات البروتين في LonP1. محتوى الحذف Cvt c و OGGl و APE1 و 4.8 كيلوبايت. في الواقع ، بالنسبة إلى LonP1 و Cyt c ، لم يمنع CR الانخفاض المرتبط بالعمر الموجود في حيوانات AL -28 ، في حين أن كميات البروتين في OGG1 و APE1 ، بالإضافة إلى محتوى حذف 4.8 كيلوبايت ، لم تكن كذلك تتأثر بالعمر ولا عن طريق CR. LonP1 مسؤول عن تدهور TFAM المنهك [25-27] وقد تم الإبلاغ عن تناقصه مع تقدم العمر [28] في كبد الفئران [29] حتى عمر 27 شهرًا. لقد اقترحنا سابقًا أن مثل هذا التعبير المنخفض الشيخوخة عن LonP1 [16] قد يكون مرتبطًا بنشاطه في إزالة TFAM غير المرتبط بـ mtDNA [26]. كتفسير محتمل لعدم فعالية CR لمنع الانخفاض المرتبط بالعمر في تعبير LonP1 ، على الرغم من تعبير TFAM المستعاد وربط TFAM بالمناطق الخاصة بـ mtDNA (البيانات الحالية و Picca وآخرون. [15]) ، هو CR التفعيل الوسيط لـ Sirt3 [30] الذي قد يكون قد أثر أيضًا على كمية البروتين في LonP1 عن طريق نزع الأسيتيل المستحث. يمكن اقتراح فرضية مختلفة لشرح عدم فعالية CR لمنع الانخفاض المرتبط بالعمر في كمية Cyt c. هذا البروتين هو المحفز الرئيسي لمسار موت الخلايا المبرمج للميتوكوندريا من خلال إطلاقه إلى العصارة الخلوية ، وبالتالي فإن انخفاض الكمية داخل الميتوكوندريا في الفئران AL -28 فيما يتعلق بقيمة AL -18 يشير إلى زيادة في عملية موت الخلايا المبرمج الجوهرية مع الشيخوخة [16،31]. علاوة على ذلك ، بالنسبة إلى LonP1 ، كانت كمية Cyt c في الفئران CR -28 لا تزال أقل بكثير من القيمة في حيوانات AL -18 ، مما يشير إلى أن CR لم يؤثر بشكل كبير على التنظيم النهائي لتعبير Cyt c / الإفراج عن العصارة الخلوية ، ويفترض ، ولا الزيادة المرتبطة بالعمر في مسار موت الخلايا المبرمج للميتوكوندريا. هذا يتفق مع الترويج السابق لموت الخلايا المبرمج بوساطة CR [23].cistanche نمو القضيبنظرًا لأنه يمكن أيضًا تشغيل مسار موت الخلايا المبرمج عن طريق تراكم تلف الحمض النووي [32،33] ، فقد حددنا التعبير البروتيني لاثنين من إنزيمات BER الرئيسية في الميتوكوندريا وهما OGG1 و APE1. لم تتأثر كميات البروتين في كلاهما بالشيخوخة و CR مرور من 18 إلى 28 شهرًا من العمر. التفسير المحتمل هو أن التعبير عن إنزيمين BER قد زاد بالفعل وكافيًا في الفئران AL -18 لمواجهة الضرر المتزايد المرتبط بالعمر لـ mtDNA. في الواقع ، تم الإبلاغ عن زيادة مرتبطة بالعمر في نشاط الميتوكوندريا OGG1 [34،35] والميتوكوندريا APE1 [36] في كبد القوارض التي مرت من 3-6- شهرًا من الحيوانات إلى 20-23- شهر القديمة ، من المحتمل أن يتم تحفيزها لمواجهة الزيادة المرتبطة بالعمر في تلف mtDNA بكفاءة. يدعم كل هذا أيضًا فرضيتنا القائلة بأن أضرار mtDNA ، التي تم إصلاحها بواسطة OGG1 و APE1 ، ظهرت في وقت مبكر جدًا من عمر القوارض (كانت موجودة بالفعل في الفئران AL -18) وتم تحفيزها ، من خلال اتصال رجعي لنواة الميتوكوندريا ، زيادة مبكرة في التعبير عن إنزيمات BER. بالنسبة لغياب تأثير CR على OGG1 و APE1 ، فإننا نقترح أن تواجد ROS المنخفض والأضرار المؤكسدة ذات الصلة قد تم التصدي له بشكل فعال من خلال التعبير عن كلا الإنزيمات التي لا تختلف عن تلك الموجودة في AL-الحيوانات المتطابقة مع العمر. بالنسبة لمحتوى حذف 4.8 كيلوبايت ، لم تكن هناك زيادة مرتبطة بالعمر تنتقل من حيوانات AL -18 إلى حيوانات AL -28 كما لو أن تلف mtDNA ظهر مبكرًا جدًا في عمر الجرذان وعمرها - يمكن التحقق من الزيادة ذات الصلة فقط بالمقارنة مع الحيوانات الصغيرة ، كما ورد في دراسات أخرى [19 ، 37-39]. تشير عدم فعالية CR في تقليل محتوى حذف 4.8 كيلوبايت بشكل ملحوظ في جرذان CR -28 مقارنةً بـ AL -28 و AL -18 إلى أن CR طويل المدى تسبب انخفاض ملحوظ في وجود ROS في الكبد. قد يكون هذا قد أدى إلى نوع من مستوى الحالة المستقرة لحذف 4.8 كيلو بايت ، لا يختلف عن مستوى نظيره AL -18 ومتوافق مع محتوى mtDNA ذي الصلة. على الرغم من أن إصلاح mtDNA لم ينخفض ​​مع تقدم العمر ، فإن الانخفاض المرتبط بالعمر في محتوى mtDNA كان لا يزال موجودًا عند الانتقال من AL -18 الفئران إلى AL -28 ، كما هو موضح سابقًا في أنسجة مختلفة من قوارض قديمة [3 ، 15 ، 19 ، 39-42]. يمكن تفسير ذلك من خلال الارتباط المتزايد المرتبط بالعمر لـ TFAM في مناطق mtDNA محددة والتي تضررت أيضًا من النقاط الساخنة [19]. وبالتالي ، فإن هذه الفرضية ستوفق بين فقدان mtDNA المرتبط بالعمر والتعبير غير المتغير ونشاط إنزيمات الإصلاح. في مزيد من الدعم لهذه الفرضية هو عدم وجود خسارة mtDNA في الفئران CR -28. في الواقع ، لقد أظهرنا سابقًا أن CR يمنع الزيادة المرتبطة بالعمر في ربط TFAM في مناطق mtDNA محددة [15]. لذلك ، وفقًا لبياناتنا الحالية والسابقة ، قد يكون تعديل ارتباط TFAM من بين الآليات الجزيئية المشاركة في تنظيم الشيخوخة والتكوين الحيوي للميتوكوندريا بوساطة CR. وقد ثبت أيضًا أن هذا التنظيم بالشيخوخة و CR يتم متابعته من خلال توازن ديناميكيات الميتوكوندريا التي تتأثر بالشيخوخة [43] وتؤدي إلى انتشار الاندماج على الانشطار [44،45]. لذلك ، قمنا بحساب مؤشر الاندماج (FI) في جميع الحيوانات التي تم فحصها (الشكل 6) ووجدنا قيمًا أكدت نتائجنا السابقة ووسعتها [16].فوائد الصلصا cistancheيمكن جمع بعض المؤشرات الجديدة من خلال الدراسة الحالية ، وبالتحديد ، في AL -18 الفئران ، غطت قيم FI نطاقًا صغيرًا ، بينما في AL -28 كان نطاق FI أكبر بكثير ، مع علامة الزيادة المرتبطة بالعمر في القيم الفردية ، في فئران CR -28 ، أشار النطاق الصغير للقيم إلى تأثير إيجابي لـ CR في تحريض الانشطار ، مع زيادة عامة في الكميات الفردية DRP1 مقارنة بتلك الموجودة في مجموعة AL -28. في حين أن الانشطار الفعال قد يزيل العضيات التالفة ، فإن اندماج كيان مماثل قد يضمن انتشار الجزيئات الكبيرة التالفة في شبكة الميتوكوندريا ، وبالتالي يخفف من آثارها السلبية [46]. لذلك ، فإن الاستعادة التي تتم بوساطة CR لتوازن ديناميكيات الميتوكوندريا المضبوطة بدقة قد تؤدي إلى عواقب إيجابية على تعديل التكوين الحيوي للميتوكوندريا ، والتي تعمل بشكل تآزري مع اتصال تلف mtDNA إلى الوراء. يتماشى هذا مع الأدبيات الحالية التي تشير إلى أن حالة المغذيات والتغيرات الأيضية يمكن أن تعدل توازن ديناميكيات الميتوكوندريا ، وبالتالي تؤثر أيضًا على التكوين الحيوي للعضية. على وجه الخصوص ، يمكن للتنظيم الحساس لـ ROS للتكوين الحيوي للميتوكوندريا أن يواجه زيادات محدودة فقط في ROS من خلال زيادة عدد العضيات [48] وقد يمنع وجود CR المنخفض لـ ROS [15] التغلب على مستوى يشبه العتبة قد يؤدي إلى لفقدان الميتوكوندريا. تم إثبات فعالية CR في تقليل وجود ROS في الدراسة الحالية من خلال انخفاض تراكم البيورينات المؤكسدة في المناطق التي تم تحليل mtDNA في الفئران CR -28 التي تدعم تحسنًا عامًا في التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، قادرة على مواجهة العمر - الانحدار المرتبط. في الواقع ، تم إثبات وجود ROS المخفض CR على نطاق واسع أيضًا على مستوى بروتينات ودهون الميتوكوندريا. على وجه الخصوص ، تم إثبات أن CR تقلل التعديلات التأكسدية لبروتينات الميتوكوندريا في قلوب الفئران|49] وتعديل مؤشر التشبع / عدم التشبع في أغشية الميتوكوندريا مما يمنع الضرر التأكسدي ويحافظ على سيولة الغشاء [8]. علاوة على ذلك ، تم إثبات أن CR يقلل من إنتاج ROS بواسطة مجمعات الجهاز التنفسي الميتوكوندريا في كل من عضلات الهيكل العظمي والكبد [8]. تشمل التأثيرات المفيدة لـ CR على مستوى ROS أيضًا تحييدًا محسنًا لـ ROS وإصلاحًا متزايدًا للجزيئات التالفة من ROS [10]. بالإضافة إلى هذا التأثير ، يتم تعديل التغييرات في وظائف الميتوكوندريا من خلال تنشيط AMPK الحساسة لـ CR و sirtuins التي تنظم نشاط عوامل النسخ المنشط لمستقبلات البيروكسيسوم المنشط لجاما 1- ألفا (PGC -1 ) ، و forkhead box (FoxO) ، مع مشاركة الأخيرة في التكوّن الحيوي ، والتمثيل الغذائي التأكسدي ، ودوران الميتوكوندريا [23]. وبالتالي ، يجب أن يتفاعل التأثير الإيجابي بوساطة CR على استقلاب الميتوكوندريا مع المسارات الأخرى لتعديل المحفز النهائي للتكوين الحيوي للميتوكوندريا ، وفقًا لنموذج الاتصال الرجعي بالنواة [50].

3.2.علامات الميتوكوندريا في 32- فئران عمرها شهر

بالنسبة للمقارنة بين فئران AL -32 و CR -32 ، تظهر بياناتنا غيابًا عامًا للاختلافات الكبيرة. قد يشير هذا إلى وجود قيود عمرية على فعالية CR في مواجهة التدهور المرتبط بالعمر عند المرور من 28 إلى 32 شهرًا. فيما يتعلق بتأثير العمر ، على الرغم من ذلك ، يمكن استخلاص استنتاجات مختلفة اعتمادًا على العلامة التي تم تحليلها. في الواقع ، في كلتا المجموعتين 32- بعمر شهر ، تم الحفاظ على الانخفاض المرتبط بالعمر في نشاط سينسيز السترات ومقادير TFAM و LonP1 و OGG1 و APE1 ومحتويات mtDNA وحذف 4.8 كيلوبايت عند مستوى كان مشابهًا لما لوحظ في الفئران AL -28 أو تم منعه جزئيًا / كليًا كما هو الحال في كميات Cyt c و MFN2 و DRP1 ونسبة حدوث البيورينات المؤكسدة في مناطق mtDNA محددة. قد تكون هذه السلوكيات المختلفة على الأرجح بسبب تفاعل المسارات المختلفة التي تنطوي على العلامات التي تم تحليلها. يمكن تسليط الضوء على استنتاج آخر من خلال مقارنة كل من 32- مجموعات عمرها شهر مع AL -18 ومجموعات AL -28 لمبالغ MFN2 و DRP1. في الواقع ، لم يكن الانخفاض المرتبط بالعمر موجودًا بالانتقال من مجموعة AL -18 إلى مجموعتي AL -32 و CR -32 لبروتيني الديناميكيين. مع الأخذ في الاعتبار أنه في المقارنة بين مجموعة AL -18 وكلتا المجموعتين البالغ عمرهما 32- شهرًا بالنسبة للعلامات الأخرى ، كان هناك انخفاض مرتبط بالعمر مماثل أو أصغر من حيث الحجم بين AL {{ 30}} و AL -28 ، يمكننا تحقيق بعض النتائج. قد يشير هذا إلى أن التغييرات المرتبطة بالعمر للعلامات قد تكون قد بدأت أو كانت موجودة بالفعل عند 18 شهرًا ، ثم وصلت بعد ذلك إلى أدنى / أعلى قيمة لها في الحيوانات القديمة ، 28- شهرًا مع "وتيرة" وهي نموذجي لعملية الشيخوخة. على العكس من ذلك ، في الحيوانات البالغة من العمر 32- شهرًا) ، بدا أن "وتيرة" العملية تتباطأ نظرًا لأن القيم أقل من أو تساوي نظائر AL -18 ، ولكنها ليست أقل / أعلى من تلك الموجودة في AL -28 ، على الرغم من انقضاء الفترة الزمنية الأطول. تشير فرضية خطوتين مختلفتين في عملية الشيخوخة [16] إلى أن الأضرار ، لأسباب مختلفة ، تبدأ في التأثير على الأنشطة البدنية والتمثيل الغذائي خلال مرحلة البلوغ في كل فأر. يتم التصدي لمثل هذه الأضرار بشكل فعال من خلال الآليات التعويضية ولا تظهر الأضرار علانية ، بالتزامن مع عمر "متوسط" مستقر يتميز باستتباب ناجح. في هذه الدراسة ، حددنا الفئران التي تتقدم في السن "بسرعة" تلك التي يبدأ فيها التوازن بين الأضرار المتداخلة والآليات التعويضية في التلاشي لاحقًا في الحياة.cistanche tubulosa جرعة redditفي هذه الحيوانات ، التي تشكل الجزء الأكبر من مجموعة AL -28 ، تتجاوز الأضرار العتبة المتوافقة مع الأنشطة العادية وتظهر حالة متغيرة. على العكس من ذلك ، فإن الجزء الأصغر المتبقي من السكان المسنين الذين تم فحصهم يحافظ على التوازن المتماثل بين الأضرار والإصلاح لفترة أطول ويشكل مجموعة الحيوانات التي تتقدم في العمر "ببطء" ، بما في ذلك كل من AL -32 و CR {{2} } من الجرذان. تم مؤخرًا اقتراح فرضية مماثلة حول مراحل الشيخوخة المختلفة للبشر أيضًا [51]. بشكل عام ، تشير هذه النتائج إلى أن الحيوانات المسنة للغاية قد تكون قد وصلت إلى طول العمر دون أن تتأثر بشكل كبير بـ CR ومن المحتمل أن يكون ذلك بسبب الاستعداد الوراثي للتعامل بشكل أفضل مع الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا المرتبط بالعمر ، لكن مثل هذه الفرضية تستدعي البحث في المستقبل. يمكن لهذه النتائج الجديدة أن تقدم إجابة على السؤال الأصلي والحاسم حول وجود حدود لفعالية CR ، الذي طرحه Ingram و de Cabo في دراستهما العميقة جدًا حول هذه المسألة l52l ، مما يسمح بتحديد هذه الحدود مع عمر 28 شهرًا لكبد الفئران. ومع ذلك ، فإن الاستنتاج القائل بأن CR أو أي نظام غذائي لم ينتج عنه عواقب مفيدة في تلك الفئران المعرضة بشكل طبيعي لطول العمر لا ينبغي أن يؤثر على الثقة العامة في فعالية هذا التدخل الغذائي في الواقع ، كان CR لا يزال قادرًا على نقل الآثار المفيدة لأنه كان قادرًا على منع معظم التغييرات المرتبطة بالعمر للتكوين الحيوي للميتوكوندريا وتلف mtDNA في كبد 28- فئران عمرها شهر. وهذا يؤكد أيضًا على CR كإستراتيجية راسخة للتصدي بكفاءة لتراجع الشيخوخة في عموم السكان.

4. المواد والطرق

4.1 الحيوانات

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في جامعة فلوريدا. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقًا لإرشادات المعهد الوطني للصحة (NIH) لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. عينات الكبد مأخوذة من ذكور جرذان Fischer 344 × Brown Norway (F344BNF1) تم الحصول عليها من مستعمرة المعهد الوطني للشيخوخة (إنديانابوليس ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم وضعها بشكل فردي في درجة حرارة- (20 درجة / -2 درجة) وضوء- بيئة خاضعة للرقابة (12- دورة فاتحة / مظلمة) مع طعام فئران منتظم ومياه متاحة للشهرة الإعلانية في قسم أبحاث الشيخوخة والشيخوخة ، قسم بيولوجيا الشيخوخة ، كلية الطب ، جامعة فلوريدا ، غينزفيل ، فلوريدا ( الولايات المتحدة الأمريكية). بدأ تقييد السعرات الحرارية عند بلوغ 3.5 شهرًا من العمر (10 بالمائة تقييد) ، ورفعت إلى 25 بالمائة عند 3.75 شهرًا ، وظل قيد 40 بالمائة من 4 أشهر حتى نهاية حياة كل حيوان ، وهو 28 شهرًا (CR {{ {17}}) أو 32 شهرًا (CR -32). تم تغذية الحيوانات المقيدة بالسعرات الحرارية بالنظام الغذائي المعزز للمعاهد الوطنية للصحة 31- لضمان عدم تعرضها لسوء التغذية ، في حين تم إعطاء الحيوانات التي تتغذى على الشهرة نظام NIH31 للجرذان. تكونت الحيوانات من المجموعات التالية: 18- شهر من تغذية الإعلانات (AL -18 ، n =6) ، 28- شهر من تغذية الإعلانات (AL -28 ، رقم =6) ، 28- شهر مقيد بالسعرات الحرارية (CR -28 ، n =6) ، إعلان عمره 32- شهر libitum-fed (AL -32، n =6)، و 32- شهر مقيدة بالسعرات الحرارية (CR -32، n =6) الفئران. تم تخدير الحيوانات قبل التضحية وأزيلت عينات الكبد على الفور ، وتم تجميدها في الأيزوبنتان المبرد بالنيتروجين السائل ، وتخزينها في النيتروجين السائل حتى مزيد من التحليل.

4.2 تحديد نشاط سينثاس السيترات

تم إجراء تحديد نشاط سينسيز السترات كما في [17]. باختصار ، تم تحضين 8 0 ميكروغرام من البروتينات الكلية المنقية من عينات الكبد في مخزن التفاعل (0. 31 ملي مولار أسيتيل- CoA ، 1 0 0 ملي مولار تريس عازلة ( الرقم الهيدروجيني 8.1) ، و 0.25 بالمائة Triton X -100 ، و 0.1 ملي مولار 550- dithiol-bis -2- حمض النيتروبنزويك ، و 0.5 ملي أوكسالو أسيتات (1 مل) عند 30 درجة.

تم تحديد نشاط سينسيز السترات (umol × min-I × g fabric-) بطريقة طيفية عن طريق قياس معدل إنتاج حمض thionitrobenzoic (TNB) عند 412 نانومتر.

4.3 مناعي غربي

تم عزل ميتوكوندريا الكبد في وسط يحتوي على 220 ملي مولار مانيتول ، 70 ملي سكروز ، 20 ملي مولار تريس- HCl ، 1 ملي مول EDTA ، و 5 ملي EGTA ، درجة الحموضة 7.4 ، عند 4 درجات وفقًا لـ 【16. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام 10 ميكروغرام من بروتينات الميتوكوندريا لتحليل التنسج المناعي الغربي. Anti-TFAM (1:50، 000)، anti-VDAC (1:50، 000، Abcam، Cambridge، UK)، anti-OGG1 (1: 2500، Abcam، Cambridge، UK) ، anti-APE1 (1: 5 000، Abcam، Cambridge، UK)، anti-MFN2 (1: 5000، Abnova، Taipei، Taiwan)، anti-DRP1 (1: 2500، Abnova، Taipei، Taiwan) ، تم استخدام مضاد Cyt c (1: 500 ، Pharmingen ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ومضاد Lon Protease (1: 10000) كأجسام مضادة أولية. تم تصنيع الأجسام المضادة ضد TFAM و Lon حسب الطلب والتبرع بها ، على التوالي ، من قبل الدكتور H. Hinagaki (قسم الكيمياء ، المعهد الوطني للبحوث الصناعية في Nagoya ، Nagoya-shi ، Aichi ، اليابان) والدكتور C. Suzuki (القسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، كلية الطب بنيوجيرسي ، جامعة الطب وطب الأسنان في نيوجيرسي ، نيوارك ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الكشف عن البروتينات عن طريق التلألؤ الكيميائي وتم تحديد كمية العصابات المناعية باستخدام برنامج Image Lab (BioRad Laboratories Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تطبيعها مقابل تعبير VDAC.

4.4.تحديد محتوى mtDNA و mtDNA 4.8 كيلو بايت "حذف مشترك"

تم استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) لتحديد المحتويات النسبية لـ mtDNA و mtDNA 4.8 كيلو بايت "حذف مشترك". تم إجراء التفاعلات عبر كيمياء SYBR Green باستخدام 3 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي كقالب والبادئات التالية: MtDNA لـ 5- GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA -3 '(nt 15. 785-15. 806) ، مراجعة mtDNA 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA -3 '(العدد 15 ، 868-15 ، 847) ؛ -اكتين لـ 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA -3 '(nt 2181-2200) ، -actinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC -3' (nt 2266-2248) ؛ 4.8 del لـ {{26} } AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA -3 '(nt 8109-8131) ، 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA -3' (nt 13، 020-12، 996). محتوى mtDNA المتعلق بالنووية تم تحديد محتوى DNA و 4.8 كيلو بايت "الحذف المشترك" المتعلق بـ mtDNA ، كما ورد في [19].

4.5 تحليل البيورينات المؤكسدة

تم استخدام Formamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg) (New England Biolabs، Beverly، MA، USA) للكشف عن البيورينات المؤكسدة [53].

تم إجراء تضخيم PCR لمناطق D-loop و Ori-L و ND1 / ND2 من mtDNA باستخدام زوج الاشعال المعني:

D-loop For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA -3 '(nt 15، 302-15، 325)، D-loop Rev 5'-TGGAATTTCTGAGGGTAGGC -3' (nt 16، 302-16، 282) ؛ Ori-L لـ 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA -3 '(nt 4414-4433) ، Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA -3' (nt 5407-5388) ؛ ND1 مقابل 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT -3' (nt 3390-3409) ، ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3 '(nt 4399-4380) على 5 نانوغرام من الحمض النووي الكلي المعالج وغير المعالج بـ Fpg. كانت ظروف ركوب الدراجات هي: حضانة ما قبل 10 دقائق عند 95 درجة ، تليها 18 دورة 15 ثانية و 58 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة 72 درجة. تم تحليل شدة النطاق للنطاقات الملطخة ببروميد الإيثيديوم بواسطة برنامج Image Lab (BioRad Laboratories Inc. ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). لتحسين التصور الرسومي ، تم التعبير عن النسبة بين شدة النطاق المعالجة بـ Fpg وغير المعالجة كنسبة مئوية من المكمل إلى 100.

4.6 الإحصاء

يتم التعبير عن البيانات على أنها المتوسط ​​والانحراف المعياري (SD). تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey للمقارنة المتعددة. بالنسبة لجميع الاختبارات ، تم تعيين الدلالة الإحصائية عند مستوى 5 بالمائة. تم إجراء التحليلات باستخدام حزمة إحصائية محددة (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station، TX، USA).

تم استخراج هذه المقالة من Int. J. مول. علوم. 2021 ، 22 ، 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms