الإمكانات التشخيصية للبروتينات الأميلوجينية الجزء الأول

خلاصة:

الاضطرابات التنكسية العصبية هي فئة من الأمراض منتشرة بشكل كبير، والتي تبدأ آلياتها المرضية قبل ظهور أي أعراض واضحة. وقد دفعت هذه الحقيقة العلماء إلى البحث عن المؤشرات الحيوية التي يمكن أن تساعد في العلاج المبكر.

تشترك هذه الأمراض غير القابلة للشفاء حاليًا في وجود تجمعات شاذة تسمى الأميلويدات في الجهاز العصبي، والتي تتكون من بروتينات محددة.

في هذه المراجعة، نناقش كيف يمكن استغلال هذه البروتينات ومطابقاتها وتعديلاتها كمؤشرات حيوية لأغراض التشخيص.

يعتبر البروتين من المواد المهمة للحفاظ على صحة جيدة، كما أن له تأثير مهم على الذاكرة. يتكون البروتين من الأحماض الأمينية، وهي المواد الخام لخلايا الدماغ والناقلات العصبية. لذلك، يرتبط تناول البروتين ارتباطًا وثيقًا بالذاكرة.

أولا وقبل كل شيء، البروتين هو مادة أساسية للجسم لبناء وإصلاح الأنسجة. خلايا الدماغ غنية بالإنزيمات والمواد التنظيمية، والتي تتطلب البروتين كمكون لتعمل بشكل طبيعي. يؤدي انخفاض نسبة البروتين في الجسم إلى عدم عمل خلايا المخ بشكل طبيعي، مما يؤثر على الذاكرة. لذلك، يلعب الحفاظ على تناول كمية كافية من البروتين دورًا مهمًا في نمو الدماغ وصيانة الذاكرة.

ثانيا، البروتين له تأثير تعزيز نشاط خلايا الدماغ. يحتاج جسم الإنسان إلى كمية كبيرة من الناقلات العصبية في الدماغ للحفاظ على التشغيل الطبيعي لوظائف مثل التفكير والذاكرة والسلوك. يتم تصنيع الناقلات العصبية في الدماغ من الأحماض الأمينية الموجودة في الجسم، ومصدر هذه الأحماض الأمينية هو البروتين. ولذلك فإن اختيار الأطعمة الغنية بالبروتين عالي الجودة يمكن أن يزيد من تركيب الناقلات العصبية في الدماغ، وبالتالي تعزيز نشاط خلايا الدماغ والمساعدة على تحسين الذاكرة.

بالإضافة إلى ذلك، يساعد البروتين أيضًا في الحفاظ على استقرار الجسم ومنع تقلبات السكر في الدم. يمكن أن يسبب انخفاض مستويات السكر في الدم أعراضًا مثل عدم الانتباه والدوخة والتعب في الجسم، والتي غالبًا ما تؤثر على أداء الذاكرة. ومن خلال الحفاظ على تناول كمية معتدلة من البروتين، يمكن تجنب تقلبات نسبة السكر في الدم بشكل فعال، مما يساعد في الحفاظ على استقرار الجسم وتحسين الذاكرة.

باختصار، يرتبط البروتين ارتباطًا وثيقًا بالذاكرة. إن تناول كمية معتدلة من البروتين يمكن أن يحافظ على استقرار الجسم، ويعزز نشاط خلايا الدماغ، وبالتالي تحسين الذاكرة. يجب أن نحاول تناول المزيد من الأطعمة الغنية بالبروتين عالي الجودة، مثل الأسماك واللحوم والفاصوليا ومنتجات الألبان، وتجنب إزالة البروتين تمامًا من النظام الغذائي. سيساعدنا ذلك على البقاء بصحة جيدة وتحسين ذاكرتنا والاستمتاع بحياة أفضل. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا، ويمكن لـ Cistanche تحسين الذاكرة بشكل كبير لأن Cistanche هو دواء صيني تقليدي له العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. تأتي فعالية Cistanche من المكونات النشطة المختلفة التي يحتوي عليها، بما في ذلك حمض التانيك، والسكريات، وجليكوسيدات الفلافونويد، وما إلى ذلك، والتي يمكن أن تعزز صحة الدماغ بعدة طرق.

انقر فوق تعرف على 10 طرق لتحسين الذاكرة

نحن نركز على البروتينات المرتبطة بالاضطرابات التنكسية العصبية الأكثر انتشارًا، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والتصلب الجانبي الضموري، والخرف الجبهي الصدغي.

نحن أيضًا نصف التحديات الحالية في الكشف، وأحدث التقنيات ذات الإمكانات التشخيصية والتطورات المستقبلية المحتملة في التشخيص.

الكلمات المفتاحية: الأمراض التنكسية العصبية. علامة حيوية؛ اميلويد. قليل القسيم. تعديل ما بعد الترجمة.

1. الحاجة إلى أساليب تشخيصية جديدة للتنكس العصبي

الأمراض التنكسية العصبية هي اضطرابات مميتة وغير قابلة للشفاء، وتتميز بالفقدان التدريجي للخلايا العصبية في مناطق معينة من الجهاز العصبي. وهي مجموعة شديدة التجانس من الأمراض، والتي تشمل مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، والخرف الجبهي الصدغي (FTD)، والتصلب الجانبي الضموري (ALS).

حاليًا، يعاني أكثر من 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من أشكال مختلفة من التنكس العصبي [1]. يمتد المسار السريري للأمراض التنكس العصبي عادةً عدة سنوات ويؤدي إلى عجز تدريجي في الذاكرة والإدراك والحركة بدرجات مختلفة اعتمادًا على علم الأمراض المحدد [2] . تركز العلاجات الدوائية الحالية على تخفيف هذه الأعراض [3].

علاوة على ذلك، لا يزال التقييم النفسي العصبي حاسمًا في تشخيص التنكس العصبي المرتبط بالخرف [4]. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الرئيسية للمرض تحدث قبل ظهور أي أعراض مهمة.

إن تطوير أساليب تشخيصية دقيقة من شأنه أن يسهل التدخلات العلاجية في الوقت المناسب لاستعادة فسيولوجيا الخلايا العصبية قبل حدوث ضرر لا رجعة فيه.

كما أنه سيشجع على إنشاء علاجات جديدة، وإعادة تقييم العلاجات الحالية التي يمكن أن تكون أكثر فعالية إذا تم تطبيقها في مراحل مبكرة. على الرغم من الحاجة الملحة إلى أساليب تشخيصية للتنكس العصبي، إلا أن تطورها لا يزال يشكل تحديًا كبيرًا، وذلك بسبب محدودية إمكانية الوصول إلى الدماغ للفحص البدني وتعقيد الاختبارات السريرية القائمة على القدرات المعرفية [2].

أتاحت التطورات التكنولوجية الحديثة توصيف مسارات وجزيئات حيوية وهياكل جديدة في الجهاز العصبي ومناطق أخرى من الجسم يمكن استخدامها كعلامات مرضية للتنكس العصبي [5،6].

على الرغم من أن أمراض التنكس العصبي المختلفة لها بعض الأنماط الظاهرية المميزة، إلا أنها تشترك أيضًا في بعض السمات الجزيئية الرئيسية. على وجه الخصوص، في العديد من هذه الاضطرابات، تخضع البروتينات والببتيدات المحددة، والتي عادة ما تكون قابلة للذوبان، لعملية تجميع ذاتي تؤدي إلى تكوين مجاميع ليفية كبيرة تسمى الأميلويدات [7،8].

تتضمن هذه العملية أيضًا توليد وسيطات قليلة القسيمات أصغر حجمًا، وهي شديدة السمية وتعتبر حاليًا لاعبين رئيسيين في آليات المرض [8]. ويرتبط تجميع الأميلويد أيضًا بعمليات التجميع الأخرى، مثل تكوين المكثفات [9]. ومع ذلك، لن تكون هذه هي محور المراجعة الحالية.

هنا، نقوم بوصف بعض البروتينات الأميلوجينية الأكثر شهرة وأهميتها التشخيصية.

نحن نركز على الأميلويد بيتا (A) والتاو من أجل AD، و-synuclein (-syn) من أجل PD، المنصهر في الساركوما (FUS)، والبروتين المرتبط بالحمض النووي TAR 43 (TDP-43) من أجل ALS وFTD. نناقش أيضًا أحدث التطورات في طرق الكشف لمراقبة تجميع هذه البروتينات.

2. تجميع الأميلويد كمصدر محتمل للمؤشرات الحيوية

الأميلويدات عبارة عن مجاميع ليفية غير قابلة للذوبان ومثرية في بنية متقاطعة، وقد تم وصف تكوينها على نطاق واسع في المختبر [7،8].

يتكون تجميع الأميلويد من شبكة معقدة من أحداث النواة. في البداية، تتفاعل البروتينات الأحادية القابلة للذوبان وتشكل قليلات القسيم عن طريق النواة الأولية. يمكن أيضًا تحفيز النواة الأولية بوجود جزيئات حيوية أخرى، مثل البروتينات الأخرى [10] والأحماض النووية [11،12،] والأغشية [13].

ثم تتحول الأوليجومرات إلى مجاميع ذات ترتيب أعلى، وأخيرًا، إلى ألياف ليفية أميلويد. بمجرد تكوين تركيز حرج من الألياف، يحفز سطح هذه الألياف تكوين قليلات قليلة إضافية عن طريق النواة الثانوية [7،8]. يمكن أن تستطيل الألياف أيضًا بإضافة المونومرات في نهاياتها، وتخضع للتفتت [7،8]. ألياف الأميلويد هي أنواع بروتينية مستقرة للغاية بسبب محتواها الغني بالصفائح المتقاطعة [8،14-16].

على العكس من ذلك، تتحول القلة بسرعة إلى تجمعات أميلويدات ذات ترتيب أعلى (الشكل 1). إن الطبيعة المؤقتة للأوليجومرات تجعل من الصعب عزلها وتوصيفها على المستوى الهيكلي.

في الآونة الأخيرة فقط، وبفضل الأساليب الجديدة مثل مضان الجزيء الواحد والمجهر الإلكتروني [14،17،18]، تبين أن قليلات القسيمات غير متجانسة للغاية في خصائصها وبنيتها الفيزيائية والكيميائية، مع اختلاف محتوى البنية الثانوية [16،19،20] .

تعتبر الأوليجومرات سامة من خلال العديد من الآليات بما في ذلك التفاعلات الشاذة الكارهة للماء. لقد ثبت أنه في الأنسجة والخلايا المعزولة، يمكن أن تؤثر القلة على نفاذية الغشاء، والتوازن الأيوني، وتحفز الإجهاد التأكسدي [16،21-23].

يمكن للجذور الحرة التي يسببها القلة أن تؤدي بعد ذلك إلى اختلال البروتين، وخلل في الميتوكوندريا، وفي النهاية موت الخلايا المبرمج [24]. ارتبطت أيضًا قلة قليلة من A و-syn بالتهاب الأعصاب [22] وفقدان المشابك العصبية [25،26].

هناك عدة عوامل يمكن أن تؤثر على تكوين ألياف أميلويد وأوليجومرات. وتشمل هذه الطفرات الجينية، والإجهاد الخلوي، ووجود أو عدم وجود جزيئات حيوية محددة.

علاوة على ذلك، يتم تعديل الأميلويد على نطاق واسع بعد الترجمة في الجسم الحي [27-29] وتعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) تغير بشكل كبير تكوين وسمية ألياف ليفية الأميلويد في المختبر [27-31].

3. البروتينات الأميلوجينية المشاركة في التنكس العصبي

في سياق التنكس العصبي، يمكن تقسيم علامات المرض إلى علامات عصبية نفسية، وتصوير عصبي، وجينية، وعلامات كيميائية حيوية [2]. على وجه الخصوص، المؤشرات الكيميائية الحيوية (أو المؤشرات الحيوية) هي جزيئات قابلة للقياس في الجسم (على سبيل المثال، البروتينات، والأحماض النووية، والمستقلبات)، والتي تشير إلى مرحلة المرض [32].

تعد البروتينات الأميلوجينية مؤشرات حيوية واعدة، حيث إنها تقدم معلومات عن الملف الكيميائي الحيوي لخلل الجهاز العصبي [2]. أدناه، نسلط الضوء على البروتينات الأميلوجينية ذات الصلة وتعديلاتها المرضية التي يمكن أن تكون بمثابة مؤشرات حيوية لحالات التنكس العصبي.

3.1. ا وتاو في م

م هو الشكل الأكثر انتشارا من الخرف. الآفات المميزة في أدمغة مرض الزهايمر هي لويحات خرفية خارج الخلية مكونة من مجاميع أميلويد من A والتشابكات الليفية العصبية داخل الخلايا (NFTs) التي تتكون من خيوط أميلويد حلزونية مقترنة (PHFs) من بروتين تاو الفائق الفسفور (p-tau) [2،27].

A عبارة عن ببتيد قصير يتولد عن انقسام سلائف أكبر عبر الغشاء، يُسمى بروتين سلائف الأميلويد (APP)، عن طريق الانقسام المتسلسل للإفرازات و- والإفرازات ويتم إطلاقه في الفضاء خارج الخلية [2،33].

يمكن لهذه العملية أن تولد أشكالًا إسوية ذات أطوال مختلفة (الجدول 1)، والتي لها درجات مختلفة من السمية في سياق AD [34]. الأشكال الإسوية A الأكثر شيوعًا هي 40- و42-الطوليات المتبقية، والتي يشار إليها عمومًا باسم A 40 وA 42، على التوالي. A 40 هو المتغير الأكثر وفرة في اللويحات (حوالي 80٪ إلى 90٪) وهو موجود أيضًا في أدمغة الأشخاص الأصحاء.

A 42 لديه ميل أعلى بكثير للتجميع، وترتبط الزيادة في نسب A 42 / A 40 بمرض الزهايمر وأشكال أخرى من الخرف [30،34] (الجدول 2). إلى جانب الانقسام، ارتبطت الطفرات الجينية (A692G، E693Q في جين APP [35،36]، الجدول 2) والعديد من PTMs الأخرى لـ A بـ AD، بما في ذلك الأكسدة، الفسفرة، الغليكوزيل والأيزومرية [30].

تشير الدراسات إلى حدوث أستلة (على سبيل المثال، Lys16 وLys28)، والفسفرة (على سبيل المثال، Ser8 وSer26)، والنترة (على سبيل المثال، Tyr10)، والبيروجلوتامات (على سبيل المثال، Glu3 وGlu11)، والأيزومرية (على سبيل المثال، Asp1 وAsp7) والسباق (على سبيل المثال، و Asp1 و Asp23 وSer26) في سياق المرض [30،37-39] (الجدول 1).

تجدر الإشارة إلى أن التدهور المعرفي يرتبط بشكل أكبر بالأشكال الوسيطة القابلة للذوبان من A بدلاً من درجة رواسب الأميلويد [16]. تاو هو بروتين رئيسي مرتبط بالأنيبيبات الدقيقة يعمل على استقرار الأنابيب العصبية الدقيقة [2،40]. في العقول البشرية، يتواجد تاو على شكل ستة أشكال إسوية مختلفة تحمل إما ثلاثة أو أربعة تكرارات مرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة (R). تسمى هذه الأشكال الإسوية 3R و4R على التوالي.

لقد وجد أن وجود الأميلويدات 3R أو 4R أو كليهما 3R و4R يكون خاصًا بالمرض. على سبيل المثال، في مرض AD، وALS، وFT، وD، ومرض باركنسون، يوجد كل من أميلويدات 3R و4R، بينما في التنكسات القشرية القاعدية ومرض بيك، يوجد فقط أميلويدات 4R و3R، على التوالي، [41،42]. يخضع تاو لـ PTMs، وخاصة الفسفرة [40].

يؤدي فرط الفسفرة المرضي إلى تقليل تقارب تاو للأنابيب الدقيقة ويسبب انفصالها عن الأنابيب الدقيقة، مما يؤدي إلى تكوين PHFs وNFTs [2].

حتى الآن، تم تحديد 85 موقعًا محتملاً للفسفرة في تاو [40]. علاوة على ذلك، كشفت الدراسات الجزيئية والخلوية أن الأستيل (على سبيل المثال، Lys174 وLys274 وLys280)، والأكسدة (على سبيل المثال، Cys322)، والنترتة (على سبيل المثال، Tyr29)، والتسكر (على سبيل المثال، Lys87، وLys132 وLys150)، والاقتطاع (على سبيل المثال، في Asp13 وLys150). Asp421 وGlu391) والتواجد في كل مكان (على سبيل المثال، Lys48 وLys63) يؤثران أيضًا على تجميع تاو [27] (الجدول 1).

3.2. -سين في PD

على عكس مرض الزهايمر، يؤثر مرض باركنسون في المقام الأول على النظام الحركي، مما يسبب الارتعاش، والصلابة، وبطء الحركة، وعدم الاستقرار الوضعي [2]. السمة المرضية المميزة لـ PD هي وجود شوائب الأميلويد السيتوبلازمي، المعروفة باسم أجسام ليوي (LBs) وعصبيات ليوي (LNs). تتكون LBs وLNs من مجاميع الأميلويد، والتي يكون مكونها الرئيسي هو -syn [43].

يحتوي -Syn على 140 وحدة بنائية مع منطقة طرفية N موجبة الشحنة، ومنطقة مركزية غير أميلويد (NAC) معرضة للتجميع، n، n، ومنطقة C سالبة الشحنة [44،45].

التكرارات أو التضاعفات في منطقة الكروموسوم -syn (4q 21-23) والطفرات بما في ذلك A53T وG51D وH50Q وE46K وA30P في تسلسل -syn، والمناطق المرتبطة ببداية PD المبكرة [46-48] (الجدول 2 ). ينتمي Syn-Syn إلى عائلة بروتينية تتضمن أيضًا - و -synucleins بتشابه يتراوح بين 55% إلى 62%. - سينوكلين لديه ميل منخفض للتجمع وقد تم اكتشافه لقمع تجمع -syn كمثبط طبيعي في حين أن -synuclein المؤكسد يمكن أن يبدأ تجميع -syn [49،50].

من المعروف أن العديد من PTMs تؤثر على تجميع -syn، وترتبط بـ PD [28،]، ولها إمكانات تشخيصية [51] (الجدول 1).

وتشمل هذه أستلة الطرف N، والعديد من الاقتطاعات في الطرف N (على سبيل المثال، -syn7-140، 14-140، 40-140، و72–140 الموجودة في المختبر، 5–140 و68 –140 موجود في الجسم الحي والعديد منها في كليهما) وC-terminus (على سبيل المثال، -syn1-115، 1-119، 1-122، 1-124، 1-125، {{ 19}} و1-133 و1-135)، الفسفرة من Ser87 وSer129، وأكسدة Met1 وMet5 وMet116 وMet127، وجمع Lys96 وLys102، ونترات Tyr39 وTyr125 وTyr133، وإنتشار Lys6 و Lys10 و Lys12 Lys21 و Lys23 و Lys43 و Lys96 [28،52،53] (الجدول 1).

3.3. TDP-43 وFUS في ALS وFTD

ALS وFTD هما من الأمراض التنكسية العصبية ذات الآليات المتداخلة. يؤثر ALS على الخلايا العصبية العلوية والسفلية، مما يسبب فقدان السيطرة على العضلات. FTD هو شكل من أشكال الخرف المرتبط بانحطاط الفص الصدغي الأمامي والأمامي [54].

يرتبط حوالي 97% من حالات التصلب الجانبي الضموري و45% من حالات الخرف الجبهي الصدغي بوجود شوائب من مجاميع TDP منتشرة في كل مكان وفرط الفسفرة وTDP -43 مقطوعة نهائيًا في سيتوبلازم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية [29].

TDP-43 عبارة عن بروتين نووي ريبي بطول 414 بقايا قادر على تكوين مجاميع تشبه الأميلويد في المختبر والمكثفات (أي حبيبات الإجهاد) [9] في ظل ظروف مرضية. وهو يتألف من قناة طرفية N مع إشارة توطين نووية، ونموذجين للتعرف على الحمض النووي الريبي (RNA)، وإشارة تصدير نووية، ومنطقة طرفية C مضطربة [29].

تم الإبلاغ عن أن جميع هذه المناطق تلعب دورًا حاسمًا في تجميع البروتين [55-57]. تم التعرف على عدة طفرات TDP-43 في كل من الحالات المتفرقة والعائلية لـ ALS وFTD، بما في ذلك G294A وQ331K وM337V [58] وK181E [59] (الجدول 2). كما هو الحال مع A و-syn، تلعب PTMs لـ TDP-43 أيضًا دورًا رئيسيًا في تجميع البروتين وتطور المرض.

تجدر الإشارة إلى أن شظايا الطرف C المقطوعة 25 كيلو دالتون و35 كيلو دالتون توجد بشكل شائع في المجاميع المرضية لدى مرضى التصلب الجانبي الضموري [29،31،54]. يعد Ubiquitination أيضًا تعديلًا نموذجيًا لإدراجات TDP -43 [31]. أخيرًا، غالبًا ما يرتبط الفسفرة الشاذة والأستلة وأكسدة TDP-43 بالتوضع الخاطئ والتجمع الشاذ للبروتين [29] (الجدول 1).

يرتبط ALS وFTD أيضًا ببروتين آخر مرتبط بالـ RNA/DNA، وهو FUS. FUS عبارة عن بروتين بطول 526 بقايا يتم تصنيعه بواسطة مجال التنشيط النسخي للطرف N ومجال الطرف C، والذي يتفاعل مع عوامل النسخ ويتضمن أيضًا إشارة تحديد الموقع النووي [60،61].

يحتوي كلا المجالين على مناطق منخفضة التعقيد ويلعبان دورًا في تكوين المكثفات والهلاميات المائية [62]. تم الإبلاغ عن أكثر من 50 طفرة (على سبيل المثال، R521C، R521H [63]) من FUS في حالات ALS/FTD.

على عكس TDP-43، يتم العثور على FUS بشكل عام كبروتين كامل الطول في المجاميع [61]. يحدث الفسفرة في المجالات الشبيهة بالبريون في FUS وقد ثبت أنه يؤثر على فصل الطور ونمط التجميع، في حين تم العثور على طفرات و PTMs (أساسًا الميثيل والتفسفر) في مجال الطرف C الخاص به لتنظيم توطينه النووي/السيتوبلازم [61،64].

على الرغم من الدور المرضي الواضح لـ FUS، فإن الأنماط الظاهرية لـ ALS/FTD تكون أقل ارتباطًا بـ FUS مقارنةً باختلالات TDP-43 [61،65]. وبالتالي، فإن دور FUS كمؤشر حيوي لا يزال يتعين تحديده.

4. الإمكانات التشخيصية للسمات الجينية والهيكلية والكيميائية للبروتينات الأميلويدية

تم استخدام العديد من طرق الكشف لتحديد كمية البروتينات الأميلوجينية في العينات البيولوجية ولتحديد العلاقة بين هذه البروتينات والأمراض التنكسية العصبية.

تهدف بعض هذه الاستراتيجيات إلى قياس التغيرات في مستويات التعبير/تركيز البروتينات الأميلوجينية بغض النظر عن شكلها أو تعديلها (الجدول 2). تركز بعض الأساليب الأخرى، بدلاً من ذلك، على فحص الخصائص الهيكلية المحددة (على سبيل المثال، الحالات المجمعة) أو الخصائص الكيميائية (أي PTM) للبروتينات الأميلويدوجينية (الجدول 1).

كل هذه الأساليب تحلل مناطق مختلفة من الجسم. يمكن للتقنيات، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)، استكشاف البروتينات مباشرة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS)، على سبيل المثال، في الدماغ [2،44،66].

ومع ذلك، يمكن أيضًا اكتشاف البروتينات الأميلويدية في مناطق أخرى من الجسم يسهل الوصول إليها. في هذا القسم، نناقش النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل كل من أنسجة المخ وسوائل الجسم التي يمكن الوصول إليها، وذلك باستخدام المقايسات المناعية بشكل رئيسي، مثل النشاف المناعي ومقايسات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

تشمل السوائل قيد النظر السائل النخاعي (CSF)، الذي يكون على اتصال مباشر مع الجزء خارج الخلية من الدماغ، وعلى هذا النحو، فهو السائل الأمثل لقياسات استقلاب الدماغ [44].

For more information:1950477648nn@gmail.com