يتأثر تأثير Nephrotoxin Ochratoxin A على خلايا الكلى البشرية التي تم دراستها بواسطة نموذج الثقافة المشتركة الجديد من خلال وجود الخلايا الليفية
Mar 01, 2022
الملخص:الالكلىمهددة بالكثير من المواد التي يحتمل أن تكون سامة. لدراسة تأثير nephrotoxin ochratoxin A (OTA) ، أنشأنا نموذجًا للثقافة المشتركة للخلية يتكون من الإنسانكلوي الخلايا الليفية القريبة والخلايا الليفية. درسنا تأثير OTA على بقاء الخلية ، والتعبير عن الجينات و / أو البروتينات المتعلقة بموت الخلايا ، والمصفوفة خارج الخلية واستتباب الطاقة. تم تحسين النخر المستحث بـ OTA في كلا النوعين من الخلايا في وجود نوع الخلية الآخر المعني ، في حين كان موت الخلايا المبرمج الناجم عن OTA مستقلاً عن ذلك. في الخلايا الليفية ، ولكن ليس في الخلايا الأنبوبية ، كان تأثير الثقافة المشتركة مرئيًا فيما يتعلق بالتعبير عن البروتين المرتبط بدورة الخلية p21. كان التعبير عن البروتين vimentin الذي يشير إلى الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة مستقلاً عن حالة الثقافة. تم تحسين التعبير عن lncRNA WISP 1- AS1 الناجم عن OTA في الثقافة المشتركة. أدى التعرض لـ OTA إلى تغييرات في التعبير عن الجينات المتعلقة باستقلاب الطاقة مع تأثير تعبئة الجلوكوز وتقليل التعبير عن بروتينات الميتوكوندريا. نوضح معًا أن تفاعل الخلايا يمكن أن يكون مختلفًا في وجود الخلايا القريبة بشكل طبيعي ، مما يتيح إجراء تقاطع خلوي. لذلك ، لتقييم سمية مادة ما ، سيكون من المفيد النظر في استخدام الثقافات المشتركة بدلاً من الثقافات الأحادية.
الكلمات الدالة:أوكراتوكسين أ ؛ زراعة الخلايا؛ استقلاب الطاقة؛ توازن موت الخلايا المبرمج - نخر. الميتوكوندريا؛ الكلى؛ كلوي
سيحسن الكستانش الفشل الكلوي / الفشل الكلوي
مقدمة
نظرًا لوظيفته الإخراجية ، فإنالكلىمهددة من قبل مجموعة متنوعة من المواقف الضارة مثل الأدوية أو ملوثات الطعام ، مثل السموم الفطرية التي تؤدي إلى أعراض حادة أو - أسوأ - مزمنةأمراض الكلىمع انتشار حوالي 10 في المائة [1،2]. لفهم آليات الإجراء الكلوي السام ، من المفيد إيجاد استراتيجيات للتخفيف من هذه السيناريوهات الضارة وقد تم إجراء العديد من الدراسات لحل مسألة لماذا وكيفالكلىمعرضة للخطر [3-5]. لدراسة تأثيرات مادة ما على كائن حي ، غالبًا ما يكون من الصعب استخدام حيوانات كاملة بسبب المخاوف الأخلاقية والمتطلبات التنظيمية والمكلفة والمتقنة. علاوة على ذلك ، يرتبط نقل المعرفة إلى الوضع البشري بعدم اليقين. لذلك ، تم إنشاء نماذج زراعة الخلايا واستخدامها على نطاق واسع ، ولها ميزة أن نوع خلية معين واستجابته لمادة أو علاج يمكن دراسته في ظل ظروف خاضعة للرقابة. على الرغم من أنه تم التوصل إلى العديد من النتائج الهامة باستخدام هذا النهج ، إلا أن بعض العيوب متأصلة: غالبًا ما يتم تخليد خلايا الخط الخلوي عن طريق الطفرات أو طرق أخرى - جذرية في بعض الأحيان - [6]. يسمح هذا بالتعامل السهل والاستخدام الطويل ولكن مع المخاطر التي تظهر في نظام نموذج معين قد لا تكون قابلة للتحويل إلى الحالة في العضو أو الكائن الحي بأكمله. للتغلب على هذا العيب ، بدلاً من خطوط الخلايا الخالدة ، يمكن استخدام الخلايا الأولية ، لكن توليد الخلايا الأولية غالبًا ما يكون صعبًا للغاية ويتطلب مهارات تقنية متقدمة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما لا تعيش الخلايا الأولية لفترة طويلة من الزمن وتحتاج إلى ظروف استزراع فردية خاصة. لكن الخلايا الأولية هي خطوة أقرب إلى الظروف الطبيعية وعلى الأقل في بعض الأحيان اتضح أنها أكثر حساسية ، على سبيل المثال ، المنبهات السامة مثل خطوط الخلايا [7] ، مما يعني أن خطوط الخلايا قد تكون أكثر قوة. عيب آخر هو حقيقة أن الخلايا غالبًا ما يتم الاحتفاظ بها في الزراعة الأحادية ، أي بدون تأثيرات أنواع الخلايا الأخرى ، والتي تكون عادةً قريبة من العضو في المنزل. لذلك ، قد تكون خطوة نحو موقف أكثر واقعية لدراسة استجابة نوع من الخلايا لمادة أو علاج في وجود تلك الخلايا الموجودة في العضو الأصلي على مقربة شديدة.
في الالكلى، الخلايا النُبيبية القريبة محاطة بأرومات ليفيّة ، ويمكن افتراض التأثير المتبادل على الأرجح. هذا هو الحال أيضا فيتلف الكلىالسيناريوهات التي تؤدي في معظم الحالات إلى التهاب وتليف أنبوبي خلالي [8،9] ، وتكون حاسمة في تراجعالكلىوظيفة. بسبب قدراتها في النقل والإنزيمية ،كلويتتعرض الخلايا الأنبوبية القريبة لخطر الانقراض بسبب مجموعة متنوعة من المواد السامة المحتملة مثل ، على سبيل المثال ، الأدوية أو بقاياها أو السموم الفطرية. يتمثل أحد أدوار الخلايا الليفية المحيطة في تزويد المصفوفة خارج الخلية بإطلاق الكولاجين ومكونات المصفوفة الأخرى وبالتالي المشاركة في تكامل النسيج [10]. لكنها تشارك أيضًا - جنبًا إلى جنب مع الخلايا الظهارية - في العمليات الالتهابية أو في التليفأمراض الكلى[11] مع خطر التطورالفشل الكلوي.
السموم الفطرية المدروسة بشكل مكثف والتي لها صلة بصحة الإنسان هي ochratoxin A (OTA) [12 ، 13]. يمكن العثور عليها في مجموعة متنوعة من المواد الغذائية [12،14] وتجنب التعرض لها وامتصاصها يكاد يكون مستحيلًا [9،15]. يؤدي هذا إلى ملاحظة أن OTA يتم اكتشافه بشكل متكرر في دم الإنسان بتركيزات نانومولار منخفضة [16]. في الحيوانات المكشوفة ، يؤدي OTA إلىفشل كلويوالتغيرات الليفية [17 ، 18]. يُفترض أن يكون التعرض للأوكراتوكسين في الإنسانأمراض الكلى[19]. في خلايا النبيبات الأولية القريبة للإنسان ، تم إظهار التأثير السام لـ OTA ، والذي يمكن ملاحظته أيضًا في الخلايا الليفية الأولية البشرية ، على الرغم من أنه ليس بارزًا كما هو الحال في خلايا النبيبات القريبة [7]. لا تزال الآليات الكامنة وراء التأثير السام لـ OTA غير مفهومة تمامًا وتخضع للعديد من الدراسات الجارية. إلى أي مدى تتداخل الخلايا المجاورة ذات الوظائف المختلفة وبالتالي تعدل وظيفة الخلية ، يكاد يكون غير معروف ولكنه متوقع. في دراسة سابقة باستخدام نموذج الثقافة المشتركة يتكون من الفئرانالكلىالنبيب القريب وخلايا الأرومة الليفية ، اتضح أن نوعًا من الحديث المتبادل بين كلا النوعين من الخلايا يحدث ، مما أدى إلى ملاحظة أن تأثيرات OTA على أنها انتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة (EMT) تحدث فقط في ظل ظروف الثقافة المشتركة [20]. استنتاج آخر يمكن استخلاصه من تلك الدراسة وغيرها هو أن خلايا الفئران أكثر قوة فيما يتعلق بالتسامح مع OTA مقارنة بخلايا الأنابيب البشرية القريبة [7،20] وبالتالي يلزم وجود نظام نموذجي يعتمد على الخلايا البشرية لتقييم الوضع البشري عن كثب و خطر التعرض للأوكراتوكسين A.
لذلك ، في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذجًا متقدمًا للثقافة المشتركة للخلايا يتكون من خلايا نبيبات بشرية قريبة (خلايا HK2) وخلايا ليفية بشرية (خلايا CCD -1092 SK) لدراسة تأثيرات OTA على بقاء الخلية (موت الخلايا المبرمج) ، نخر) والتعبير عن بعض الجينات المختارة نموذجيًا والمتعلقة بدورة الخلية وموت الخلية والمصفوفة خارج الخلية والتمثيل الغذائي. على غرار الدراسات السابقة التي أجريت باستخدام خلايا الفئران [20] ، تم وضع الخلايا الأنبوبية البشرية القريبة على أجهزة ترشيح ووضعت المرشحات فوق طبقة من الخلايا الليفية المزروعة في قاع طبق بتري بحيث يكون الجانب السفلي الجانبي للخلايا الظهارية متجهًا نحو الخلايا الليفية ، مما يتيح نوعًا من المحادثة بين نوعي الخلايا.
نتائج
نشاط البروتين وإطلاق اللاكتات ديهيدروجينيز وكاسبيز -3للحصول على أول انطباع عن التأثيرات المحتملة لظروف الاستنبات نفسها وكذلك حول التأثيرات على التعديلات التي يسببها OTA ، قمنا بمقارنة نشاط caspase -3 كمقياس لموت الخلايا المبرمج للخلايا المزروعة في الزراعة الأحادية مع نشاط الخلايا المزروعة في الخلايا. - الثقافة المحتضنة مع أو بدون 100 نانومتر OTA لنقطتين زمنيتين ، 24 و 48 ساعة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد إطلاق اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) كمقياس للنخر وكذلك محتوى البروتين لإعطاء انطباع عام عن حالة الخلية. لذلك ، تم وضع كميات متساوية من الخلايا إما في قاع البئر (الخلايا الليفية) أو على فيفلتر (خلايا الأنابيب القريبة). بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، تم وضع الفلاتر في الآبار التي توجد بها الخلايا الليفية (انظر الملخص الرسومي). كما هو مبين في الشكل 1 أ ، لا يمكن ملاحظة أي تأثيرات تعتمد على حالة الثقافة على محتوى البروتين في كلا النوعين من الخلايا بعد 24 أو 48 ساعة (انظر أيضًا الملف التكميلي S1). في الأرومات الليفية ، أدى التعرض لـ OTA إلى زيادة طفيفة في محتوى البروتين بينما أدى OTA في الخلايا الأنبوبية إلى انخفاض طفيف في محتوى البروتين مما يدل على أن OTA قد يكون له تأثير سلبي على الخلايا الأنبوبية. كانت هذه التأثيرات مستقلة تقريبًا عن حالة الاستنبات في كلا النوعين من الخلايا
الشكل 1. تأثيرات الأوكراتوكسين A (OTA) و / أو ظروف الاستزراع على محتوى البروتين (A) ، ونشاط كاسباس -3 (B) ، وإطلاق اللاكتات ديهيدروجيناز (LDH) (C). تمت زراعة الخلايا إما في أحادي أو في ثقافة مشتركة وتعرضت لـ 1 0 0 نانومتر OTA لمدة 24 أو 48 ساعة. N=3 - 6 ، n=14 - 18 (بروتين ، LDH) أو 8–9 (caspase -3). * يشير إلى ap <0.05 للخلايا="" غير="" المعرضة="" للأوكراتوكسين="" a="" (مقارنة="" تأثيرات="" ota="" ،="" على="" الجانب="" الأيسر)="" أو="" بالخلايا="" في="" الثقافة="" الأحادية="" (مقارنة="" تأثيرات="" المزرعة="" ،="" الجانب="" الأيمن="" على="" التوالي).="" لتوضيح="" التأثير="" على="" محتوى="" البروتين="" ،="" قمنا="" بدراسة="" موت="" الخلايا="" المبرمج="" والنخر.="" بالمقارنة="" مع="" فيبروبلاستس="" ،="" كان="" ota="" تأثير="" واضح="" على="" موت="" الخلايا="" المبرمج="" في="" الخلايا="" الأنبوبية="" بعد="" التعرض="" لمدة="" 24="" ساعة="" مع="" حوالي="" 2.="" 5-="" ضعف="" في="" النشاط="" (الشكل="" 1="" ب).="" بعد="" 48="" ساعة="" من="" التعرض="" ،="" كانت="" الزيادة="" لا="" تزال="" ملحوظة="" ولكنها="" ليست="" مميزة="" كما="" بعد="" 24="" ساعة.="" ومع="" ذلك="" ،="" كانت="" هذه="" الزيادات="" مستقلة="" تقريبًا="" عن="" ظروف="" الاستزراع="" باستثناء="" أنه="" بعد="" 48="" ساعة="" في="" وجود="" الخلايا="" الليفية="" ،="" انخفض="" نشاط="" الكاسبيز="" في="" الخلايا="" الأنبوبية="" بشكل="" طفيف="" ،="" مما="" يشير="" إلى="" تأثير="" الحماية="" المتواضع="" للثقافة="" المشتركة.="" ومع="" ذلك="" ،="" كان="" هناك="" تأثير="" حماية="" للثقافة="" المشتركة="" يمكن="" ملاحظته="" بالنسبة="" للأرومات="" الليفية="" ،="" خاصة="" في="" وجود="" ota.="" في="" الثقافة="" المشتركة="" ،="" تم="" تحسين="" إطلاق="" ldh="" بشكل="" واضح="" في="" الخلايا="" الليفية="" والخلايا="" الأنبوبية="" مقارنة="" بظروف="" الزراعة="" الأحادية="" المستقلة="" عن="" وجود="" ota="" (الشكل="" 1c).="" في="" الخلايا="" الأنبوبية="" ،="" أدى="" ota="" إلى="" زيادة="" ldh="" المنطلق="" في="" الوسائط="" خاصة="" بعد="" التعرض="" لمدة="" 48="" ساعة="" ،="" وهو="" ما="" لم="" يكن="" واضحًا="" في="" الخلايا="" الليفية.="" مجتمعة="" ،="" أدى="" وجود="" نوع="" الخلية="" الآخر="" المعني="" إلى="" نخر="" محسن="" ولكن="" إلى="" موت="" الخلايا="" المبرمج="" بشكل="" أقل="" بحيث="" لم="" يتغير="" محتوى="" البروتين="" الكلي="" بشكل="" ملحوظ.="" كانت="" تأثيرات="" ota="" على="" موت="" الخلايا="" المبرمج="" والنخر="" أيضًا="" مستقلة="" في="" الغالب="" عن="" وجود="" أو="" عدم="" وجود="" نوع="" الخلية="">
لطخة غربية وتعبير مرنا
CDKN1A / ص 21تبين أن دورة الخلية تتأثر بـ OTA ويمكن إثبات أن بروتين p21 الذي يشارك في دورة الخلية قد تم تنظيمه بواسطة OTA في الخلايا الأنبوبية [21]. لاستكشاف مدى تأثر البروتين ، وكذلك التعبير عن ترميز mRNA لـ p21 ، بوجود الخلايا الليفية ، أجرينا لطخات غربية و RT-PCR. كما هو مبين في الأشكال 2A و B و 3 ، أدى التعرض لمدة 48 ساعة لـ 100 نانومتر OTA إلى زيادة كمية البروتين p21 في أحادي ولكن أيضًا في التكوينات المشتركة للثقافة في الخلايا الأنبوبية. في الخلايا الليفية تحت ظروف الاستزراع المشترك ، لم يكن لـ OTA أي تأثير على تعبير البروتين p 21- بالرغم من زيادة تعبير mRNA بواسطة OTA بشكل مستقل عن وجود نوع الخلية الأخرى. ومن المثير للاهتمام ، في ظل ظروف الثقافة المشتركة ، أن التعرض لـ OTA لم يزيد من تعبير البروتين p21. في الخلايا الأنبوبية ، لم يتم تغيير تعبير الحمض النووي الريبي عن طريق وجود الخلايا الليفية ولكن في الخلايا الليفية في الثقافة المشتركة ، لم يتم تحسين تعبير pZlmRNA فقط في التعرض لـ OTA ولكن أيضًا في الخلايا التي لم تتعرض لـ OTA (انظر أيضًا الملف التكميلي S1). هذا يدل على أن p resenee من نوع الخلية الآخر له تأثير على تعبير البروتين p21 ، خاصة في الخلايا الليفية.
انزيمات الأكسدة الحلقية 2 (COX2)لقد ثبت أن بروتين انزيمات الأكسدة الحلقية 2 (COX2) وكذلك مستويات الرنا المرسال تزداد أثناءفشل كلوي[22]. كما هو مبين في الأشكال 2C و D و 3 ، فقط في الخلايا الليفية ، زاد تعبير البروتين عن طريق التعرض لـ OTA. بالإضافة إلى ذلك ، في وجود الخلايا الأنبوبية ، تم تحسين تعبير بروتين COX2 في الخلايا غير المعالجة وكذلك في الخلايا المعرضة لـ OTA ، مما يدل على وجود تأثير واضح لخلايا الأنابيب. ومع ذلك ، لم يتأثر تعبير mRNA بواسطة OTA وحدث تأثير طفيف جدًا للثقافة المشتركة عن طريق التعرض لـ OTA. في المقابل ، في الخلايا الأنبوبية ، كان تعبير الرنا المرسال والبروتين عن COX2 مستقلاً تمامًا عن OTA أو عن وجود فيفروبلاستس. وهذا يدل على أنه فيما يتعلق بخلايا نبيبات COX2 يمكن أن تؤثر على الأرومات الليفية ، لكن الأرومات الليفية ليس لها تأثير على الخلايا الأنبوبية.
فيبرونكتينفشل كلويغالبًا ما يكون مصحوبًا بالتليف الكيسي. أثناء التليف ، يحدث تراكم للمصفوفة خارج الخلية وملاحظة واحدة إلى جانب الأخرى هي زيادة كمية بروتين فيبرونيكتين [23]. لذلك ، تم تحديد التغيير المعتمد على OTA في mRNA المشفر بالألياف وتعبير البروتين في ظروف الثقافة الأحادية أو المشتركة. كما هو مبين في الأشكال 3 و 4 أ ، ب ، 48 ساعة أدى تعرض الخلايا الأنبوبية إلى 100 نانومتر OTA إلى انخفاض فيفيبرونكتين داخل الخلايا في كل من الثقافة الأحادية والمشتركة. كان تأثير OTA أقل في الثقافة المشتركة. علاوة على ذلك ، تم تقليل كمية ترميز mRNA لـ fifibronectin عن طريق التعرض لـ OTA بشكل مستقل عن ظروف الثقافة ، كما أدى وجود الخلايا الليفية فيفي إلى انخفاض تعبير mRNA في الخلايا الخاضعة للتحكم والخلايا المعرضة لـ OTA. على النقيض من ذلك ، لم يتم تغيير تعبير فيبرونكتين تقريبًا في الأرومات الليفية لا بواسطة OTA ولا عن طريق ظروف الثقافة بسبب التباين الكبير ، خاصة في البقع الغربية. قد يكون الاتجاه نحو التعبير المستحث OTA مرئيًا في الثقافة الأحادية.
فيمنتينVimentin هو بروتين تزداد وفرته عند حدوث انتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة (EMT) ويمكن أن يؤدي تطور EMT إلىفشل كلوي[23]. لذلك ، تم تحديد التغيير المعتمد على OTA لـ vimentin mRNA وتعبير البروتين في ظروف الثقافة الأحادية والمشاركة. كما هو مبين في الشكلين 3 و 4 ج ، د ، 48 ساعة أدى تعرض الخلايا الأنبوبية إلى 100 نانومتر OTA إلى وفرة أقل من بروتين الفيمنتين في ظل ظروف الثقافة الأحادية والمشتركة. ومع ذلك ، في وجود فيبروبلاستس ، كان تعبير بروتين الفيمنتين مستقلاً عن ظروف الاستزراع. لم يتم تغيير التعبير عن ترميز mRNA للفيمنتين تقريبًا لا بواسطة OTA ولا عن طريق ظروف الثقافة باستثناء أن التعرض OTA في الثقافة المشتركة أظهر زيادة طفيفة. في الأرومات الليفية ، كان التعبير البروتيني للفيمنتين مستقلاً تمامًا عن التعرض للأوكتا وكذلك عن وجود الخلايا الأنبوبية. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم تغيير تعبير mRNA المشفر للفيمنتين تقريبًا
التعبير عن بعض الجينات المختارةلمزيد من الاختبار النموذجي في المدى الذي قد تؤثر فيه ظروف الثقافة أيضًا على التعبير عن RNAs الأخرى ، اخترنا بعض الجينات ، التي تلعب دورًا في نخر موت الخلايا المبرمج ، أو تطور السرطان ، أو استقلاب الطاقة (انظر أيضًا الملف التكميلي S1).
WISP 1- AS1 is a long non-coding RNA (lncRNA) induced by OTA affecting transcriptional regulation and playing a role in the apoptosis-necrosis balance and probably in cancer development [24]. As seen in Figure 5A, 48 h exposure to 100 nM OTA led in both cell types to a marked increase in the expression of that lncRNA. Without OTA, the presence of the respective other cell type had almost no inflfluence on the expression. However, in the presence of OTA, its expression was higher in co-culture as compared to mono-culture.
GDF15عامل تمايز النمو 15 (GDF15) هو عضو في عامل النمو المحول للعائلة الفائقة التي تستجيب للإجهاد. تمت مناقشته كمؤشر حيوي أيضًا لـأمراض الكلىأو كمؤشر للبقاء على قيد الحياةالكلىمرضى زرع [25،26]. تم تحسين التعبير عن ترميز mRNA لـ GDF15 في كلا نوعي الخلايا بعد التعرض لـ OTA كما هو موضح في الشكل 5 ب. تم تفضيل هذا التأثير الناجم عن OTA في الأرومات الليفية في فيفروبلاستس عندما كانت الخلايا الأنبوبية في المنطقة المجاورة. في الخلايا الأنبوبية ، ومع ذلك ، كان التعبير مستقلاً عن وجود فيبروبلاستس (الشكل 5 ب).CDK2تم التعرف على كيناز 2 المعتمد على Cyclin (CDK2) من خلال تحليل شبكة الارتباط الموزون كمنظم رئيسي لخلل تنظيم دورة الخلية الناجم عن OTA [21]. في الخلايا الليفية في الزراعة الأحادية ، لم يتم تغيير التعبير عن ترميز mRNA لـ CDK2 بواسطة OTA. علاوة على ذلك ، لم يؤثر وجود الخلايا الأنبوبية على تعبير الرنا المرسال. ومع ذلك ، في الخلايا الأنبوبية ، أدى OTA إلى تعبير محسّن قليلاً فقط في وجود الخلايا الليفية (الشكل 5C).
البروتينات المرتبطة بالجليكوجين والجلوكوز: PYGM و GYS1 و GLUT1 (SLC2A1)الالكلىيشارك أيضًا في توازن الجلوكوز ويمكن أن يمد الجسم بالجلوكوز إما عن طريق استحداث السكر أو عن طريق تعبئة مخازن الجليكوجين [27]. يلعب فوسفوريلاز الجليكوجين (PYGM) دورًا في تحلل مخازن الجليكوجين ، وبالتالي تعبئة الجلوكوز [28]. كما هو موضح في الشكل 6 أ ، أدى التعرض لمدة 48 ساعة لـ 100 نانومتر OTA إلى زيادة ملحوظة في التعبير عن ترميز mRNA لفوسفوريلاز الجليكوجين ، خاصة في الخلايا الأنبوبية. ومع ذلك ، في الخلايا الأنبوبية ، لم تكن هذه الزيادة تعتمد على حالة الاستنبات ، بينما في الخلايا الليفية ، كان التعبير الناجم عن OTA أعلى في وجود الخلايا الأنبوبية مقارنة بالحالة التي لا تحتوي على خلايا نبيبية ، يحفز Glycogen synthase 1 (G ^ YSl) التفاعل المعاكس. وبينما تم تنظيم التعبير عن الفوسفوريلاز ، تم تنظيم التعبير عن سينسيز بواسطة OTA في الخلايا الأنبوبية وفي الخلايا الليفية في ctilture المشترك (الشكل 6 ب). يشير هذا إلى تأثير تعبئة الجلوكوز لـ OTA ، ومن المثير للاهتمام أن تعبير mRNA لناقل الجلوكوز GLUTl (SLC2A1) قد تم تنظيمه بواسطة OTA أيضًا (الشكل 6C) ، مما يؤكد فكرة زيادة الطلب على الجلوكوز بسبب تعرض OTA ربما بسبب
البروتينات المرتبطة بالميتوكوندريا: NDUFB10 و MRPS16
هناك مؤشرات على أن التعرض للأوكراتوكسين A يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في إمكانات الميتوكوندريا فيالكلىتظهر الخلايا [24] أن وظيفة الميتوكوندريا قد تتأثر بالتعرض لـ OTA ، والتي قد تتأثر بشكل إضافي بوجود الخلايا الليفية. لذلك ، ممثلًا لتشفير الحمض النووي الريبي الآخر لبروتينات الميتوكوندريا ، نعرض هنا التعبير عن ترميز mRNAs لـ NDUFB1 0 و MRPS16. رموز NDUFBt0 لـ NADH للميتوكوندريا: ubiquinone oxidoreductase الوحدة الفرعية B10 ، والتي تعد جزءًا من مجمع الجهاز التنفسي للميتوكوندريا I ويتم التعبير عنها بشكل كبير في القلب والكلى(جين NCBI. متوفر على الإنترنت: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (تم الوصول إليه في 17 مارس 2021)). رموز الجينات MRPS16 لبروتين الريبوسوم الميتوكوندريا S16 ، والذي يلعب دورًا في تخليق بروتين الميتوكوندريا. كما هو مبين في الشكل 7 ، أدى التعرض لـ OTA لمدة 24 ساعة في كلا النوعين من الخلايا إلى انخفاض التعبير عن كلا الرنا المرسال. في الخلايا الأنبوبية ، لم يتأثر التعبير المنخفض عن جين NDUFB10 بوجود الأرومات الليفية ، بينما في الخلايا الليفية ، تم إنقاذ تقليل OTA الناجم عن التعبير NDUFB10 قليلاً في وجود خلايا نبيبية (الشكل 7 أ). في الخلايا الأنبوبية ، كان التعبير المنخفض بالفعل عن الترميز الجيني للوحدة الفرعية الريبوزومية للميتوكوندريا بواسطة OTA أقل أيضًا في وجود الخلايا الليفية ، بينما في الخلايا الليفية أدى وجود الخلايا الأنبوبية إلى تعبير أعلى قليلاً عن MRPS16 mRNA (الشكل 7 ب). يوضح هذا أن وظيفة الميتوكوندريا يمكن أن تتأثر بـ OTA ولكن يمكن أيضًا تعديل تأثير OTA عندما يكون نوعا الخلايا قريبين من بعضهما البعض.
مناقشة
الالكلىمعرضة لخطر الانقراض من قبل مجموعة متنوعة من المواد السامة للكلية مع خطر الإصابة بالتهاب حاد أو كرونيتفشل كلوي[1]. لدراسة تأثير المواد السامة للكلية على أنواع مختلفة من الخلايا ولتقليل التعامل مع الحيوانات ، تم تطبيق مزارع الخلايا على نطاق واسع. تتمتع مزارع الخلايا هذه بميزة إضافية تتمثل في إمكانية التحكم في الظروف التجريبية والتأثيرات المحددة لمادة ما باستخدام نوع خلية محدد. إلى جانب هذه المزايا غير المتنازع عليها ، تبقى بعض الاعتبارات: على سبيل المثال ، في نوع خلية واحدة "العضو المنزلي" (على سبيل المثال ، الخلايا الأنبوبية القريبة فيالكلى) محاط بأنواع أخرى من الخلايا (على سبيل المثال ، الخلايا الليفية) مع ترابطات متعددة. لذلك ، قد لا يكون رد الفعل تجاه مادة ما عند استخدام نوع خلية واحد فقط هو نفسه الموجود في وجود الخلايا القريبة في الأنسجة الأصلية. في نموذج يتكون من نوعين مختلفين من الخلايا الكلوية للجرذان ، تبين أن الحديث المتبادل موجود بين النبيبات وخلايا الخلايا الليفية ، مما يؤدي إلى ظهور تفاعلات فقط عندما يكون نوعا الخلايا متقاربين [20]. ومع ذلك ، عند مقارنة نتائج هذه الدراسة بالنتائج التي تمت ملاحظتها باستخدام خلايا الأنابيب الكلوية البشرية ، يتضح أن خلايا الفئران أكثر قوة من تلك التي يخبرها الإنسان عن رد فعلها تجاه العلاج باستخدام السم الكلوي المنتشر في كل مكان ، ochrafoxin A (OTA) [7]. لذلك ، من الضروري وجود نموذج زراعة مشتركة يتكون من خلايا بشرية. أنشأنا مثل هذا النموذج باستخدام خط خلية الأنبوب البشري القريب HK2 والخلايا الليفية البشرية. نمت خلايا HK2 على مدخلات مرشح وجُمعت مع أرومات ليفية نمت في قاع 6- صفيحة بئر. بعد تسجيل المعلمات الأساسية مثل موت الخلايا المبرمج والنخر ، استخدمنا هذا النموذج للحصول على بيانات أولية عن تأثير ochratoxin A على عرض بعض البروتينات و RNAs المتعلقة بدورة الخلية ، EMT ، والتمثيل الغذائي الخلوي.
بقاء الخلية بناءً على محتوى البروتين ، بدا أنه لا OTA ولا حالة الثقافة كان لها تأثير ملحوظ. ومع ذلك ، تحولت العلاقة بين موت الخلايا المبرمج والنخر نحو النخر في كلا النوعين من الخلايا عندما تمت زراعة الخلايا معًا. من المعروف أن OTA يحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا الأنبوبية [29] وبامتداد أقل أيضًا في الخلايا الليفية [7]. ينعكس هذا أيضًا في النتائج الحالية. ومن المثير للاهتمام ، أن وجود نوع الخلية الآخر المعني أدى إلى انخفاض معدلات موت الخلايا المبرمج في كلا النوعين من الخلايا ولكن إلى تعزيز إطلاق LDH. هذا هو التلميح الأول إلى أن وجود نوع آخر من الخلايا بالفعل يمكن أن يؤثر على الوظيفة الخلوية وأن تفاعل الخلايا مع مادة سامة يمكن أن يكون مختلفًا في الثقافة المشتركة مقارنة بالثقافة الأحادية.
التعبير عن البروتين والحمض النووي الريبي قمنا بتوسيع دراساتنا من خلال تحديد تعبير البروتين والحمض النووي الريبي لبعض البروتينات المختارة نموذجيًا وترميز RNAs لها. نظرًا لتأثير OTA على دورة الخلية [21،30] ، تمت دراسة التعبير عن CDKN1A / p21. وفقًا للنتائج التي توصل إليها دوبورج وآخرون [21] ، أدى OTA إلى تعبير محسن ليس فقط عن CDKN1A mRNA ولكن أيضًا عن بروتين CDKN1A / p21 في الخلايا الأنبوبية. في هذه الخلايا ، لم يؤثر وجود الخلايا الليفية على تعبير CDKN1A mRNA ، بينما في الخلايا الليفية ، كان تأثير الثقافة المشتركة واضحًا مع وفرة mRNA المحسّنة فقط في الثقافة المشتركة. ومع ذلك ، فإن هذه الزيادة في وفرة الرنا المرسال لم تنعكس تمامًا عن طريق التعبير البروتيني ، مما يشير إلى مزيد من الآليات التنظيمية. يمكن إضافة دراسات دورة الخلية للحصول على نظرة ثاقبة حول التأثير على دورة الخلية. وجد أن كيناز 2 المعتمد على Cyclin (CDK2) يلعب دورًا في خلل التنظيم الناجم عن OTA لدورة الخلية [21]. في الخلايا الأنبوبية ، تم تحسين تعبير mRNA الخاص به بواسطة OTA في الثقافة المشتركة بينما لم تتأثر الخلايا الليفية بالخلايا الأنبوبية. تشير النتائج معًا إلى أن دورة الخلية في الخلايا الأنبوبية تتأثر بوجود الخلايا الليفية.
لوحظ تأثير ثقافة مشتركة أخرى للتعبير عن COX2 في الخلايا الليفية. بالنسبة للأرومات الليفية ، أدى وجود الخلايا الأنبوبية إلى تعبير بروتيني محسن بشكل واضح (مشابه للنتائج التي لوحظت في خلايا الفئران [20]) ، والتي لم تكن مرئية لخلايا الأنابيب التي لم تظهر أي اعتماد على الثقافة. هذا يشير إلى أن دور الخلايا الليفية في الالتهاباتأمراض الكلىربما تم التقليل من شأنها من خلال الدراسات التي تستخدم فيفروبلاستس في الثقافة الأحادية. يتم التعبير عن البروتين الخيطي الوسيط vimentin بشكل أساسي في الخلايا الليفية ويتم التعبير عنه بشكل متزايد خلال الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) في الخلايا الظهارية [10]. على الرغم من أنه قد ثبت أن التعرض المطول لـ OTA يمكن أن يؤدي إلى تعزيز التعبير عن الكولاجين الثالث أو الفبرونكتين في الخلايا الأنبوبية [7] ، في هذه الدراسة كان التعبير عن البروتين vimentin الذي يشير إلى EMT في الخلايا الأنبوبية أقل حتى بعد التعرض لـ OTA ، بشكل مستقل. من ظروف الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، كان التعبير عن fibronectin mRNA والبروتين أقل إلى حد ما ولم يتم تحسينه. علاوة على ذلك ، في الخلايا الليفية ، لم يتم إثبات أي تعبير متغير بحيث لا تجادل هذه النتائج لصالح EMT الناجم عن OTA ، كما هو موضح من قبل الآخرين [31].
سيحسن الكستانش وظيفة الكلى / وظيفة التجشؤ
لمزيد من اختبار ما إذا كانت الثقافة المشتركة يمكن أن تؤثر على الإجابة الخلوية للإجهاد الناجم عن OTA ، حددنا التعبير عن بعض الحمض النووي الريبي المختار نموذجيًا والمتعلق بنخر موت الخلايا المبرمج ، وتطور السرطان واستقلاب الطاقة. تلعب RNAs الطويلة غير المشفرة دورًا مهمًا في العديد من العمليات التنظيمية الخلوية وإخراجها عن مسارها ، وكذلك في التليف الكلوي أو السرطان [32]. WISP 1- AS1 هو RNA طويل غير مشفر مستحث بواسطة OTA ويتم التعبير عنه في خلايا الورم الكلوي [24]. لقد وجدنا أن تنظيمه بواسطة OTA في كل من أنواع الخلايا والثقافة المشتركة عزز التنظيم. هذا يسمح بتفاقم تأثير WISP 1- AS1 على توازن موت الخلايا المبرمج والنخر وربما تكون الورم. إن إطلاق LDH المعزز الذي لوحظ في الثقافة المشتركة يمكن تفسيره جزئيًا على الأقل من خلال المحتوى المحسن لـ WISP 1- AS1 ، والذي ثبت أنه ضروري للنخر الناجم عن OTA [24].
WISP 1- AS1كان يشتبه أيضًا في أنه يلعب دورًا في التمثيل الغذائي بما في ذلك الميتوكون دريا [24]. في الخلايا الظهارية المعدية ، تبين أن OTA تسبب خللًا وظيفيًا في الميتوكوندريا [33]. إلى عن علىالكلىالخلايا ، هناك نتائج مثيرة للجدل حول ما إذا كان التعرض لـ OTA له تأثير على إمكانات الميتوكوندريا أم لا [21 ، 24]. قد يكون انخفاض إمكانات الميتوكوندريا نتيجة لضعف الميتوكوندريا أو قد يؤدي إلى تلف الميتوكوندريا. قد يؤدي انخفاض التعبير عن بروتينات الميتوكوندريا إلى اختلال الوظيفة التي تنعكس أو يتبعها إمكانات الميتوكوندريا المتغيرة. تجبر وظيفة الميتوكوندريا الضعيفة الخلية على استخدام مسارات بديلة لضمان إمدادات الطاقة. يمكن الحفاظ على إمدادات الطاقة في ظل مساهمة الميتوكوندريا غير المناسبة من خلال زيادة استخدام تحلل السكر مما يؤدي إلى زيادة إنتاج اللاكتات. ومع ذلك ، في خلايا HEK293 ، يكون جنينيًا بشريًاالكلىخط الخلية ، فقد وجد أن OTA أدى بدلاً من ذلك إلى تقليل تحلل السكر وأن الكمية المعززة من اللاكتات بسبب إنتاج اللاكتات من الجلوتامين كانت تعتمد على تعبير lncRNA WISP 1- AS1 [24]. في المقابل ، في خلايا الظهارة المعوية ، يمكن إثبات أن التعرض للأوكراتوكسين A يؤدي إلى إعادة برمجة التمثيل الغذائي للجلوكوز نحو تحلل السكر ونشاط أقل لدورة حمض الكربوكسييك [34]. يمكننا أن نظهر هنا أن (1) OTA يؤدي إلى انخفاض تعبير mRNA لاثنين من بروتينات الميتوكوندريا المختارة بشكل تمثيلي ، والتي تلعب دورًا في تخليق بروتين الميتوكوندريا (MRPS16) وإنتاج الطاقة (NDUFB10) و (2) تم تنظيم إنزيمات معالجة الجليكوجين بطريقة يمكن تحريك الجلوكوز المحسن (GYS1 لأسفل و PYGM up). بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن قدرة نقل GLUT1 أعلى ناتجة. ومع ذلك ، كانت هذه التعديلات التي يسببها OTA مستقلة تقريبًا عن ظروف الثقافة.
في الختام ، لقد أظهرنا أنه في ظل ظروف الثقافة المشتركة ، يمكن أن يختلف تفاعل الخلايا عن التفاعلات التي لوحظت في الثقافة الأحادية ، على الرغم من أن جميع المعلمات التي تمت دراستها هنا لم تكن معتمدة على الثقافة. ومع ذلك ، استنادًا إلى التكوينات المقدمة هنا ، يجب تفضيل استخدام الثقافة المشتركة إن أمكن ، وبالتالي تجنب إمكانية الإشراف على التأثيرات التي لا تحدث عند دراسة نوع خلية واحد فقط. يبقى السؤال كيف تتواصل الخلايا فيما بينها. كشفت الدراسات في نموذج الاستزراع المشترك للجرذان عن آلية تعتمد على COX 2- [20] وفي الفئران ، يبدو أن حمض الريتينويك يشارك في الحديث الخلوي المتبادل عنالكلىالخلايا [35]. بالإضافة إلى ذلك ، يبقى السؤال ، إذا ولماذا وكيف يتداخل OTA مع استقلاب الطاقة الخلوية ودور الميتوكوندريا فيه.
تحديد أنشطة LDH و Caspase -3 ومحتوى البروتينبالنسبة للتحلل ، تم غسل الخلايا مرتين في محلول PBS بارد مثلج ، وتم تجميعها وإزالتها في محلول MOPSTriton المؤقت (2 0 ملي مولار 3- (N- مورفولينو) حمض البروبان سلفونيك ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 0. 1٪ Triton X100). تم تحديد محتوى البروتين في الخلايا المحللة باستخدام حمض البيسينشونينيك [36،37]. تم تحديد نشاط LDH في الوسائط أو محللات الخلية كمقياس للنخر وفقًا لـ Bergmeyer [38] كما هو موضح بالتفصيل في [20]. تم تحديد نشاط Caspase -3 كمقياس لموت الخلايا المبرمج باستخدام الركيزة الفلوريجينية caspase -3 (DEVD-AFC) كما هو موضح في [39]. باختصار ، تم تحضين محلول الخلية 60 ميكرولتر مع محلول تفاعل 65 ميكرولتر (20 مليمول / لتر بيبرازين -1 ، 4- مكرر (2 حمض إيثان سلفونيك (PIPES) ، 4 مليمول / لتر EDTA ، 0.2 بالمائة {{26} } [(3- cholaminopropyl) dimethylammonio] -1- بروبان كبريتات (CHAPS) ، 10 مليمول / لتر ديثيوتريتول (DTT) ، درجة الحموضة 7.4) تحتوي على 42 ميكرو مول / لتر DEVD-AFC (Aspglu-val-asp {{ 36}} أمينو -4- ثلاثي فلورو ميثيل الكومارين ، التركيز النهائي) عند 37 درجة مئوية. تم قياس مضان المنتج المشقوق (AFC) عند إثارة 400 نانومتر وانبعاث 505 نانومتر. تم قياس كمية AFC المشقوق بواسطة منحنى معايرة باستخدام AFC المعروف تركيزات.
RT-PCR تم إجراء عزل الحمض النووي الريبي الكلي (RNA) باستخدام كاشف Trizol (Life Technologies ، دارمشتات ، ألمانيا). تم غسل الخلايا ثم فصلها بعد ذلك باستخدام كاشف Trizol ونقلها إلى أنبوب تفاعل. بعد إضافة الكلوروفورم والطرد المركزي (12 ، 000 × جم) ، تم جمع الطور العلوي وخلطه مع الأيزوبروبانول المثلج. بعد الطرد المركزي (12 ، 000 × جم) تمت إزالة المادة الطافية وغسل الحبيبات مرتين باستخدام 75 بالمائة من الإيثانول وأخيرًا تم حله في الماء. تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة تجارية من Invitrogen (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليماتهم. تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي باستخدام كاشف SYBR Green (Invitrogen). تم تصنيع الاشعال بواسطة Microsynth AG ، Balgach ، سويسرا. يتم عرض تسلسل التمهيدي في الجدول 1. تم حساب تغيير أضعاف التعبير الجيني بالطريقة 2∆∆Ct باستخدام التعبير عن EEF2 و RPS17 كمراجع. تبين أن التعبير عن هذين الجينين هو الأقل تغييرًا (إن وجد) في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي عند مقارنة OTA المعالجة بخلايا HK2 غير المعالجة (النتائج غير المنشورة).
البقع الغربية بعد فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم-بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ، تم نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز. بعد ذلك ، تم حظر مواقع الارتباط المجانية للغشاء بمحلول 5 في المائة من الحليب الجاف الخالي من الدسم في محلول ملحي منظم TRIS (3 ملي مولار من قاعدة TRIS ، 14 0 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0. 17 ملي مولار تريس -HCl ، pH 7.4) يحتوي على 0.1 بالمائة توين 20. تمت إضافة الأجسام المضادة الخامسة المخففة في محلول TRIS الملحي بالإضافة إلى 5 بالمائة من ألبومين المصل البقري (TRIS-BSA ، للتخفيفات انظر الجدول 2) وحضنت الأغشية طوال الليل. بعد الغسيل ، تمت إضافة الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفلور في TRIS-BSA لمدة 90 دقيقة. تم تسجيل مضان الأجسام المضادة الثانية باستخدام نظام كشف LICOR.
سيحسن الكستانش من آلام الكلى / الكلى