يتم التحكم في برنامج التليف الكلوي بواسطة MicroRNAs التي تنظم التمثيل الغذائي التأكسدي

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

فيرنيكا ميغيلا * ، ريكاردو راموس ، لورا غارسيا-بيرميجوب ، دييغو رودريغيز-بويولك ، د

سانتياغو لامسا **

برنامج العمليات الفسيولوجية والمرضية ، Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM) ، 28049 ، مدريد ، إسبانيا

(ب) مرفق الجينوم ، باركي سينتيفيكو دي مدريد ، مدريد ، إسبانيا

ج قسم علم الأمراض ، مستشفى يونيفرسيتاريو "Ramn y Cajal" ، IRYCIS ، مدريد ، إسبانيا

د قسم الطب والتخصصات الطبية ، مؤسسة الأبحاث في المستشفى الجامعي "برينسيبي دي أستورياس" ، IRYCIS ، جامعة ألكالي ، ألكالي دي هيناريس ، مدريد ، إسبانيا

الكلمات المفتاحية: MicroRNAS ، تليف الكلى ، أكسدة الأحماض الدهنية ، المصفوفة خارج الخلية ، CPT1A ، الميتوكوندريا

كمال الأجسام cistanche جيد جدًا لوظيفة الكلى

A B S T R A C T

التراكم المفرط للمصفوفة خارج الخلية (ECM) هو السمة المميزة للأمراض التليفية. في الكلى ، هو المسار المشترك الأخير للأمراض السائدة ، مما يؤدي إلى الفشل الكلوي المزمن. بينما تلعب السيتوكينات مثل TGF- دورًا أساسيًا في تحول الأرومة الليفية العضلية ، فقد أظهر العمل الأخير أن الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وأكسدة الأحماض الدهنية المعيبة (الفاو) ، والتي تهدد المصدر الرئيسي للطاقة للخلايا الطلائية الأنبوبية الكلوية ، قد تم اقتراحها لتكون من المساهمين الأساسيين لتطور وتطور تليف الكلى. تم الإبلاغ عن MicroRNAs (miRNAs) ، التي تنظم التعبير الجيني بعد النسخ ، للتحكم في التليف الكلوي. لتحديد miRNAs المشاركة في اختلال التمثيل الغذائي للتليف الكلوي ، أجرينا شاشة صفيف miRNA في نموذج الماوس لانسداد الحالب أحادي الجانب (UUO). تم اختيار MiR -150-5 p و miR -495-3 p لارتباطهما بعلم الأمراض البشري ، ودورهما في التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، واستهدافهما للإنزيم المكوك CPT1A للأحماض الدهنية. وجدنا 2- و 4- تنظيمًا مطويًا لـ miR -150-5 p و miR -495-5 p ، على التوالي ، في كل من نموذج UUO ونموذج اعتلال الكلية الناجم عن حمض الفوليك (FAN) ، بينما نظمت TGF - 1 تعابيرها في خط الخلية الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية HKC -8. تتآزر miRNAs مع TGF- فيما يتعلق بتأثيره المؤيد للتليف عن طريق تعزيز العلامات المرتبطة بالتليف Acta2 و Col 1 1 و Fn1. أظهرت دراسات الطاقة الحيوية انخفاضًا في معدل استهلاك الأكسجين المرتبط بمنظمة الأغذية والزراعة (OCR) في خلايا HKC -8 في وجود كلا الحمض النووي الريبوزي. باستمرار ، تم تخفيض مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة المرتبطة بالميتوكوندريا CPT1A و PGC1 وعامل نسخ الميتوكوندريا A (TFAM) بمقدار النصف في الخلايا الظهارية الكلوية المعرضة لهذه miRNAs. على النقيض من ذلك ، لم نكتشف التغييرات في كتلة الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء (ميكرومتر) أو إنتاج الأنيون الجذري لأكسيد الميتوكوندريا. تدعم بياناتنا أن miR -150 و miR - 495 قد يسهمان في تكوين التليف الكلوي من خلال تفاقم الفشل الأيضي المرتبط بشكل حاسم بالخلايا الطلائية الأنبوبية ، مما يؤدي في النهاية إلى التليف.

1 المقدمة

مرض الكلى المزمن (CKD) هو حالة سريرية حيث يتم الحفاظ على الحد من وظائف الكلى. يعتبر بشكل عام أنه لا رجوع فيه وتدريجي. إنه يمثل مشكلة صحية عامة مهمة يمكن أن تؤثر على 12-14 في المائة من عامة السكان [1]. قد يكون موجودًا في حوالي 30-40 في المائة من المرضى الذين يعانون من أمراض منتشرة بشكل كبير مثل داء السكري وارتفاع ضغط الدم ، حيث يساهم في إملاء التطور والتنبؤ. بغض النظر عن مسببات المرض ، يؤدي تطور مرض الكلى المزمن إلى تليف نبيبي خلالي وتليف كبيبي [2]. يتضمن التليف الأنبوبي الخلالي توسع الحيز بين الغشاء القاعدي الأنبوبي والشعيرات الدموية حول الأنبوب من خلال ترسب بروتينات المصفوفة (في الغالب من النوع الأول والثالث من الكولاجين والفيبرونيكتين) بالاشتراك مع الخلايا الالتهابية وفقدان الخلايا الأنبوبية وتراكم الأرومة الليفية العضلية [3].

يعتبر عامل النمو المحول- (TGF-) من السيتوكين المؤيد للتليف المنتشر في كل مكان والمنظم الرئيسي لتمايز الأرومة الليفية العضلية في التليف [4]. أظهرت الدراسات الحديثة أن خللًا عالميًا في أكسدة الأحماض الدهنية (الفاو) ، مما يؤدي إلى حل وسط في المصدر الرئيسي للطاقة للخلايا الطلائية الأنبوبية ، يلعب دورًا مهمًا في تطور التليف الكلوي [5،6]. TGF- يقمع الفاو بطريقة تعتمد على SMAD 3- و PGC1A ، وبالتالي يؤثر على منظمات النسخ لامتصاص الأحماض الدهنية والأكسدة ، بما في ذلك CPT1A [5]. أدت التعديلات في منظمة الأغذية والزراعة أخيرًا إلى تراكم الدهون داخل الخلايا ونضوب ATP ، مما يؤدي إلى التليف [5،7]. وبالتالي ، فإن الاستراتيجيات التي تهدف إلى استعادة اضطراب التمثيل الغذائي الذي يعمل في مرض الكلى المزمن قد يوفر خيارات علاجية [8].

ظهرت MicroRNAs (miRNAs) كمنظمين مهمين للتعبير الجيني من خلال عملهم على تنظيم ما بعد النسخ. في الكلى ، ثبت أن miRs تلعب أدوارًا مهمة في تكوين الكلية ، والتوازن ، والمرض [9]. تستطيع الجزيئات MiRNA أيضًا تنظيم العمليات الليفية وقد أطلق عليها اسم "التليف" [10]. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لعدم وجود علاج فعال لمنع أو العودة إلى تكوين الليف الكلوي [11] ، تم اقتراح التلاعب بتعبير ميرنا عن طريق التسليم في الجسم الحي لمحاكيات أو مثبطات ميرنا كاستراتيجية علاجية واعدة لمرض الكلى المزمن [12]. بالإضافة إلى ذلك ، قد تشكل الجزيئات المجهرية المنتشرة مؤشرات بيولوجية تشخيصية وحتى تنبؤية [13].

يحدث التحكم بوساطة MiRNA للتليف الكلوي بشكل أساسي من خلال تنظيم إشارات TGF - 1 بطريقة تعتمد على الخلية وتعتمد على السياق ، باستخدام مسار Smad كأحد الأهداف الرئيسية [14]. في العمل السابق ، حددنا العديد من الجزيئات المجهرية التي لها تأثير على التليف الكلوي من خلال تنظيم مسارات التمثيل الغذائي المحددة [15،16]. يؤدي الإفراط في التعبير عن miR -9-5 p إلى منع تمايز الخلايا الكلوية الأنبوبية وإعادة برمجة الاختلال الأيضي المرتبط بالتليف [16] ، بينما يؤدي فقدان وظيفة miR -33 ، سواء كانت وراثية أو دوائية ، إلى زيادة الفاو ومنع تراكم الدهون في الخلايا الطلائية الأنبوبية. ويرتبط هذا بزيادة إمداد الطاقة وتحسين الطاقة الحيوية للميتوكوندريا والوقاية من التليف الكلوي التجريبي [15]. وبالتالي ، فإن miRNAs التي تنظم الطاقة الحيوية الخلوية قادرة أيضًا على تنظيم التليف الكلوي. في هذه الدراسة ، استخدمنا استراتيجية قائمة على مجموعة miRNA في نموذج إصابة الكلى المزمنة لانسداد الحالب الأحادي (UUO) لتحديد miRNAs المشاركة في النمط الظاهري الليفي الكلوي من خلال تعديل المسارات الأيضية. من خلال اختيار العديد من الجينات المرتبطة بوظيفة الميتوكوندريا (CPT1A ، TFAM ، PGC1A) ، حددنا كلاً من miR -150 و miR -495 باعتبارها miRNAs قادرة على تقليل معدل استهلاك الأكسجين المرتبط بمنظمة الأغذية والزراعة (OCR) وتعزيز TGF { {21}} التحول الليفي المستحث في خط الخلية الظهارية الأنبوبي الكلوي البشري HKC -8. تسلط النتائج التي توصلنا إليها الضوء على أهمية miRNAs كمنظمات استقلابية للميتوكوندريا تشارك في تكوين التليف الكلوي.

2. المواد والأساليب

خطوط الخلايا وظروف الثقافة. تمت زراعة الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة من الكلى البشرية (HKC -8) في DMEM / F12 (متوسط ​​Dulbecco's Eagle's المعدل 1: 1 (v / v)) (Corning ، نيويورك ، نيويورك) مكمل بـ 15 ملي مولار HEPES ، 5 ​​بالمائة (المجلد / المجلد) مصل بقري الجنين (FBS)

(HyClone Laboratories، Logan، UT)، 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) (Gibco، Rockville، MD)، 0. 5 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون (Sigma، St. Louis، MO)، 50 وحدة / مل من البنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (جيبكو ، روكفيل ، ماريلاند) عند 37 درجة مئوية و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم توفير هذا الخط الخلوي من قبل معمل الدكتور سوستاك (فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء العلاجات باستخدام 10 نانوغرام / مل من TGF {11}} (R&D Systems ، Minneapolis ، MN) بعد تجويع خلايا HKC -8 الخالية من المصل لمدة 12 ساعة.

إجراء تعداء. تم زرع الخلايا في أطباق استنبات 60 مم لتصل إلى نقطة التقاء 70 في المائة. تم نقلها باستخدام 40 نانومتر من mirVana ™ miRNA mimic of miR -150 أو miR -495 أو mirVana ™ miRNA mimic mimic control (شركة Ambion ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام lipofectamine 2000 (Invitrogen ، Carlsbad ، CA) . تم تحضين الخلايا باستخدام lipofectamine-pre-miRNA 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. بعد ذلك ، تمت إضافة 5 مل وسط جديد يحتوي على 10 بالمائة من FBS إلى أطباق الثقافة ، وتم الحفاظ على الخلايا في المزرعة لمدة 6 ساعات حتى استخدامها في التجارب اللاحقة. في حالة الدمج مع علاج TGF - 1 ، تم تطبيقه على الخلايا بعد فرط التعبير عن الحمض النووي الريبي طبقًا للقسم السابق.

لطخة مناعية. تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني ، وتجانسها ، وإزالتها في 1 0 0 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA يحتوي على 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 0.1 بالمائة SDS ، 1 بالمائة ديوكسيكولات الصوديوم ، 1 بالمائة NP -40 ، و 25 ملي مولار تريس- HCl pH 7.6 ، في وجود البروتياز (Complete ، Roche Diagnostics ، Mannheim ، ألمانيا) ومثبطات الفوسفاتيز (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO) ويتم حصادها عن طريق القشط. تم تجانس ربع قطعة من كل عينة كلية (تم الحصول عليها بعد التشريح في نصفين بالطول والعرض) في محلول RIPA 300 ul مع حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ 5 مم (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا) باستخدام TissueLyser LT (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا) بالاهتزاز عند 50 هرتز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية تم توضيح العينات بالطرد المركزي عند 10 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم تم التخلص من الحبيبات ، وتم الاحتفاظ بالمادة الطافية كمحلل بروتين. تم تحديد تركيزات البروتين بواسطة مجموعة فحص البروتين BCA (Thermo Scientific ، Rockford ، IL) وتم قياسها في Glomax®-Multi Detection System (Promega ، Madison ، WI). تم فصل كميات متساوية من البروتين (10-50 ميكروغرام) من المستخلص الكلي على 8-10 بالمائة SDS- بولي أكريلاميد المواد الهلامية ونقلها إلى أغشية النتروسليلوز النشاف (GE Healthcare، Chicago، IL) عند 12 فولت لمدة 20 دقيقة في شبه جاف. نظام ترانس بلوت توربو (بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا).

تم حظر الأغشية عن طريق الحضانة لمدة ساعة واحدة مع 5 في المائة من الحليب الخالي من الدسم في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0. 5 في المائة توين -20 وتم تنظيفها طوال الليل باستخدام الأجسام المضادة المحددة: CPT1A (Ab128568 ، Abcam ؛ 1: 1 { {26}} ؛ 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها) ، -SMA (sc -32251 ، سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ؛ 1: 1000 ؛ 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها) ، GAPDH (MAB374 ، ميليبور ؛ 1: 15000 ؛ 1 ساعة ، درجة حرارة الغرفة ). بعد الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية IRDye 800 goat anti-rabbit و IRDye 600 goat anti-mouse (1: 15000 ، LI-COR Biosciences ، Lincoln ، NE) ، تم تصوير الأغشية في ثلاث نسخ باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey (LI-COR Biosciences ، لينكولن ، نبراسكا). تم إجراء قياس كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageJ 1.48 (http://rsb.info.nih.gov/ij) وتم تحديد تعبير البروتين النسبي عن طريق التطبيع مع GAPDH. تم تطبيع تغييرات الطية لقيم حالة التحكم.

استخراج الحمض النووي الريبي. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا HKC -8 أو كليتي الفئران باستخدام مجموعة miRNeasy Mini Kit (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحديد كمية وجودة الحمض النووي الريبي عند 260 نانومتر بواسطة مقياس الطيف الضوئي -1000 Nanodrop (Thermo Scientific ، Rockford ، IL).

تحليل تعبير الرنا المرسال تم إجراء النسخ العكسي (RT) باستخدام 500 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة iScript ™ cDNA Synthesis (Bio-Rad ، Hercules ، CA). تم إجراء qRT – PCR باستخدام iQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad ، Hercules ، CA) ، باستخدام 96- نظام Bio-Rad CFX96 RT – PCR جيد مع C1000 Cycler (Bio-Rad ، Hercules ، CA) حسب تعليمات المصنع. تم الحصول على قيمة Ct من كل منحنى تضخيم باستخدام برنامج تحليل CFX96 المقدم من الشركة المصنعة. تم تحديد تعبير mRNA النسبي باستخدام طريقة 2 - ΔΔCt [17]. تم استخدام جين 18S لأغراض التطبيع. The primer sequences used for mRNA quantification were: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGACGACCTGGTGAGAGA, RV: CATTGTGTCCCCTAATGCCTT), FN1 (FW: GTGTTGGGAATGGTCGT GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA- TAAGCATC), 18S (FW: AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC, RV: GCTTA ATTTGACTCAACACGGGA). تم تطبيع تغييرات الطية لقيم حالة التحكم.

القياس الكمي للتعبير ميرنا تم إجراء القياس الكمي لتعبير miRNAs باستخدام miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon ، Feedback ، Denmark). بعد RT ، تم تضخيم قالب cDNA باستخدام بادئات LNA الخاصة بـ microRNA من أجل miR 150-5 p أو miR -495-3 p (Exiqon ، Feedback ، Denmark). تم إجراء qRT – PCR في 96- نظام PCR جيد Bio-Rad CFX96 Real-Time مع C1000 Cycler باستخدام iQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad ، Hercules ، CA) وفقًا لتعليمات الشركات المصنعة . تم الحصول على قيمة Ct للآبار الثلاثية من كل منحنى تضخيم باستخدام برنامج CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad ، Hercules ، CA). تم تطبيع قيم Ct للتحكم الداخلي 5S rRNA. تم تطبيع مستويات البلازما ميرنا إلى miR -103 a -5 p. تم تحديد تعبير ميرنا النسبي باستخدام طريقة 2 - ΔΔCt [17]. تم تطبيع تغييرات الطية لقيم حالة التحكم.

نماذج الفئران لتليف الكلى. تم إيواء الفئران في منشأة حيوانية خالية من مسببات الأمراض (SPF) في CBMSO وفقًا للوائح الاتحاد الأوروبي لجميع الإجراءات. تم التعامل مع الحيوانات بالاتفاق مع دليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر الوارد في التوجيه 2010/63 / EU الصادر عن البرلمان الأوروبي. تم منح الموافقة من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات المحلي التابع لـ Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" في مدريد ، ولجنة الأخلاقيات في CSIC ، والوحدة التنظيمية للإجراءات التجريبية على الحيوانات من Comunidad de Madrid.

انسداد الحالب من جانب واحد (UUO): تم إجراء جراحة UUO كما هو موضح سابقًا [18]. باختصار ، تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين (3-5 بالمائة للتحريض و1-3 بالمائة للصيانة) وتم تقسيمها إلى مجموعتين تجريبيتين: مجموعة UUO ومجموعة العمليات الوهمية. في مجموعة UUO ، تم حلق الفئران على الجانب الأيسر من البطن ، وتم إجراء شق عمودي من خلال الجلد باستخدام مشرط وتم سحب الجلد. تم عمل شق ثانٍ من خلال الصفاق لكشف الكلى. تم ربط الحالب الأيسر مرتين 15 مم تحت الحوض الكلوي بالحرير الجراحي ثم تم قطع الحالب بين الأربطة. بعد ذلك ، تمت إعادة الكلى المربوطة بلطف إلى وضعها التشريحي الصحيح وأضيف محلول ملحي معقم لتعويض فقدان السوائل. تم خياطة الشقوق وتم حبس الفئران بشكل فردي. تم إجراء العملية الصورية بطريقة مماثلة ولكن بدون ربط الحالب. تم استخدام البوبرينورفين كمسكن. تم إعطاء الجرعة الأولى 3 0 دقيقة قبل الجراحة ثم كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة بجرعة 0.05 مجم / كجم تحت الجلد. في هذا النموذج ، انخفض تدفق الدم الكلوي ومعدل الترشيح الكبيبي بشكل ملحوظ خلال 24 ساعة والالتهاب الخلالي (الذروة في 2-3 أيام) ، والتوسع الأنبوبي ، والضمور الأنبوبي ، والتليف واضح بعد 7 أيام. تصل الكلية المسدودة إلى أقصى خلل وظيفي بعد حوالي أسبوعين من العملية. تم التضحية بالفئران بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون وتم جمع عينات من الكلى والدم المسدودة بعد نضح مع PBS في 3 و 5 و 7 و 10 و 15 يومًا بعد UUO.

اعتلال الكلية الناجم عن حمض الفوليك (FAN): في هذا النموذج ، تم تحفيز التليف الكلوي عن طريق الحقن داخل الصفاق (ip) مع 25 0 ملغ من حمض الفوليك (Sigma-Aldrich، St. 0. 3 M بيكربونات الصوديوم (مركبة) كما هو موصوف سابقًا [19]. تلقت الحيوانات الضابطة 0.3 مل من السيارة (IP). تم التضحية بالفئران بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون وتم حصاد الكلى وعينات الدم بعد نضح مع برنامج تلفزيوني بعد 15 يومًا من إعطاء FA.

التنميط microRNA. لتحديد miRNAs المحددة التي تنظم النتيجة التليفية ، تم اختيار مصفوفة miRCURY LNA microRNA المخصصة (Exiqon ، Feedback ، Denmark) كمنصة لتنميط microRNA. تتكون هذه المنصة من إجمالي 175 فحصًا فريدًا خاصًا بميكروبات الفأرة الموجودة في Sanger miRBase v22.1 (http: // microrn a.sanger.ac. المملكة المتحدة). لكل microRNA ، تم اختيار الخيط السائد للتحليل. اعتمد اختيار MiR على الجينات المستهدفة المتوقعة المتعلقة بالتليف الكلوي ، واستقلاب الميتوكوندريا ، وعمليات الأكسدة والاختزال ، والإيقاع اليومي. تم إجراء هذا التحليل باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية للتنبؤ بأهداف miRNA القائمة على التسلسل ، وعالم مصغر [20] (www.Ebi.ac. UK / Enright-SRV / microcosm) ، Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org / vert { {9}} /) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de) و miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) و miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). بعد استخراج الحمض النووي الريبي من عينات الكلى المكونة من 7 أيام من UUO ، تعرض جزء ميرنا الموجود في 20 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي باستخدام miRCURY LNA RT Kit (Exiqon ، Feedback ، Denmark) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحليل cDNAs الناتجة باستخدام لوحات miRCURY miRNA PCR في نظام Roche LightCycler 480 Real-Time PCR باستخدام miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon ، Feedback ، Denmark). تم تحليل كل عينة في نسختين. تم تنفيذ هذا الإجراء في مرفق الجينوم في Fundacion Parque Científico de Madrid (مدريد ، إسبانيا). تم استخدام برنامج LC480 للحصول على قيم Cq (Cq) لكل ميرنا. تم حساب قيمة دلتا Ct (Ct) عن طريق تطبيع قيم Ct إلى التدبير المنزلي الداخلي snRNAU6. تم إنشاء خريطة الحرارة باستخدام بيانات PCR في الوقت الفعلي المقدمة على أنها Ct. تم بناء المجموعات الهرمية وفقًا لقيم ΔCt. تم حساب قيمة دلتا Ct (Ct) عن طريق طرح Ct لمجموعة العينة المرجعية (الكلية الضابطة) من ΔCt لكل عينة من الكلى المعوقة. تم إنشاء التقدير الكمي النسبي (RQ) أو التغيير المطوي لكل ميرنا باستخدام طريقة 2 - ΔΔCt [17]. تم تحديد miRNAs المعبر عنها تفاضليًا بواسطة اختبار Limma حدودي. لأخذ اختبار الفرضيات المتعددة في الاعتبار ، تم تعديل قيم P (صفة) باستخدام تصحيح Benjamini-Hochberg للاكتشاف الخاطئ (FDR) [25]. تم رسم النتائج في مخطط بركان.

تحليل ميرنا في بلازما الدم من مرضى كد. تم تحليل مستويات miRNAs المحددة في عينات البلازما من مجموعة مكونة من 0 0 مريض مصاب بمرض الكلى المزمن ، والموضح بالتفصيل أدناه. تم جمع الدم الوريدي المحيطي في فواصل مفرغة مطلية بالرش (BD ، Franklin Lakes ، NJ). للحصول على البلازما ، تم طرد الدم عند 4 0 0 جم لمدة 20 دقيقة ، تم نقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وطردها عند 800 جم لمدة 20 دقيقة. تم جمع البلازما وتجميدها في قسامات عند - 80 درجة مئوية.تم استخراج البلازما ميرنا من الدم باستخدام مجموعة عزل miRCURY TM RNA - Biofluids و UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon ، Vedbaeck ، الدنمارك). تم إجراء تحليلات لمستويات miR -150 في هذه العينات كما هو موضح في القياس الكمي لقسم إجراء تعبير ميرنا. قياسات معدل استهلاك الأكسجين. تمت دراسة أكسدة الأحماض الدهنية - معدل استهلاك الأكسجين المرتبط (OCR) (المرتبط بالفسفرة المؤكسدة) ومعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) (المرتبط بإنتاج اللاكتات وتحلل السكر) باستخدام محلل التمثيل الغذائي Seahorse Bioscience وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة [26]. تم زرع خلايا HKC -8 في لوحة p60 وتم إجراء تعداء الرنا الميكروي كما هو موضح أعلاه عندما وصلت إلى التقاء 70 بالمائة بعد 48 ساعة ، وعولجت خلايا HKC -8 بـ 10 نانوغرام / مل من TGF {{ 18}} لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، تم بذر الخلايا عند 2 × 104 خلية لكل بئر في صفيحة مستنبتة لخلايا Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience ، North Billerica ، MA). بعد التقيد بالخلية ، تم استبدال وسيط النمو بوسيط محدود الركيزة ، Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مكمل بـ 0.5 ملي مولار من الجلوكوز و 1 ملي مولار من الجلوتامات. قبل ساعة واحدة من قياس الفحص ، تم تحضين الخلايا باستخدام وسيط اختبار Krebs-Henseleit Buffer (KHB) المضاف إليه 0.2 بالمائة من الكارنيتين عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون. قبل خمسة عشر دقيقة من الفحص ، تمت إضافة مثبط CPT1 Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO) 400 ميكرومتر إلى الآبار المقابلة ، وتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون. أخيرًا ، قبل الفحص مباشرة ، تمت إضافة BSA أو 200 ميكرومتر Palmitate-BSA FAO Substrate (Agilent Technology ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). على الفور ، تم تشكيل اختبار الإجهاد XF Cell Mito في محلل طاقة Seahorse XFe24 عن طريق إضافة عدة مُعدِّلات متتابعة لوظيفة الميتوكوندريا. أولاً ، تم استخدام oligomycin مثبط سينثيز ATP (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO) (1 ميكرومتر) بعد القياس الأساسي. هذا يقلل من تدفق الإلكترون عبر ETC ، مما يؤدي إلى انخفاض في تنفس الميتوكوندريا. بعد ذلك ، تمت إضافة عامل فصل السيانيد 4- (ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) (SigmaAldrich ، St. نتيجة لذلك ، فإن تدفق الإلكترون عبر ETC غير مقيّد ، واستهلاك الأكسجين بواسطة المركب IV يصل إلى الحد الأقصى. الحقن الثالث والأخير عبارة عن خليط من مثبطات المركب III و I anti- mycin / rotenone (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO) (1 ميكرومتر). يعمل هذا المزيج على إيقاف تنفس الميتوكوندريا ويتيح حساب التنفس غير الميتوكوندريا مدفوعًا بعمليات خارج الميتوكوندريا. تم تحضير الركائز / المثبطات في نفس الوسط الذي أجريت فيه التجربة وتم حقنها من منافذ الكاشف تلقائيًا في الأوقات المحددة. تم تسجيل القياسات لفترات زمنية مدتها 3- دقيقة (خلال فترة إجمالية قدرها ساعتان) وتم تطبيع القيم لمحتوى البروتين الكلي. تم استخراج البروتين من الآبار بمحلول PBS بنسبة 0.1 في المائة -40- وقياس كمية البروتين باستخدام اختبار بروتين BCA (Thermo Scientific ، Rockford ، IL). تم استخدام أربعة آبار لكل مجموعة تجريبية. تم استخدام اختبار إجهاد فرس البحر XFp Cell Mito لتحديد المعلمات الرئيسية لوظيفة الميتوكوندريا: التنفس القاعدي للميتوكوندريا ، التنفس المرتبط بـ ATP ، تسرب البروتون (استهلاك الأكسجين غير المرتبط بـ -- ATP) ، التنفس الأقصى ، التنفس غير الميتوكوندريا ، والقدرة التنفسية الاحتياطية ، كما هو موصوف سابقًا [27].

فحص Luciferase لتوصيف مواقع الربط المرشحة لـ miRNA -150 و miRNA -495 في CPT1A 3′-UTR البشري ، اختبار luciferase re- porter الذي يحتوي على CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics، Carlsbad، CA، Product رقم التعريف S814347). تم إنشاء الطفرات الموجهة بالموقع في مناطق البذور لمواقع miR -150 و miR -495 المتوقعة ضمن 3 ′ - UTRs باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة Multisite-QuikChange (ستراتاجين ، لا جولا ، كاليفورنيا) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG، RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG) ، تم تسلسل جميع التركيبات قبل استخدامها للتأكد من أنها بنية سليمة. تم زرع خلايا HKC -8 في لوحة بئر ap 24- وتم نقلها بشكل عابر باستخدام 200 نانوغرام pLightSwitch _ CPT1A _3 ′ - UTR (تركيبات سليمة أو متحولة) و 4 ng pGL 3- المروج (لوسيفيراز اليراع تحت سيطرة مروج SV40) (Promega Corporation ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) البلازميدات المراسل و 40 نانومتر لأي من mirVana ™ miRNA تقليد miR -150 ، miR -495 أو mirVana ™ miRNA mimic mimic control (شركة Ambion ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام lipofectamine 2000 (Invitrogen ، Carlsbad ، CA) عندما وصلوا إلى نقطة التقاء 70٪ كما هو موضح أعلاه. تم استخدام أربعة آبار لكل مجموعة تجريبية. تم إجراء فحوصات Luciferase بعد 24 ساعة باستخدام نظام مراسل Dual-Luciferase (Promega ، Madison ، WI). تم الكشف عن إشارات الفانيليا واليراع لوسيفيراز باستخدام نظام الكشف المتعدد Glomax (شركة Promega ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيع نشاط الرينيلا لوسيفيراز بواسطة نشاط لوسيفيراز اليراع.

إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP). تم تحديد التغييرات في MMP على أنها اختلافات في مضان رباعي ميثيل رودامين ميثيل استر (TMRM) (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). يتراكم في الميتوكوندريا المستقطبة سالبة الشحنة ويتألق باللون البرتقالي. عندما تنهار إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا المبرمجة أو المجهدة استقلابيًا ، ينتشر كاشف TMRM في جميع أنحاء العصارة الخلوية الخلوية وتنخفض مستويات التألق بشكل كبير. تمت زراعة خلايا HKC {0}} ونقلها كما هو موضح في ثقافة الخلية وأقسام إجراء تعداء الخلايا. بعد ذلك ، تم استبدال وسط النمو بمحلول الملح المتوازن الخالي من الفينول (HBSS) مع 10 ملي مولار من Hepes. تم استخدام العلاجات مع oligomycin (5 ميكرومتر) و FCCP (4 ميكرومتر) لمدة 5 دقائق كظروف تحكم إيجابية وسلبية. بعد ذلك ، تم تلوين الخلايا بـ 250 نانومتر TMRM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.تم حصاد الخلايا باستخدام التربسين ، وطردها (3 000 دورة في الدقيقة ، 5 دقائق) وتم إعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر HBSS بنسبة 1 بالمائة مصل الأبقار الزلال (BSA) و 5 ملي حمض إيثيلين ديامينيتتراسيتيك (EDTA). تم قياس شدة التألق عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام طول موجة انبعاث يبلغ 570 نانومتر لـ TMRM (FL2) [28] في نظام BD FacsCantoTM II (BD Bioscience ، San Jos ، CA) وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo 10.2 (FlowJo ، LLC ، Ashland ، أو). لكل حالة تجريبية ، تم تحليل ما لا يقل عن 20000 مفردة في ثلاث نسخ.

إنتاج الأنيون الجذري لأكسيد الميتوكوندريا. تم إجراء تقييم إنتاج الأنيون الجذري الفائق باستخدام مؤشر الأنيون الجذري Mito- SOX ™ الأحمر فوق أكسيد الميتوكوندريا (Invi- trogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وهو صبغة فلورية انتقائية للغاية لأنيون جذري لأكسيد الميتوكوندريا في الخلايا الحية ، وفقًا للشركة المصنعة. تعليمات. تم زراعة خلايا HKC -8 ونقلها كما هو موضح في ثقافة الخلية وأقسام إجراء تعداء الخلايا. بعد ذلك ، تم استبدال وسط النمو بمحلول الملح المتوازن الخالي من الفينول (HBSS) مع 10 ملي مولار من Hepes. تم استخدام العلاج بمضاد الميسين A (150 ميكرومتر) وكربونيل سيانيد م - كلوروفينيل هيدرازون (CCCP) (50 ميكرومتر) لمدة 5 دقائق كظروف تحكم إيجابية وسلبية. بعد ذلك ، تم تلوين الخلايا بـ 5 ميكرومتر MitoSOX ™ أحمر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم حصاد الخلايا كما هو موصوف في قسم غشاء الميتوكوندريا. تم قياس شدة الإسفار عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام طول موجة انبعاث يبلغ 580 نانومتر لـ MitoSOX ™ Red (FL2) في نظام BD FacsCantoTM II (BD Bioscience ، San Jos ، CA) وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo 10.2 (FlowJo ، LLC ، Ashland ، أو). لكل حالة تجريبية ، تم تحليل ما لا يقل عن 20 فردًا 000 في ثلاث نسخ.

وسم الميتوكوندريا. تم إجراء تقييم محتوى الميتوكوندريا باستخدام MitoTracker ™ green FM (Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والذي ينتشر بشكل سلبي عبر غشاء البلازما ويتراكم في الميتوكوندريا النشطة بغض النظر عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم زراعة خلايا HKC -8 ونقلها كما هو موضح في ثقافة الخلية وأقسام إجراء تعداء الخلايا. بعد ذلك ، تم استبدال وسط النمو بمحلول الملح المتوازن الخالي من الفينول (HBSS) مع 10 ملي مولار من Hepes. تم تلوين الخلايا بـ 150 نانومتر باستخدام MitoTracker ™ green FM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتحليل التدفق الخلوي ، تم حصاد الخلايا كما هو موصوف في قسم إمكانات غشاء الميتوكوندريا. تم قياس شدة التألق باستخدام طول موجة انبعاث يبلغ 516 نانومتر مع MitoTracker ™ green FM (FL1) في نظام BD FacsCantoTM II (BD Bioscience ، San Jos ، CA) وتم تحليلها باستخدام FlowJo 10.2 soft-ware (FlowJo، LLC ، آشلاند ، أو). لكل حالة تجريبية ، تم تحليل ما لا يقل عن 20 فردًا 000 في ثلاث نسخ. من أجل التصوير الفلوري ، تم تلوين النوى أيضًا بـ DAPI (Sigma ، St. Louis ، MO) لمدة 5 دقائق عند RT. تم تصور الخلايا الحية بواسطة مجهر متحد البؤر زايس LSM 710 مقلوب مع خلية لوحظت ، هدف 63X / 1.2 Water C-Apo- chromat Corr UV-VIS-IR M27 وتحليلها باستخدام برنامج Zeiss Zen2010B sp1 (زايس ، أوبيركوشن ، ألمانيا) .

تحديد رقم نسخة الميتوكوندريا. تم استخلاص الحمض النووي الجيني من خلايا HKC {0}} باستخدام مجموعة DNeasy Blood & Tissue Kit (Qia- gen ، فالنسيا ، كاليفورنيا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحديد وفرة الميتوكوندريا باستخدام مجموعة مقايسة رقم نسخ الحمض النووي البشري للميتوكوندريا (ديترويت R&D ، ديترويت ، ميتشيغن). تم تقديم رقم نسخة mtDNA النسبي كنسبة الحمض النووي mtDNA إلى النووي.

عينات مريض CKD البشري. تم اختيار مجموعة من 100 مريض مصاب بمرض الكلى المزمن (المرحلة 3-4) من مستشفى برينسيبي دي أستورياس لتحليل مستويات البلازما ميرنا. تضمنت مجموعتين فرعيتين مختلفتين مصنفتين وفقًا لتطور وظائف الكلى بناءً على مؤشر GFR MDRD [29] على مدى 24 شهرًا: 50 مريضًا قدموا أقل من 10 بالمائة منالكلىتدهور وظيفي في حين أن البقية عانوا من انخفاض بنسبة 40 في المائة على الأقل في وظائف الكلى أو بدأواكلويالعلاج البديل (غسيل الكلى). قمنا أيضًا بتحديد درجة التليف فيالكلىخزعات من مجموعة مختلفة من 26 مريضًا يعانون من اختلال وظيفي في الكسب غير المشروعالكلىزرع من مستشفى Ramn y Cajal. تم تقييم جميع الخزعات وفقًا لمعايير بانف 2007 [30].

تحليل احصائي. تم تحليل البيانات باستخدام الاختبارات اللامعلمية إلا في الحالات المحددة. تم فحص الفرق بين المجموعتين المستقلتين من خلال اختبار Mann-Whitney ، بينما تمت مقارنة أكثر من مجموعتين مع اختبار Kruskall-Wallis. تم اعتبار القيمة الاحتمالية لـ 0. 0 5 أو أقل ذات دلالة إحصائية (* / #: P <0. 0="" 5="" ،="" **="" ##:="" p=""><0. 01،="" ***="" ###:="" p=""><0.001). تم="" تحليل="" البيانات="" باستخدام="" graphpad="" prism="" 6.0="" (برنامج="" graphpad="" ،="" لا="" جولا="" ،="" كاليفورنيا).="" تم="" الإبلاغ="" عن="" البيانات="" على="" أنها="" تعني="" ±="" خطأ="" معياري="" للمتوسط="">

3. النتائج

بيانات التعبير ميرنا في ليفي الناجم عن UUOالكلى. لفك تشفير مساهمة miRNAs في تنظيم التمثيل الغذائي لـكلويالتليف ، تم إجراء نموذج 7 أيام UUO في الفئران WT. تم عزل الحمض النووي الريبي من السيطرة والتليفالكلىتم تحليل العينات وملف تعريف تعبير miRNA في مجموعة microRNA مخصصة. استند تصنيف miRNAs إلى استهدافها المحتمل للإنزيمات الرئيسية المشاركة في التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، وعمليات الأكسدة والاختزال وإيقاع الساعة البيولوجية بعد تحليل "in silico" (مزيد من التفاصيل في قسم الأساليب). كشفت خريطة الحرارة عن أنماط تعبير مميزة بوضوح في بعض miRNAs عند مقارنة التليفية والتحكمالكلىعينات (الشكل 1 أ). أظهر تحليل مؤامرة البركان أنه تم التعبير عن 73 من 175 miRNAs بشكل مختلف ، 17 أعلى و 56 لأسفل ، في عينات الكلى الليفية مقارنة بعينات التحكم (الشكل 1 ب ، الجدول التكميلي 1). من بينها ، تم اختيار جزيئات الحمض النووي الريبوزي المعينة التي يمكن أن تنظم نتيجة التليف في الكلى من خلال المسارات الأيضية. لهذا الغرض ، في تحليل السيليكو لـ 3′UTR (منطقة غير مترجمة) للجينات المحددة المشاركة في وظائف التمثيل الغذائي والميتوكوندريا ، تم إجراء CPT1A و TFAM و PGC1A بثلاث أدوات تنبؤ مستقلة (Targetscan و miRWalk و miRanda). تضمنت معايير الاختيار أيضًا مستوى التعبير الكلوي ، وحداثة الأهداف ، ودرجة المعرفة عن طريق التمثيل الغذائي والأهمية البيولوجية. شجعنا الارتباط بعلم الأمراض البشرية ، ومستوى تعبير أنسجة الكلى ، ودورها في استقلاب الميتوكوندريا ، واستهدافهم المحتمل لإنزيم CPT1A الذي ينقل الأحماض الدهنية ، على التركيز على ثلاث miRNAs ، miR -150-5 p ، miR -495-3 p و miR -33-5 p ، كمرشحين قادرين على تنظيم التغيرات الأيضية المرتبطة بالتليف الكلوي (الشكل 1 ج). وتجدر الإشارة إلى أن CPT1A 3′-UTR يحتوي على موقع بذور واحد لـ miR -150 وموقعين أساسيين لـ miR -495. لاحظنا أن miR -150 و miR -495 قللا من نشاط مقايسة مراسل لوسيفيراز التي تحتوي على CPT1A 3′-UTR بحوالي 15 بالمائة و 25 بالمائة على التوالي. تم إلغاء هذا التنظيم المنخفض تمامًا في حالة الطفرات النقطية (PMs) في 3′-UTR لـ CPT1A لموقع ربط miR -150 (PM2) وغائبًا جزئيًا في مواقع ربط miR -495 (PM1) و PM3) (الشكل التكميلي 1A و B). تشير هذه البيانات إلى تفاعل مباشر لـ CPT1A مع miR -150 و miR -495. MiR -33-5 p موضوع دراسة منفصلة [15]. تم تنظيم MiR -150-5 p و miR -495-3 p في عينات الكلى الليفية مقارنة بعينات التحكم ، مع تغيير أضعاف قدره 3.69 (القيمة الاحتمالية: 0. 0 12 ) و 1.95 (القيمة الاحتمالية: 0.012) ، على التوالي.

تعمل كل من MiR -150 و miR -495 على تحسين استجابة TGF- المحترقة في الإنسانكلويالخلايا الظهارية الأنبوبية. تم إجراء النسخ العكسي الكمي - تفاعل البوليميراز المتسلسل (qRT – PCR) لتأكيد تغيير تعبير miR -150-5 p و miR -495-3 p الذي تم تحديده بواسطة التنميط عن تعبير miRNA في UUOالكلىعينات (الشكل 2A و B). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل حركية تعبير miR -150-5 p و miR - 495-3 p في الكلى بعد 3 و 5 و 7 و 10 و 15 يومًا من إجراء UUO بواسطة qRT-PCR. تم تحسين التعبير عن هذه miRNAs بشكل ملحوظ بواسطة 2- أضعاف في 5 أيام بعد UUO وظل مرتفعًا بعد 15 يومًا من UUO (الشكل 2C و D). تم تقييم مستوى التعبير عن هذه miRNAs أيضًا في نموذج اعتلال الكلية بحمض الفوليك (FAN). لقد وجدنا 4- و 2- تنظيمًا مطويًا لـ miR -495-3 p و miR -150-5 p ، على التوالي ، في ليفيالكلىعينات من نموذج FAN (الشكل 2E). TGF - 1 ، أحد المنظمين الرئيسيين للتليف الليفي ، أحدث أيضًا تعبير miR -150 و miR -495 في خلايا HKC -8 أكثر من 2- أضعاف و {{ 6}} أضعاف ، على التوالي ، بعد 48 ساعة ، ودعم دور محتمل لهذه miRNAs في الأحداث المتعلقة بإشارات TGF (الشكل 3 أ و ب). لتقييم ما إذا كان miR -150 و miR -495 متورطين في التحول المؤيد للتليف للخلايا الظهارية الأنبوبية بواسطة TGF - 1 ، تم نقل خط الخلية البشرية HKC -8 باستخدام miR -150-5 p أو miR -495-3 p وتم التعامل معها باستخدام TGF - 1 في أوقات مختلفة. أدت زيادة مستويات miR -150-5 p و miR -495-3 p إلى تحسين عرض مستوى الرنا المرسال الذي يسببه TGF - 1- للعلامات المرتبطة بالتليف Acta2 و Col 1 1 و Fn1 ( الشكل 3 ج ود). وبالمثل ، فإن الإفراط في التعبير عن miR -150-5 p أو miR -495-3 p قلل بشدة من CPT1A وتحسين وفرة بروتين SMA (الشكل 3E و F). تشير هذه البيانات إلى أن هذه الجزيئات المجهرية قد تشارك في التسبب في المرضكلويالتليف عن طريق تعزيز التمايز الظهاري المعتمد على TGF - 1- للخلايا الأنبوبية ، وكذلك عن طريق الإضرار بالتعبير عن إنزيم حرج يشارك في الفاو.

يحث كل من MiR -150 و miR -495 على إحداث تغييرات في الطاقة الحيوية للميتوكوندريا وتقليل تعبير الجينات المشاركة في وظيفة الميتوكوندريا الحاسمة. لاكتساب نظرة ثاقبة على العواقب الأيضية الناتجة عن إدارة miR -150-5 p أو miR -495-3 p ، درسنا ملف الطاقة الحيوية للإنسانكلويالخلايا الظهارية الأنبوبية.

الشكل 1. بيانات تعبير ميرنا في التليف الناجم عن UUO. (أ) خريطة الحرارة تظهر تعبير ميرنا النسبي للمقابل والمعيقالكلىمن C57 / BL 6- خضعت الفئران J لإجراء UUO لمدة 7 أيام (ن=6). يتراوح شريط المقياس من الأخضر إلى الأحمر (التعبير من الأعلى إلى الأدنى) وتمثل الأرقام قيم ΔCt. على الجانب الأيسر يشار إلى miRNAs المختارة للدراسة. (ب) تحليل مؤامرة البركان من miRNAs المعدلة UUO. Log1 0 القياس النسبي (RQ) والسالب (-) log10 المعدل (صفة) يتم رسم قيم P على محوري x و y ، على التوالي. يتم تمثيل كل ميرنا بنقطة. أظهر 73 من 175 miRNAs تعبيرًا متغيرًا في العينات الليفية (صفة قيمة P أكبر من أو تساوي 0.05). يتم تمييز miRNAs المحددة لمزيد من التحليل. تم اختيار (C) miR -150-5 p و miR -495-3 p على أساس قوتهم في استهداف السيليكو للجينات CPT1A و TFAM و PGC1A. لكل microRNA محدد ، تتم الإشارة إلى المواقع المستهدفة المحفوظة للبذور في 3'UTR من هذه الجينات ، وتغيير طياتها وأهميتها (صفة P- القيمة).

الشكل 2. مستويات التعبير عن miR -150-5 p و miR -495-5 p inالكلىمن طرازي UUO و FAN. (أ ، ب) تحليل qRT-PCR لتعبير miR -150-5 p (A) و miR -495- 3 p (B) فيالكلىمن الفئران بعد 7 أيام من UUO في العينات التي تم تحليلها مسبقًا باستخدام مجموعة microRNA. (C – E) تحليل qRT-PCR لتعبير miR -150-5 p و miR -495-3 p بعد نموذج FAN (C) وبعد 3 و 5 و 7 و 1 0 وبعد 15 يومًا UUO لـ miR -150-5 p (D) و miR {{1 0}} ص (شرق). تمثل الرسوم البيانية الشريطية متوسط ​​مستويات التعبير عن تغيير الطية ± sem من الفئران 6 (A ، B ، E) و 3 (C و D) لكل مجموعة. * P <0. 0="" 5="" ،="" **="" p=""><0. 01="" ،="" ***="" p=""><0.001 مقارنة="" بشروط="" التحكم="" المقابلة="" ؛="" #p=""><0.05 ،="" ##="" p=""><0.01 مقارنة="">الكلىمن الفئران بنفس العلاج التجريبي.

تم استخدام TGF - 1 كنموذج سيتوكين مشارك في التغييرات المرتبطة المؤيدة للليف. لتحديد حالة الطاقة الحيوية لهذه الخلايا ، تم قياس معدل استهلاك الأكسجين المرتبط بمنظمة الأغذية والزراعة (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) لخلايا HKC -8 أثناء المعالجة المتسلسلة بالمركبات التي تعدل نشاط الميتوكوندريا في وجود بالميتات ، باستخدام Seahorse XF24 محلل التدفق خارج الخلية (مزيد من التفاصيل في قسم الأساليب). بعد 48 ساعة مع TGF - 1 ، أظهرت خلايا HKC -8 بوجود miR -150-5 p انخفاضًا ثابتًا في القاعدي ، والتعرّف البصري البصري على الحروف مقترنًا بتوليد ATP ، والتنفس المرتبط بـ ATP ، وأقصى قدر من التنفس ، والذي يتعلق OCR الحساس لـ FCCP (الشكل 4 أ). ينعكس الضعف في OXPHOS من خلال انخفاض في محتوى ATP في خلايا HKC -8 التي تفرط في التعبير عن miR -150-5 ص (الشكل 4 ج). لم نلاحظ أن هذه miRNAs تسببت في الاختلافات في ECAR (البيانات غير معروضة). تمشيا مع هذا ، مستويات التعبير mRNA للميتوكوندريا-

تم تقليل الجينات المستهدفة ذات الصلة CPT1A و PGC1 وعامل نسخ الميتوكوندريا A (TFAM) بمقدار النصف في الخلايا التي عولجت بتقليد miR -150 مقارنةً بالخلايا المعالجة بـ miRNA التي تحاكي NC (الشكل 4E). أسفرت الدراسات التي تستخدم نفس النهج التجريبي مع mi -495-3 ص عن نتائج مماثلة (الشكل 4 ب ، د ، و). ومع ذلك ، فإن كتلة الميتوكوندريا ، التي تم تحديدها بواسطة رقم نسخة mtDNA وتلطيخ الميتوكوندريا باستخدام MitoTracker TM green FM ، لم يتم تعديلها بشكل كبير بواسطة miRNA -150 و miRNA - 495 في كل من الظروف القاعدية وتحت علاج TGF. لوحظ وجود اتجاه متناقص في هذه المعلمة بشكل أساسي (الشكل التكميلي 2 أ ، ب ، ج). بشكل عام ، تدعم هذه البيانات أن miR -150 و miR -495 تروج لملف

عمل مؤيد للتليف في الخلايا الظهارية الأنبوبية من خلال ضعف وظيفة الميتوكوندريا.

لا تغير MiR -150 و miR -495 إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر) وجذر أكسيد الميتوكوندريا الفائق

الشكل 3. يعمل كل من MiR -150 و miR -495 على تحسين الاستجابة المؤيدة للليفية المعتمدة على TGF - 1- في الإنسانكلويالخلايا الظهارية الأنبوبية. (أ ، ب) تحليل RT-PCR لتعبير miR {0} p (A) و miR -495-3 p (B) في HKC -8 من الخلايا المعالجة بـ 1 {{24 }} نانوغرام / مل TGF - 1 للأوقات المحددة. (C، D) مستويات mRNA لأكتين العضلات الملساء ألفا (-SMA) ، نوع ألفا 1 -1 كولاجين (Col 1 1) ، فبرونيكتين (FN) من الخلايا المنقولة باستخدام miR-NC وتقليد miR تم تحديد -150-5 p (C) أو miR -495-3 p (D) بواسطة qRT-PCR باستخدام Sybr green. تم التعامل مع الخلايا باستخدام TGF - 1 (1 0 نانوغرام / مل) بعد زيادة التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال (انظر أيضًا قسم الطرق). (E ، F) اللطخات المناعية التي تصور مستويات البروتين CPT1A و -SMA في الخلايا المنقولة باستخدام miR-NC وتقليد miR -150-5 p (E) أو miR {{2 0}} p (F) لـ النقاط الزمنية المشار إليها. تم استخدام GAPDH لأغراض التطبيع. تمثل الرسوم البيانية الشريطية (اللوحات اليمنى) متوسط ​​تعبير تغيير الطية ± sem من 3 تجارب مستقلة. * P <{{3 0}}.="" 05،="" **="" p=""><0.01، ***="" p=""><0.001 مقارنة="" بظروف="" التحكم="" المقابلة="" ؛="" #p=""><0.05، ##="" p=""><0.01، ###="" p=""><0.001 مقارنة="" بالخلايا="" المعالجة="" بـ="" mir-nc="" بنفس="" الحالة="">

الشكل 4. MiR -150 و miR -495 يعززان TGF 1- من قمع الفاو في خلايا HKC -8. (أ ، ب) معدل استهلاك الأكسجين (OCR) لخلايا HKC -8 المنقولة بواسطة

4 0 nM miR-NC ومحاكاة miR -150-5 p (A) أو miR -495-3 p (B) وعرضها لـ 1 0 نانوغرام / مل TGF {{5} } بعد تعبير ميرنا الزائد (انظر أيضًا قسم الطرق). تُظهر الرسوم البيانية الشريطية (اللوحات اليمنى) معدلات التعرف الضوئي على الحروف المرتبطة بالقدرات القاعدية ، وتسرب البروتون ، والقدرات المرتبطة بالـ ATP ، والسعات القصوى والاحتياطية وحالات الجهاز التنفسي غير الميتوكوندريا. يتم تمثيل البيانات بعد التطبيع بكمية البروتين. (C ، E) مستويات ATP في HKC -8 الخلايا المنقولة باستخدام miR-NC وتقليد miR -150-5 p (C) أو miR -495-3 p (E). (D ، F) مستويات mRNA لـ CPT1A و PGC1A و TFAM في HKC {15}} من الخلايا المنقولة باستخدام miR-NC وتقليد miR -150-5 p (D) أو miR -495-3 p (F) كانت تم تحديده بواسطة qRT-PCR باستخدام Sybr green. تُظهر الرسوم البيانية الشريطية المتوسط ​​± sem لـ 4 تجارب مستقلة. * P <0. 0="" 5="" ،="" **="" p=""><0. 0="" 1="" ،="" ***="" p=""><0.001 مقارنة="" بشروط="" التحكم="" المقابلة="" ؛="" #p=""><0.05، ##="" p=""><0.01، ###="" p=""><0.001 مقارنة="" بالخلايا="" المعالجة="" بـ="" mir-nc="" بنفس="" الحالة="">

إنتاج الأنيون. تعد إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) الناتجة عن مضخات البروتون (المجمعات I و III و IV) مكونًا أساسيًا في عملية تخزين الطاقة أثناء الفسفرة المؤكسدة. يمكن أن تؤدي زيادة ميكرومتر إلى اضطراب الأكسدة والاختزال في الميتوكوندريا ، بينما يؤدي انخفاضه إلى تقليل إنتاج ATP ، مما يضر بقدرة الخلية على البقاء [254]. الأنيون الجذري للأكسيد الفائق (O2 • -) هو جذر حر يمكن تكوينه في الميتوكوندريا نتيجة لتسرب الإلكترون الذي قد يحدث خلال عدة خطوات من ETC. توليد O2 • - داخل مصفوفة الميتوكوندريا يعتمد أيضًا بشكل حاسم على نسب NADH / NAD plus و CoQH2 / CoQ وتركيز O2 المحلي [255]. قد يؤدي الإفراط في إنتاجه إلى فقدان توازن الأكسدة والاختزال في الميتوكوندريا من خلال آليات مختلفة ، وهي حالة مرتبطة بالعديد من الحالات المرضية بما في ذلك AKI و CKD [201]. تم فحص ميكرومتر باستخدام صبغة TMRM وإنتاج الأنيون الجذري الفائق باستخدام صبغة MitoSOX. أولاً ، تحققنا من صحة هذه الاختبارات من خلال معالجة الخلايا باستخدام FCCP و CCCP كعناصر تحكم سلبية ، لـ TMRM و MitoSOX على التوالي ، و Oligomycin و Antimycin A كعناصر تحكم إيجابية ، لـ TMRM و MitoSOX على التوالي ، في خط الخلايا البشرية HKC {{7} }. في حالة مقايسة TMRM ، تسببت معالجة oligomycin في زيادة 3- أضعاف في متوسط ​​التألق لـ TMRM مقارنة بصبغة التحكم ، بينما أدت معالجة FCCP إلى انخفاض 9- أضعاف. أنتج Antimycin A و CCCP 35- زيادة أضعاف و 2- ضعفًا ، على التوالي ، في مقايسة MitoSOX (الشكل التكميلي 3A و B). لتحديد ما إذا كانت تأثيرات miR -150 و miR -495 على استقلاب الميتوكوندريا تسببت في حدوث تغييرات في هذه المعلمات ، تم نقل خلايا HKC -8 باستخدام miR -150-5 p أو miR {17} } p تقليد أو miR-NC المقابل. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في القياس الكمي مضان لتحقيقات TMRM أو MitoSOX بين ظروف العلاج مع miRs المحددة و miR-NC (الشكل التكميلي 3C).

لا تتأثر مستويات MiR -150 و miR -495 في عينات البلازما والكلى من مرضى CKD. قمنا بتقييم التعبير عن miRNAs المختارة في خزعات البلازما والكلى من مرضى CKD. لم يُظهر تحليل خزعات الكلى المأخوذة من 26 مريضًا (مستشفى Ramn y Cajal) ارتباطًا بين درجة التليف ومستويات miR -150-5 p و miR -495-3 p ، على التوالي (الشكل التكميلي 4A و B) . تم تحديد مستويات البلازما المتداولة لـ miR -150-5 p ، وهو miRNA مع أعلى تعبير للكلى لهما ، في مجموعة من 100 مريض CKD (مستشفى برينسيبي دي أستورياس). نظرًا للقيود المفروضة على توفر العينة ، لم نتمكن من تحديد قيم المصل لـ miR - 495-3 p في هذه المجموعة. تم تقسيم هؤلاء المرضى سابقًا إلى مجموعتين فرعيتين بناءً على تطور وظائف الكلى لديهم على مدار 24 شهرًا بحيث أظهر 50 مريضًا أقل من 10 بالمائة من تدهور وظائف الكلى بينما عانى الباقون من انخفاض بنسبة 40 بالمائة على الأقل في الكلى. وظيفة. لم يُظهر القياس الكمي qRT-PCR لمستويات البلازما لـ miR -150-5 p اتجاهًا واضحًا نحو التعبير التفاضلي في المجموعتين الفرعيتين من المرضى (الشكل التكميلي 4C).

4. مناقشة

لقد عزز اكتشاف الجزيئات المجهرية (miRNA) كمنظمين رئيسيين للعمليات الفيزيولوجية المرضية البحث عن استخدامها كعوامل علاجية في كل مكان سريري تقريبًا ، بما في ذلك أمراض الكلى [31]. التليف الكلوي هو نتيجة منتشرة بشكل كبير لأمراض الكلى المزمنة (CKD) مع استقلالية المسببات ، ووجودها هو مؤشر واضح للتطور. ومن ثم ، فقد تم تكريس جهد كبير لتحديد الحمض النووي الريبي المرتبط بتليف الكلى [32 ، 33]. في هذه الدراسة ، ركزنا على الدور المتزايد الأهمية لاضطراب التمثيل الغذائي فيكلويتلفوحددنا اثنين من miRNAs ، miR -150 و miR -495 ، والتي كانت من قبل ممثلين غير معروفين في المشهد. علاوة على ذلك ، وجدنا أنها تمارس تأثيرًا عميقًا على الطاقة الحيوية الخلوية من خلال التآزر مع TGF- وتعديل طرق التمثيل الغذائي الرئيسية المتعلقة بالدهون.حامض أكسدة.

الإصابة الظهارية تتعايش مع خلل في الدهونحامضأكسدة، المصدر الرئيسي للطاقة للخلايا الطلائية الأنبوبية [5]. إنه يؤدي إلى اختلال التمايز لديهم مما يؤدي إلى ضعف الوظيفة الأنبوبية ، مما يؤدي إلى توقف دورة الخلية ، ويعزز إطلاق السيتوكينات المؤيدة للليفية التي قد تساهم في تنشيط الخلايا الليفية العضلية الخلالية [5،34]. تمت زيادة تعبير MiR -150 و miR -495 بالماوسليفيالكلىو فيبشري الكلىالخلايا الظهارية (HKC {0}}) بعد العلاج بـ TGF- ، مما يشير إلى مشاركتها في الاستجابة المؤيدة للتليف. مهم ، في تحليل السيليكو لترميز المناطق الجينومية لـ miR -150 و miR -495 يسمح بتحديد مواقع الربط لعوامل النسخ المتعلقة بإشارات TGF والمسارات الأخرى المشاركة في تلف UUO (عمليات البحث في genecards.org لـ miR -150 و miR -495). قلل كل من miR -150 و miR -495 من مستوى التعبير للجينات المستهدفة CPT1A و PGC1 و TFAM ، والذي انعكس في انخفاض المحتوى الأساسي ، المرتبط بـ ATP ، والحد الأقصى من OCR و ATP بعد العلاج باستخدام miR -150 و miR -495. كان هذا التأثير مصحوبًا باستجابة محسنة لـ TGF- pro-fibrotic في خلايا HKC -8. وجدنا أن TGF- قلل من كتلة الميتوكوندريا والحمض النووي للميتوكوندريا. بعد العلاج باستخدام miRNA -150 و miRNA -495 ، لوحظ اتجاه تنازلي في محتوى الميتوكوندريا في الظروف القاعدية ، على الرغم من عدم بلوغ الأهمية. يشير هذا إلى آلية مستقلة عن دور PGC1 أو TFAM وعلى الأرجح مرتبطة بالتأثير الأيضي المرتبط بخفض تنظيم CPT1A باعتباره المتغير الرئيسي المتأثر بوجود miRNAs. تعد التعديلات في الطاقة الحيوية للميتوكوندريا حاسمة في أمراض الكلى [35]. للحفاظ على ذلك ، فقد أظهرنا مؤخرًا أن إنزيم CPT1A هو إنزيم مهم للحفاظ على الحيز الأنبوبي الصحي ، حيث يحمي الإفراط في التعبير عنه من التليف الكلوي [6]. ومع ذلك ، PGC1

وترتبط جينات TFAM ارتباطًا وثيقًا بوظيفة الميتوكوندريا والتكوين الحيوي [36]. يرتبط ضعف التعبير عن هذه الجينات بـ CKD ، بينما يساهم الحفاظ عليها في سلامة الكلى كما هو موضح في العديد من نماذج التلف. وهكذا ، هان وآخرون. وجد أن اكتساب الوظيفة الأنبوبية لـ PGC1 يحمي الفئران ضد تليف الكلى الناجم عن Notch وعكس الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا المرتبط بهذا النموذج [37]. وبالمثل ، فإن إعادة التعبير عن Tfam في الخلايا الأنبوبية منعت إعادة البرمجة الأيضية والتليفية التي يسببها الشق [38]. وبالتالي ، فمن المتصور أن انخفاض تعبير الرنا المرسال لهذه الجينات الميتوكوندريا ، الناجم عن miR -150 و miR -495 ، يساهم أيضًا في النمط الظاهري الظهاري التالف.

الانخفاض الذي لاحظناه في التعرف الضوئي على الحروف المرتبط بتلف الخلايا الظهارية يتوافق مع التقارير السابقة ، بما في ذلك دراساتنا مع miR -33 و miR -9 [15،16]. في حين أن Kang et al. ذكرت أيضًا أن أكسدة الجلوكوز كانت أقل في النماذج البشرية والفأرية للتليف الكلوي [5] ، تُظهر بياناتنا أن الانخفاض بوساطة الرنا الميكروي في التعرف الضوئي على الحروف لا يؤدي في حد ذاته إلى اختلافات في ECAR ، مما يشير إلى أن إيقاف تحلل السكر في الحالات التليفية يعتمد على الأرجح على المنبهات الليفية بدلاً من الفسفرة المؤكسدة الضعيفة. تم تحديد العديد من الجزيئات المجهرية كمعدلات رئيسية لوظيفة الميتوكوندريا ، بما في ذلك النموذج البدائي ميرنا المؤيد للليفية ، مير -21 [39]. تم استدعاء قمع تعبير PPAR بواسطة miR -21 كآلية تمارس بها هذه الميرنا عملها المؤيد للتليف. بالإضافة إلى تثبيط الفاو ، أشارت الجينات المستهدفة لـ miR -21 إلى أن هذه الميرنا تُسكِت نطاقًا واسعًا من عمليات الميتوكوندريا. تشمل الأمثلة الأخرى mir -9 [16] و miR -33 [15] و miR -30 e [40،41]. ومع ذلك ، على حد علمنا ، هناك عدد قليل من التقارير التي تتناول تنظيم microRNA لجينات CPT1A و PGC1 و TFAM في سياق التليف الكلوي. ومن المثير للاهتمام ، أن microRNA -214 الذي يعزز الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) أثناء التليف الكلوي ، يستهدف بشكل مباشر TFAM في خلايا سرطان القولون [42]. تم الإبلاغ عن هذا القمع أيضًا لـ miR -590-3 ص [43]. إن عائلة miR -29 ، إحدى أفضل المنظمات تميزًا لإنتاج ECM في تليف الأعضاء ، تستهدف مباشرة PGC1 ، مما يحافظ على التوازن القلبي. وبالتالي ، فإن الإسكات المرضي لـ miR -29 يؤدي إلى زيادة تنظيم PGC1 ، مما يؤدي إلى تغييرات عميقة في التكوين الحيوي للميتوكوندريا التي تساهم في الإصابة بأمراض القلب [44]. بينما تدعم بياناتنا بوضوح دور miR -150 و miR -495 في تليف الكلى ، سيكون من الضروري إجراء مزيد من الدراسات في الجسم الحي لتأكيد هذا الخلاف.

لتقييم سلامة سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا (ETC) ، ركزنا على ميزتين: ΔѰm وإنتاج الأنيون الجذري الفائق. لاحظنا أن miR -150 و miR -495 لم يغيروا هذه المعلمات. مطلوب ΔѰm مستقر من أجل بقاء الخلية ويختلف حجمها بين أنواع الخلايا [45]. يتم ضبط صيانتها بدقة حيث أن الزيادة في ميكرومتر قد تؤدي إلى اضطرابات في حالة الأكسدة والاختزال ، بينما يؤدي انخفاضها إلى تقليل إنتاج ATP وقد يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. في دراستنا ، تم قياس التغيرات في ميكرومتر باستخدام الصبغة الفلورية الموجبة TMRM ، بينما تم قياس إنتاج الأنيون الجذري لأكسيد الميتوكوندريا باستخدام الصبغة الفلورية MitoSOX Red. إن استخدام هذه الأدوات في الحالات التي تؤثر على وظائف الكلى ليس واضحًا في الأدبيات. ومع ذلك ، في مواجهة عدم وجود تغييرات في دراستنا ، لم نتبع استراتيجيات أخرى متعمقة لتقييم هرمونات الأكسدة والاختزال ، وبالتالي ، لا يمكننا استبعاد أن هذه الجزيئات المجهرية قد تغير نغمة النواة أو وظيفة المكونات العديدة لـ الخ.

في الإعداد السريري ، تم اقتراح miR -150 باعتباره ميرنا مؤيد للليف في التهاب الكلية الذئبي عن طريق تعديل إشارات TGF [46،47] ، بينما ارتبط miR -495 بدور وقائي في أمراض القلب السكري تليف [48]. لمعرفة مشاركتهم المحتملة في CKD ، قمنا بتقييم مستويات المصل والمتني في مجموعتين مختلفتين من المرضى. تم اقتراح مستويات المصل من miRNAs كواسمات حيوية محتملة لتطور CKD [49،50]. وبالتالي ، فإن مستويات مير -21 المنتشرة في المصل ووفرة miR -29 c في exosomes البولي ترتبط بالتليف الكلوي ، مما يشير إلى دورها المحتمل كمؤشرات حيوية [51 ، 52]. ومع ذلك ، لم تكن مستويات miR -150 و miR -495 مختلفة سواء في عينات البلازما أو الكلى من مرضى CKD. قد تفسر أنماط تعبير microRNA المختلفة بين الأنواع وأنواع الخلايا عدم وجود اختلاف في مستويات miR -150 و miR -495 في الأنسجة الليفية [53]. في حين أن مستويات البلازما الدقيقة التي تم الإبلاغ عنها في بعض الحالات يمكن أن تعكس تلك الموجودة في أنسجة الكلى ، ينبغي أيضًا النظر في الآليات الأخرى المتعلقة بإفراز الجزيئات المجهرية في الدورة الدموية أو موازنة هذا الإفراز من قبل الأعضاء الأخرى [١٣ ، ٥٤].

بشكل عام ، تدعم نتائجنا تعزيز miR -150 و miR -495كلويطلائيةزنزانةعلى الأرجح عدم التمايز من خلال الحرمان من الطاقة ، الذي ينقله قمع الجينات المرتبطة بوظيفة الميتوكوندريا CPT1A و PGC1 و TFAM. كما أنها توفر أساسًا لمتابعة دورها في الجسم الحي ، فضلاً عن فائدتها المحتملة كمؤشرات حيوية تشخيصية أو تشخيصية.

الكاتب الاشتراكات

SL تصور وتوجه البحث. قام VM بتصميم وتنفيذ وتحليل غالبية التجارب. ساعد RR في تحليل صفيف microRNA. أجرى DRP و LGB دراسات في مجموعتين مختلفتين من مرضى CKD. ساعد جميع المؤلفين في مناقشة النتائج وكتب SL و VM المخطوطة.

إعلان تضارب المصالح

الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من وزارة العلوم الإسبانية SAF 2015-66107- R و PID 2019-104233 RB-I 00 (SL) ، PI17 / 01513 (DRP) بتمويل مشترك من قبل الاتحاد الأوروبي صندوق التنمية الإقليمية ، Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12 / 0021/0009 و RD16 / 0009/0016 (SL و DRP) ، FIS PI17 / 00625 (DRP) ، Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017 / BMD3751 (SL and DRP) ، منحة مساعدة من الجمعية الإسبانية لأمراض الكلى (Fundacin Senefro 2017) إلى SL و Fundacionكلوي"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) وجميعهم من أسبانيا. يتلقى CBMSO الدعم المؤسسي من Fundacion "Ramn Areces". تم دعم VM من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه لبرنامج FPI (BES - 2013-065986) من وزارة العلوم الإسبانية.