التأثير الوقائي لمادة الكيرسيتين على الخلايا البطانية المصابة بنقص الأكسجة وإعادة الأكسجة

للمزيد من المعلومات الرجاء الاتصالtina.xiang@wecistanche.com

خلفية: مرض الأوعية الدموية الدماغية الصغيرة (CSVD) هو مجموعة من المتلازمات السريرية التي تغطي جميع العمليات المرضية للأوعية الدموية الصغيرة في الدماغ ، والتي يمكن أن تسبب السكتة الدماغية والخرف الخطير. ومع ذلك ، نظرًا لأن التسبب في CSVD غير واضح ، فإن العلاج محدود. يعتبر ضعف الخلايا البطانية قبل ظهور الأعراض السريرية ، مثل ارتفاع ضغط الدم وسرطان الدم. لذلك ، من المتوقع أن يكون علاج الخلايا البطانية طفرة جديدة.كيرسيتين، الفلافونويد الموجود في مجموعة متنوعة من النباتات ، له وظيفة مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة. هدفت هذه الدراسة إلى التحقيق في التأثير الوقائي للكيرسيتين على إصابة الخلايا البطانية وتقديم نظرية أساسية للتطبيق اللاحق في العيادة.

الطريقة: تم استنبات الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للدماغ البشري (HBMECs) في المختبر ، وتم إنشاء نموذج إصابة الخلايا البطانية عن طريق نقص الأكسجة وإعادة الأكسجة (H / R). تمت دراسة التأثيرات الوقائية للكيرسيتين على HBMECs من منظور بقاء الخلية ، وهجرة الخلايا ، وتكوين الأوعية ، وموت الخلايا المبرمج. من أجل مزيد من الدراسة لآلية كيرسيتين ،الاكسدةوتم تحليل إجهاد الشبكة الإندوبلازمية. علاوة على ذلك ، تمت دراسة سلامة الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​أيضًا.

نتائج: كيرسيتينيمكن أن تعزز قابلية البقاء ، والهجرة ، وتولد الأوعية من HBMECs ، وتمنع موت الخلايا المبرمج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ quercetin أيضًا تنشيط مسار إشارات Keap1 / Nrf2 ، وتقليل تعبير البروتين ATF6 / GRP78. أظهرت دراسة أخرى أن الكيرسيتين يمكن أن يزيد من تعبير كلودين -5 و Zonula occludens -1.

الاستنتاجات: تُظهر تجاربنا أن الكيرسيتين يمكن أن يحمي HBMECs من H / R ، والذي يحتوي على تعزيز تكاثر الخلايا ، وهجرة الخلايا ، وتكوين الأوعية ، مما يقلل من الضرر المحتمل لغشاء الميتوكوندريا ويمنع موت الخلايا المبرمج. قد يكون هذا مرتبطًا بمضادات الأكسدة وتثبيط إجهاد الشبكة الإندوبلازمية. في الوقت نفسه ، يمكن أن يزيد كيرسيتين من مستوى كونيكسين BBB ، مما يشير إلى أن كيرسيتين يمكن أن يحافظ على سلامة BBB.

الكلمات الدالة: مرض الأوعية الدموية الدماغية الصغيرة ، الخلايا البطانية ، كيرسيتين ، الإجهاد التأكسدي ، إجهاد الشبكة الإندوبلازمية ، الحاجز الدموي الدماغي

المقدمة

مرض الأوعية الدموية الدماغية(CSVD) هو مصطلح شامل يشمل جميع العمليات المرضية التي تشمل الأوعية الصغيرة في الدماغ ويشير إلى مجموعة من المتلازمات السريرية والتصويرية والمرضية ذات المسببات المختلفة التي تحتوي على الشرايين داخل الجمجمة حتى الأوردة （القطر<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

كيرسيتينهو أحد مركبات الفلافونويد الموجودة في العديد من النباتات ، مثل بوليغونوم cuspidatum Sieb. لدى et Zucc أنشطة قوية مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات ويمكن أن تمارس تأثيرات وقائية في مختلف الحالات المرضية بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية واضطرابات التمثيل الغذائي وأمراض التنكس العصبي والسكري والسرطان والسمنة (Dok-Go et al ، 2003 ؛ Comalada et al ، 2005 ؛ تشو وآخرون ، 2006). أدت المعالجة المسبقة باستخدام الكيرسيتين إلى زيادة كبيرة في مستويات التعبير عن إنزيمات مضادات الأكسدة الذاتية في الخلايا العصبية الهرمية الحُصينية CA1 للحيوانات المصابة بنقص التروية ، مما يُظهر تأثيرات قوية مضادة للأكسدة وقائية للأعصاب (Chen et al ، 2017). وجدت الدراسات الحديثة أيضًا أن الكيرسيتين له تأثيرات اعصاب ضد الإصابة الدماغية مع الحفاظ على سلامة BBB (Jin et al ، 2019). ومع ذلك ، فإن تأثيره على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMECs) تحت إصابة نقص الأكسجة وإعادة الأكسجة (H / R) لم يتم دراسته بشكل جيد ، ولم يتم الإبلاغ عن البروتين المستهدف من كيرسيتين الذي يحمي BMECs.

في دراستنا ، استكشفنا التأثير الوقائي للكيرسيتين على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للدماغ البشري (HBMECs) المصابة بالـ H / R في الثقافة. في الوقت نفسه ، درسنا أيضًا الآلية المحتملة لتأثيره الوقائي ، وذلك لتوفير أساس نظري أكثر للترويج السريري للكيرسيتين وتقديم أفكار جديدة لعلاج CSVD.

المواد والأساليب

الوسائط والكواشف والأجسام المضادة

كيرسيتين(purity>98 بالمائة) من شركة Best Biological Technology Co، Ltd. (تشنغدو ، الصين). تم شراء HBMECs من شركة Qingqi Biotechnology Development Co.، Ltd (شنغهاي ، الصين). تم الحصول على مصل بقري الجنين (FBS) من شركة Biological Industries (كيبوتس بيت هعيمق ، إسرائيل). تم شراء البنسلين / الستربتومايسين ووسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) من Hyclone (GA ، الولايات المتحدة). تم شراء مجموعة أدوات اختبار إمكانات غشاء الميتوكوندريا (JC -1) ومجموعة اختبار بروتين BCA و 2 و 7- ثنائي أسيتات ثنائي كلوريد هيدرو فلورسين (DCFH-DA) ومحلل NP4 0 من Beyotime Biotechnology (شنغهاي، الصين). تم شراء تحضير الفوسفاتيز ومثبط الأنزيم البروتيني الكامل من شركة روش (شنغهاي ، الصين). تم شراء مجموعة Apoptosis Kit من BD Biosciences (سباركس ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة). Malondialdehyde (MDA) ، Superoxide disutase (SOD) ، جزيء التصاق الخلايا بين الخلايا -1 (ICAM -1) ​​، جزيء التصاق الخلايا الوعائية -1 (VCAM {{1 0}} ) مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) كانت (اشترت Cambridge ، Abcam الشركة dfrom1 "一 المملكة المتحدة). الأجسام المضادة ضد العامل النووي E 2- العامل 2 (Nrf2) ، Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1) ، تنشيط عامل النسخ 6 (ATF6) ، البروتين المنظم للجلوكوز 78 (GRP78) ، Zonula occludens 1 (ZO -1) ، كلودين -5 ، تم شراء GAPDH من Cell Signaling Technology (Danvers ، الولايات المتحدة). تم الحصول على IgG المضاد للأرانب المقترن من Horseradish peroxidase (HRP) من شركة Jackson (بنسلفانيا ، الولايات المتحدة). تم شراء مجموعة التوزيع السريع SDS-PAGE ومحلول الكروموجين ECL من EpiZyme Biotechnology (شنغهاي ، الصين). تمت تربيتها في DMEM تحتوي على 1 0 بالمائة من FBS و 1 بالمائة بنسلين ستربتومايسين ، في 37 حاضنة مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. لتسبب البطانة تم علاج تلف الخلايا ، HBMECs بنقص الأكسجة لمدة 12 ساعة متبوعًا بإعادة الأكسجة لمدة 8 ساعات ، وكانت الإجراءات المحددة على النحو التالي (Warpsinski et al. ، 2020): تم تحضين HBMEC أولاً مع الوسط الخالي من المصل في حاضنة نقص الأكسجة (1 بالمائة) O ، 5 بالمائة CO.94 بالمائة N) لمدة 12 ساعة ، ثم تم تغيير الوسيط إلى الوسط الطبيعي الذي يحتوي على 10 بالمائة من FBS ، بينما تم تحضينهم في حاضنة نورموكسيا (95 بالمائة O2،5 بالمائة CO2) لمدة 8 ساعات. تم إذابة علاج كيرسيتين 2 مجم كيرسيتين في 331 ميكرولتر DMSO لتشكيل محلول مخزون بتركيز 1 مليمول / لتر وتخزينه عند درجة -20. تم تخفيف محلول العمل إلى 0.1،0.5،1،2،5،10umol / L باستخدام DMEM ، حيث كانت النسبة المئوية لـ DMSO أقل من 0.1 بالمائة. بمجرد أن تصبح الخلايا ملتصقة ، تمت إضافة كيرسيتين بالوسط الخالي من المصل ، ثم تم وضع الألواح في حاضنة نقص الأكسجة. بعد 12 ساعة ، تمت إزالة الخلايا وتغييرها إلى كيرسيتين بوسط مصل ووضعها في حاضنة نورموكسيا لمدة 8 ساعات.

فحص جدوى الخلية

آثار الكيرسيتينحول صلاحية HBMECs بواسطة مجموعة عد الخلايا -8 وفقًا لدليل المشغل. تم أولاً تقييم الجرعات الآمنة من الكيرسيتين للخلايا في حالة عدم وجود تلف في الخلايا البطانية ، ثم تم اختبار الآثار الوقائية لها في حالة تلف الخلايا. تم تكرار جميع النتائج التجريبية ثلاث مرات على الأقل.

تم إجراء تجارب فحص شفاء الخدش وترحيل تشكيل الأنبوب باستخدام طريقة خدش الخلية. قبل العلاج بالكيرسيتين ، تم رسم خط عمودي مستقيم في الجزء السفلي من لوحة المزرعة وتم تصويره للتسجيل لمدة 0 ساعة ، ثم تعرضت الخلايا بعد ذلك للعلاج بالكيرسيتين والنمذجة قبل التقاط الصور الفوتوغرافية للتسجيل. تم تباين المناطق الأمامية والخلفية مرتين.

تشكيل الأنبوب الذي يحاكي القدرة على تكوين الأوعية الخلوية ، تم وضع Matrigel (9-12 mg / ml) في الجزء السفلي من لوحة الثقافة ، ثم تم طلاء الخلايا المعالجة بالكيرسيتين والنمذجة في الأعلى ، وبعد 8 ساعات ، تم التقاط الصور. تم تحليل ومقارنة الجيل المتفرع من الأوعية الدموية باستخدام ImageJ.

إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومقايسة موت الخلايا المبرمج

تم استخدام مجموعة التغيير المحتمل لغشاء الميتوكوندريا ومجموعة موت الخلايا المبرمج للكشف عن موت الخلايا المبرمج. تم الكشف عن التغيير في إمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق تلطيخ HBMECs باستخدام مسبار الفلورسنت JC -1. تمت إضافة محلول تلطيخ JC -1 (1 ×) واحتضانه في حاضنة 37 درجة لمدة 20 دقيقة قبل غسلها مرتين باستخدام محلول تلطيخ JC -1 (1 ×) وإضافته أخيرًا إلى كل بئر لبرنامج PBS . بعد ذلك ، تم استخدام مصور الخلية عالي المحتوى للتحليل.

تم جمع HBMECs من 6- ألواح البئر ، وطردها مركزيًا لإزالة المادة الطافية ، ثم إضافة 1 × محلول ربط Annexin V لتفجير الخلايا وخلطها ، ثم إضافة صبغة FITC Annexin V للاحتضان في الظلام عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة ، أضف محلول تلطيخ بروبيديوم يوديد (PI) قبل 5 دقائق من الماكينة ، وتم استخدام مقياس التدفق الخلوي بيكمان للكشف.

إليسا

بعد معالجة الخلايا بـ H / R أو كيرسيتين ، تم جمع المادة الطافية. تم اكتشاف ICAM -1 و VCAM -1 و SOD و MDA باستخدام مجموعات ELSA وفقًا لدليل المشغل.

مقايسة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تم اكتشاف قدرة توليد ROS بواسطة مسبار DCFH-DA ، والذي تم تقييمه بواسطة مصور الخلية عالي المحتوى ، وتحليله عن طريق التألق باستخدام ImageJ. النشاف الغربي

تم جمع HBMECs من لوحات الاستنبات ، واستخدم NP40 محلول إضافة الفوسفاتيز ومثبط البروتياز الكامل لاستخراج البروتينات من الخلايا. تم تحديد محتوى البروتين وأخذ 30 ميكروغرام من البروتين لتجارب مناعية. تم استخدام هلام SDS-PAGE في الرحلان الكهربائي ، وتم حظره باستخدام حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5 في المائة بعد النقل الكهربائي إلى غشاء PVDF لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. ثم anti-Nrf2 (rabbit، 1: 1، 000)، anti-Keapl (rabbit، 1: 1، 000)، anti-ATF6 (rabbit، 1: 1، 000 )، anti-GRP78 (rabbit، 1: 1، 000)، anti-ZO -1 (rabbit، 1: 1، 000)، anti-Claudin -5 ( أرنب ، 1: 1 ، 000) تم تحضين الأجسام المضادة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل في اليوم التالي ، تمت إضافة الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب من الماعز (IgG HRP ، 1:10 ، 000) واحتضانها لمدة ساعة واحدة. أخيرًا ، تم تطوير الاكتشاف بعد الغسيل ثلاث مرات في TBST.

التحليل البروتيني

تم علاج HBMECs مع H / R في وجود كيرسيتين (l umol / L). بعد ذلك ، تم كشط الخلايا برفق من لوحة المزرعة باستخدام مكشطة خلوية ، وتم جمعها في قوارير مبردة ، ووضعها سريعًا في النيتروجين السائل ، ثم تخزينها عند -80 درجة لمدة 5 دقائق ، واستخدمت تقنية iTRAQ لإجراء التحليل البروتيني ، البروتينات ذات القيمة p<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 أو<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

تحليل احصائي

كانت البيانات تتناسب مع التوزيع الطبيعي ، وتم استخدام يعني ± الانحراف المعياري للتعبير عن البيانات. تم استخدام GraphPad Prism 8 للتحليل الإحصائي. تم تحليل عينتين مستقلتين بواسطة اختبار t ، ووصفت بيانات القياس بمتوسط ​​± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء المقارنة بين المجموعات عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). ف القيمة<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

النتائج

نتائج

تأثير الكيرسيتين على حيوية الخلية

لاختبار تأثير الكيرسيتين على حيوية الخلية ، قمنا أولاً بفحص جرعة آمنة من كيرسيتين على الخلايا ، كما هو موضح في الشكل 1 أ ، والتي لم يكن لها أي تأثير على قابلية بقاء الخلية في 0. 1-10 umol / L . بعد ذلك ، للبحث عن جرعة فعالة على أساس تلف الخلايا البطانية ، أظهرنا أن الكيرسيتين في 0. 1-1 ميكرومول / لتر يمكن أن يعزز قابلية بقاء الخلية في H / R-HBMECs ، كما هو موضح في الشكل 1 ب. تم إجراء تجارب لاحقة حول نطاق التركيز هذا. تجدر الإشارة إلى أنه عندما وصل تركيز الدواء إلى 10 ميكرولتر / لتر ، ظهرت السمية الخلوية. كنا نظن أنه عندما تضررت HBMECs بسبب H / R ، فإن تحملها ينخفض. لذلك ، عندما يكون تركيز الدواء أعلى قليلاً ، يزداد الضرر الذي يلحق بالخلايا. لذلك ، تحدث السمية الخلوية عندما يكون تركيز الدواء 10 ميكرولتر / لتر.

تأثير الكيرسيتين على هجرة الخلايا وتكوين الأوعية الدموية

لفحص تأثيرات الكيرسيتين على القدرات المهاجرة والأوعية للخلايا البطانية ، خضعت HBMECs للعلاج H / R أثناء إعطاء كيرسيتين. أجرينا اختبارًا للخدش لاختبار قدرة ترحيل الخلايا ، والذي أظهر أن علاج H / R أضعف قدرة ترحيل H / R-HBMECs مقارنةً بالتحكم ، ويمكن أن يعزز الكيرسيتين بشكل كبير ترحيل الخلايا بتركيز 0 . 1-1 ميكرول / لتر. تم استخدام Tubulogenesis لتقليد تكوين الأوعية في المختبر ، ويمثل طول فرعها القدرة على تكوين الأوعية. أظهرت النتائج أن العلاج H / R أدى إلى انخفاض القدرة على تكوين الأوعية ، ولكن كيرسيتين 0. 1-1 ميكرولتر / لتر يمكن أن يعكس هذه الإصابة ، كما هو موضح في الشكل 2.

تأثير الكيرسيتين على موت الخلايا المبرمج

لاختبار قدرة الكيرسيتين على تثبيط موت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية ، استخدمنا إمكانات غشاء الميتوكوندريا وموت الخلايا المبرمج للتقييم. عندما أصيبت الخلايا للخضوع لأحداث موت الخلايا المبرمج ، تم تقليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتم تقليل التألق الأحمر السيتوبلازمي بشكل كبير ، وزاد التألق الأخضر ، وتم اعتماد الأحمر / الأخضر (R / G) أخيرًا لتمثيل التغيير المحتمل لغشاء الميتوكوندريا ، والذي سوف ينخفض ​​عندما يتم اختراق إمكانات غشاء الميتوكوندريا. أظهرت نتائجنا أنه بعد العلاج H / R ، انخفضت إمكانات غشاء الميتوكوندريا للخلايا ، كما يتضح من زيادة التألق الأخضر. مع جرعات متزايدة من كيرسيتين ، تم تحسين التألق الأحمر باستمرار ، مما يشير إلى أن كيرسيتين يمكن أن يرفع من إمكانات غشاء الميتوكوندريا بالاعتماد على الجرعة (الشكل 3 أ ، ج). علاوة على ذلك ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لفحص موت الخلايا المبرمج مباشرة. أظهرت النتائج أن HBMECs أظهرت ارتفاع معدل موت الخلايا المبرمج بعد علاج H / R ، بينما أظهر كيرسيتين عند 0. 1-1 umol / L أظهر قدرة واضحة على تثبيط موت الخلايا المبرمج (الشكل 3 ب ، د).

تأثير الكيرسيتين على التصاق الخلية

بمجرد تلف الخلايا البطانية ، يتم إنتاج بعض جزيئات الالتصاق ، مثل ICAM {0}} و VCAM -1 ، مما يؤدي إلى امتصاص المواد السامة في BBB ، وإتلاف حمة الدماغ (Hauptmann et al ، 2020 لفحص تأثير الكيرسيتين على قدرة H / R-HBMECs على إنتاج جزيئات الالتصاق ، تم قياس ICAM -1 و VCAM -1 باستخدام ELISA. في دراستنا ، أدى H / R إلى زيادة مستويات ICAM -1 و VCAM -1 ، ولكن إضافة كيرسيتين تحت تركيز 0. 1-1 umol / L قلل من هذا التأثير (الشكل 4).

يمكن أن يمنع كيرسيتين الإجهاد التأكسدي

الكيرسيتين هو مادة الفلافونويد ذات القدرة القوية المضادة للأكسدة ، لذلك استخدمنا مسبار DCFH-DA لاكتشاف أنواع ROS. لاحظنا

زيادة توليد ROS في HBMECs المعرضة لـ H / R ، والتي تم تقليلها بشكل ملحوظ عن طريق علاج كيرسيتين بتركيزات {{0}}. 1-1 umol / L وفي الوقت نفسه ، اكتشفنا تغيرات مستوى الإجهاد التأكسدي منتجات SOD و MDA مع ELISA ، وأظهرت النتائج أن كيرسيتين بتركيز 0. 1-1 μmol / L كان قادرًا على تقليل SOD و MDA ، اللذان تم رفعهما بواسطة H / R ، مما يشير إلى أن كيرسيتين يمكن أن يقلل من تلف HBMECs من الإجهاد التأكسدي (الشكل 5).

يمكن أن ينظم كيرسيتين بروتينات Keap1 / Nrf2 و ATF6 / GRP78

لمزيد من استكشاف آلية الحماية من كيرسيتين على HBMECs ، قمنا بتحليل مستويات التعبيرالاكسدةوالبروتينات المرتبطة بالإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية. من المعروف أن Keap1 / Nrf2 ينظم استجابات مضادات الأكسدة في الجسم الحي. تجبر إصابة الإجهاد التأكسدي الخلايا البطانية على الخضوع للاستجابة للضغط ، مما يؤدي إلى زيادة مستويات Keapl / Nrf2 (Warpsinski et al ، 2 0 20). في هذه الدراسة ، أدى H / R إلى تنشيط آليات الاستجابة الخلوية المضادة للأكسدة وزيادة مستويات Keapl و Nrf2 ، والتي يمكن تعزيزها بشكل أكبر بواسطة كيرسيتين عند 0. 5-1 umol / L لتعزيز قدرة مضادات الأكسدة في HBMECs .ATF6 / GRP78 هو أحد المسارات التي تنظم التوازن في الشبكة الإندوبلازمية (ER). يمكن أن يؤدي إجهاد ER إلى تفاقم إصابة الخلايا البطانية (Nie et al ، 2020). في دراستنا ، تم تنشيط إجهاد ER بواسطة H / R ، وزادت مستويات ATF6 و GRP78. كان Quercetin في l umol / L قادرًا على تقليل مستويات البروتين بشكل كبير لكليهما ، وتمنع إجهاد ER ، وحماية HBMECs من إصابة H / R (الشكل 6).

يمكن أن يحافظ Quercetin على نزاهة BBB

BMECs هي العمود الفقري لبنية BBB ، ويؤثر موتهم أو موتهم بعد إصابة H / R على سلامة BBB ووظائفه (Ding et al ، 2019) ، في هذه الورقة ، انعكست وظيفة الخلايا البطانية من خلال اكتشاف التغييرات في التعبير. من البروتينات المرتبطة بـ BBB ZO -1 وكلودين -5. بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، كان تعبير ZO -1 وكلودين -5

انخفض في إصابة H / R ، مما يشير إلى تلف BBB ويمكن عكس هذا الضرر بواسطة كيرسيتين بتركيزات 0. 5-1 ميكرولتر / لتر ، مما يشير إلى أن الكيرسيتين يمكن أن يحافظ على وظيفة الخلايا البطانية (الشكل 7).

التحليل البروتيني

للعثور على بروتينات التعبير التفاضلي (DEPs) لـ H / R المصابة HBMECs في وجود كيرسيتين أم لا ، تم استخدام ITRAO لإجراء تحليل البروتينات. عرض البروتينات ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 أو<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

نقاش

CSVD ، باعتباره عبئًا طبيًا واجتماعيًا واقتصاديًا متزايدًا ، جذب الانتباه بسرعة. ولكن من المدهش أن التسبب في مرض CSVD لا يزال غامضًا في الوقت الحالي ، مما لا يقدم أي مخطط واضح لعلاجه أيضًا. بالنظر إلى أن المراحل المتأخرة من CSVD يمكن أن تتطور إلى نتائج شديدة مثل السكتة الدماغية والخرف ، فإن استهداف الآفات المبكرة للعلاج يمكن أن يؤخر بشكل فعال تطور CSVD (Cannistraro et al ، 2019). لقد ثبت أن التغيرات المرضية المبكرة لـ CSVD تكمن في خلل في الخلايا البطانية وأن الأدوية التي تثبت خللها قد تحسن من ضعف المادة البيضاء الدماغية في آفات CSVD (Rajani et al ، 2018). نظرًا للدور الذي تلعبه الخلايا البطانية في CSVD ، شرعنا في التحقيق في التأثيرات الوقائية للطب الصيني التقليدي على الخلايا البطانية باستخدام HBMECs.

الكيرسيتين هو مادة الفلافونويد الموجودة في مجموعة متنوعة من النباتات (Nawrot-Hadzik et al ، 2019). لها أنشطة قوية مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات ويمكن أن تمارس تأثيرات وقائية في مختلف الحالات المرضية. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن كيرسيتين يمكن أن يخفف من إصابة H / R ، وتؤكد العديد من البيانات التجريبية استنتاجنا أن كيرسيتين يمكن أن يعزز بقاء الخلية ، وهجرة الخلايا ، وتكوين الأوعية ، وزيادة إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتمنع موت الخلايا المبرمج.

بالنظر إلى أن الكيرسيتين له نشاط قوي مضاد للأكسدة ، فقد بحثنا في الآلية التي يحمي بها الكيرسيتين HBMECs من حيث مضادات الأكسدة. يمكن زيادة مستويات الأكسجين التفاعلية بشكل كبير بسبب الإجهاد التأكسدي (Wu et al.، 2018) ، ويمكن أن يتسبب تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية في حدوث العديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية ، والخلل البطاني والأمراض المرتبطة بالشيخوخة ، والأمراض العصبية التنكسية (Chen et al ، 2015 ؛ Jakaria et al.، 2018؛ Santos et al.، 2018). علاوة على ذلك ، يحدث الإجهاد التأكسدي في بيروكسيد الدهون ، مما ينتج MDA ، والذي سيدمر توازن مضادات الأكسدة في الجسم ويزيد من تلف الخلايا البطانية (Yang et al ، 2021).

يعتبر Keapl / Nrf2 أهم مسارات الإجهاد الذاتي المضادة للأكسدة في الوقت الحاضر ، ويمكن أن يؤدي تنشيط هذا المسار إلى تحسين خلل الخلايا البطانية بشكل كبير. على وجه الخصوص ، تساعد ROS في تعزيز تنشيط مسار إشارات Nrf2 (Selimoglu-Buet et al ، 2017). لقد أثبتنا أن كيرسيتين يمكن أن يقلل من توليد ROS و MDA ، مع زيادة تعبير البروتين Keapl و Nrf2 ، مما يشير إلى أن كيرسيتين قد يخفف من إصابة الخلايا البطانية عن طريق تقليل استجابات الإجهاد التأكسدي عن طريق تنشيط مسار إشارات Keapl / Nrf2.

ليس ذلك فحسب ، فإن إجهاد ER المستمر ينشط استجابة البروتين غير المطوية ويغير التعبير عن الجينات المضادة للأكسدة ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج البطاني (Tang et al ، 2019). علاوة على ذلك ، يمكن أن يسبب الإجهاد التأكسدي أيضًا اضطرابًا في طي البروتين في ER ، ويثير إجهاد ER ، ويؤدي إلى تفاقم إصابة الخلايا البطانية (Hetz ، 2012). يمكن تنشيط إجهاد ER من خلال هذه المسارات الثلاثة: كيناز ER الذي يشبه PKR (PERK) ، والإينوزيتول الذي يتطلب إنزيم 1 (IRE1) ، و ATF المنشط -6 ، والذي يحمي الخلايا من إجهاد ER في ظل ظروف الاستتباب (Hetz et al ، 2020). ولكن عند تأثرها بالمحفزات السلبية الخارجية ، فإن هذه المسارات الثلاثة ستنشط استجابة إجهاد ER وتحفز موت الخلايا المبرمج. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات أن تثبيط استجابة الإجهاد ER يمكن أن يعكس خلل الخلايا البطانية الناجم عن H / R (Chen et al ، 2020). استجابة الإجهاد الشبكية الإندوبلازمية ، وحماية الخلايا البطانية.

كمكون رئيسي في BBB ، تشمل وظائف الخلايا البطانية الحفاظ على سلامتها. يتسبب الخلل الوظيفي في BBB في تسرب السوائل والبروتينات ومكونات البلازما الأخرى إلى الأنسجة المحيطة بالأوعية الدموية ، مما يزيد من إضعاف توسع الأوعية الدماغية ونقل المغذيات (Wardlaw et al ، 2019). عندما تتلف الخلايا البطانية وسيتم تدمير سلامة BBB ، فإن حماية الخلايا البطانية يمكن أن تحافظ على سلامة BBB. نفاذية BBB (Yang et al ، 2020). ترتبط الخلايا البطانية بالهيكل الخلوي للأكتين عن طريق بروتينات السقالات مثل ZO -1 ، مما يجعل الوصلات الضيقة بين الخلايا البطانية التي تحافظ على ضيق BBB (Zhang et al ، 2020). في دراستنا ، تم استخدام تعبير claudin -5 و ZO -1 لتمثيل تكامل BBB. أظهرت نتائجنا أن مستويات بروتين كلودين -5 و ZO -1 انخفضت في HBMECs التي تعرضت لإصابة H / R ، مما يشير إلى أن سلامة BBB قد تعطلت ، وأن الكيرسيتين يمكن أن يقلل من هذه الإصابة عن طريق رفع claudin {{ 9}} ومستويات البروتين ZO 1.

علاوة على ذلك ، للعثور على الأهداف المحتملة للكيرسيتين على HBMECs ، تم تصنيف i-TRAQ في الخلايا. بعد التحليل البروتيني ، تم فحص أفضل 20 بروتينًا من البروتينات الشائعة المعبر عنها تفاضليًا. من بينها INSRR ، DUSP3 ،

ترتبط ANXA2 و HBA1 و PGK1 و VTN و GPI بالخلايا البطانية. يعتبر INSRR علامة بطانية للورم ويمكن أن يؤدي الإفراط في التعبير عنه إلى تعزيز تكوين الأوعية (Nowak-Sliwinska et al ، 2019). يمكن أن يقلل ANXA2 المؤتلف من نفاذية البطانة تحت حالات الإصابة بنقص التأكسج وعامل الالتهاب ، مما يشير إلى أن ANXA2 قد يكون متورطًا في الحفاظ على ضيق الخلايا البطانية (Li et al ، 2019). في تلطيخ أقسام عنق الرحم البشري ، تم العثور على تعبير قوي عن DUSP3 في الخلايا البطانية ، وأظهرت التجارب أيضًا أن DUSP3 ضروري لنمو الأوعية الدموية الدقيقة الناجم عن عامل نمو الخلايا الليفية (Amand et al. 2014). تبين أن تعبير HBAl في الخلايا البطانية يتحكم في توتر ووظيفة الأوعية الدموية (Sangwung et al. ، 2017) ، ويُعتقد أيضًا أن PKK1 يقلل من تصلب الشرايين (Zhang et al ، 2020). علاوة على ذلك ، يعتبر VTN أمرًا بالغ الأهمية لتشكيل الجلطة في حالة إصابة الأوعية الدموية (Bowley et al ، 2017). يتم إثراء GPI في الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة للأنسجة الزليلية من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي في بيئة نقص الأكسجة وينظم إفراز عامل نمو بطانة الأوعية الدموية من الخلايا الليفية الزليلية لالتهاب المفاصل الروماتويدي للحث على تكوين الأوعية (Lu et al ، 2017). أظهرت البروتينات المعبر عنها المتعلقة بالعقم بوساطة دوالي الخصية أن Nrf2 كان منظمًا أوليًا لـ ANXA2 (Panner Selvam et al ، 2021). يمكن أن يؤدي تثبيط PGK1 إلى تنشيط مسار Keapl / Nrf2 وتحفيز استجابة مضادات الأكسدة الواقية للخلايا (Bollong et al ، 2018). قد يكون البروتينان هما الهدفان المحتملان للكيرسيتين من خلال مسار Keapl / Nrf2. يمكن لمزيد من الدراسة التحقق من دور هذه البروتينات في تأثير كيرسيتين على H / R-HBMECs.

من المسلم به أن الكيرسيتين يمكن أن يمارس تأثيرات وقائية على الخلايا البطانية. لكن الأهداف المحددة للعمل لا تزال تتطلب مزيدًا من التحقيق ، وما إذا كانت هناك مسارات إضافية للعمل لا يزال غير معروف.

في الختام ، أظهرت هذه الدراسة أن الكيرسيتين يحافظ على سلامة الحاجز الدموي الدماغي من خلال حماية الخلايا البطانية. على المستوى الجزيئي ، قد يلعب كيرسيتين دورًا في حماية الخلايا البطانية عن طريق الحماية من الإجهاد التأكسدي من خلال مسار Keapl / Nrf2 وتثبيط إجهاد الشبكة الإندوبلازمية من خلال مسار ATF6 / GRP78. تضع هذه الدراسة الأساس لـ TCM لعلاج CSVD من خلال حماية الخلايا البطانية.