يتحكم قارئ RNA M6 A YTHDF2 في الخلايا القاتلة الطبيعية المضادة للأورام والمناعة المضادة للفيروسات الجزء 3

YTHDF2 مطلوب من أجل بقاء خلايا NK وانتشارها ووظائف المستجيب بوساطة IL-15

يعد IL-15 أحد السيتوكينات، إن لم يكن الأكثر أهمية، للوظائف متعددة المظاهر للخلايا القاتلة الطبيعية. اكتشفنا نحن وآخرون سابقًا أن IL-15 يلعب أدوارًا رئيسية في تنظيم توازن الخلايا القاتلة الطبيعية والبقاء على قيد الحياة ووظائف المستجيب (Becknell and Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019 ب؛ يو وآخرون، 2013).

يشير تعدد أشكال الخلايا إلى قدرتها على أداء وظائف مختلفة في بيئات مختلفة. يرتبط تعدد الأشكال الخلوي ارتباطًا وثيقًا بالمناعة لأن العديد من الخلايا في الجهاز المناعي يمكن أن تلعب مجموعة متنوعة من الأدوار المختلفة.

في الجهاز المناعي، تعد الخلايا التائية نوعًا بالغ الأهمية من الخلايا. فهي تتعرف على مسببات الأمراض وتهاجمها، بينما تنظم أيضًا نشاط الخلايا المناعية الأخرى. يعد تعدد الأشكال للخلايا التائية مهمًا جدًا لأنه عندما يواجه الجهاز المناعي ممرضًا جديدًا، تحتاج الخلايا التائية إلى لعب أدوار مختلفة في فترة قصيرة للاستجابة بفعالية. على سبيل المثال، عندما يواجه الجهاز المناعي عدوى بكتيرية، تحتاج الخلايا التائية إلى لعب دور قتل البكتيريا، وعندما يواجه الجهاز المناعي عدوى فيروسية، تحتاج الخلايا التائية إلى لعب دور تنظيم الخلايا المناعية الأخرى.

بالإضافة إلى ذلك، في الجهاز المناعي، هناك فئة من الخلايا تسمى البلاعم لها أيضًا تأثيرات متعددة المظاهر. يمكنها بلعمة وتكسير مسببات الأمراض الأجنبية، ويمكنها أيضًا تنشيط الخلايا المناعية الأخرى لمهاجمة مسببات الأمراض. يعد تنوع الخلايا البلعمية مهمًا لأنها تحتاج إلى لعب أدوار مختلفة في بيئات مختلفة. على سبيل المثال، في حالات العدوى الفيروسية، تحتاج الخلايا البلعمية إلى إفراز بعض المواد لمحاربة الفيروس، بينما في حالات العدوى البكتيرية، تحتاج الخلايا البلعمية إلى ابتلاع البكتيريا وهضمها لإزالة العامل الممرض.

باختصار، هناك علاقة وثيقة بين تعدد الأنماط الخلوية والمناعة. يمكن للخلايا متعددة المظاهر أن تلعب أدوارًا مختلفة في البيئات المصابة بمسببات الأمراض المختلفة، وبالتالي تعزيز قدرة الجهاز المناعي على الاستجابة وتحسين مناعة الجسم ضد مسببات الأمراض المختلفة. ولذلك، ينبغي أن نهتم بتعدد الخلايا وكذلك تعزيز زراعة المناعة للحفاظ على صحة الإنسان. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين الذاكرة، ويمكن لـ Cistanche deserticola أن يحسن الذاكرة بشكل كبير، لأن Cistanche deserticola يمكنه أيضًا تنظيم توازن الناقلات العصبية، مثل زيادة مستويات الأسيتيل كولين وعوامل النمو. هذه المواد مهمة جدًا للذاكرة والتعلم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لـ Cistanche deserticola أيضًا تحسين تدفق الدم وتعزيز توصيل الأكسجين، مما يضمن حصول الدماغ على العناصر الغذائية والطاقة الكافية، وبالتالي تحسين حيوية الدماغ والقدرة على التحمل.

انقر فوق معرفة طرق تحسين ذاكرتك

في الدراسة الحالية، نظهر أن IL-15 ينظم مستويات mRNA وبروتين YTHDF2 في خلايا NK (الشكل 6 A؛ والشكل 1، D – F). لذلك ، توقعنا أن YTHDF2 مطلوب للبقاء على قيد الحياة بوساطة IL-15 ووظائف المستجيب للخلايا NK.

لقد حاولنا أولاً تحديد عوامل النسخ المحتملة أسفل إشارة IL-15 التي تنظم تعبير YTHDF2 بشكل مباشر. قمنا بتحليل موسوعة عناصر الحمض النووي باستخدام قاعدة بيانات متصفح الجينوم بجامعة كاليفورنيا، سانتا كروز (https://genome.ucsc.edu)، والتي توفر تنبؤات بمواقع الارتباط عبر الجينوم بأكمله، بالاشتراك مع JASPAR (http://jaspar.genereg) .شبكة).

لقد وجدنا أن STAT5، وهو عامل رئيسي في اتجاه المصب لـ IL-15 في خلايا NK، يحتوي على أربعة مواقع ربط ضمن 2 كيلو بايت من موقع بدء النسخ (TSS) لـ Ythdf2، مما يشير إلى أن IL-15 قد يكون إيجابيًا تنظيم النسخ Ythdf2 في خلايا NK الماوس من خلال STAT5.

باستخدام مثبط STAT5 STAT5-IN-1 (مولر وآخرون، 2008)، أظهرنا أن تثبيط STAT5 أدى إلى انخفاض Ythdf2 في كل من mRNA ومستويات البروتين في خلايا NK الفأرية (الشكل S4، A). و B). للتأكيد بشكل أكبر على أن YTHDF2 هو عامل المصب الذي ينظمه STAT5، استخدمنا الفئران Stat5fl/fl Ncr1-iCre (يشار إليها فيما يلي باسم الفئران Stat5ΔNK)، حيث يتم حذف STAT5 على وجه التحديد في خلايا NK الماوس (Wiedemann et آل، 2020).

لقد تعاملنا مع خلايا الطحال NK من الفئران Stat5WT و Stat5ΔNK باستخدام IL -15. لقد وجدنا أن YTHDF2 انخفض بشكل كبير في خلايا NK من الفئران Stat5ΔNK مقارنةً بخلايا NK من الفئران Stat5WT في كل من مستويات الحمض النووي الريبي (RNA) ومستويات البروتين (الشكل 6 وB وC؛ والشكل S4 وC وD).

أظهر اختبار مراسل Luciferase أن كلا من STAT5a وSTAT5b قاما بتنشيط النسخ الجيني Ythdf2 مباشرة (الشكل 6 وD وE). أظهرت نتائج الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) – qPCR أن STAT5 لديه إثراء كبير في أربعة مواقع على التحكم IgG الطبيعي، مما يشير إلى الارتباط المباشر في خلايا NK الماوس (الشكل 6 F). توضح نتائجنا معًا أن تعبير YTHDF2 يتم تنظيمه بواسطة STAT5 في اتجاه مجرى إشارة IL-15 في خلايا NK.

ثم تساءلنا عما إذا كانت خلايا NK الناقصة في Ythdf2-معيبة في استجابتها لـ IL-15. قمنا بعزل خلايا NK الطحالية من فئران Ythdf2ΔNK وفئران Ythdf2WT وقمنا بتربيتها في المختبر في وجود IL -15. لقد وجدنا أن نمو الخلايا NK انخفض بشكل ملحوظ في الفئران Ythdf2ΔNK مقارنة مع الفئران Ythdf2WT (الشكل 6 G). أظهرت مقايسة وضع العلامات على CellTrace Violet (CTV) أن تكاثر خلايا NK كان ضعيفًا بسبب نقص Ythdf2 (الشكل 6 H).

 كشف تحليل توزيع دورة الخلية عن زيادة كبيرة في نسبة خلايا NK من الفئران Ythdf2ΔNK في المرحلة G 0 / G1 ولكن هناك انخفاض كبير في نسبة خلايا NK من الفئران Ythdf2ΔNK في المرحلة S (الشكل 6 I)، مما يشير إلى أن نتائج نقص Ythdf2 في اعتقال المرحلة G 0 / G1 في خلايا NK.

بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك زيادة بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف في خلايا موت الخلايا المبرمج (الملحق V + Sytox-Blue +/−) من الفئران Ythdf2ΔNK مقارنة بتلك الموجودة في الفئران Ythdf2WT (الشكل 6 J) ، مما يشير إلى البقاء المعيب لخلايا NK بعد فقدان Ythdf2. تشير هذه النتائج إلى أن YTHDF2 ينظم استجابة خلايا NK لـ IL-15 في المختبر. نظرًا لأن IL-15 تتم ترجمته وإفرازه بشكل سيئ في الجسم الحي في حالة مستقرة (Corbel et al., 1996; Fehniger et al.,2001)، لاستكشاف ما إذا كانت خلايا NK الناقصة لـ Ythdf2- معيبة في استجابتها إلى IL-15 في الجسم الحي، تعاملنا مع الفئران باستخدام IL-15.

لقد وجدنا أن خلايا Ythdf2- الناقصة مقابل خلايا WT NK أظهرت انخفاضًا ملحوظًا في تكاثر الخلايا وزيادة في موت الخلايا المبرمج عندما عولجت الفئران بـ IL-15 (الشكل 6 K؛ والشكل S4، E–J). هذه البيانات تشير إلى أن YTHDF2 ينظم استجابة خلايا NK لـ IL-15، خاصة في بعض الظروف ذات المستوى العالي من IL-15. لقد وجدنا أيضًا أن مستويات mRNA والبروتين لـ IFN- و granzyme B و perforin قد انخفضت بشكل ملحوظ في خلايا Ythdf2ΔNK NK مقارنة بخلايا Ythdf2WT NK استجابةً لـ IL-15 (الشكل 6، L–N)، مما يشير إلى أن YTHDF2 يساهم أيضًا في وظائف المستجيب لخلايا NK بوساطة IL-15 في المختبر.

بشكل جماعي، توضح بياناتنا أن YTHDF2 مطلوب من أجل بقاء خلايا NK بوساطة IL-15 وانتشارها ووظائف المستجيب. بعد ذلك، قمنا بالتحقق من آليات المصب التي ينظم YTHDF2 من خلالها بقاء NK بوساطة IL-15 وانتشارها ووظيفة المستجيب. لقد وجدنا أن خلايا NK من الفئران Ythdf2ΔNK والفئران Ythdf2WT لها مستويات مماثلة من مستقبلات IL-15 CD122 (IL-15R ) وCD132 (IL-15R c؛ الشكل S4 K). يتم التوسط في إشارات IL-15 من خلال ثلاثة مسارات إشارات على الأقل في خلايا NK: Ras-Raf-MEK-ERK وPI3K-AKT-mTOR وJAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al.، 2014).

لاستكشاف مسار الإشارة الذي ينظمه YTHDF2 في خلايا NK، قمنا بفحص مستويات الفسفرة في خلايا ERK وAKT وS6 وSTAT3 وSTAT5 في NK من فئران Ythdf2ΔNK أو فئران Ythdf2WT بعد التحفيز باستخدام IL-15.

أظهرت النتائج أن نقص Ythdf2 لم يؤثر على فسفرة ERK وAKT وS6 وSTAT3 عند تحفيز IL-15 (الشكل S4 وL وM) ولكنه أعاق بشكل كبير تنشيط STAT5، كما يتضح من انخفاض مستويات الفسفرة STAT5 في Ythdf{{ 7}} خلايا NK الناقصة عن تلك الموجودة في خلايا NK من الفئران Ythdf2WT (الشكل 6 O)، مما يشير إلى أن YTHDF2 مطلوب من أجل الإشارة المثلى IL-15/STAT5 في خلايا NK المنشطة.

نظرًا لأننا أظهرنا أن STAT5 المفسفر في اتجاه مجرى IL-15 يرتبط بمروج Ythdf2 (الشكل 6، D–F)، وأظهرنا هنا أن YTHDF2 مطلوب من أجل فسفرة STAT5 الأمثل، تشير بياناتنا إلى حلقة ردود فعل إيجابية من STAT5 – YTHDF2 في اتجاه مجرى النهر من IL -15 التي قد تتحكم في بقاء الخلايا القاتلة الطبيعية وانتشارها ووظائف المستجيب.

يحدد التحليل على نطاق النسخ Tardbp باعتباره هدف YTHDF2 في خلايا NK

لمعالجة الآلية الجزيئية التي ينظم YTHDF2 من خلالها خلايا NK، أجرينا أولاً تسلسل الحمض النووي الريبي (seq) في خلايا Ythdf2WT وYthdf2ΔNK NK الموسعة. أدى حذف Ythdf2 في خلايا NK إلى 617 جينًا معبرًا عنها تفاضليًا، بما في ذلك 252 جينًا منتظمًا و365 جينًا منظمًا (الشكل S5 A).

أظهر تحليل علم الجينات (GO) أن الجينات المعبر عنها تفاضليًا تم إثراءها بشكل كبير في العمليات المرتبطة بدورة الخلية، وتقسيم الخلايا، وانقسام الخلايا، بما في ذلك الانقسام الخيطي، وفصل الكروموسوم، والمغزل، والجسيم النووي، والجسم الأوسط، والكروموسوم (الشكل 7). أ).

أظهر تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) إثراءًا كبيرًا لأهداف E2F ومجموعات الجينات المميزة للمغزل الانقسامي G2 / Mcheckpoint في خلايا Ythdf2ΔNKNK (الشكل S5 B). انخفضت الجينات المرتبطة بالدورة الخلوية والانقسام الخلوي، بما في ذلك Aurka وAurkb وCdc20 وCdc25b وCdc25c وCdk1 وE2f2 وPlk1 (Bertoli et al.، 2013)، بشكل ملحوظ في خلايا NK من الفئران Ythdf2ΔNK (الشكل 7 ب). ).

تم أيضًا تنظيم جينات الفصل المغزلي والكروموسوم مثل Anln و Aspm و Birc5 و Bublb و Cenpe و Esco2 و Ska1 و Ska3 و Tpx2 (Gorbsky، 2015) بشكل كبير في خلايا NK من الفئران Ythdf2ΔNK مقارنة بخلايا NK من Ythdf2WTmice (الشكل 7 C).

بالإضافة إلى ذلك، انخفضت جينات بقاء الخلية، بما في ذلك Birc5 (Niu et al.، 2010)، وSeptin4 (Larisch et al.، 2000)، وRffl (Yanget al.، 2007)، بشكل ملحوظ في خلايا NK من الفئران Ythdf2ΔNK (الشكل 1 أ). 7 د). تم أيضًا تنظيم جينات وظيفة المستجيب لخلايا NK، بما في ذلك Klrk1 وNcr1 وCD226 وGzma (Bezman et al.، 2012)، بشكل كبير في خلايا NK من الفئران Ythdf2ΔNK (الشكل 7 د).

تدعم هذه البيانات أدوارنا المميزة لـ YTHDF2 في تنظيم وظائف تكاثر خلايا NK والبقاء على قيد الحياة والمستجيب. ثم أجرينا m6A-seq في خلايا NK الموسعة IL-2 من الفئران Ythdf2WT وYthdf2ΔNK. أظهر تحليل المكون الرئيسي أن ثلاث مكررات بيولوجية من كل نمط وراثي متجمعة معًا (البيانات غير معروضة)، مما يشير إلى إمكانية تكرار جيدة لعينات m6A-seq.

حدد التحسين الهندسي الفائق لتحليل إثراء الحافز (HOMER) فكرة الإجماع m6A (GGAC)، مما يشير إلى الإثراء الناجح للنصوص المعدلة بـ m6A (الشكل 7 E). تم تحديد موقع تعديلات m6A في الغالب في نصوص ترميز البروتين، وتم إثراء القمم في 59 منطقة غير مترجمة (UTR) و39UTR، خاصة حول كودونات البداية والتوقف (الشكل 7 F والشكل S5 C).

كشف تحليل GO التخصيب للجينات ذات قمم m6A أن معظم النصوص التي تحمل علامة m6A في خلايا NK تم إثراءها في المسارات المرتبطة بدورة الخلية وتكاثر الخلايا (الشكل S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com