تتحكم المكثفات التي ينظمها الثيفلافين في التحكم في التوازن المعوي مع ذبابة الفاكهة والشيخوخة الجزء 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

خلفية:يعد التليف أحد أكثر السمات المرضية شيوعًا لعملية شيخوخة الكلى ، كما يؤدي التليف في الشيخوخة إلى تفاقم مرض الكلى المزمن (CKD). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata ، CF) هو دواء نباتي شائع الاستخدام في الفولكلور الصيني. ومع ذلك ، فقد أبلغت دراسات قليلة عن آثاره الدوائية. هدفت هذه الدراسة إلى استكشاف تأثير مستخلص إيثانول التليف الكيسي على التليف الكلوي في فئران SAMP8 وتحديد المركبات النشطة المحتملة.

طُرق:تم استخدام 8 المعرضة للشيخوخة (SAMP8) المعجل بالماوس كنماذج حيوانية ، وتم إعطاء جرعات مختلفة من التليف الكيسي عن طريق التزقيم لمدة شهر واحد. لمراقبة درجة الشيخوخة الكلوية في الفئران باستخدام تلطيخ الجالاكتوزيداز. تم استخدام تلطيخ ماسون ومستويات التعبير عن Col-lI و a-SMA و FN لتقييم التليف الكلوي في الفئران. تم قياس مستويات التعبير البروتيني لمسار Nrf2 ومسار Wnt / -catenin / RAS في الكلى. وقد تسبب -galactosidase (-gal) في إحداث خلايا NRK -52 E كنموذج في المختبر لفحص المكونات النشطة لـ CF.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

نتائج:أدى مستخلص الإيثانول CF إلى تثبيط نشاط الجلاكتوزيداز الكلوي ومستويات التعبير عن الفئران Coll و a-SMA و FNin SAMP8 ، وتحسين تلطيخ ماسون في الفئران SAMP8. خفض التليف الكيسي بشكل ملحوظ البروتين البولي والكرياتينين ونتروجين اليوريا ومستويات مصل TNF-a و IL -1 في الفئران SAMP8 ، وزاد بشكل ملحوظ مستويات SOD و GSH-Px. علاوة على ذلك ، قام CF بتنشيط مسار Nrf2 وسد مسار Wnt / -catenin / RAS في كليتي الفئران. بالإضافة إلى 3 ، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل إيثانول (SDC -0-14 ، 16) و (3 ، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل إيثانول -8- O - [4- O-trans -caffeoyl - - D-apiofuranosy- (1 → 3) - - D-glucopyranosyl (1 → 6)] - - D-glucopyranoside (SDC -1-8) تم عزله من CF ، مما قلل من شيخوخة الخلايا E NRK -52 ، وربما تلعب المكونات النشطة للتليف الكيسي دورًا في مكافحة الشيخوخة.

الاستنتاجات:أوضحت تجاربنا أن مستخلص إيثانول CF قد يحسن التليف الكلوي في فئران SAMP8 عبر مسار Wnt / -catenin / RAS. وقد تكون SDC -0-14 و 16 و SDC -1-8 هي الأساس المادي للتليف الكيسي لممارسة التأثيرات المضادة للشيخوخة الكلوية ذات الصلة.

الكلمات الدالة:الشيخوخة ، Corallodiscus flabellata ، الكلى ، التليف الكلوي ، SAMP8 ، الشيخوخة ، Wnt / -catenin / RAS

مقدمة

يتزايد الانتشار العالمي لمرض الكلى المزمن (CKD) مع تقدم العمر ويشكل عبئًا كبيرًا على المجتمع [1-3]. أكثر المظاهر المرضية شيوعًا لمرض الكلى المزمن هو شكل من أشكال التليف الكلوي [4]. وبالمثل ، يعد التليف الكلوي أيضًا أحد علامات شيخوخة الكلى [2]. أظهرت الدراسات أن الإجهاد التأكسدي ، والالتهاب ، و Wnt / -catenin ، ونظام الرينين-أنجيوتنسين-الألدوستيرون (RAS) ، وإشارات الراباميسين (mTOR) كلها مرتبطة بمرض الكلى المزمن الناجم عن الشيخوخة [5]. يرتبط التليف الكلوي في الكلى المسنة ارتباطًا وثيقًا بتنشيط مسار إشارات Wnt / -catenin و RAS [6]. عند تنشيط Wnts ، يتم نقل -catenin في السيتوبلازم إلى النواة ، حيث يرتبط بعامل ربط المحسن اللمفاوي (LEF) / عائلة عامل نسخ T-cell (TCF) ويبدأ نسخ الجينات المستهدفة في المصب. ومن المثير للاهتمام أن منطقة المروج لجين RAS تحتوي أيضًا على مواقع ربط LEF / TCF ، والتي تسمح لـ -catenin بتعزيز ارتباط LEF -1 بهذه المواقع [7].cistanche الكوليسترول ،لذلك ، فإن استهداف مسار إشارات Wnt / -catenin / RAS يمكن أن يكون استراتيجية علاجية محتملة للتليف الكلوي [8،9]. في السنوات الأخيرة ، جذب العلاج البديل للتليف الكلوي بالمنتجات الطبيعية انتباه العديد من العلماء [10] . وجد Xiaoyan Shen وزملاؤه أن الجينسنوسيد Rgl يحسن التليف الكبيبي أثناء شيخوخة الكلى عن طريق تثبيط تنشيط NLRP3 الالتهاب في الفئران SAMP8 [11]. استكشفت هذه الدراسة تأثير مستخلص C. flabellate (CF) على التليف الكلوي في فئران SAMP8 من مسار Wnt / -catenin / RAS.

يمكن لمكافحة الشيخوخة

تم تسجيل CF كنبات طبي في الصين لأول مرة في "Dian Nan Ben Cao. يستخدم النبات بأكمله بشكل شائع لعلاج الزحار وسرعة القذف ومرض الحويصلة المنوية وأمراض الكلى في مناطق الأقليات العرقية في الصين [12]. في الوقت الحاضر ، هناك عدد قليل من التقارير حول التليف الكيسي في الأبحاث الحديثة. وجدت الدراسات الدوائية في مختبرنا أن مستخلص التليف الكيسي له تأثيرات مدر للبول ويحسن عديد السكاريد الدهني / د-غالاكتوزامين بفشل الكبد وتلف الدماغ في الفئران [13 ، 14]. ودراسات كيميائية نباتية على كشفت أن جليكوسيدات الفينيثانويد والفلافونويد كانت المكونات الكيميائية الرئيسية للتليف الكيسي [15،16]. وكان الهدف من هذه الدراسة هو التحقق من تأثير مستخلص التليف الكيسي على التليف الكلوي في فئران SAMP8 وتوضيح الآلية الممكنة ، وذلك لتوفير الدليل التجريبي لعلاج أمراض الكلى مع التليف الكيسي الموصوف في الكتب القديمة.

المواد والأساليب

جمع واستخراج المادة النباتية

سجل "يوننان للأدوية العشبية الصينية" إمكانية حصاد التليف الكيسي على مدار العام. تم حصاد نباتات التليف الكيسي المستخدمة في هذه التجربة في مقاطعة Xixia ، مقاطعة Henan ، الصين في سبتمبر. تم التعرف عليها من قبل البروفيسور Suiqing Chen من جامعة Henan للطب الصيني ، وتم تخزين العينات في مكتبة عينات المختبر.الآثار الجانبية cistanche الصحراءتمت إعادة تدفق النباتات (1 كجم) باستخدام 50 بالمائة من الإيثانول (3 × 12 لتر ، كل ساعة واحدة) ، وتم ترشيح الخليط باستخدام 16 طبقة من الشاش. تم تجفيف نواتج الترشيح المجمعة بالتبخير الدوراني باستخدام مجفف بالتجميد. أخيرًا ، كانت النسبة المئوية لإنتاج 50 بالمائة من مستخلص خام الإيثانول من CF كانت 15.5 بالمائة. يُحفظ المستخلص المجفف في الثلاجة لحين استخدامه مرة أخرى. تسرد المواد التكميلية البيانات ذات الصلة بتسمية مكونات مستخلص التليف الكيسي.

تم استخدام عملية فصل أخرى تم الإبلاغ عنها سابقًا في هذه الدراسة للحصول على جزء شطف الماء و 20 بالمائة جزء شطف الإيثانول و 30 بالمائة جزء شطف الإيثانول و 40 بالمائة جزء شطف الإيثانول من CF [13]. تم فصل جزء الإيثانول بنسبة 40 بالمائة باستخدام Sephadex LH -20 وعمود هلام السيليكا وتنقيته بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء شبه تحضيرية (HPLC) للحصول أخيرًا على مركبات مثل SDC -0-14 ، 16 ، SDC { {10}} ، SDC -0-60 (كحول بنزيل هيدروكسي).

الحيوانات والإدارة

تم استخدام SAMP8 الذكور البالغ من العمر ستة أشهر والفئران المقاومة للشيخوخة (SAMR1) من أول مستشفى تابع لجامعة تيانجين للطب الصيني التقليدي (تيانجين ، الصين) في هذه الدراسة. تم إيواء الحيوانات في ظروف الإضاءة الخاضعة للرقابة (12- دورة الضوء / الظلام) ودرجة الحرارة (23-25 درجة مئوية) والرطوبة (45-55 بالمائة) وتلقت نظامًا غذائيًا قياسيًا وإعلانًا عن الماء الشهرة. تم تقسيم ما مجموعه 48 فأرًا من SAMP8 إلى أربع مجموعات تجريبية (ن =12 / مجموعة): الفئران النموذجية SAMP8 (M) ، الفئران SAMP8 المعالجة بمستخلص CF الإيثانول بجرعة منخفضة (CF-L ، 387.5 مجم / كجم ، داخل المعدي) ، الفئران SAMP8 المعالجة بمستخلص CF-M ، 775 مجم / كجم ، داخل المعدة بجرعة متوسطة من الفئران المعالجة باستخراج الإيثانول CF-H (CF-H ، 155 0 مجم / كجم ، داخل المعدة). عولجت الفئران في مجموعة التحكم SAMRI (Con، n =10) ومجموعات نموذج SAMP8 (M) بمحلول ملحي فسيولوجي (0.9 بالمائة). تم علاج جميع الفئران عن طريق الفم لمدة شهر واحد. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة Henan للطب الصيني وتم إجراؤها وفقًا للإرشادات المؤسسية (Henan ، رقم الموافقة الصيني: HACTCM -2018009060-19). أثناء التجربة ، كان هناك موت واحد للفأر في كل مجموعة من مجموعات Con و M ، وتوفي اثنان من الفئران في مجموعة CF-H.

جمع العينات

في نهاية التجربة ، تم إيواء الفئران بشكل فردي في أقفاص استقلابية 12- من المجموعات البولية. ثم تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين ، وتم جمع عينات الدم من خلال النزيف المداري. تمت إزالة الكليتين من كل فأر جراحيًا وحفظهما عند 80 درجة حتى التحليلات.

زراعة الخلايا والدراسة في المختبر

NRK {0}} الخلايا E التي تم شراؤها من البنك الخلوي التابع للأكاديمية الصينية للعلوم (شنغهاي ، الصين) تمت تربيتها للتحقيق في تأثير مستخلص CF على شيخوخة الخلايا التي يسببها D-galactose (D-gal، S11050، Yuanye، شنغهاي، الصين). نمت خلايا NRK -52 E في تعديل Dulbecco لمتوسط ​​Eagle's Dulbecco (DMEM ، 12100،046 ، Thermo Fisher ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) مزودًا بنسبة 10 في المائة من مصل بقري جنيني في حاضنة عند 37 درجة مئوية وبحضور 5 في المائة ، تمت زراعة خلايا أول أكسيد الكربون في 96- ألواح الآبار أو 6- ألواح الآبار إلى التقاء 80-85 بالمائة ثم تمت معالجتها بوسائط نمو تحتوي على تركيبات دوائية مختلفة: Media plus D-gal ( 20 مجم / مل） ، Media plus D-gal plus CF 10 ، 25،50 ، 100 ميكروغرام / مل） أو ميديا ​​بالإضافة إلى D-gal بالإضافة إلى مركب أحادي 10 ميكرومتر） على التوالي لمدة 48 ساعة. MTT) للكشف عن حيوية الخلية ، وتم استخدام تلطيخ الجالاكتوزيداز لمراقبة شيخوخة الخلية.

تلطيخ الجالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة

الكلى المجمدة من الفئران المقطعة إلى شرائح بسماكة 10- ميكرومتر وخلايا NRK -52 كانت ملطخة بالشيخوخة المرتبطة بالشيخوخة -Galactosidase (SA - - gal ، C0602 ، Beyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصين) باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة.

التحليل النسيجي

تم إصلاح أقسام الكلى بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد المخزن ، و 10- المقاطع المضمنة بالبارافين بسماكة ميكرون كانت ملطخة بثلاث ألوان ماسون (G1 0 06 ، الخدمة ، ووهان ، الصين) وتم ملاحظتها مجهريًا. تم قياس المناطق ذات اللون الأزرق في أقسام ماسون الملطخة بألوان ثلاثية الألوان بشكل كمي من ستة حقول تم اختيارها عشوائيًا وتم تحليلها بواسطة برنامج Image-Pro Plus 6.0.

القياسات البيوكيميائية

تم إذابة عينات متجانسة المصل والكلى إلى درجة حرارة الغرفة ، ومستويات ديسموتاز الفائق (SOD ، CSB-E08556 م ، ووهان هوامي ، ووهان ، الصين) ، الجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH-Px ، A 005-1-2 ، نانجينغ جيانتشنغ ، نانجينغ ، الصين) ، إنترلوكين -1 (إيل -1 ، RK00006 ، ABclonal ، ووهان ، الصين) ، عامل نخر الورم- (TNF- ، RK00027 ، ABclonal ، ووهان ، الصين) ، نيتروجين اليوريا (C { {10}} ، نانجينغ جيانتشنغ ، نانجينغ ، الصين) ، الكرياتينين (كر ، سي 011-2-1 ، نانجينغ جيانتشنغ ، نانجينغ ، الصين) في مصل الفأر ، إجمالي البروتين البولي (C 035-2-1 ، نانجينغ جيانتشنغ ، نانجينغ ، الصين) في بول الفأر ومستويات التعبير عن الكولاجين من النوع الأول (Col-I ، MU30364 ، Bio-Swamp ، ووهان ، الصين) ، أكتين عضلي ناعم (-SMA ، MU30359 ، Bio-Swamp ، ووهان ، الصين) ، فبرونيكتين (FN ، MU30179 ، Bio-Swamp ، ووهان ، الصين) في أنسجة الكلى للفأر تم قياسها بالتتابع وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة الفحص.

التحليل المناعي

تم إجراء التحليل الكيميائي المناعي باستخدام الطريقة الروتينية [17]. تضمنت الأجسام المضادة المستخدمة ما يلي: Wnt4 (14371-1- AP ، Proteintech ، شيكاغو ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، -catenin (17565-1- AP ، Proteintech ، شيكاغو ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، النوع 1 من مستقبلات الأنجيوتنسين II (AGTR1 ، {{ 7}} AP ، Proteintech ، شيكاغو ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، عامل p-Nuclear erythroid 2- المرتبط بالعامل 2 (p-Nrf2، ab76026، Abcam، Cambridge، UK)، pc-Fos (ab27793، Abcam، Cambridge، UK) ) ، عامل نمو النسيج الضام (CTGF ، GB11078 ، الخدمة ، ووهان ، الصين). تمت ملاحظة المقاطع تحت المجهر (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان).جرعة cistanche redditقم بقياس المنطقة والكثافة البصرية المتكاملة (IOD) للمنطقة باستخدام تعبير تان باستخدام برنامج Image-Pro Plus 6. 0 وحساب متوسط ​​الكثافة البصرية (MOD ، MOD=IOD / area) لشبه -تحليل كمي.

تحليل لطخة غربية

تم إجراء اختبار لطخة ويسترن كما هو موضح في دراسة سابقة [18]. باختصار ، تم تجانس أنسجة الكلى في المخزن المؤقت للتحلل وقياسها باستخدام مجموعة اختبار بروتين برادفورد (AR0197 ، Boster Biological Technology ، ووهان ، الصين). ثم تم تعريض المتجانسات للرحلان الكهربائي للهلام دوديسيل كبريتات - بولي أكريلاميد الصوديوم ، وتم نقلها إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين ، وتم حظرها في محلول مانع للتسرب (4 في المائة من الحليب الجاف الخالي من الدسم) لمدة 90 دقيقة. تم تحضينها بعد ذلك بالأجسام المضادة الأولية (Wnt4 ؛ الرينين ؛ AGTR1 ؛ p-Nrf2 ؛ pc-Fos ؛ البروتين المرتبط بـ Kelch-like ECH 1 (Keapl ، GB11847 ، Service-bio ، ووهان ، الصين) ؛ -actin (AC026 ، Abclonal ، ووهان ، الصين) ؛ و glyceraldehyde -3- نازعة هيدروجين الفوسفات (GAPDH ، AC033 ، Abclonal ، ووهان ، الصين)) طوال الليل عند 4 درجات ، تليها حضانة بجسم مضاد ثانوي مترافق بحضور فلوني مناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة . تم فحص البروتينات ذات الأهمية باستخدام ماسح ضوئي Odyssey IR (LI-COR Biosciences ، نبراسكا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم قياس شدة الإشارة باستخدام برنامج Image Studio. تم تطبيع مستويات البروتين ضد -actin أو GAPDH.

تحليل UPLC-Q-TOF-MS لعينات الكلى

تم وزن الأنسجة الكلوية وتجانسها في محلول فسيولوجي بارد مثلج (وزن / حجم =1: 1). بعد ذلك ، تمت إضافة 1 مل من الأسيتونيتريل إلى 200 ميكرولتر من عينات تجانس الأنسجة ، متبوعًا بالاستخراج بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة. تم الطرد المركزي للمستخلص عند 12 و 000 جم و 4 درجة لمدة 10 دقائق. تم أخذ المادة الطافية في القارورة لتحليلها. تم إجراء الفصل الكروماتوغرافي على كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء (UPLC) (نظام Dionex UltiMate 3000 ، Thermo Scientific ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مع نظام LC الذي يشتمل على عمود RSLC 120 C18 2.2 ميكرون ، 2.1 × 100 مم ؛ الحرارية العلمية).فوائد استخراج cistancheتتكون الطور المتحرك من المذيب أ (أسيتونتريل) والماء مع {{0}}. 1٪ حمض الفورميك (ب). تم إجراء الفصل عن طريق شطف التدرج على النحو التالي: 10-70 بالمائة أ من 0 إلى 3 دقائق ، 70-78 بالمائة أ من 4 إلى 13 دقيقة ، 78-90 بالمائة أ من 14 إلى 15 دقيقة ، 90 بالمائة -10 بالمائة أ من 15 إلى 16 دقيقة ، 10 بالمائة أ من 16 إلى 20 دقيقة. كان حجم الحقن لعينة الاختبار 2 ميكرولتر. تم إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي （MS باستخدام مصدر ESI في ظل الظروف المنخفضة التالية: كان الجهد الشعري في الوضع الإيجابي 3.5 كيلو فولت ، وكان الجهد الشعري في الوضع السالب 3.2 كيلو فولت. كان ضغط البخاخات 2.0 بار ودرجة حرارة الغاز الجاف 230 درجة ومعدل التدفق 8 لتر / دقيقة.

تحليل احصائي

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}. 05 ؛ تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه للمقارنة بين المجموعات. تم اعتبار قيمة AP الأقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

نتائج

حسن التليف الكيسي شيخوخة وتليف الكلى في SAMP8 الفئران

لاستقصاء تأثير التليف الكيسي على كليتي فئران SAMP8 ، تم قياس نشاط غالون SA - - في الكلى. في الشكل لا ، زاد نشاط SA - - في أنسجة الكلى بشكل ملحوظ في المجموعة M (التحسين الأزرق). أدت إدارة CF-L و CF-M إلى تثبيط نشاط -Galactosidase بشكل كبير في كليتي فئران SAMP8 بينما لم يكن التحسن بواسطة CF-H كبيرًا. أيضًا ، كان مؤشر الكلى للمجموعة النموذجية أقل بكثير من مؤشر المجموعة الضابطة (الشكل 1 ب ، P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

حسّن التليف الكيسي وظائف الكلى ، والإجهاد التأكسدي ، ومستويات الالتهاب في SAMP8 الفئران

إلى جانب ذلك ، تم اختبار مؤشرات وظائف الكلى لكل مجموعة من الفئران ، والتي تضمنت حجم البول في الفئران لمدة 12 ساعة ، ومستويات الكروم واليوريا في مصل الدم ، ومستويات بروتين البول. كما هو مبين في الشكل 2 أ-د ، كانت مستويات بروتين البول ومصل الكروم والنيتروجين في الدم في المجموعة النموذجية أعلى بكثير من تلك الخاصة بمجموعة التحكم (الشكل 2 أ ، ف.<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche جنكيز خانبعد ذلك ، تم استكشاف ما إذا كان التليف الكيسي يُعدّل بشكل مفيد الإجهاد التأكسدي والالتهاب في كليتي الفئران التي تتقدم في العمر بسرعة. كما هو مبين في الشكل 2e-h ، كانت مستويات SOD و GSH-Pxin في كليتي المجموعة M أقل بكثير من تلك الخاصة بمجموعة Con ، وكانت مستويات IL -1 أعلى بكثير من تلك الموجودة في مجموعة Con. بعد علاج التليف الكيسي ، تم تحسين المؤشرات المذكورة أعلاه ، وخاصة تأثير تحسين CF-L و CF-M أفضل.

قام التليف الكيسي بتنشيط مسار Nrf2 في كلية فئران SAMP8

تم قياس مستوى التعبير عن p-Nrf2 في أنسجة الكلى للتحقق مما إذا كان مسار Nrf2 متورطًا في التأثير الوقائي لـ CF (الشكل 3 أ-ج) في هذه الدراسة. انخفض مستوى التعبير عن p-Nrf2 بشكل ملحوظ في مجموعة SAMP8 وحدها (P.<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

خفف CF من تنشيط إشارات Wnt / -catenin / RAS في كلية فئران SAMP8

من أجل مزيد من استكشاف الآلية المحتملة للتليف الكيسي الذي يمارس تأثير مضاد التليف. تم إجراء توطين البروتين باستخدام الكيمياء المناعية. كما هو مبين في الشكل 4 أ ، مستوى التعبير عن Wnt4 و

- تم تحريض الكاتينين في الغالب في الخلايا الأنبوبية الكلوية. ولوحظت نتائج مماثلة عندما تم تقييم AGTR1 ، أهداف مسار المصب لإشارات Wnt (الشكل 4 أ). بعد ذلك ، تم تحديد مستوى التعبير البروتيني ، وأظهرت النتائج أن بروتينات Wnt4 و -catenin و renin و AGTR1 قد تراكمت في أنسجة الكلى للفئران في المجموعة النموذجية ، بينما منع CF بشكل كبير تلك التغييرات (الشكل 4 ب-و. ). علاوة على ذلك ، تم تحديد مستوى التعبير عن CTGF أيضًا وتحليله كميًا. تمشيا مع النتائج المذكورة أعلاه ، تم التعبير عن CTGF بشكل أساسي في الأنابيب الكلوية ، كما أدى التليف الكيسي إلى تثبيط نشاط CTGF بشكل ملحوظ (الشكل 4 د ز).

يمنع التليف الكيسي ومركباته شيخوخة الخلايا الإلكترونية NRK -52 التي يسببها D-gal

تم استخدام خلايا NRK المستحثة بـ D-gal -52 لفحص بعض المكونات النشطة في التليف الكيسي ، لتحديد الأساس المادي لعلاج الكلى الخرف عن طريق مستخلص التليف الكيسي. أظهرت النتائج أن التليف الكيسي عزز قابلية الخلية للبقاء بطريقة تعتمد على الجرعة والمركبات

كان لـ SDC -0-14 و 16 و SDC -1-8 المعزول عن التليف الكيسي تأثيرات أفضل على تكاثر الخلايا. إلى جانب ذلك ، أظهر 25 ميكروغرام / مل CF ومركبات SDC -0-14 و 16 و SDC -1-8 تأثير تثبيط نشاط -Galactosidase (الشكل 5).

تم إجراء تحليل CF المحسن لـ PCA لأنسجة الكلى في الفئران SAMP8 تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لاستكشاف تأثيرات CF على الفئران SAMP8. كما هو مبين في الشكل 6 أ ، كان هناك تجميع واضح بين مجموعتي التحكم والنموذج (R2X =0. 542 ؛ Q 2=0 .38) ، مما يشير إلى أن المستقلبات الذاتية للفئران SAMP8 كانت مختلفة عن SAMR1 الفئران ، مما يجعلها تنحرف عن مجموعة SAMR1. كما هو مبين في الشكل 6 ب ، تجمعت مجموعات CF المختلفة أيضًا في فئات مختلفة من مجموعات التحكم والنموذج ، واقتربت مجموعات CF من مجموعة التحكم ، مما يشير إلى أن

كانت المستقلبات الذاتية للفئران SAMP8 التي تدخلت في CF مماثلة لتلك الموجودة في الفئران SAMR1.

مناقشة

تلعب الشيخوخة دورًا مهمًا في تطور مرض الكلى المزمن [19]. مع تقدم تليف الكلى المزمن ، تفرز الخلايا المتشيخة العوامل المؤيدة للتليف وتفرزها (TGF- و CTGF وما إلى ذلك) والعوامل المسببة للالتهابات (IL -1 و IL -6 و TNF- وهكذا دواليك ) ، وهي عوامل النمط الظاهري إفرازية المرتبطة بالشيخوخة ، وبالتالي تسريع التليف الكلوي [20 ، 21]. في الوقت الحاضر ، حقق الطب الصيني التقليدي نتائج جيدة في علاج التليف الكلوي بآثار جانبية أقل [22]. استكشفت هذه الدراسة التأثيرات التدخلية لمستخلص التليف الكيسي على التليف الكلوي في الفئران SAMP8. كانت سلالة الفئران المختارة لهذه الدراسة هي SAMP8 ، والتي تم تطويرها بناءً على العمر والشيخوخة ودرجات التصنيف الظاهري المرضي لـ AKR / الفئران وكانت نموذجًا للشيخوخة المتسارعة من أصل وراثي فقط [23،24]. أظهرت الدراسات أن التغيرات في أمراض الكلى لدى فئران SAMP8 (9 أشهر) تشمل التليف النبيبي الخلالي وتصلب الكبيبات البؤري القطاعي [25]. وقد وجد أن التليف الكلوي في SAMP8 الفئران كان مرتبطًا بالعمر [6]. لذلك ، قمنا باختبار نشاط -galactosidase و

مستوى التليف الكلوي في فئران SAMP8 ووجد أن CF-L و CF-M يحسن نشاط التليف الكلوي و -Galactosidase في SAMP8 الفئران (الشكل 1). واختبرنا أيضًا إخراج البول من الفئران. تمشيا مع الدراسات المنشورة سابقًا التي تشير إلى أن التليف الكيسي الذي تم الحصول عليه من خلال عمليتين مختلفتين له تأثيرات مدر للبول [13] ، زاد المستخلص بشكل كبير من حجم البول لدى فئران SAMP8. أظهرت الدراسة الحالية أيضًا أن مكملات التليف الكيسي تحسن وظائف الكلى ونشاط إنزيمات مضادات الأكسدة ومستويات العوامل الالتهابية في فئران SAMP8 (الشكل 2).

حظي نظام Keap 1- Nrf2 باهتمام العديد من العلماء في السنوات الأخيرة نظرًا لخصائصه المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات. تمت دراسة إمكاناته الدوائية في علاج أمراض الكلى على نطاق واسع في الدراسات غير السريرية والسريرية [26]. Nrf2 هو منظم نسخ رئيسي للجينات المتعلقة بحالة الأكسدة والاختزال والتأثيرات المضادة للأكسدة [27]. أظهرت الدراسات أن الفسفرة مطلوبة لتنشيط Nrf2 وتحريض الجين المستهدف [28]. أدى تنشيط Nrf2 إلى تحسين تطور CKD عن طريق منع الإجهاد التأكسدي والحفاظ على توازن الأكسدة الخلوي [29]. كعامل نسخ رئيسي ، يلعب Nrf2 دورًا مهمًا في الدفاع ضد الإجهاد التأكسدي من خلال تنظيم مضادات الأكسدة وإنزيمات إزالة السموم [30]. كيم وآخرون. ذكرت أن ريسفيراترول ، كمنشط قوي لـ Nrf2 ، خفف من الإصابة الكلوية التقدمية المرتبطة بالشيخوخة [31]. في هذه الدراسة ، حسّن CF من توهين Nrf2 في كلية فئران SAMP8 دون التأثير على مستوى التعبير لـ Keapl ، مما يشير إلى أن مستخلص خام CF قد يحسن الضرر التأكسدي في الكلى عن طريق تنشيط مسار Nrf2 (الشكل 3).

يتميز التليف الكلوي بالترسب المفرط للمصفوفة خارج الخلية (ECM) مما يؤدي إلى تكوين ندبات في الحمة الكلوية [32]. يُعتقد أن عامل النمو المحول- (TGF-) هو السيتوكين الرئيسي في فرط نشاط الانفجار الليفي [33 ، 34]. بالطبع ، استهداف مسار إشارات TGF- فقط غير كافٍ لتقليل التليف الكلوي. أشارت بعض الدراسات إلى أن CTGF و Wnt / -catenin و renin-angiotensin system والإجهاد التأكسدي وما إلى ذلك ، كانت متورطة في التليف الكلوي [35-37]. Wnt / -catenin هو مسار إشارات محفوظ تطوريًا يشارك في تنظيم توازن الأنسجة ، وتطور الأعضاء ، وإصلاح الإصابة [38]. سيسترناس وآخرون ناقش التأثير المؤيد للتليف لإشارات Wnt في كل من العضلات والهيكل العظمي والكلى [39]. أثبتت الأدلة المتزايدة أن مسار إشارة Wnt / الكاتينين يلعب دورًا مهمًا في تنظيم تطور وتطور الآفات الليفية الكلوية بعد الإصابة [40-42]. تكون إشارة Wnt / -catenin صامتة نسبيًا في كليتي البالغين الأصحاء ويتم تنشيطها بمجرد تعرض الكلى لأنواع مختلفة من التلف [43].

في الثدييات ، تضم عائلة Wnt ما لا يقل عن 19 فردًا من أفراد الأسرة مهمين لنمو الكلى. وما لا يقل عن 15 من أفراد الأسرة هؤلاء يتم تنظيمهم بشكل تفاضلي في الكلى المسنة ، بما في ذلك Wnt4 [6]. أظهرت نتائج الدراسة الحالية أن مستوى التعبير عن بروتين Wnt4 في كليتي فئران SAMP8 كان أعلى بكثير من ذلك في فئران SAMR1 ، والذي تم التحقق منه بواسطة كل من اللطخة الغربية والتحليلات الكيميائية المناعية (الشكل 4 أ ، د ، و). من قبيل الصدفة ، تم أيضًا تنظيم مستوى التعبير عن بروتين الكاتينين. أيضًا ، تم التعبير عن كل من Wnt4 و -catenin في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية ، كما يتضح من التحليل الكيميائي المناعي (الشكل 4 أ و و). تسبب Wnt / -catenin في التليف الكلوي عن طريق تحفيز العديد من الجينات الليفية مثل مكونات RAS ومصفوفة metalloproteinase -7 (MMP -7) ومثبط منشط البلازمينوجين 1 (PAI -1) وحلزون [37 ]. تشو وآخرون. وصف Wnt / -catenin بأنه المنظم الرئيسي المنبع ، والذي يتحكم في التعبير عن جميع مكونات RAS المختبرة في الكلى [44]. استخدم زو وزملاؤه نموذجًا لاستئصال الكلية 5/6 (5/6 NX) لإظهار مستويات التعبير عن المكونات الرئيسية لـ RAS في الدماغ والكلى ، مثل مولد الأنجيوتنسين ، والإنزيم المحول للأنجيوتنسين ، والأنجيوتنسين II AT {{25. }} تم تنظيمه بشكل كبير. تم تثبيط مستوى التعبير المنتظم بواسطة مانع مركزي لـ Wnt ، والذي كان ناقلًا للفيروس مرتبطًا بالغدة يفرط في التعبير عن جين DKK1 [45]. وبالمثل ، وجدت الدراسة الحالية أنه لا يزال يتم التعبير عن AGTR1 في الظهارة الأنبوبية الكلوية ، وأن مستويات التعبير عن الرينين و AGTRl في أنسجة الكلى لدى فئران SAMP8 كانت أكبر بكثير من تلك الموجودة في الفئران SAMR1 (الشكل 4 أ و دج). أشارت هذه النتائج إلى أن مسار إشارات Wnt / -catenin / RAS قد تم تنشيطه في كليتي فئران SAMP8 ، وقد منع التليف الكيسي بشكل فعال تنشيط هذا المسار.

يمارس CTGF وظائف بيولوجية متعددة ، بما في ذلك تعزيز انقسام الخلايا الكيميائية ، والحث على الالتصاق ، وتعزيز تكاثر الخلايا وتوليف ECM [35 ، 46]. قام CCN2 (CTGF) بتشكيل إشارات Wnt عن طريق الارتباط بالبروتين المرتبط بمستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة 5/6 (LRP5 / 6) لمزيد من التوسط في التليف [39 ، 47]. استخدمت دراسات أخرى إسكات الجينات لاكتشاف وتأكيد أن Nrf2 ينظم مسار Wnt من خلال تنظيم مستوى التعبير عن CTGF ، مما يؤثر على اضطراب الخلالي الكلوي. أيضًا ، نظم Nrf2 مستوى نسخ CTGF بشكل أساسي عبر منظم النسخ CTGF c-Fos [48]. أظهر التحليل الكيميائي المناعي أنه تم التعبير عن CTGF و pc-Fos بشكل رئيسي في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية ، كما تم توزيع PC-Fos في الكبيبات. أظهر التحليل الكمي أن مستويات التعبير عن كلا البروتينين تم تثبيتها بواسطة CF (الشكلان 3 ب و هـ و 4 أ و ج). أخيرًا ، تم استخدام تحليل PCA للتحقق بشكل أكبر من أن CF يحسن تلف الكلى في فئران SAMP8 (الشكل 6). قدمت الدراسة الحالية دليلًا على أن CF لم ينشط إشارات Nrf2 فحسب ، بل اعتمد أيضًا على Nrf2 لموازنة الإجهاد التأكسدي والالتهاب ، وتثبيط إشارات Wnt / -catenin / RAS ، وتحسين شيخوخة الكلى والتليف الكلوي. ومع ذلك ، وجدنا أيضًا تحسنًا غير متسق في تأثير CF على تلطيخ Masson و SA - - في هذه التجربة. من المتوقع أن يكون هذا بسبب التقدم غير المتسق للشيخوخة الكلوية والتليف الكلوي في SAMP8 الفئران. قد تكون درجة الشيخوخة الكلوية في الفئران في هذه التجربة أكثر خطورة من التليف. لذلك ، لم يكن التأثير المحسن لـ CF-H على الشيخوخة الكلوية في فئران SAMP8 واضحًا مثل تأثير التليف الكلوي.

يستخدم D-galactose على نطاق واسع في العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر في الجسم الحي وفي المختبر ، باعتباره أحد السكريات الأحادية المختزلة. وجد أن D-gal يسبب الشيخوخة والإصابة في NRK -52 الخلايا E [49] ، ويؤدي إلى شيخوخة الخلايا الطلائية الأنبوبية القريبة للكلية البشرية (خلايا HKC -8) ، ويزيد من مستويات التعبير عن اثنين من الخلايا الكلوية بروتينات علامة التليف FN و a-SMA [6]. في هذه الدراسة ، تم استخدام D-gal لتحفيز خلايا NRK -52 E في المختبر. باستخدام مقايسة MTT وتلطيخ -Galactosidase للكشف عن المركبات المعزولة من CF ، وجد أن SDC -0-14 و 16 و SDC -1-8 عززت قابلية بقاء الخلية التي يسببها D-gal وتمنع D-gal المستحث شيخوخة الخلية (الشكل 5). تشير هذه النتائج إلى أن SDC -0-14 و 16 و SDC -1-8 قد تكون الأساس المادي لتليف الكيسي لتأخير شيخوخة الكلى. SDC -1-8 هو واحد من جليكوسيدات فينيلثانويد. تم العثور على جليكوسيدات الفينيثانويد لإطالة عمر Caenorhabditis Elegans [50] ، مع مكافحة الشيخوخة ، [51] وتأثيرات حماية الأعصاب [52-54]. توفر هذه التوجيهات لدراستنا المتابعة حول التأثيرات الدوائية للتليف الكيسي.

الاستنتاجات

في الختام ، أظهرت الدراسات التي أجريت في الجسم الحي أن التليف الكيسي يقلل من التليف الكلوي في الفئران المسنة. تم العثور على بعض المكونات النشطة المحتملة في التجارب المختبرية. قدمت هذه النتائج الدعم الدوائي لعلاج أمراض الكلى باستخدام التليف الكيسي واتجاهًا لمزيد من البحث حول المكونات النشطة للتليف الكيسي.

تم استخراج هذه المقالة من Cao et al. الطب التكميلي والعلاجات BMC (2022) 22:52