التأثير العلاجي للسيستانوسيد أ على استقلاب العظام في الفئران المستأصلة المبايض

1. مقدمة

أصبحت هشاشة العظام، وهي "القاتل الصامت" الجهازي للهيكل العظمي، خطراً صحياً كبيراً يصيب أكثر من 2000 مليون شخص في جميع أنحاء العالم في السنوات الأخيرة. ويتميز بانخفاض كثافة كتلة العظام (BMD) والتدهور المعماري الدقيق، والذي ينجم عن زيادة ارتشاف العظم على تكوين العظام، وفي النهاية يؤدي إلى كسر هشاشة العظام. في الوقت الحاضر، يعد تحديد العوامل التي تمنع التمايز العظمي والارتشاف هو الإستراتيجية الشائعة والناجحة لتطوير الأدوية العلاجية لهشاشة العظام، وهناك بالفعل العديد من العوامل الاصطناعية، بما في ذلك استراديول فاليرات وأليندرونات الصوديوم، التي يمكنهامنع وعلاج هشاشة العظام. ومع ذلك، فإن أدوية هذه الأمراض بعيدة كل البعد عن المثالية؛ بعض هذه الأدوية يمكن أن تزيد من خطر الإصابة بسرطان بطانة الرحم وسرطان الثدي ولها أيضًا درجة من الآثار الجانبية، مثل فرط كالسيوم الدم، فرط كالسيوم البول، وما إلى ذلك، مما يحد من تطبيقاتها السريرية. ولذلك، لأكثر من ألف عام، تم استخدام الأدوية الصينية التقليدية (TCM)، وخاصة الطب الصيني التقليدي الصالح للأكل مع المركبات النشطة بيولوجيا والأجزاء المعزولة، على نطاق واسع بأمان وفعالية في البلدان الآسيوية للوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها، بما في ذلك هشاشة العظام.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لعلاج ومنع مرض هشاشة العظام PHGS75% ECH 30% ACT 12%

تتميز هشاشة العظام بأنها ارتشاف عظمي معزز بسبب زيادة تكوين ناقضات العظم، وتنطوي هذه العملية على التزام حيدات المكونة للدم في سلائف ناقضات العظم، والتي تندمج لتشكل خلايا عظمية عظمية متعددة النوى تستهدف مواقع العظام التي تخضع لإعادة التشكيل [4]. منشط مستقبلات العامل النووي κB يجند (RANKL)، وهو عامل رئيسي يتم إفرازه من الخلايا العظمية، يحفز تمايز الخلايا الوحيدة إلى خلايا عظمية [8،9]. يؤدي تفاعل RANKL مع مستقبله RANK إلى سلسلة من الأحداث داخل الخلايا، بما في ذلك NF-κB وPI3K/Akt والكيناز المعتمد على الكالسيوم/الهالمودولين عن طريق تجنيد العامل المرتبط بمستقبل بروتين إشارة المحول TNF (TRAF6). ونتيجة لذلك، يتم تنظيم العديد من الجينات ذات الصلة بالناقضة العظم، بما في ذلك TRAP، وcathepsin K، وDPD، ويتم تسريع عملية ارتشاف العظم.

تتميز جليكوسيدات فينيليثانويد بحمض السيناميك وشظايا هيدروكسيل فينيل إيثيل المرتبطة بـ -جلوكوبيرانوز (الأبيوز، الجالاكتوز، الرامنوز، الزيلوز، إلخ) عبر رابطة جليكوسيدية، والتي يتم توزيعها على نطاق واسع في النباتات الطبية [10]. سيستانوسيد A (Cis A) نشطجليكوسيد فينيليثانويدفي Cistanche deserticola YC Ma. وفقا لسجل دستور الأدوية الصيني، تم استخدام C. deserticola تقليديا لعلاج نقص يين الكلى، وضعف العضلات، والضعف القطني، وما إلى ذلك، وجليكوسيدات الفينيليثانويد هي المكونات النشطة بيولوجيا الرئيسية في هذه العشبة [11]. واستنادًا إلى نظرية "الكلى" في الطب الصيني التقليدي، يمكن للكلية أن تتحكم في نظام العظام، مما يعني أن تطور العظام ووظائفها يعتمد على جوهر الكلى، ويمكن أن يتحول جوهر الكلى هذا إلى نخاع العظم لتغذية العظام. تعزيز نمو وإصلاح الهيكل العظمي وتقوية الهيكل العظمي[12]. وبما أن C. deserticola يمكن أن يقوي الكلى، فقد افترضنا أن Cis A يمكن أن يمنع ويعالج هشاشة العظام. ولذلك تم تصميم الدراسة الحالية للتحقق من صحة إمكاناتCis A في الوقاية من هشاشة العظامباستخدام نموذج الفئران المبيض، وتم تحديد علامات تكوين العظام وامتصاصها، بالإضافة إلى الآليات المحتملة ذات الصلة لتقدير النشاط الحيوي المضاد لهشاشة العظام لهذا العامل.

2. النتائج والمناقشة

2.1. نتائج

2.1.1. آثار Cis A على اختبار ثني العظام ثلاثي النقاط

ولتحليل ما إذا كان العلاج باستخدام Cis A يجعل العظام أقوى، قمنا بإخضاع عظام الفخذ لاختبار الانحناء ثلاثي النقاط. كما هو موضح في الشكل 1، كان الحمل الأقصى المطبق عند كسور العظام 21.5% و22.0% أعلى في الحيوانات المعالجة بـ 20 ملجم/كجم و80 ملجم/ كجم Cis A، على التوالي، مقارنة بالحيوانات الموجودة في مجموعة المبيض (OVX) (p < 0.05). وفي الوقت نفسه، أدى العلاج بـ Cis A أيضًا إلى تعزيز تصلب العظام. أظهرت جميع الفئران المعالجة بـ Cis A زيادة كبيرة في الصلابة ببيانات 121.0 ± 12.1 (p <0.05)، 124.1 ± 16.2 (p <0.05) و127.7 ± 9.6 (p <0.01)، على التوالي، بالمقارنة مع 102.2 ± 10.7 من الفئران OVX. تشير النتائج إلى أن زيادة قوة العظام في الفئران OVX المعالجة بـ Cis A كانت بسبب زيادة كمية العظام وتحسين جودة العظام.

2.1.2. آثار Cis A على البنية الدقيقة للعظام

تظهر البنية الدقيقة للعظام التربيقية ثلاثية الأبعاد للفئران المقاسة بالأشعة المقطعية الدقيقة (الشكل 2 والجدول 1) بشكل حدسي أن الفئران في مجموعة OVX قدمت انخفاضًا ملحوظًا في المنطقة التربيقية والعدد التربيقي عند مقارنتها بالمجموعة الوهمية، مما يشير إلى أن استئصال المبيض يمكن أن يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في كثافة كتلة العظام (BMD، −46٪)، ومحتوى المعادن في العظام (BMC، −66٪)، والمحتوى المعدني للأنسجة (TMC، −85٪)، وكسر حجم العظام (BVF، −82٪)، الرقم التربيقي (Tb. N, −76%) وزيادة في الفصل التربيقي (Tb. Sp, +80%) دون أي تعديل في إجمالي كثافة المعادن في الأنسجة (TMD) وسمك التربيق (Tb. Th) بعد عملية 12 أسبوعا. ومع ذلك، فإن الفئران OVX التي عولجت بـ Cis A أدت إلى زيادة كثافة المعادن بالعظام (+43%~57%)، وBMC (+65%~73%)، وTMC (+83%~) حسب الجرعة 90%)، BVF (+80%~88%)، انخفاض أكبر في السل. Sp (-79٪ ~ 88٪) ومزيد من Tb المحسن. N (+73%~82%) مقارنة بمجموعة OVX. يبدو أن TMD لم يتأثر باستئصال المبيض ولكنه زاد بشكل ملحوظ عن طريق العلاج باستخدام استراديول فاليرات (EV).

2.1.3. آثار Cis A على كل من تكوين العظام وعلامات الارتشاف

يظهر الشكل 3 تأثيرات Cis A على علامات ارتشاف العظم، بما في ذلك TRAP وDPD ومؤشر تكوين العظام Cathepsin K ALP وبروتين Gla العظمي (BGP). بعد 12 أسبوعًا من عملية استئصال المبيض، تظهر أنشطة TRAP وDPD ، وتم زيادة الكاثيبين K في مجموعة OVX بشكل ملحوظ، وخاصة DPD، الذي زاد بنسبة 55.6٪ تقريبًا؛ تم تعزيز TRAP وcathepsin K بنسبة 43.5% و38.1% على التوالي، مقارنةً بالمجموعة الوهمية. أظهر Cis A، الذي يتم تناوله عن طريق الفم لمدة 12 أسبوعًا، إمكانية ملحوظة في منع جميع علامات ارتشاف العظم المذكورة أعلاه، وخاصة الجرعة العالية (80 مجم / كجم) التي تظهر تأثيرًا كبيرًا على قمع أنشطة DPD بنسبة 45.0%، وTRAP بنسبة 49.0% وكاثيبسين K بنسبة 44.0%، على التوالي (p < 0.01)، مقارنةً بـ مجموعة OVX (الشكل 3). على الرغم من ظهور اتجاه متزايد لأنشطة ALP وBGP في مجموعة OVX، إلا أنه لم تلاحظ أي تغييرات ذات دلالة إحصائية. ومع ذلك، لوحظ تحسن كبير في نشاط ALP في المجموعات المعالجة بـCis A المنخفضة والعالية مقارنةً بالمجموعة الوهمية (P <0.01).

سيستانش توبولوسا الطبيعي للوقاية من أمراض هشاشة العظامPHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. تأثيرات Cis A على مستويات التعبير البروتيني لـ TRAF6 و NF-κB PI3K و Akt و OPG و RANKL

كشف تحليل اللطخة الغربية أنه بالمقارنة مع المجموعة الوهمية، زادت مستويات البروتين لـ TRAF6 وNF-κB وRANKL في مجموعة OVX بشكل ملحوظ (p < 0.05)، بينما OPG، انخفضت بشكل ملحوظ PI3K، وAkt (الشكل 4). Cis A (20 مجم/كجم أو 80 مجم/كجم) قلل بشكل كبير من تعبير TRAF6 (p <0.05)، متبوعًا بانخفاض تعبير RANKL وزيادة OPG، مما يعني أنه تم تنظيم نسبة OPG/RANKL. وبالتالي ، تم تنظيم شلالات الإشارة لـ NF-andB وتم تنظيم PI3K / Akt بواسطة علاج Cis A (P <0.05).

2.2. مناقشة

ونظراً للقيود المفروضة على الخيارات العلاجية الحالية لمرض هشاشة العظام، هناك حاجة إلى بدائل من الأغذية أو النباتات الطبية الطبيعية الصالحة للأكل. كجزء من جهودنا المستمرة لاكتشاف عوامل فعالة مضادة لهشاشة العظام من الطب الصيني التقليدي، وجدنا سلسلة من المستخلصات والكسور والمركبات التي تمتلك تأثير خصائص مضادة لهشاشة العظام [13،14]. يعتبر Cistanche deserticola أحد العلاجات التقليدية الهامة للطب الصيني التقليدي، والذي وجد أنه يتمتع بمواصفات أمان مناسبة [15] ووظائف طبية واسعة لعلاج قصور الكلى، وما إلى ذلك [16]. وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي، الطب الصيني التقليدي الذي يمتلك تأثير تنشيط الكلى عادةيستخدم لعلاج هشاشة العظام; جليكوسيدات الفينيليثانويد هي المكونات النشطة بيولوجيا الرئيسية في هذه العشبة، مما يعني ذلكجليكوسيدات فينيليثانويدالموجودة في C. deserticola قد تمتلك خاصية مضادة لهشاشة العظام. لقد ثبت أن مستخلص C. deserticola يمكن أن يمنع بشكل كبير انخفاض كثافة المعادن في العظام ويمنع تدهور البنية الدقيقة التربيقية الناجمة عن OVX [17]. في التجربة المختبرية، أدى أيضًا إلى زيادة كبيرة في ALP والبروتين التشكلي للعظام -2 وmRNA للعظم، بالإضافة إلى تمعدن العظام في الخلايا العظمية المستزرعة [18]. أظهر Echinacoside، وهو مكون نشط حيويًا رئيسيًا في C. deserticola والمسجل رسميًا في دستور الأدوية الصيني [11]، نشاطًا مضادًا لهشاشة العظام بجرعة عالية تتراوح من 30 إلى 270 ملجم/كجم من وزن الجسم يوميًا [19]، كما أظهرت النتائج المختبرية أنه يمكن أن يعزز تجديد العظام عن طريق زيادة حصة OPG / RANKL في خلايا MC3T 3- E1 Subclone 14 [20]. كان Cis A أحد جليكوسيدات فينيل إيثانول المعزولة من C. deserticola، وكشفت عدة تقارير أن هذا المركب يمتلك نشاطًا مضادًا للأكسدة [21] وخصائص مضادة للالتهابات [22،23]. اكتشفت ورقة بحثية منشورة مؤخرًا أن Cis A أظهر أنشطة وقائية على كل من CCl4 والتسمم الكبدي الناجم عن الكحول في الفئران، كما أظهر أيضًا خاصية وقائية على الضرر الناجم عن الإيثانول في خلايا الكبد الفأرية المستنبتة الأولية في المختبر [24]. في دراستنا الحالية، أظهرت النتائج أن Cis A يمتلك نشاطًا مضادًا لهشاشة العظام بجرعة منخفضة (20 ~ 80 مجم / كجم من وزن الجسم / يوم) باستخدام نموذج الفئران المستأصلة المبيض، وتم ممارسة هذا النشاط الحيوي عن طريق تقليل تنظيم مستوى TRAF6، وقمعه. التعبير عن RANKL و NF-κB وتحفيز OPG و PI3K و Akt، مما يعني أن التأثير العلاجي لـ Cis A في الفئران OVX كان من خلال آلية TRAF 6- بوساطة تعطيل NF-kappaB وتنشيط PI3K / Akt.

من المعروف أن استئصال المبيض يمكن أن يسبب هشاشة العظام مع انخفاض واضح في كثافة المعادن بالعظام، والقوة الميكانيكية الحيوية، ونوعية العظام، والبنية الدقيقة للعظام التربيقية، والتغيرات المذكورة أعلاه ترجع جزئيًا إلى نقص هرمون الاستروجين [25]. الآن، في تجربة الجسم الحي الحالية، توضح دراستنا أن هشاشة العظام الناجمة عن استئصال المبيض أدت إلى انخفاض كبير في القوة الميكانيكية الحيوية والمعلمات الهيكلية التربيقية، بما في ذلك BMD وBMC وTMC وTb. N، وزيادة السل. س. وعلاج Cis A أدى إلى تحسين الخواص الميكانيكية للعظام بشكل كبير بما في ذلك الحد الأقصى للحمل والصلابة، وتعزيز كثافة المعادن في العظام، وتحسين معظم المعلمات الهيكلية للهندسة المعمارية الدقيقة للتربيق العظمي مقارنة بالفئران في مجموعة OVX، مما يشير إلى أن Cis A كان فعالًا في تحسين جودة العظام. والبنية الدقيقة التربيقية في الفئران OVX.

إلى جانب إجمالي كثافة المعادن بالعظام، يمكن لاختبار الانحناء ثلاثي النقاط وقياس البنية الدقيقة للعظام التربيقية تشخيص هشاشة العظام بشكل مباشر، كما تم استخدام علامات تكوين العظام، بما في ذلك ALP وBGP، ومؤشر ارتشاف العظم، بما في ذلك TRAP وDPD وcathepsin K، لتشخيص هشاشة العظام. توضيح الآليات ذات الصلة المضادة لهشاشة العظام في Cis A. في دراستنا، أظهر نشاط ALP في فئران مجموعة OVX اتجاهًا متزايدًا غير ملحوظ، مما يشير إلى زيادة معدل دوران العظام [26،27] في هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث؛ أظهرت الجرعة العالية (80 مجم / كجم من وزن الجسم / يوم) والجرعة المنخفضة (20 مجم / كجم من وزن الجسم / يوم) من علاجات Cis A تحسنًا كبيرًا في نشاط ALP مقارنةً بالمجموعة الوهمية، في حين يبدو أن نشاط BGP لم يتأثر بـ استئصال المبيض في جميع المجموعات المعالجة؛ تمت زيادة TRAP وDPD وcathepsin K بشكل ملحوظ في مجموعة OVX، كما خفضت إدارة Cis A بشكل ملحوظ جميع علامات ارتشاف العظم الثلاثة. تشير البيانات المذكورة أعلاه إلى أن Cis A يمتلك نشاطًا محتملاً مضادًا لهشاشة العظام، وقد تم ممارسة هذا التأثير من خلال تنظيم استقلاب العظام، بما في ذلك قمع ارتشاف العظم وزيادة تكوين العظام.

يعد التنسيق بين بانيات العظم وناقضات العظم عاملاً حاسماً في الحفاظ على سلامة الهيكل العظمي. تلتصق الخلايا العظمية، التي تعبر عن TRAP، بسطح العظم من خلال تكوين مناطق مانعة للتسرب مرتبطة بالأكتين، والتي يتم من خلالها إطلاق الإنزيمات المحللة للبروتين، مثل كاثيبسين K، مما يؤدي إلى تكوين حفر الارتشاف. يتم تعديل تكوين الخلايا العظمية العظمية بواسطة الخلايا غير الناضجة من السلالة العظمية العظمية بواسطة RANKL وOPG [28]. OPG هو مستقبل خادع يمنع تنشيط RANKL لتكوين العظم، مما يقلل من ارتشاف العظم. RANKL، الذي يوفر إشارة مهمة لأسلاف ناقضات العظم، هو جزيء مرتبط بغشاء من عائلة يجند عامل نخر الورم الذي يشجع على تكوين الخلايا الآكلة. يُعتقد أن نسبة تعبير OPG/RANKL هي معلمة أساسية لنشاط تكوّن العظم، وتشمل شلالات الإشارة التي يتم تنشيطها بواسطة RANKL مسارات NF-κB وPI3K [29]. تتجلى أهمية مسار NF-inB في تكوين العظم العظمي من خلال حقيقة أن حذف NF-inB في الفئران أدى إلى عدم وجود خلايا عظمية ناضجة [30]. ثبت أن TRAF6 هدف واعد للأدوية الجديدة المضادة لهشاشة العظام. أظهرت الفئران التي تعاني من نقص TRAF 6- والتي تظهر خللًا في ترقق العظم وترقق العظم الشديد أهمية TRAF6 في استقلاب العظام. تشير الأدلة الناشئة إلى وظيفة تنظيمية مهمة لـ TRAF6 في شلالات الإشارات بوساطة RANKL/RANK [4،31]. أشارت بيانات الدراسة الحالية إلى أن علاج Cis A على الفئران OVX أدى إلى تقليل تنظيم مستويات التعبير البروتيني TRAF6، وانخفاض RANKL، وزيادة تعبيرات OPG وبالتالي منع تنشيط RANKL لـ NF-κB وتنشيط مسارات إشارة PI3K/Akt، مما يشير إلى أن Cis A يمنع تمايز الخلايا العظمية عن طريق تعطيل NF-kappaB بوساطة TRAF 6- وتنشيط PI3K/Akt وزيادة نسبة OPG/RANKL، وبالتالي تثبيط تكون الخلايا العظمية وتعزيز تكوين العظام.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لنشاط مضاد لهشاشة العظامPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. المواد والأساليب

3.1. المواد النباتية والتحضير والتصميم

ينبع Cistanche deserticolaتم جمع YC Ma، الذي حدده البروفيسور شيويه يان فو من قسم الصيدلة بجامعة نينغشيا الطبية، في 2 سبتمبر 15 في مقاطعة يونغنينغ بمقاطعة نينغشيا بالصين. تم حفظ عينة القسيمة (#20150901) في معشبة قسم الصيدلة. تم استخلاص ما مجموعه 30.0 كجم من السيقان المجففة بالهواء لـ C. deserticola باستخدام 70٪ من الإيثانول (180 لتر، 3 × 2 ساعة) 3 مرات. تم تجميع المرشحات وتعريضها لعمود راتنجي كبير المسام (AB-8) مع نظام مذيب متدرج تدريجي لزيادة الإيثانول في الماء (0%، 20%، 60%، كل 60 لتر) لإعطاء ثلاثة أجزاء، ثم تمت تنقية 60% من الجزء بشكل أكبر بواسطة Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co.، Uppsala، السويد) وكروماتوجرافيا سائلة شبه تحضيرية عالية الأداء (Agilent 1100، Agilent Technologies، Waldbronn، ألمانيا) للحصول على اللون الأصفر الشاحب سيستانوسيد A 4.5 جم (Cis A؛ كان العائد 0.015٪). تم توضيح الهيكل بشكل أساسي من خلال تحليلات بيانات الرنين المغناطيسي النووي (Bruker Avance، 400 MHz، ألمانيا) وأطياف MS (Agilent 6540، Agilent Technologies)، والتي كانت متسقة مع البيانات المبلغ عنها [19]. تم تحديد نقائه بواسطة طريقة تطبيع منطقة HPLC (الشكل 5). في التجارب على الحيوانات، بناءً على تجربتنا الأولية، كانت جرعة Cis A 20-80 مجم/كجم/يوم.

3.2. المواد الكيميائية والمذيبات

تم استخدام ما يلي: مجموعة استخراج البروتين الكلي ومجموعات تكميم البروتين BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd، Nanjing، China)، والأجسام المضادة الأولية لـ TRAF6 و NF-κB و PI3K و Akt و RANKL و OPG و -actin و tubulin ( تقنية تشوير الخلية، بيفرلي، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية)، الأجسام المضادة الثانوية لمضادات الأرانب IgG المرتبطة ببيروكسيداز الفجل (ZSGB-BIO، بكين، الصين)، استراديول فاليرات (1 مجم، Delpharm Lille SAS، باريس، فرنسا)، Bone Gla - الروابط المتشابكة للبروتين وديوكسيبيريدينولين مجموعات ELISA (شركة Xinyu Biological Engineering Co. Ltd.، شنغهاي، الصين) ومجموعة Cathepsin K ELISA (Biovision، Mountain View، CA، USA). جميع المواد الكيميائية والعوامل الكيميائية الحيوية الأخرى المستخدمة كانت عبارة عن كواشف من الدرجة التحليلية AR.

3.3. التجارب على الحيوانات

تم شراء 60 فأرًا من سلالة كونمينغ، عمرها 8 أسابيع ويبلغ وزن جسمها 26. 0 ± 1.62 جم، من جامعة نينغشيا الطبية، وتم الاحتفاظ بفئران واحدة 0 في قفص واحد مع اتباع نظام غذائي مختبري قياسي وماء الصنبور تحت ظروف يتم التحكم فيها بالهواء (24.0 ± 0.5 ◦ مئوية، ورطوبة 45%-50% و12 ساعة/12 دورة إضاءة داكنة فاتحة). بعد التأقلم لمدة أسبوع واحد، تم إجراء عملية جراحية تحت ظروف معقمة، وتم تخدير جميع الفئران باستخدام هيدرات الكلورال (100 ملغم / كغم، IP)؛ كانت الفئران التي خضعت للتعرض لعملية جراحية دون إزالة المبايض هي المجموعة الوهمية (ن=10)؛ تعرض الآخرون لاستئصال المبيض الثنائي كمجموعات OVX (ن=50). تم إجراء التجارب على الحيوانات المذكورة أعلاه وفقًا لدليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا بجامعة نينغشيا الطبية.

بعد فترة تعافي لمدة {{0}} أسبوع أخرى، تم تقسيم الفئران الـ 50 OVX المذكورة أعلاه عشوائيًا وبشكل متساوٍ إلى 5 مجموعات: تمت معالجتها عن طريق الفم باستخدام استراديول فاليرات (1 مجم / كجم / يوم) كعنصر تحكم إيجابي (EV)؛ مع 20 و40 و80 ملغم/كغم/يوم من Cis A كمجموعات جرعة منخفضة ومتوسطة وعالية، على التوالي؛ مع السيارة (0.5٪ كربوكسي ميثيل السليلوز () -Na) كمجموعة نموذجية (OVX). تم إعطاء جميع الفئران عن طريق الفم بكمية متساوية قدرها 1 مل/100 جرام من وزن الجسم، EV أو Cis A، والتي بدأت في الأسبوع الثاني بعد العملية واستمرت لمدة 12 أسبوعًا. تم قياس وزن الجسم كل أسبوعين، مع تعديل الجرعة وفقا لذلك. بعد آخر تناول عن طريق الفم، تم سحب عينات الدم من الشريان الفخذي للفئران المخدرة، وتم السماح لها بالتجلط، وطردها عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق لتوفير المصل؛ تم تشريح الفخذ الأيمن والساق. تم تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية لإجراء مزيد من التقييم للبنية الدقيقة للعظام والمعلمات الكيميائية الحيوية في الدم المرتبطة بهشاشة العظام.

3.4. اختبار الانحناء ثلاثي النقاط

تم تحديد الخاصية الميكانيكية الحيوية لعظم الفخذ الأيمن للفأرة باستخدام ترتيب الانحناء ثلاثي النقاط. تحتوي رقصة الانحناء على دعم على شكل حرف V لتأمين الأطراف البعيدة والدانية لعظم الفخذ أثناء الاختبار. تم وضع عظم الفخذ أفقيًا مع الجانب الأمامي للأعلى، وتم تطبيق الحمل للأسفل في وسط منتصف عظم الفخذ. كانت المسافة بين الدعامات 8 ملم. تم تحميل العظام بمعدل إزاحة ثابت قدره 0.02 مم / ثانية حتى الفشل باستخدام آلة اختبار BOSE (3220) (Bose Corporation، Endura TEC Systems Group، Minnetonka، MN، USA). تم الحصول على منحنيات إزاحة الحمل واستخدامها لحساب الخواص الهيكلية والمواد، بما في ذلك الحمل الأقصى، وذروة الحمل، ومعامل المرونة، وقوة الانثناء، وما إلى ذلك.

3.5. تحليل التصوير المقطعي المحوسب

تم تنظيف عظام الفخذ اليمنى لجميع الفئران من الأنسجة الرخوة الملتصقة، وتم تحديد البنية الدقيقة للعظم التربيقي للميتافيزيقيا الفخذية البعيدة اليمنى أعلاه بواسطة ماسح التصوير المقطعي المحوسب (eXplore Locus SP، GE Healthcare، London، ON، Canada) مع تم ضبط الدقة المتناحية على 8 ميكرومتر في الأبعاد المكانية الثلاثة. تم اختيار المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام نفس الإحداثيات في لوحة نمو عظم الفخذ. المعلمات الشكلية للعظام، بما في ذلك كثافة المعادن بالعظام (BMD)، والمحتوى المعدني للعظام (BMC)، والمحتوى المعدني للأنسجة (TMC)، والكثافة المعدنية للأنسجة (TMD)، وكسر حجم العظم (BVF)، والفصل التربيقي (Tb. Sp)، والرقم التربيقي (Tb. N). ) وسمك التربيق (Tb. Th)، تم تقييمها من خلال تحليل العائد على الاستثمار باستخدام برنامج تحليل العظام ABA.

3.6. تحليل البارامترات البيوكيميائية

تم قياس نشاط الفوسفاتيز القلوي في المصل (ALP) على محلل تلقائي (Ciba-Corning 550 Diagnostics، Corp.، Oberlin، OH، USA))؛ تم تحديد مستويات مصل DPD وBGP وCathepsin K بواسطة مجموعات الكواشف المقابلة، وتم تحليل الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP) وفقًا للأدبيات ذات الصلة [32].

3.7. تحليل لطخة غربية

تم الكشف عن مستويات التعبير البروتيني لـ TRAF6 و NF-κB PI3K و Akt و OPG و RANKL في مجموعات مختلفة عن طريق تحليل اللطخة الغربية. باختصار، تم استخلاص البروتين من الساق اليمنى للفئران باستخدام محلول تحلل يحتوي على 0.5 ملي مولار من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل والبروتياز ومثبطات الفوسفاتيز. تم الطرد المركزي لل Lysates لمدة 10 دقائق عند 12 ،000 × g للحصول على المواد الطافية لمزيد من التحليل. تم قياس تركيز البروتين من ليساتيس باستخدام مقايسة الكمي حمض البيكينكونيك. تم فصل البروتينات (50-100 ميكروغرام) باستخدام 10٪ SDS-PAGE، وتم نقلها إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين واحتضانها بأجسام مضادة أولية وحيدة النسيلة تستهدف TRAF6 وNF-κB RANKL وPI3K وAkt وOPG و-actin (1:500). تم تجريد الغشاء نفسه وإعادة فحصه، مع اكتشاف إشارات التوهج الكيميائي بواسطة برنامج Image Lab. - الأكتين أو توبولين يعمل كعنصر تحكم داخلي.

3.8. التحليل الإحصائي

تم تحليل جميع البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب على الحيوانات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه مع اختبار دينيت بواسطة SPSS (الإصدار 22.0، IBM SPSS Statistics، IBM Corp.، Armonk، New York، NY، USA ) برمجة؛ تم اعتبار قيمة p <0.05 ذات دلالة إحصائية، وتم تقديم جميع النتائج على أنها متوسط ​​± SD.

4. الاستنتاجات

باختصار، رابطة الدول المستقلة أ،جليكوسيدات الفينيليثانويد النشطةالمعزول من C. deserticola، أظهر نشاطًا كبيرًا مضادًا لهشاشة العظام على فئران OVX، وقد تكون الآلية الجزيئية مرتبطة بتثبيط NF-kappaB بوساطة TRAF6- وتنشيط PI3K/Akt، وبالتالي من المحتمل أن يكون عاملًا واعدًا لعلاج هشاشة العظام مرض.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لنشاط مضاد لهشاشة العظامPHGS75% ECH 30% ACT 12%