الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للنيفرون في الكلى الطبيعية والكيسية

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

توماس بلانك^1,2,7نيكولاس جودين^3,7محمد زيدان^1,4,7مريم جرفة تراوري³، فرانك بينيم^1,5، ليزا تورينسكي¹، سيرج جارباي¹، كليمنت نجوين¹مارتين بيرتين¹، جيرارد فريدلاندر^1,6، فابيولا ترزي^1,8وماركو بونتوجليو^1,8

¹المعهد الوطني للصحة والبحوث الطبية U1151 ، المركز الوطني للبحوث العلمية UMR8253 ، جامعة باريس ، معهد نيكر إنفانتس مالاديس ، مقاطعة «Croissance et Signalisation» ، باريس ، فرنسا ؛²Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique، AP-HP، Hôpital Necker Enfants Malades ، باريس ، فرنسا ؛³Structure Fédérative de Recherche Necker، US 24- UMS3633، Paris، France؛ ⁴Service de Néphrologie-Transplantation، AP-HP، Hôpital Bicêtre، Le Kremlin-Bicêtre، France؛⁵Service d'ExplorationsFonctionnelles، AP-HP، Hôpital Necker Enfants Malades، Paris، France؛ و⁶Service d'Explorations Fonctionnelles، AP-HP، HôpitalEuropéen Georges Pompidou، Paris، France

الكلمات الرئيسية: كيسيالكلىمرض؛الكلى; نفرون؛ التهاب الكلية. تطهير الأنسجة

بيان متعدية

توفر طرق المقاصة أداة فريدة لفهم كيف تؤدي التغيرات المورفولوجية إلى عواقب مرضية.الكلىهي أعضاء مهمة تحافظ على توازن الجسم من خلال الماء ، والمستقلبات ، ومعالجة الكهارل ، والتي تعتمد بشكل أساسي على 3- بنية الأبعاد المعقدة لـالنيفرونعندما يتم تغيير هذا التنظيم الهيكلي ، يترتب على ذلك فيزيولوجيا أمراض الكلى. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة قوية تعتمد على المقاصة الضوئية والفحص المجهري متعدد الفوتونات والتتبع الرقمي لدراسةالكلىعلى مستوى النيفرون المفرد تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. على وجه الخصوص ، نقدم 3- إعادة بناء الأبعاد الأولى لتعدد الكيسات بمقياسالنيفرون. يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من السياقات المرضية ، مما يسمح بفهم أفضل للعملية المعقدة لتدهور الكلى ، وبالتالي تطوير استراتيجيات علاجية أكثر استهدافًا

تحافظ الكلية على توازن الجسم عبر مركبها3- الأبعاد(3D) هيكل النيفرون. عندما يتم تغيير هذا التنظيم الهيكلي ، فإن الفيزيولوجيا المرضية الكلوية. مزمنالكلىتتميز الأمراض بتطور الآفات الكلوية. من المثير للاهتمام أن علماء الأمراض قد أبلغوا عن عدم تجانس واسع في توزيع الآفات أثناء أمراض الكلى المزمنة .1،2 ما إذا كان هذا يعكس حقيقة أن قطاعات معينة من النيفرون يمكن أن تتضرر بشكل مختلف ، أو بدلاً من ذلك ، أن بعض النيفرون لها احتمالات مختلفة للإصابة ككل ، غير معروف. لمعالجة هذه المشكلة ، من الضروري إعادة بناء 3D (ثلاثي الأبعاد) شكلالنيفرونفي السياقات المرضية.

على حد علمنا،النيفرونتم إعادة بنائها بالكامل فقط باستخدام أقسام ثنائية الأبعاد. هذا في المقام الأول بسبب التشوهات الميكانيكية ، وهو تأثير لا مفر منه لإجراء التقطيع. علاوة على ذلك ، لا يسمح ثلاثي الأبعاد (إعادة البناء من الصور ثنائية الأبعاد بالتصوير المباشر للهياكل ثلاثية الأبعاد في الأنسجة المركبة بالكامل.

لقد حسّن الفحص المجهري Multiphoton من قدرتنا على اكتشاف التغيرات المورفولوجية في المقاطع السميكة. ومع ذلك ، فإن القيد المهم هو العمق الضحل الذي يمكن الوصول إليه بسبب تشتت الضوء. من خلال تقليل فروق معامل الانكسار إلى الحد الأدنى ، حسنت عوامل التطهير بشكل كبير القدرة على تصوير الأعماق .6 ، 7 على الرغم من حقيقة أن أول عامل مقاصة تم تقديمه منذ قرن من الزمان ، 8 لم يتم تطوير العديد من بروتوكولات المقاصة إلا مؤخرًا ، معظمها للدماغ. - 17 أظهرت الدراسات الحديثة قدرتها على تصوير أعضاء صلبة أخرى ، مثل الكبد أو البنكرياس أوالكلى.18–26

تكيسالكلىالمرض ، وهو اضطراب غير متجانس وراثيًا ينطوي على طفرات في العديد من الجينات الهدبية ، هو أكثر أمراض الكلى الوراثية شيوعًا.الكلىيتسم المرض بتطور الأكياس التي تؤدي إلى التدمير الكامل للكلية. [28) اقترحت الدراسات أن الأكياس يمكن أن تتطور إما على شكل "دفع للخارج" لجزء من النيفرون ، كما هو الحال في مرض الكلى متعدد الكيسات السائد ؛ كتوسع منتشي في قنوات التجميع (CDs) ، كما هو الحال في جسمية متنحية متعددة الكيساتالكلىمرض؛ أو حصريًا في الأنابيب النخاعية ، كما هو الحال في التهاب الكلية (NPHP) ، ومع ذلك ، كيف تتطور الأكياس ثلاثية الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) والتنظيم مع بعضها البعض والنبيبات المجاورة الطبيعية لا تزال غير معروفة.

هنا ، قمنا بدمج المقاصة الضوئية مع الفحص المجهري متعدد الفوتونات لتقديم رؤى جديدة حول الكيفيةالنيفرونيتم تشكيلها وتنظيمها في ظروف فسيولوجية وكيف يتم تعديلها أثناء المرض ، مثل تكوين المثانة. تظهر نتائجنا أن هناك 3 أنواع منالنيفرونوأن الأوعية قد تؤثر على تنظيم النيفرون المكاني ، ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا أن النيفرون تميل إلى التكمن في طائرات معينة. بشكل غير متوقع ، عندما طبقنا هذه التقنية على jckmice ، لاحظنا أن الأكياس تطورت فقط في مقاطع نيفرون محددة مع أكياس مغزلية مختلطة مع الأنابيب الطبيعية.

انقر لسيستانشآثار جانبيةلأمراض الكلى

النتائج

الإعداد التجريبية

لدراسة شكل كاملالنيفرونفيما يتعلق ببيئتهم ، اعتمدنا تقنية تعتمد على المقاصة البصرية والفحص المجهري متعدد الفوتونات (الشكل التكميلي S1A). بمقارنة بروتوكولات المقاصة الضوئية المختلفة ، قررنا ذلك بالنسبة لـالكلى، كان كحول بنزيل / بنزوات بنزيل (BABB) هو الأنسب من حيث الكفاءة (الشكل التكميلي S1B و C والجدول التكميلي S1).

3D (ثلاثي الأبعاد) تتطلب إعادة الإعمار والتعقب الرقمي صورًا عالية الجودة بدقة عالية ونسبة إشارة إلى خلفية عالية. لاحظنا أن الإشارة الضوئية التي قدمها التألق الطبيعي لم تكن موحدة على أقسام الكلى. على وجه الخصوص ، كانت الصور من النخاع متناقضة بشكل سيئ مع انخفاض نسبة الإشارة إلى الخلفية (الشكل التكميلي S2). لتحسين نسبة الإشارة إلى الخلفية ، المقاطع غربًا مع حمض-شيف الدوري (الشكل التكميلي S1D) ، لأننا لاحظنا بشكل تجريبي أن هذا التلوين يرتفع إلى تباين عالٍ في الأقسام الرقيقة أثناء 2- التألق الضوئي. ومع ذلك ، فإن الإشارة لم تكن موحدة خلال دورية سميكة حامض - شيف - ملطخةالكلىالمقاطع (الشكل التكميلي S1E). لذلك ، قمنا بتلوين أقسام الكلى باستخدام الليكتين المقترن بالفلوروكروم: راصات الفول السوداني وراصات جرثومة القمح ، والتي تلطخ الكبيبات والأنابيب ، وبساطة Griffonia I folia agglutinin ، التي تميز الأوعية الدموية .30 بشكل ملحوظ ، مع مزيج من theselectins ، ونسبة الإشارة إلى الخلفية زاد بشكل كبير في أقسام الكلى بأكملها ، مع تحسن كبير في كل من المستوى XY والمحور z (الشكل التكميلي S1E والفيلم التكميلي S1).

تصور ثلاثي الأبعاد لقطاع النيفرون

لتصور شكل الكلالنيفرون، قمنا بتتبع مساراتهم ، بدءًا من القطب البولي في الكبيبة وانتهاءً عند تقاطع القرص المضغوط (فيلم إضافي S2). على الرغم من حقيقة أن الليكتينات المستخدمة عالميًا تربط جميع أجزاء الكلية ، فقد لاحظنا أنه عند فحصها بعناية ، تميزت هذه الإكلينات بنمط معين في الطريقة التي تم بها تلوين الأغشية القاعدية أو اللمعية في الأجزاء الكلوية المختلفة. بمعنى آخر ، استفدنا من النمط النمطي لتلطيخ الليكتين لتحديد قطاعات النيفرون المختلفة. بهذه الطريقة ، يمكننا بسهولة تحديد 6 كيانات: النبيب الداني (PT) ، الطرف الرفيع (TL) من Henleloop (HL) ، الطرف الصاعد السميك (TAL) من HL ، النبيب الملتوي البعيد (DCT) ، النبيب المتصل (CNT) ، وقرص مضغوط. تميز الانتقال بين PT و TL بالفقدان المفاجئ لإشارة حدود فرشاة PT النموذجية وبتقليل عرض التجويف ، والذي كان غائبًا تقريبًا في TL (الشكل 1 أ). على العكس من ذلك ، تميز الانتقال بين TL و TAL بزيادة كبيرة في قطر الأنبوب الخارجي وعرض التجويف الثابت نسبيًا (الشكل 1 ب). في جميع النيفرون ، تم العثور على انتقال TAL إلى DCT بشكل منهجي في القطب الوعائي للكبيبة ، وتميز هذا الانتقال بتضخم مفاجئ لقطر الأنبوب الخارجي والذي كان في الغالب بسبب الزيادة غير الملحوظة في قطر التجويف (الشكل 1 ج). تميز الانتقال بين DCT و CNT بالخفض في كل من القطر الأنبوبي والتجويف (الشكل 1 د). أخيرًا ، تم تمييز الاتصال بين CNT والقرص المضغوط القشري بزيادة مفاجئة في كل من القطر الأنبوبي والتجويف (الشكل 1 هـ). كان التقدير الكمي للتحولات الشكلية ذا دلالة إحصائية (الشكل 1f) ، وتم التحقق من صلتها بالتلطيخ بعلامات أنبوبية محددة (الأشكال التكميلية S3 – S5 والفيلم التكميلي S3 – S5).

يختلف شكل وحجم PT باختلاف عمقها

تلطيخ سميكةالكلىسمحت لنا الأقسام بتتبع إحداثيات التطور المكاني لقطاعات PT بأكملها. ومن المثير للاهتمام ، اكتشفنا أن شكلها كان متغيرًا للغاية ويتم تحديده من خلال موضع الكبيبات في القشرة. على الصعيد العالمي ، حددنا 3 أنماط. الأول يتوافق مع الأكثر سطحيةالنيفرون(SNs) (الشكل 2 أ ؛ الفيلم التكميلي S6) ، الذي احتل الجزء الخارجي من القشرة (أكثر 30 في المائة خارجيًا بالقرب من الكبسولة الكلوية). شكلت أجزائها الملتفة هياكل مدمجة مع 6 إلى 7 تلافيفات فقط حول الكبيبة الخاصة بها ، وتحتل مساحات صغيرة جدًا ومعبأة بإحكام. انتهى الالتواء من هذه SNs في الجزء المستقيم الطويل والمستقيم الذي نزل إلى النخاع. في الطرف المقابل من هذا الطيف ، لاحظنا نمطًا ثانيًا من النيفرون الموجود في أعمق جزء من القشرة (40 في المائة عمق داخلي أكثر) ، بجانب النخاع (النيفرون المجاور للطيف [JNs]) (الشكل 2 أ ؛ الشكل التكميلي S6 والفيلم التكميلي S6). تميزت PT الخاصة بهم بحلقة قصيرة أولية تنحدر بشكل منهجي نحو الحليمة ثم تحول U للصعود نحو الكبسولة الكلوية. على النقيض من SNs ، تميزت الأنابيب الملتوية القريبة JN بملفات كبيرة تطورت حول الكبيبة الخاصة بها واحتلت مجالات كبيرة معبأة بشكل غير محكم في القشرة المجاورة للقشرة. كان الجزء الملتوي من PT من JNs يحتوي على 10 إلى 15 تحويلات ، مما يشكل مجالات كبيرة. أخيرًا ، شمل النمط الثالث النيفرون الموجود في الجزء الأوسط من القشرة (النيفرون الأوسط [MNs]) (الشكل 2 أ ؛ الفيلم التكميلي S6). ومن المثير للاهتمام ، أن هذه الأنابيب كان لها اتجاه مكاني وشكل يمثل انتقالًا بين SNs و JNs. في الواقع ، كانت تحتوي على 8 إلى 9 تلافيف مع ملفات أكبر من SNs ، لكنها أصغر من JNs. بالإضافة إلى ذلك ، كان لدى MNs أجزاء مستقيمة أطول من JN. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت مقارنة عالمية لأشكال PTs أن SNs و MNs كان لها نمط متجانس بينما كانت JNs غير متجانسة للغاية (الشكل التكميلي S6). بالإضافة إلى ذلك ، إعادة الإعمار المكاني للعديدالنيفرون كشف أن PTs لا تختلط أبدًا (فيلم إضافي S6) ، مما يشير إلى أن كل نفرون يشغل مساحة فردية خاصة به في القشرة.

أكدت التحليلات المورفومترية الاختلافات الكبيرة في حجم وشكل SNs و JNs ، مع منظور وسيط لـ MNs. كان PT لـ JNs أكثر من 2- أضعاف أطول من PT لـ SNs (الشكل 2 ب) ؛ ومع ذلك ، كان الاستقامة أكبر في SNs منه في JNs (الشكل 2 ج) ، بما يتفق مع الملاحظة القائلة بأن أنابيب JN كانت أكثر تقطرًا (الشكل 2 أ ؛ الشكل التكميلي S6).

الشكل 1|المعايير المورفولوجية المستخدمة لتحديد قطاعات النيفرون. (أ - هـ) مورفولوجيا الأجزاء المختلفة من الفئران التي تتحكم في النيفرون.النيفرونتم تتبعها من القطب البولي للكبيبة إلى قناة التجميع (النبيب القريب [PT]: الفيروز ؛ الطرف الرفيع [TL] من حلقة هنلي: رمادي فاتح ؛ الطرف الصاعد السميك [TAL] لحلقة هنلي: رمادي داكن ؛ بعيد النبيبات الملتوية [DCT]: وردي ؛ الأنبوب المتصل [CNT]: أصفر ؛ قناة التجميع القشرية [CCD]: برتقالي). تشير الأسهم إلى قطر مقاطع النيفرون المختلفة. (واصلت)

الشكل 1|(تتمة) (و) التحديد الكمي للقطر الأنبوبي الخارجي لقطاعات النيفرون المختلفة. يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني±SEM. تحليل التباين متبوعًا باختبار Tukey-Kramer: ** P <0. 0 1 ، *** P <0.001.

الشكل 2 |ثلاثي الأبعاد(ثلاثي الأبعاد) إعادة بناء الأنابيب القريبة تكشف عن 3 أشكال ومنظمات مختلفة. (أ) صور ثلاثية الأبعاد تمثيلية لإعادة البناء للأنابيب القريبة من خلال القشرة الكلوية بأكملها ، مقسمة إلى 3 مستويات (خطوط بيضاء) وفقًا لشكل الأنابيب شبه القشرية (PTs): قشرة سطحية (زرقاء) ، وسط (خضراء) ، وقشرة جوكستاميدولاري (حمراء) ، المقابلة ل 30 في المائة الخارجية ، 30 في المائة الوسطى ، و 40 في المائة من القشرة الداخلية ، على التوالي. لاحظ الأشكال المختلفة للأنواع الثلاثة من ملفاتالنيفرونوعلى وجه الخصوص طول وتعرج النبيبات juxtamedullary. شريط {{0} ملم. (ب ، ج) التحديد الكمي للطول (ب) و (ج) استقامة الأنواع الثلاثة من الأنابيب القريبة. (د) القياس الكمي لحجم الكبيبات من كل منطقة قشرة. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​SEM. تحليل التباين متبوعًا باختبار Tukey-Kramer: PT juxtamedullary مقابل PT السطحي: ### P <0. 0="" 01؛="" pt="" juxtamedullary="" مقابل="" pt="" الأوسط:="" ***="" p=""><0.001 ؛="" pt="" السطحي="" مقابل="" pt="" المتوسط:="" $$$="" p=""><>

الشكل 3 |ثلاثي الأبعاد(ثلاثي الأبعاد) إعادة بناء النيفرون يكشف عن 3 أنواع مختلفة من النيفرون. (أ) صور ثلاثية الأبعاد تمثيلية للنيفرون الكامل (اللوحات اليسرى) من الكبيبات إلى مجرى التجميع في القشرة السطحية (الأزرق) والقشرة الوسطى (الخضراء) والمنطقة المجاورة (الحمراء) في الفئران الخاضعة للتحكم. تجزئة النيفرون (اللوحات اليمنى) لثلاثة أنواع مختلفة من النيفرون. شريط =150 ملم. (ب) القياس الكمي للمسافة الداخلية بين طرفي حلقة Henle للأنواع الثلاثة من النيفرون. (ج) التحديد الكمي لطول النيفرون لـ (تابع)

الشكل 3|(تابع) 3 أنواع منالنيفرون. (د) القياس الكمي لطول الأجزاء المختلفة من النيفرون حسب نوع النيفرون. يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني±SEM. تحليل التباين متبوعًا باختبار Tukey-Kramer: nephron juxtamedullary nephron (JN) مقابل النيفرون السطحي (SN): ### P <0. 0="" 0="" 1؛="" jn="" مقابل="" النيفرون="" الأوسط="" (mn):="" *="" p=""><0. 05="" ،="" **="" p=""><0.01 ،="" ***="" p=""><0.001. cnt="" ،="" توصيل="" الأنابيب="" ؛="" dct="" ،="" النبيبات="" البعيدة="" ؛="" pt="" ،="" النبيبات="" القريبة.="" tal="" ،="" الطرف="" الصاعد="" السميك="" لحلقة="" henle="" ؛="" tl="" ،="" طرف="" رفيع="" من="" حلقة="">

يختلف حجم الكبيبات باختلاف العمق

ثم قمنا بتحليل عمق وقطر الكبيبات المختارة عشوائياً من كل منطقة من المناطق الثلاث. كشفت التحليلات المورفومترية أن الكبيبات كانت موجودة في المتوسط ​​783 و 355 ملم من الكبسولة الكلوية في JNs و SNs ، على التوالي. كما ذكرنا سابقًا ، لاحظنا أن حجم الكبيبات يختلف باختلاف عمقها. على وجه الخصوص ، كان الحجم الكبيبي لـ JNs أكبر بثلاث مرات من حجم SNs و MNs (الشكل 2 د).

إعادة بناء النيفرون ثلاثي الأبعاد

ثم قمنا بتتبع التطور المكاني للكلالنيفرونfromPT إلى CNT. العرض العالمي للثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعادأكد إعادة الإعمار أن شكل النيفرون يختلف بين SNs و MNs و JNs (الشكل 3 أ ؛ الفيلم التكميلي S7). يرجع هذا الاختلاف بشكل رئيسي إلى هيكل PT. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أن HL لديها تنظيم مكاني ثلاثي الأبعاد مختلف. على وجه الخصوص ، تم فصل TL و TAL بشكل أكثر بعدًا في JNsthan في SNs و MNs (الشكل 3 ب). كشفت التحليلات المورفومترية أن JNs كانت عالميًا {{4} أضعاف أطول من SNs (الشكل 3 ج). تم توزيع الطول المتزايد بشكل متناسب في جميع المقاطع ، باستثناء TAL و DCT ، والتي تميل إلى أن يكون لها نفس الطول المطلق في جميع أنواع النيفرون (الشكل ثلاثي الأبعاد). هذا يشير إلى أن استطالة النيفرون هي عملية نمطية متجانسة بشكل مفاجئ.

تؤثر السفن المقوسة على الالتواء PT المتجاور

للحصول على منظور أكثر شمولاً لملفالكلىالهيكل ، استفدنا من تلطيخ Griffonia simplicifoliaagglutinin ، والذي سمح لنا بتتبع الأوعية المقوسة وفروعها في الأوعية المشعة القشرية (الشكل 4 أ ؛ الفيلم التكميلي S8). ومن المثير للاهتمام ، أن المتزامن ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) أظهر إعادة بناء النيفرون والأوعية أن الأوعية المقوسة تميل إلى أن تكون في تنظيم مكاني موازٍ مدهش مع الأنابيب القريبة. على وجه الخصوص ، لاحظنا أن المسار الذي يتبعه JNs محددة (JNs المقيدة) يميل إلى اتباع مسار السفينة المجاورة (الشكل 4 ب ؛ الفيلم التكميلي S9). بشكل ملحوظ ، هذا التحيز (لوحظ فقط في مجموعة فرعية من JNالنيفرون) يمثل عدم التجانس الكبير في أشكال PT (الشكل التكميلي S6). كشفت التحليلات المورفومترية أن PTs "المقيدة" كانت أطول بشكل ملحوظ وأكثر تعقيدًا (استقامة منخفضة) من تلك "غير المقيدة" (الشكل 4 ج و د). تجدر الإشارة إلى أن الأجزاء الملتفة من كل من SNs و MNs تم وضعها فوق الأوعية المقوسة ولم تكن مقيدة.

مرض الكلى المزمن

تميل الأنابيب الصغيرة إلى الاستلقاء في الطائرات

ومن المثير للاهتمام أن فحص ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) أشكالالنيفرونأشارت إلى أنها تميل إلى الاستلقاء في الطائرات (الشكل 5 أ ؛ MovieS1 التكميلي 0). لتقدير هذه المعلمة ولتقييم التحيز الإحصائي المحتمل لهذا التشكل ، قمنا بقياس الميل العام للأنابيب للانحناء عن المستوى المحدد بواسطة حلقاتها. أظهرت قياساتنا أنه بالمقارنة مع نموذج محاكاة للمشي العشوائي الذي تم إنشاؤه باستخدام نفس مجموعة الزوايا المقاسة المتتالية والطول بين النقاط المتتالية (الشكل 5 ب) ، تميل الأنابيب إلى التطور بانحراف أصغر عن المستوى (الشكل 5 ج). يشير هذا إلى أن الأنبوبة مصممة لتقييد مسارها على طول الطائرة. كانت الفروق الملحوظة ذات دلالة إحصائية عالية (P <>

تكشف إعادة بناء النيفرون ثلاثية الأبعاد عن نمط معين لتطور الكيس

لتحديد ما إذا كان بروتوكولنا يسمح بتتبع النيفرون في الأنسجة المرضية غير المنظمة ، قمنا بتمييز الأشكال والتوزيع المكاني للكيسات في فئران جاك ، وهو نموذج شائع الاستخدام من NPHP ومرض كيس 31 - 33 3 أظهرت صور D ذلك على الرغم من ظهور الخراجات البارزة العامة ثلاثية الأبعاد (ثلاثي الأبعادلم يختلف مسار النيفرون اختلافًا كبيرًا عن الفئران الضابطة (الفيلم التكميلي S11) وبالمثل ، أكدت التحليلات المورفومترية أن الطول الكروي لـالنيفرونكان الحجم الكبيبي وطول كل قطعة نيفرون قابلة للمقارنة مع فئران التحكم (الشكل التكميلي S7). تجدر الإشارة إلى أنه بسبب تطور الكيس ، لم نتمكن من التمييز بين TL من TAL في HL. طورت جميع النيفرونات أكياس مغزلية (الأفلام التكميلية S11 و S12). كانت إحدى السمات الأكثر لفتًا للانتباه هي ملاحظة أن التوسعات الكيسية المغزلية حدثت في مواقع متعددة على طول مقطع النيفرون نفسه (الأفلام التكميلية S12 و S13). من المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا أن الأكياس لم تتطور أبدًا في الأطراف النازلة و HL (الشكل 6 أ ؛ الفيلم التكميلي S12). على النقيض من ذلك ، تم اكتشافها في الغالب في HL التصاعدي ، و DCTs ، و CNTs ، وفي الجزء العلوي من الأقراص المضغوطة ، باستمرار مع CNT (الشكل 6 أ ؛ الفيلم التكميلي S12). على وجه الخصوص ، لاحظنا أن DCT ، وكذلك مقاطع CNT ، لديها احتمالية متزايدة بشكل غريب لتطوير الخراجات في الأجزاء الأكثر بُعدًا (الشكل 6 ب). كشفت التحليلات الكمية الشكلية لصور إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد أن الحجم الإجمالي للكيس لكل نفرون كان مرتفعًا بشكل خاص في CNT (الشكل 7 أ). بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أن تضخمات الكيس في HL و DCT كانت أكبر في JNs منها في SNs و MNs (الشكل 7 أ ؛ الفيلم التكميلي S12). علاوة على ذلك ، كان معدل حدوث الكيس أعلى بكثير في JNs منه في الأنواع الأخرىالنيفرون(الشكل 7 ب). لاحظنا أيضًا أن متوسط ​​المسافة البينية الكبيبية (المحسوبة على أقرب 5 كبيبات) تميل بشكل خاص إلى زيادة الفئران غير الكيسية ، خاصة في القشرة الأكثر سطحية (الشكل التكميلي S8).

الشكل 4|تحدد السفن شكل النيفرون. (أ)ثلاثي الأبعادإعادة بناء بنية السفينة من الأوعية المقوسة إلى الأوعية المشعة القشرية. شريط ¼ 200 ملم. (ب) الصور التمثيلية للأنابيب القريبة المجاورة "غير المقيدة" (اللوحة العلوية) و "المقيدة" (اللوحة السفلية). شريط ¼ 100 مم. (ج ، د) التحديد الكمي للطول (ج) و (د) استقامة الأنابيب القريبة المجاورة "غير المقيدة" و "المقيدة". يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني±SEM. اختبار مان ويتني: "مقيد" مقابل "غير مقيد": * P <0. 0="" 5="" ،="" ***="" p=""><>

3D (ثلاثي الأبعاد) كشفت إعادة بناء العديد من الخراجات أنها كانت متغيرة للغاية في الشكل والحجم (الشكل 6 ج ؛ الأفلام التكميلية S11 و S13). في HL التصاعدي ، كان للخراجات شكل مغزلي بقطر صغير. في DCT ، كان للخراجات شكل كروي إلى حد ما وأكبر وكانت متناثرة بين الأنابيب غير المتضخمة. ومن المثير للاهتمام ، أن الانتقال بين DCT و CNT تميز بشكل منهجي بهيكل طبيعي غير متماسك. في المقابل ، في CNT ، لاحظنا بشكل منهجي بنية كيسية متوسعة متصلة مباشرة بالقرص المضغوط. ومن المثير للاهتمام ، في القرص المضغوط ، تقلص هذه البنية تدريجياً إلى حجم نبيب عادي. في الأصح ، لا يمكن الكشف عن مزيد من الخراجات في الجزء المجاور للقرص المضغوط. ميزة أخرى متسقة هي التنظيم المكاني الغريب للخراجات في الطرف الصاعد HL. إنفاكت ، على الرغم من أن الخراجات كانت أعمق وأقرب إلى الحلقة في SNs ، إلا أنها كانت أكثر سطحية وأقرب إلى DCT في JNs (الشكل 6 ج). مرة أخرى ، احتلت الأكياس موقعًا وسيطًا في MNs (الشكل 6 ج).

الشكل 5|تميل نبيبات النيفرون إلى التطور كهيكل مسطح. (أ) مسار نموذجي للنبيبات القريبة من النيفرون. يوضح هذا المسار الميل إلى الاستلقاء في المستوى. يمكن رؤية مستوية تطور المسار بشكل أفضل عند تدويرها بشكل صحيح ومواءمتها مع وجهة نظر المراقب (انظر التمثيل الأيمن لنفس القطعة الأنبوبية ، والتي ، على الجانب الأيسر ، ممثلة على شكل مختلف) . (ب) تمثيل تخطيطي لمسار أنبوبي يتكون من 4 أجزاء (بين 5 نقاط تحدد مسارًا أنبوبيًا معينًا كما هو موضح كمثال). يمكن تمثيل الدرجة التي تميل بها المسارات إلى "الخروج من مستواها" بالزاوية المشار إليها هنا باسم "بيتا". (واصلت)

الشكل 5|(تابع) يتم قياس هذه الزاوية بين المقطع p 3- p4 فيما يتعلق بالمستوى (المحدد بالنقاط السابقة مباشرة p3 و p2 و p1) ويتم تمثيلها بمستطيل رمادي غامق في المخطط. ثم تم حساب زوايا بيتا بشكل متكرر مع مجموعة النقاط في مسار أنبوبي. لتقييم مدى انحياز زوايا بيتا هذه ، قمنا بمحاكاة المشي العشوائي (محاكاة مونتي كارلوس] (باستخدام نفس مجموعة زوايا ألفا المتتالية لكل مسار أنبوبي (مقاسة بين جميع المقاطع المتتالية). أدى هذا المشي العشوائي إلى إنشاء مسار بمجموعة متطابقة من زوايا ألفا وزوايا بيتا العشوائية. (ج) قطع الكمان للتوزيع العالمي لزوايا بيتا ونتيجة MCs في الأنبوب القريب (PT) ، والطرف الرفيع (TL) من حلقة Henle ، والطرف الصاعد السميك (TAL) من حلقة Henle ، والنبيب الملتوي البعيد (DCT) ) والنبيبات الضامة (CNT). MCs، P <0.>

نقاش

الطرق النسيجية التقليدية محدودة في قدرتها على اكتشاف التغيرات المرضية التي تؤثر على الشكل العالمي لـالنيفرون. هنا ، نقدم نهجًا قويًا يعتمد على إزالة الأنسجة التي لديها القدرة على معالجة الأسئلة الحاسمةالكلىهندسة معمارية بتفاصيل مكانية غير مسبوقة في ظل الظروف العادية والمرضية. أكدت نتائجنا وجود 3 أنواع من النيفرون تختلف في مكانها وشكلها وحجمها بما يتوافق مع خصائصها الوظيفية. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن nephronstend إلى الاستلقاء في الطائرات والتكيف مع التنظيم المكاني للسفينة. من المثير للاهتمام ، عندما طبقنا هذه التقنية على نموذج لمرض الكلى الكيسي ، لاحظنا أن الأكياس تتطور في جميع النيفرون ، ولكن فقط في قطاعات محددة. ومن المثير للاهتمام ، أن شكل الكيس يختلف باختلاف الجزء الكلوي وأنه على طول نفس النيفرون ، تتداخل الكيسات مع الأنابيب الطبيعية غير المنتفخة. إجمالاً ، توفر هذه النتائج أول صورة ثلاثية الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) توصيف الترتيب المكاني لـالنيفرونوالأوعية والأهم من ذلك أنها توفر الأساس لفهم العملية المرضية ، مثل تكوّن الزهد.

يعتبر المقاصة البصرية للكلى أمرًا صعبًا بسبب المستويات العالية من التألق الذاتي وكثافة الخلايا. من خلال مقارنة بروتوكولات المقاصة المختلفة ، حددنا في BABB تقنية powerfultique لتنفيذ التصور وإعادة بناء الهياكل الموجودة في أعمق جزء منالكلى، وهذا هو ، النخاع. علاوة على ذلك ، فإن BABB سريع وقابل للتحجيم ، وبمجرد مسحه ، يمكن تخزين العينات لأشهر قبل الحصول على الصورة. الميزة الرئيسية الأخرى لهذه التقنية هي تكلفتها المنخفضة. قد ينتج عن عوامل المقاصة تفكك أو تضخم الهياكل. أحد أهم القيود هو التعليق على الهياكل التي تستغرق وقتًا طويلاً للغاية ، ومع ذلك ، هناك عدد متزايد من التقنيات القائمة على التعلم العميق والتي يجب أن تتغلب بسرعة على هذا الحد.

تمشيا مع النتائج التي تم الحصول عليها من خلال التقنيات الكلاسيكية ، أظهرت دراستنا أن النيفرون يختلف في شكلها وطولها وفقًا لموقعها. على وجه الخصوص ، لاحظنا أن JNs لديها أكثر تطوراً من PTs المعقدة وكبيبات أكبر وأطول مرتين من SNs. الطول المتزايد هو نتيجة لعملية متناغمة لأن الإطالة تؤثر بشكل متناسب على جميع قطاعات النيفرون. لاحظ Weal أيضًا أن JNs لديها HL أكبر. إجمالاً ، تُظهر هذه البيانات بوضوح أن التشريح المجهري لـ SNs و JNs مختلفان بشكل كبير وأن MNs تعرض ميزات وسيطة. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات الفسيولوجية أظهرت ذلكالنيفرون.2 والأحداث التي تكمن وراء هذه الاختلافات غير معروفة بعد. من المغري التكهن بأن البنية الخاصة لـ JNsmay تفسر خصوصية وظائفها.

ومن المثير للاهتمام ، من خلال توفير ثلاثي الأبعاد لأول مرة (ثلاثي الأبعاد) إعادة بناءالنيفرونوالأوعية المحيطة بها ، اكتشفنا وجود قيود مكانية بين الأوعية المقوسة ومجموعة فرعية من النيفرون. وبالتالي ، فمن المتصور أن السفن قد تملي الطريقة التي تطول بها النيفرون أثناء التطور .34 ، 35 كشف فحص الأشكال ثلاثية الأبعاد للنيفرون جنبًا إلى جنب مع المحاكاة الحسابية أيضًا أن النيفرون لا يختلط أبدًا وأن كل نيفرون يميل إلى الاستلقاء في المستوى. لا يزال يتعين توضيح الأهمية الوظيفية لهذه الملاحظة.

تطور الكيس خلال تكيس متعددالكلىالمرض لا يزال عملية مثيرة للاهتمام. NPHP ، حالة مرضية تتميز بتطور الكيس ، هي أكثر الأمراض الوراثية شيوعًا - تسبب مرض الكلى في نهاية المرحلة عند الأطفال والمراهقين. تم تحديد عشرين جينًا من NPHP حتى الآن. 36 من بينها ، يقوم NEK8 بتشفير عضو من عائلة كيناز A المرتبطة بالسرطان ، والتي تلعب دورًا في وظيفة الأهداب وتطور دورة الخلية. وتجدر الإشارة إلى أن التحور في نفس مجال البروتين يؤدي إلى NPHP9 في البشر. 38 2 اقترحت دراسات D أن تطور الكيس يختلف اختلافًا كبيرًا بين الأشكال المختلفة لمرض الكلى المتعدد الكيسات. حصريًا من CD و DCT.31 على الرغم من أن هذه الدراسات الكيميائية الهيستولوجية المناعية مفيدة ، إلا أنها لا تستطيع أن تجادل ضد احتمال أن فقدان علامات أنبوبية معينة يفسر هذه الملاحظة بشكل مصطنع. وهكذا ، our3D (ثلاثي الأبعاد) تقدم الدراسة أول دليل واضح على أن تطور الكيس هو عملية قد تنطوي فقط على قطاعات كلية معينة. ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من أن NIMA (لم يحدث أبدًا في الانقسام الفتيلي A) - يتم التعبير عن كيناز 8 (NEK8) في السيتوبلازم لجميع قطاعات النيفرون ، إلا أن تعبيره في الأهداب مقيد بـ DCT و CD. نظرًا لأن هذه الأجزاء فقط هي عرضة لتطوير الأكياس ، 31 يمكننا أن نفترض أن تعطيل وظيفة الهدبية NEK8 هو الحدث الحاسم لتكوين الكيس. ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا أيضًا أن الكيسات المغزلية هي في حالة استمرارية مع الأنابيب الطبيعية غير المتضخمة. تشير حقيقة أن طفرة سلالة جرثومية متنحية تؤدي إلى نمط ظاهري مرضي في مجموعة فرعية فقط من الخلايا إلى أن حدثًا ثانويًا قد يؤدي إلى تطور كيس في هذه الخلايا ، كما هو مقترح في حالة تعدد الكيسات الجسدية السائدة.الكلىالمرض 40،41

الشكل 6 |ثلاثي الأبعاديكشف (ثلاثي الأبعاد) إعادة بناء النيفرون أن الأكياس تتطور فقط في قطاعات نيفرون محددة. (أ) صور ثلاثية الأبعاد تمثيلية مع عرض حجم الكيس لكليون كامل (اللوحات اليسرى) من الكبيبات إلى مجرى التجميع في القشرة السطحية (الزرقاء) والقشرة الوسطى (الخضراء) والمنطقة المجاورة (الحمراء) في فئران جاك. تجزئة النيفرون (اللوحات اليمنى) لثلاثة أنواع مختلفة منالنيفرون. شريط =150 ملم. (ب) احتمال تطوير الأكياس في قطاعات النيفرون المختلفة في فئران جاك. (واصلت)

الشكل 6|(تتمة) المحور الأفقي هو طول طبيعي من النيفرون يقابل 50 صندوقًا (النبيب القريب [PT] ، فيروزي ؛ Henleloop [HL] ، أبيض ؛ النبيبات الملتوية البعيدة [DCT] ، الوردي ؛ النبيبات المتصلة [CNT] ، الأصفر). (ج) صور إعادة بناء الكيسات ثلاثية الأبعاد التمثيلية مع عرض حجم الكيس للطرف الصاعد لـ HL (اللوحات اليسرى) و DCTs (الألواح الوسطى) و CNT وقنوات التجميع القشرية (CCDs) (الألواح اليمنى) في السطحية (الألواح العلوية) ، الوسط (الوسط) الألواح) ، و nephrons juxtamedullary (الألواح السفلية) في الفئران جاك. شريط=50 ملم.

الشكل 7|توصيف توزيع الكيس وحجمه في جميع أنحاء النيفرون. (أ) القياس الكمي لحجم الكيس الكلي (مجموع الكيسات لكل نيفرون) لكل مقطع نيفرون (حلقة هنلي [HL] ، أبيض ؛ النبيبات الملتفة البعيدة [DCT] ، وردي ؛ النبيبات المتصلة [CNT] ، أصفر) و (ب) طول النبيب الذي تحتله الأكياس لكل نوع من النيفرون (سطحي: أزرق ؛ وسط: أخضر ؛ juxtamedullary: أحمر) في Jackmice. يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني±SEM. تحليل التباين متبوعًا باختبار Tukey-Kramer: nephron juxtamedullary nephron [JN] مقابل النيفرون السطحي [SN]: #P <0. 0="" 5؛="" jn="" مقابل="" النيفرون="" الأوسط="" [mn]:="" *="" p=""><0. 05،="" **="" p=""><>

لاحظنا أيضًا أن تضخم الكيس هو أكثر شيوعًا في JNs منه في SNs ، على الأقل بالنظر إلى الكيس الذي يقع بين PT و CNT. على الدوام ، تم الإبلاغ عن أنه في سياق تصلب الكبيبات ، توجد الآفات الكبيبية بشكل متكرر أكثر في JNs من inSNs. أن تتدهور هي فرضية مثيرة للاهتمام تستحق المزيد من البحث.

باختصار ، نصف تقنية جديدة للتصويرالكلىثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) مع خصوصية جزيئية كافية ودقة لتسجيل التوزيع المكاني والكمي للهياكل الداخلية المصنفة على وجه التحديد (النيفرونوالأوعية والخراجات). نظرًا للراحة والسرعة والقدرة على القياس الكمي المباشر ، نتوقع أن تصبح هذه التقنية أداة قوية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للكلية.

طُرق

الحيوانات

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل "Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris" ومن قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة باريس ديكارت. تم استخدام فئران FVB / N عمرها شهرين (ن=20) لإعداد الحالة التجريبية لـالكلىتم إجراء الدراسة بعد ذلك على 2- فئران ذكور جاك عمرها أسبوع (ن=4) وزملاء في رفقاء القمامة (ن=3).

تحضير أنسجة الكلى

قبل القتل ، تم تروية الفئران ، عن طريق قسطرة داخل القلب ، مع 25 مل من محلول ملحي مملح (1000 وحدة دولية / لتر) متبوعًا بـ 75 مل من بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS). أجريت التجارب تحت تأثير الزيلازين (Rompun 2٪ ، Bayer ، Leverkusen ، ألمانيا ، 6 مجم / جرام من وزن الجسم) والكيتامين (Clorketam 1000 ، Vetoquinol SA ، Lure ، فرنسا ، 120 مجم / جرام من وزن الجسم).

لدراسات المقاصةالكلىتم إصلاحها في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة لمدة 4 ساعات وتم دمجها في 4 في المائة من الاغاروز و 1. تم قطع مقاطع بسمك {4} مم تحيط بالنقير الكلوي وتخزينها في برنامج تلفزيوني عند 4الدرجة العلمية. تم تلطيخ أقسام الكلى أولاً ثم تنظيفها.

بالنسبة للدراسات الكيميائية الهيستوكيميائية المناعية على المقاطع الرقيقة ، تم تثبيت الكلى في 4 في المائة من بارافورمالدهيد طوال الليل وتم قطع المقاطع المضمنة بالبارافين و 4- ملم.

تلطيخ

حمض الدوري - شيف تلطيخ. 1. 5- ملمالكلىتم تحضين المقاطع في حمض شيف دوري نقي أو 1: 100 PBS مخفف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل المقاصة.

الكيمياء الهيستولوجية المناعية على أقسام رقيقة مدمجة بالبارافين. تم تسخين أربعة أقسام ميكرومتر من الكلى المضمنة بالبارافين لاسترجاع المستضد وحضنت طوال الليل في 44 درجةمع لكتينات مقترنة بالفلوروكروم لتتبع الأنابيب (رودامين الفول السوداني agglutinin [RL -1072-5] وراقات جنين القمح رودامين [RL -1022-5] ، Vector Laboratories ، Burlingame ، CA ، المخفف في 1: 200) والجزء- جسم مضاد أولي محدد لتصوير مقاطع أنبوبية مميزة (Lotus tetragonolobus lectin [B -1325] ، Vector Laboratories ، مخفف في 1: 100 ؛ Mouse anti-Calbindin D28K [D -4] ، Santa Cruz ، Heidelberg ، ألمانيا ، مخفف بنسبة 1: 200 ؛ ماعز مضاد لـ AQP2 [C -17] ، سانتا كروز ، مخفف في 1: 200). في اليوم التالي ، تم تحضين الأقسام بالجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (Alexa Fluor 488 مقترن [S32354] ، Invitrogen ؛ مضاد للماعز Alexa Fluor 488 [A -11055] ، Invitrogen ؛ مضاد للفأر AlexaFluor 488 [A -21202] ، Invitrogen ، Carlsbad ، CA ؛ تم تخفيفها جميعًا عند 1: 500) قبل تلوينها بـ 40 ، 6- دياميدينو -2- فينيليندول. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne ، فرنسا) وتم تحضيرها باستخدام برنامج Fiji (الإصدار 1.50). تلطيخ الليكتين على أقسام سميكة. سمك 1. 5- ملمالكلىتم تحضين المقاطع في 44 درجةلمدة شهر واحد في Texas Red أو flfluorescein isothiocyanate المقترنة ليكتين: الفول السوداني agglutinin (RL -1072-5) وراصات جرثومة القمح (RL -1022-5) ، مخفف في 1: 1 0 0 في 0.1 بالمائة أزيد PBS و 0.1 بالمائة Triton-X. تم بعد ذلك غسل المقاطع كل يوم لمدة أسبوعين باستخدام برنامج تلفزيوني قبل المقاصة.

وظائف الكلى

المقاصة البصرية

لتصفية المقياس ، 1. 5- ملمالكلىتم تحضين المقاطع في ScaleA2 (4 M يوريا ، 0. 1 بالمائة Triton X -100 ، 1 0 بالمائة جلسرين) أو ScaleB4 (8 Murea ، 0.1 بالمائة Triton X -100 ) لمدة أسبوعين ، حتى عام واحد ، في سن 4الدرجة العلمية.

بالنسبة لتصفية BABB ، تم تجفيف أقسام الكلى 1. 5- ملم في عمليات الشطف المتتابعة من الإيثانول عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضين العينات بعد ذلك في BABB (Sigma-Aldrich ، Saint Louis ، MO) بمعدل 1: 2 لمدة يومين على الأقل عند 4 درجات.

الحصول على صورة مجهرية ثنائية الفوتون

تم تصوير الأنسجة باستخدام هلام مائي على مجهر متعدد الفوتونات المقلوب (LaVision BioTec) مزودًا بليزر Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) (الشكل التكميلي S1A). كان الطول الموجي للإثارة 815 نانومتر عند 8 بالمائة من الطاقة ، استخدمنا 20Xهدف الغمر في الماء (XLUMPLFL2 0 XW ، أوليمبوس [طوكيو ، اليابان] ؛ الفتحة الرقمية ، 0. 95 ؛ مسافة العمل ، 2.0 مم). من أجل الحصول على الفلورة ، استخدمنا كاشفًا غير قابل للفصل بنسبة 80 في المائة مع مرشح ممر النطاق 593/40 نانومتر.

تتألف الخطوة الأولى من الحصول على صورة فسيفساء ثنائية الأبعاد في مكدس z الأوسط باستخدام معلمات اكتساب دون المستوى الأمثل (400 مم × 400 مم و 1011 × 1011 بكسل ، مع تداخل بنسبة 10 في المائة ومتوسط ​​خطي عند 2) لتوجيه اختيار المجالات المركزية الأكثر صلة (الشكل التكميلي S9A) ). بمجرد تحديد شبكة XY وحقول z من الاهتمام ، تم تعديل المعلمات للحصول على صور عالية الجودة. أدى هذا النهج إلى تقليل المنطقة محل الاهتمام إلى 5X12 حقلاً لكل مكدس z. بعد ذلك ، حصلنا على 850 z مكدس / شرائح بصرية (حجم خطوة 1- مم) تحيط بالنقير الكلوي في الجزء الأوسط منالكلىالجزء.

خياطة الصور ومعالجتها وتتبعها تم تجانب كل مكدس وفقًا للطريقة التي طورها Preibischet al. sc / فيجي). نظرًا لأننا لاحظنا تحولًا مهمًا بين صورتين متجاورتين بعد التركيب ، فقد كتبنا برنامج مطابقة مخصصًا في Python. يعوض هذا البرنامج عن تحول الصورة ، مما يسمح لنا بمحاذاة الصور بشكل صحيح (الشكل التكميلي S9B). تم تحليل الصور المصححة باستخدام Imaris الإصدار 8.4.2 (Bitplane ، زيورخ ، سويسرا). تم تتبع الأنابيب والأوعية باستخدام الوضع اليدوي لحزمة تتبع الفتيل في Imaris وانضم إليها Imaris Xtension الذي طورناه باستخدام MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone _ انضمام _ الفتيل _ Tool.zip؟dl =0) (الشكل التكميلي S9C). تم إعادة بناء كيسات الكبيبات والأكياس ثلاثية الأبعاد باستخدام الوضع اليدوي للحزمة السطحية لـ Imaris. ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعادتم عرض التنظيم المكاني الكبيبي باستخدام الوضع اليدوي لحزمة البقع من Imaris.

قياس الشكل

تم تحديد طول القطعة الأنبوبية وطول النيفرون والاستقامة باستخدام حزمة تتبع الفتيل من Imaris. وفقًا لبرنامج Imaris ، تم قياس الاستقامة على أنها النسبة بين المسافة بين نقطتين وطول مسار مقطع النيفرون. واحد وثلاثون PT و 12 صحيحًاالنيفرونتم إعادة بنائها وقياسها في 3 فئران من النوع البري ، في حين أعيد بناء 37 PT و 17 wholenephrons وقياسها في 4 فئران جاك. تم تحديد أحجام الكيس والكتل باستخدام "الحزمة السطحية" لإماريس. تم قياس واحد وثلاثين و 34 من الكبيبات في الفئران البرية من النوع والجاك ، على التوالي. تم قياس أربعة وسبعين كيسًا في المجموع.

تم قياس زوايا "الخروج من المستوى" للانعطافات الأنبوبية (المشار إليها باسم "بيتا") بين المستوى (المحدد بواسطة 3 نقاط متتالية) والاتجاه مع نقطة التفتيش الرابعة المتتالية التالية (الشكل 5 ب). لتقييم الدلالة الإحصائية للتحيز الملحوظ ، قمنا بمحاكاة توزيع زوايا بيتا مع الدوران العشوائي لزوايا بيتا (محاكاة مونت كارلو) في الهياكل التي تتكون من نفس الأجزاء مع نفس مجموعة زوايا ألفا.

لحساب احتمال حدوث آفة كيسية جنبًا إلى جنب مع مقاطع النيفرون ، قمنا بتمثيل كل نيفرون بمجموعة من النقاط في الفضاء. تم شرح كل نقطة فيما يتعلق بوجود كيس مقابل الهيكل الطبيعي ونوع المقطع. تم حساب الاحتمال عند كل طول معياري (تم تعيينه على 50 حاوية) على أنه النسبة بين عدد النقاط مع التعليق التوضيحي الكيسي والعدد الإجمالي للنقاط في الحاوية.

لحساب متوسط ​​المسافة البينية الكبيبية ، أخذنا في الاعتبار لكل كبيبة متوسط ​​المسافة البينية الكبيبية المحسوبة على أقرب 5 كبيبات.

تحليلات البيانات والإحصاءات

يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني ± SEM. تم تقييم الفروق بين المجموعات التجريبية باستخدام تحليل التباين الذي تم اتباعه ، عندما يكون ملحوظًا (P <{0}. 0="" 5)="" ،="" بواسطة="" اختبار="" tukey-kramer.="" عندما="" تمت="" مقارنة="" مجموعتين="" فقط="" ،="" تم="" استخدام="" اختبار="" mann-whitney.="" تم="" إجراء="" التحليلات="" الإحصائية="" باستخدام="" برنامج="" graph="" prism="" (sandiego="" ،="" ca="" ،="" الإصدار="">

إفشاء

أعلنت جميع المؤلفين لا المصالح المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر مختبر مختبر الحيوانات المتحركة والمتحورة وراثيًا (LEAT) ، ومنصات الأنسجة والتصوير لهيكل الاتحاد الفيدرالي deRecherche Necker للمساعدة التقنية. نشكر بيير إيسنارد وماري كلير جوبلر ونيكولاس كوبرفاسر على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للبحوث والبحوث الطبية ، وجامعة باريس ديكارت ، و Help Publique - Hôpitaux de Paris ، و Agence Nationale de laRecherche ، و Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I ، RochePharma Research and Early Development (بازل ، سويسرا) و INstitut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (باريس ، فرنسا).

الكاتب الاشتراكات

قام كل من TB و NG و MZ بتصميم وتنفيذ التجارب وتحليل البيانات. أجرى FB و LT ​​و MGT و SG أيضًا بعض التجارب وحللت البيانات. أجرى MB و CN تجارب الماوس. ساهم كل من TB و MZ أيضًا في كتابة المخطوطة ، وقام GF بمراجعة المخطوطة. قدم كل من FT و MP الإطار المفاهيمي وصمما الدراسة ، وأشرفوا على المشروع ، وكتبوا الورقة.

Cistanche - الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للكلى النيفرون

المواد التكميلية

ملف تكميلي (PDF)

الشكل S1. الإعداد التجريبي وإجراء الاستحواذ ومعالجة الصور.

الشكل S2. حدود إشارة التألق الذاتي في دقة XY و z.

الشكل S3. صورة ثنائية الأبعاد للانتقال بين PT وTL على 4- مم بارافين مضمنالكلىأقسام.

الشكل S4. صورة ثنائية الأبعاد للانتقال بين TAL و DCT على أقسام الكلى المضمنة بالبارافين 4- مم.

الشكل S5. صورة ثنائية الأبعاد للانتقال بين DCT و CNT على أقسام الكلى المضمنة بالبارافين 4- مم.

الشكل S6. تكشف إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد عن 3 أشكال مختلفة من الأنابيب القريبة.

الشكل S7.ثلاثي الأبعادإعادة الإعمار يكشف أن طول وتجزئةالنيفرونلا تتأثر الخراجات.

الشكل S8. كثافة الكبيبات في السيطرة والكيسيالكلى.

الشكل S9. إجراءات الاقتناء ومعالجة الصور اللاحقة للمعالجة الجدول S1. مقارنة بين طرق المقاصة ملف تكميلي (أفلام)

فيلم S1. يحسن تلطيخ الليكتين بشكل ملحوظ الدقة ونسبة الإشارة إلى الخلفية.

فيلم S2. تتبع مسار الأنبوب.

فيلم S3. إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للكلية المطهرة ، مما يدل على الوصل بين النبيب القريب والطرف الرقيق لحلقة هنلي.

فيلم S4. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للكلية المطهرة تظهر الوصلة بين الطرف الصاعد السميك من Henleloop والنبيب الملتوي البعيد.

فيلم S5.ثلاثي الأبعادإعادة بناء تطهيرهاالكلىإظهار الوصلة بين النبيب الملتوي البعيد والنبيب الموصل.

فيلم S6. يختلف شكل وحجم الأنابيب القريبة باختلاف عمقها.

فيلم S7. إعادة بناء النيفرون ثلاثي الأبعاد في الفئران الضابطة.

فيلم S8. تتبع مسار سفينة من وعاء مقوس إلى وعاء مشع قشري.

فيلم S9. تقوم الأوعية المقوسة بنمذجة شكل الأنابيب المتجاورة.

فيلم S10.النيفرونتميل إلى الاستلقاء في الطائرة.

فيلم S11. تُظهر إعادة بناء النيفرون ثلاثية الأبعاد نمطًا محددًا لتطور الكيس.

فيلم S12.ثلاثي الأبعاديكشف تجزئة النيفرون أن الأكياس تتطور في قطاعات نيفرون محددة.

فيلم S13. الترتيب المكاني والعلاقة المتبادلةالنيفرونوالأوعية في تكيس متعددالكلى.

المراجع

1. ريتش AR. ضعف غير موصوف حتى الآن للتكتل المجاور للنخاع في الكلية الشحمية. مستشفى بول جونز هوبكنز. 1957 ؛ 100: 173 - 186.

2. Bankir L، Bouby N، Trinh-Trang-Tan MM. عدم تجانس تشريح الكلية. ملحق Int الكلى. 1987 ؛ 20: S25 – S39.

3. كريستنسن إي ، جران ب ، كريستوفرسن آي بي وآخرون.ثلاثي الأبعادإعادة بناء نفرون الفئران. أنا J Physiol Physiol. 2014 ؛ 306: F664 – F671.

4. Zhai XY ، Birn H ، Jensen KB ، et al. إعادة البناء الرقمية ثلاثية الأبعاد والبنية التحتية الدقيقة للنبيبات القريبة من الماوس. J آم سوك نفرول ، 2003 ؛ 14: 611-619.

5. Zhai XY ، Thomsen JS ، Birn H ، وآخرون. إعادة بناء ثلاثي الأبعاد لنفرون الفأر. J آم سوك نفرول. 2006 ؛ 17: 77-88.

6. Puelles VG ، Moeller MJ ، Bertram JF. يمكننا أن نرى بوضوح الآن: التصفية الضوئية والكلىقياس الشكل. بالعملة أوبين نفرول هيبرتنز 2017 ، 26: 179-186.

7. Seo J ، Choe M ، Kim SY. تقنيات المقاصة والتوسيم للأنسجة البيولوجية الكبيرة الحجم. خلايا مول. 2016 ؛ 39: 439-446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen، nebst Anhang: Über Knochenfärbung. لايبزيغ ، ألمانيا: S. Hierzel ؛ 1914.

9. Hama H ، Kurokawa H ، Kawano H ، et al. مقياس: نهج كيميائي للتصوير الفلوري وإعادة بناء دماغ الفأر الشفاف. Nat Neurosci. 2011 ؛ 14: 1481-1488.

10. Ertürk A ، Becker K ، Jährling N ، et al.ثلاثي الأبعادتصوير أعضاء خالية من المذيبات باستخدام 3DISCO. نات بروتوك. 2012 ؛ 7: 1983-1995.

11. Kuwajima T ، Sitko AA ، Bhansali P ، et al. كليرت: طريقة تنظيف خالية من المنظفات والمذيبات للأنسجة العصبية وغير العصبية. 2013 ؛ 140: 1364-1368.

12. Ke MT ، Imai T. المقاصة البصرية لعينات الدماغ الثابتة باستخدام SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014 ؛ 66: 2.22.1-2.22.19.

13. Chung K، Deisseroth K. CLARITY لرسم خرائط للجهاز العصبي. NatMethods. 2013 ؛ 10: 508-513.

14. Tomer R ، Ye L ، Hsueh B ، Deisseroth K. Advanced CLARITY للتصوير السريع والعالي الدقة للأنسجة السليمة. نات بروتوك. 2014 ؛ 9: 1682–1697.

15. Yang B ، Treweek JB ، Kulkarni RP ، وآخرون. التنميط الظاهري للخلية الواحدة مع الأنسجة السليمة الشفافة من خلال تطهير الجسم بالكامل. خلية. 2014 ؛ 158: 945-958.

16. Susaki EA ، Tainaka K ، Perrin D ، وآخرون. تصوير الدماغ بالكامل بدقة خلية واحدة باستخدام الكوكتيلات الكيميائية والتحليل الحسابي. الخلية 2014 ؛ 157: 726-739.

17. Alanentalo T ، Asayesh A ، Morrison H ، et al. التصوير الجزيئي المقطعي والتقدير الكمي ثلاثي الأبعاد داخل أجهزة الفأر البالغة. طرق نات 2007 ؛ 4: 31-33.

18. Parra SG ، Chia TH ، Zinter JP ، et al. الفحص المجهري متعدد الفوتونات لأعضاء الفئران التي تم تطهيرها. J بيوميد Opt. 2010 ؛ 15: 036017.

19. Renier N ، Wu Z ، Simon DJ ، وآخرون. iDISCO: طريقة بسيطة وسريعة لتجميع عينات الأنسجة الكبيرة لتصوير الحجم. خلية. 2014 ؛ 159: 896-910.

20. Lee H و Park JH و Seo I وآخرون. تطبيق محسّن لتقنية إزالة الأنسجة الكهربية ، CLARITY ، على الأعضاء الصلبة السليمة بما في ذلك الدماغ والبنكرياس والكبد ،الكلىوالرئة والأمعاء. BMC ديف بيول. 2014 ؛ 14: 1-7.

21. Iversen BM ، Amann K ، Kvam FI ، et al. زيادة ضغط الشعيرات الدموية الكبيبية وحجمها يتوسطان في حدوث تصلب الكبيبات في قشرة SHR المجاورة للقشرة النخاعية. أنا J Physiol Physiol. 1998 ؛ 274: F365-F373.

22. Angelotti ML ، Antonelli G ، Conte C ، Romagnani P. تصوير الكلى: من الضوء إلى الفحص المجهري فائق الدقة. زرع الكلى 2021 ؛ 36: 19-28.

23. Puelles VG ، van der Wolde JW ، Schulze KE ، et al. التحقق من صحة طريقة ثلاثية الأبعاد لعد وتغيير حجم الخلايا في الكبيبات الكاملة. J آم سوك نفرول. 2016 ؛ 27: 3093-3104.

24. Pannabecker TL، Dantzler WH، Layton HE، Layton AT. دورثلاثي الأبعادالعمارة في آلية تركيز البول في النخاع الكلوي الداخلي. أنا J Physiol Physiol. 2008 ؛ 295: F1271-F1285.

25. Saritas T ، Puelles VG ، Su XT ، وآخرون. المقاصة البصرية في الكلى تكشف عن إعادة تشكيل النبيبات بوساطة البوتاسيوم. ممثل الخلية .2018؛ 25: 2668–2675.e3.

26. Schuh CD ، Polesel M ، Platonova E ، وآخرون. يكشف التصوير الهيكلي والوظيفي المشترك للكلية عن اختلافات محورية رئيسية في الالتقام النبيبي الصغير. J آم سوك نفرول. 2018 ؛ 29: 2696-2712.

27. براون DA ، هيلدبراندت F. Ciliopathies. كولد سبرينج هارب بيرسبكت بيول 2017 ، 9: a028191.

28. Bergmann C، Guay-Woodford LM، Harris PC، et al. تكيسالكلىمرض. نات ريف ديس بريم. 2018 ؛ 4:50.

29. ويلسون بد. مرض تكيس الكلى. إن إنجل جي ميد. 2004 ؛ 350: 151–164.

30. Laitinen L ، Virtanen I ، Saxén L. التغييرات في نمط الارتباط بالجليكوزيل أثناء التطور الجنيني لكلية الفأر كما يتضح مع اقتران المحاضرات. ي هيستوكيم سيتوتشيم. 1987 ؛ 35: 55-65.

31. Smith LA ، Bukanov NO ، Husson H ، et al. تطور مرض تعدد الكيسات في فئران الكلى الكيسية الأحداث: نظرة ثاقبة على التسبب في المرض ، والتشوهات الهدبية ، والسمات المشتركة مع المرض البشري. J AmSoc Nephrol. 2006 ؛ 17: 2821-2831.

32. Liu S، Lu W، Obara T، et al. يتسبب عيب في كيناز عائلة Nek في الإصابة بمرض الكلى الكيسي في الفأر وفي أسماك الزرد. التنمية 2002 ؛ 129: 5839-5846.

33. Franke M ، Baeßler B ، Bechtel J ، وآخرون. رسم خرائط بالرنين المغناطيسي T2 والتصوير الموزون بالانتشار للكشف المبكر عن تكون المثانة والاستجابة للعلاج في نموذج فأر لمرض الكلى المتعدد الكيسات.الكلىكثافة العمليات 2017 ؛ 92: 1544-1554.

34. Barry DM، McMillan EA، Kunar B، et al. المحددات الجزيئية لتخصص الأوعية الدموية في الكليةالكلى. نات كومون. 2019 ؛ 10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N، Jafree DJ، Long DA. الاتصال البطاني الظهاري في تكيس متعددالكلىالمرض: دور إشارات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية. إشارة الخلية. 2020 ؛ 72: 109624.

36. سريفاستافا إس ، موليناري إي ، رامان إس ، ساير جا. العديد من أمراض الجينات الأولى؟ 2017 ؛ 5:287.

37. Fry AM ، O'Regan L ، Sabir SR ، Bayliss R. تنظيم دورة الخلية من قبل عائلة NEK من البروتين كينازات. ي خلية العلوم. 2012 ؛ 125: 4423–4433.

38. Otto EA، Trapp ML، Schultheiss UT، et al. تؤثر طفرات NEK8 على التوطين الهدبي والوسطى وقد تسبب الإصابة بسرطان الكلية. J آم سوكنيفرول. 2008 ؛ 19: 587-592.

39. Wilson PD. قطبية Apico-basal في ظهارة مرض الكلى المتعدد الكيسات. 2011 ؛ 1812: 1239-1248.

40. Happé H ، Leonhard WN ، van der Wal A ، et al. يسرع الضرر الأنبوبي السام في الكلى من الفئران المحذوفة من Pkd 1- تكوّن الكيسات مصحوبًا بقطبية خلوية مستوية غير منظمة ومسارات إشارات Wnt الكنسية. همهمة مول جينيه. 2009 ؛ 18: 2532-2542.

41. Piontek K ، Menezes LF ، Garcia-Gonzalez MA ، et al. يحدد مفتاح النمو الحرج حركية تكوين كيس الكلى بعد خسارة Pkd1. نات ميد. 2007 ؛ 13: 1490-1495.

42. Ikoma M ، Yoshioka T ، Ichikawa I ، Fogo A. آلية عدم القابلية للتأثر بالكبيبات القشرية العميقة للنضجالكلىللتصلب الكبيبي الشديد البؤر. بيدياتر الدقة. 1990 ؛ 28: 270-276.

43. Preibisch S ، Saalfeld S ، Tomancak P. خياطة مثالية عالميًا لـtiled 3D (ثلاثي الأبعاد) اقتناء الصور المجهرية. المعلوماتية الحيوية. 2009 ؛ 25: 1463-1465.