ينقذ Tubuloside B من Cistanche Salsa الخلايا العصبية PC12 من 1- ميثيل -4- موت الخلايا المبرمج الناجم عن أيون الفينيل والإجهاد التأكسدي

مقدمة

من الناحية المرضية، يتميز مرض باركنسون المتقطع (PD) عادةً بفقد الخلايا العصبية الكاتيكولامينية، وخاصة الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء المكتنزة (SNc)، ووجود خلايا عصبية داخلية مميزة|شوائب تسمى أجسام ليوي في مناطق الدماغ المصابة. على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من العوامل المتورطة في التسبب في مرض باركنسون، إلا أن الآليات المشاركة في بدء وتطور مرض باركنسون تظل غير مؤكدة، وعلى الرغم من أن سبب مرض باركنسون لا يزال محل إجابة، إلا أن العديد من خطوط الأدلة تشير بقوة إلى تورط الإجهاد التأكسدي، مما يؤدي أخيرًا إلى موت الخلايا العصبية أو موت الخلايا المبرمج عن طريق التوليد المفرط للجذور الحرة. حقيقة أن نظام الدوبامين الأسود يمكن أن ينتج مستويات عالية من الجذور الحرة ولديه مستويات منخفضة نسبيًا من نظام الدفاع التأكسدي يدعم هذه الفرضية. أظهرت الدراسات التي أجريت في الجسم الحي وفي المختبر سمية عصبية مؤكسدة بوساطة الإجهاد لـ MPP +، وهو مستقلب نشط لـ l-ميثيل-4- فينيل-l,2,3,6- رباعي هيدروبيريدين (MPTP) على الخلايا العصبية الدوبامينية. إن تورط الجذور الحرة التي تنتج بشكل مفرط عن طريق الإجهاد التأكسدي كسبب مباشر للاضطرابات التنكسية العصبية مثل PD يشير إلى دور محوري لمضادات الأكسدة. كان Tubuloside B (الشكل l) أحد مركبات الفينيليثا النويدية المعزولة من سيقان Cistanche salsa. وقد وجدت الدراسات السابقة أن العديد من الفينيليثانويدات، بما في ذلك توبولوسيد ب، أظهرت نشاطًا قويًا في التخلص من الجذور الحرة.

بالنظر إلى هذه النتائج، فقد بحثنا في هذه الدراسة في تأثير tubu]nside B على السمية العصبية التي يسببها MPP+-في المختبر، وذلك باستخدام خط خلايا ورم القواتم العصبي الودي PC12 الذي تم استخدامه بنجاح على مر السنين لدراسة الوظيفة العصبية.

سيستانش توبولوسا الطبيعي للوقاية من مرض باركنسون PHGS75% ECH 30% ACT 12%

المواد والأساليب

مواد

تم توفير Tubuloside B من Cistanche Salsa من قبل الدكتور Li Lei (قسم المنتجات الطبيعية، كلية العلوم الصيدلانية، جامعة بكين، بكين، الصين). بلغت نسبة نقاء المركب أكثر من 98% بتحليل HPLC. تم شراء وسط النسر (DMEM) المعدّل من Dulbecco ومصل الحصان ومصل العجل الجنيني من GIBCO BRL، 1- ميثيل ~ - فينيل بيريدي أيون الأونيوم (MPP + ) ، poly-L-lysine، 3- (4، {{ {8}}ثنائي ميثيل ثيازول-2 -yl)-2،5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT)، يوديد البروبيديوم (PI)، RNase A، بروتيناز K، و2؛ تم شراء 7'-ثنائي كلوروفلوريسئين ثنائي الأسيتات (DCFH-DA) من سيجما.

زراعة الخلايا

تم الحفاظ على خلايا PCI2 في DMEM مكملة بـ 10٪ من مصل الحصان، و5٪ من مصل العجل الجنيني، و100 وحدة / مل من البنسلين و100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. تمت زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة ومهوّاة بنسبة 95% هواء و5% ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة. تم إجراء جميع التجارب 24-48 ساعة بعد زرع الخلايا. تم حصاد الخلايا بشكل روتيني عن طريق التربسين 0.25٪ عندما اقتربت الخلايا من مرحلة الالتحام الفرعي ومطلية في قوارير استزراع 25 سم مقسمة بنسبة 1: 8.

تحليل بقاء الخلية

تم تحديد صلاحية الخلية باستخدام اختبار MTT المعدل كما هو موضح سابقًا [10]، باختصار، تم زرع خلايا PC12 في 96- صفائح بئر بكثافة I × 104 خلية لكل بئر. تمت زراعة المزارع لمدة 48 ساعة، ثم تم تغيير الوسط إلى وسط يحتوي على تركيزات مختلفة من Burnside B أو MPP+. بعد الحضانة لمدة تصل إلى 48 ساعة و72 ساعة، تمت إضافة محلول MTr (5 مجم / مل في DMEM) إلى أطباق البئر 96-، وتم السماح للخلايا بالاحتضان لمدة 4 ساعات عند 37 درجة. بعد إزالة الوسيط، كانت بلورات الخلية والصبغة عبارة عن تغذية قابلة للذوبان بإضافة 200 ميكرولتر من DMSO، وتم قياس الامتصاص عند 570 نانومتر (540 نانومتر كمرجع) باستخدام قارئ صفيحة ميكروية نموذجية 550 (Bio-Rad). تم أيضًا تحليل صلاحية الخلية باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق. تم جمع الخلايا وتكويرها بلطف وصبغها بمحلول 0.6٪ من التريبان الأزرق لمدة 3 أمطار. تم بعد ذلك تقييم النسبة المئوية للخلايا غير الملونة في عشرة مجالات مجهرية تم اختيارها عشوائيًا. كدواء إيجابي، تم استخدام 100 نانوجرام/مل عامل نمو البشرة (EGF).

سيستانش توبولوسا الطبيعي لنشاط إزالة الجذور الحرة PHGS75% ECH 30% ACT 12%

الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق التدفق الخلوي

تم الكشف عن خلايا موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) [11]. باختصار، تم حصاد حوالي 1 × 1 06 خلايا محتضنة بمواد اختبار بواسطة الطرد المركزي وتم غسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. تم إصلاح الخلايا باستخدام 7 0٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة عند درجة - 20 وغسلها مرة واحدة باستخدام PBS. تم بعد ذلك إعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5 مجم / مل RNaseA و 0.5 مجم / مل PI. بعد مزيد من الحضانة لمدة 30 دقيقة في الظلام، تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام FACScan (بيكتون ديكنسون، هايدلبرغ، ألمانيا).

تحليل تجزئة الحمض النووي عن طريق الكهربائي

قمنا بتطبيق بروتوكول مور [12] الذي عزل الحمض النووي المجزأ فقط وتم تطبيع التجارب باستخدام عدد متساو من الثقافات من كل مجموعة اختبار. باختصار، تم غسل 3 × 106 خلايا عصبية من كل عينة من العينات المعالجة في محلول ملح هانك المتوازن (1000 جم لمدة 10 دقائق)، وتم تجانس الكريات المتكونة في قاع الأنبوب مع 1 مل من محلول التحلل (10 مللي مولار تريس عند درجة الحموضة 7.4.5 مللي مولار EDTA، 1% Triton X -100) لمدة 20 دقيقة على الجليد. بعد الطرد المركزي عند 11.000 جم لمدة 20 مطر عند 4 درجات، تمت إزالة المواد الطافية التي تحتوي على الحمض النووي المجزأ وهضمها باستخدام 20 مجم/مل RNase A عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة، و0.1 مجم/مل بروتيناز K عند 56 درجة. لمدة 1 ساعة إضافية. تم استخلاص الحمض النووي المجزأ باستخدام الفينول والكلوروفورم، وتم طرده عند درجة حرارة 1O,000 جم لمطر واحد عند درجة حرارة 4 مئوية. تم نقل الطور المائي إلى أنبوب إيبندورف جديد، ممزوجًا بحجمين من الإيثانول المثلج ثم توضع عند 20 درجة لمدة ساعة واحدة على الأقل لترسيب الحمض النووي. بعد الطرد المركزي عند 15,000 جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات، تمت إزالة المواد الطافية، وتم غسل كريات الحمض النووي باستخدام 80٪ إيثانول مرة واحدة (15000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات)، وتجفيفها بالهواء، وإذابتها في 20 ميكرولتر TE العازلة عند درجة الحموضة 7.6. تم بعد ذلك نقل العينة بأكملها بالكهرباء على هلام الاغاروز بنسبة 1.5% لمدة ساعة واحدة عند 85 فولت. وتم فحص الهلام وتصويره بواسطة نظام توثيق جل المنتجات فوق البنفسجية (GELDOC-2000، Bio-Rad، الولايات المتحدة الأمريكية).

قياس تشكيل ROS داخل الخلايا

تم الكشف عن تكوين البيروكسيدات داخل الخلايا باستخدام مجهر ليزر مسح متحد البؤر باستخدام مركب غير فلوري، ثنائي أسيتات ثنائي كلوروفلوريسئين 2"7" (DCFH-DA) [13]، والذي يتم إزالة الأسترة داخل الخلايا عن طريق استريزات داخلية إلى المادة الحرة المتأينة. حمض، 2;7"-ثنائي كلوروفلوريسئين. 2"،7-ثنائي كلوروفلوريسئين قابل للأكسدة إلى فلورسنت 2"7"-ثنائي كلوروفلوريسئين (DCF) بواسطة مضادات الأكسدة المائية. تم تحضين الخلايا بـ 10 ميكرومتر DCFH-DA لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة. تم غسل الثقافات مرتين بمحلول ملح هانك المتوازن وتصويرها في نفس الوسط. تم التصوير باستخدام مجهر ليزر مسح متحد البؤر، وكان متحمس DCF عند 488 نانومتر وكان مرشح الانبعاثات مرشح حاجز 510 نانومتر، لتوفير مقارنة صالحة، تم استخدام نفس معلمات الاستحواذ لجميع الملاحظات. تم تعيين الموضع الرأسي الأمثل في منتصف الخلايا، ومن ثم تم فحص الحقل بسرعة. نظرًا لأن الإضاءة عند الطول الموجي للإثارة البالغ 488 نانومتر تسببت في زيادة التألق بسبب أكسدة هذه الصبغة، فقد تم تعريض كل حقل إلى Iight في نفس الوقت. تم استخدام القيم الأساسية من الخلايا غير المحفزة كقيم تحكم للمقارنة مع الخلايا المعالجة MPP + في وجود أو عدم وجودتوبولوسيد ب. بعد المسح، تم قياس متوسط ​​كثافة التألق النسبي في 15-20 أجسام الخلايا العصبية لكل مجال مجهر في أربع ثقافات منفصلة لكل حالة علاج.

تحليل احصائي

تم التعبير عن جميع القيم التي تم الحصول عليها كوسيلة ± SD. تم تحديد الأهمية الإحصائية للاختلافات بين المجموعات عن طريق اختبار الطالب؛ تم اعتبار القيم p المحسوبة التي تقل عن 0.05 ذات دلالة إحصائية.

نتائج

كما هو مبين في الشكل 2، أنتج MPP+ انخفاضًا معتمدًا على الجرعة في صلاحية خلايا PCI2. في المقابل، أنتج EGF، وهو عامل تغذية عصبي معروف، حماية كبيرة لبقاء الخلية عند 100 نانوغرام/مل من MPP+ كما تم تخفيف التأثيرات السامة للخلايا في وجود توبولوسيد B (5، 10، 50 أو 100 ميكروغرام-مل{{12} })، على الرغم من أنها أقل فعالية من المرجع

المخدرات (الشكل 3) . أظهر توبولوسيد ب عند هذه التركيزات تأثيرات وقائية للخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة ولم يسبب المركب وحده أي سمية واضحة للخلايا (البيانات غير معروضة). أظهر التحليل الكهربي الهلامي لمستخلص الحمض النووي من خلايا PCI 2 المعالجة بـ 200 ميكرومتر MPP+ لمدة 48 ساعة تدرج الحمض النووي. السمة المميزة الكلاسيكية لموت الخلايا المبرمج، توبولوسيد ب، عند جرعات تبلغ 10 و100 ميكروجرام·مل-1 تكوين متعلم لسلّم الحمض النووي (الشكل 4) . يُظهر الشكل 5 رسومًا بيانية نموذجية لتحليل قياس التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج الناجم عن MPP＋ في خلايا PC12 في وجود أو عدم وجود توبولوسيد B. كشف القياس الكمي لملف دورة الخلية باستخدام PI عن عدد الخلايا ذات خصائص الصبغيات الفرعية (منطقة M1). يدل على تجزئة الحمض النووي المبرمج. في الخلايا غير المعالجة، كان جزء الصبغيات الفرعية المبرمج في حده الأدنى يصل إلى 5．94％ من إجمالي 10000 خلية (الشكل ．5 أ). بعد التعرض لمدة 48 ساعة لـ MPP＋، زادت نسبة موت الخلايا المبرمج إلى 43．02;j;(الشكل 5 ب)．. عند إضافته إلى ثقافة الخلية، توبولوسيد بيمنع MPP+-موت الخلايا المبرمجبطريقة تعتمد على الجرعة. عند تركيز 10 ميكروغرام · مل-1، لم تكن الحماية بواسطة توبولوسيد B ذات دلالة إحصائية، ولكن عند 50 و1 00 ميكروجرام·مل-1، انخفضت بنسبة 45 ％ و63％ على التوالي، وقد لوحظ. زيادة النسبة المئوية لخلايا البقاء على قيد الحياة (الشكل 5D، E) .

يمكن اكتشاف تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا باستخدام خلايا DCFH-DA．PC12 المعالجة بـ 200 ميكرومتر MPP＋ لمدة 48 ساعة معروضة مضانًا مكثفًا داخل الخلية بعد صبغها بصبغة DCFH-DA (الشكل 6). العلاج المتزامن مع توبولوسيد ب (بجرعات 10 و 100 ميكروغرام · مل) يثبط إنتاج الـ ROS المستحث بـ MPP＋一 (النسبة المئوية المخفضة كانت 24．52％ و55．63％، على التوالي).

سيستانش توبولوسا الطبيعي لعلاج مرض باركنسون PHGS75% ECH 30% ACT 12%

مناقشة

تتضمن التسبب في مرض باركنسون إجهادًا تأكسديًا قويًا، وانخفاض مستويات مضادات الأكسدة، وعيوب الميتوكوندريا. ومن المعروف أنها تحفز موت الخلايا المبرمج في العديد من الأنظمة الخلوية. على وجه الخصوص، ثبت أن الجذور الحرة تؤدي إلى موت الخلايا النشطة في الخلايا العصبية. ينتج MPTP متلازمة شبيهة بالشلل الرعاش لا رجعة فيها وتسبب انحطاطًا انتقائيًا للخلايا العصبية الدوبامينية السوداوية المخططية لدى البشر. وقد تم استخدام هذا السم العصبي لخلق. يتم تحويل النماذج الحيوانية المتناولة من PD[15]-MPTP بواسطة أوكسيديز أحادي الأمين B إلى Mpp＋، والتي تتراكم في الميتوكوندريا. حيث يثبط مركب الميتوكوندريا الأول وخلل الميتوكوندريا. وظيفة تسبب موت الخلايا المبرمج [16] . لذلك، تم استخدام السمية العصبية المستحثة بـ MPP+一 في الخلايا العصبية الدوبامينية على نطاق واسع كنموذج مسبب للمرض PD لفحص العوامل الوقائية العصبية.

في الدراسة الحالية، أثبتنا أن موت الخلايا الناجم عن MPP+-من خلال الإجهاد التأكسدي في خلايا PC12 انخفض بواسطة توبولوسيد B. علاوة على ذلك، أثبتنا أن توبولوسيد B محمي أيضًا بطريقة تعتمد على الجرعة ضد MPP{{ 3}} تحفيز سلم الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج، كما تم قياسه باستخدام التحليل الكهربي لهلام الحمض النووي وتحليل التدفق الخلوي. علاوة على ذلك، فإن العلاج المتزامن بتركيزات أعلى من توبولوسيد B يمنع إنتاج ROS الناجم عن MPP. وهكذا، أظهر توبولوسيد ب تأثيرات وقائية عصبية متعددة الوظائف. قد تشارك عدة آليات، منفصلة أو مجتمعة، في عمل توبولوسيد ب. إن التأثير المضاد للأكسدة هو آلية محتملة للوقاية العصبية بوساطة توبولوسيد ب. وجد Xiong Q أن توبولوسيد B أظهر نشاطًا قويًا لمسح الجذور الحرة على 1،1- ثنائي فينيل -2- جذر بيكريل هيدرازيل وزانثين] أوكسيديز الزانثين الذي ولّد جذر أنيون الأكسيد الفائق.

تم الإبلاغ مؤخرًا عن أن العديد من الفينيليثانويدات تمتلك خصائص مسح الجذور الحرة وتحمي الإصابات السامة الناجمة عن الإجهاد التأكسدي. ROS التي تنتجها MPP + مثل بيروكسيد الهيدروجين وأنيون الأكسيد الفائق وجذر الهيدروكسيل تلحق الضرر بسهولة بالجزيئات البيولوجية، مما قد يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج أو موت الخلايا النخرية. وبالتالي، قد يكون للتوبولوسايد ب تأثيرات مباشرة ضد أنواع الأكسجين التفاعلية. في حين أن بياناتنا لا تحدد الموقع الدقيق الذي يعمل فيه توبولوسيد ب على قمع تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية، إلا أنها تشير إلى أن آلية الحماية العصبية تتضمن تحفيز مسارات مضادات الأكسدة. تشير دراسة التركيب الجزيئي للتوبولوسيد ب أيضًا إلى أنه يمتلك قدرة قوية علىالكسح الجذور الحرة(اتصال شخصي).

وقد تكون الآليات الأخرى ذات صلة أيضاً. على سبيل المثال، قد يكون لدى توبولوسيد B القدرة على مواجهة سمية MPP+ عن طريق تثبيط فتح المسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا والخلل الوظيفي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضًا أخذ ما إذا كان للتوبولوسايد ب له تأثير مباشر على تعزيز النمو على الخلايا العصبية في الاعتبار. لا تزال الآلية الدقيقة للعمل الوقائي العصبي للتوبولوسيد ب غير واضحة. هناك حاجة لدراسات إضافية لتوضيح الصورة الكاملة لتأثيره الوقائي للأعصاب.

بشكل قاطع، توبولوسيد ب منمستخلص سيستانش السالساله تأثيرات وقائية واضحة على موت الخلايا المبرمج الناتج عن MPP+-والإجهاد التأكسدي. قد تكون آثاره الوقائية للأعصاب ضد سمية MPP + مهمة وتشير إلى أنه قد يكون له إمكانات علاجية في الوقاية من مرض باركنسون وعلاجه.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لعلاج مرض باركنسون PHGS75% ECH 30% ACT 12%