نشاط إنزيم أوكسيدوريدوكتيز الزانثين في البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية والبلازما الغنية كمؤشر للإجهاد التأكسدي لدى المرضى الذين يحتاجون إلى العلاج ببدائل الكلى

خلفية مجردة: إنزيم أوكسيدوريدوكتيز الزانثين(XOR) هو إنزيم هيدروكسيلاز يشارك في استقلاب البيورينات. يمكن أن يختلف نشاط XOR: يمكن تحويل بروتين المتجانس إلى شكلين إسويين مختلفين XD (مضاد للأكسدة) وXO (محفز للأكسدة). الإجهاد التأكسدي والالتهابات المصاحبةفشل كلوي مزمن(CKD)، وغسيل الكلى، وزرع الكلى، أدى إلى تنشيط الصفائح الدموية. تهدف الدراسة الحالية إلى تحديد تأثير العلاج ببدائل الكلى المطبق على أوكسيدوريدوكتيز الزانثين ونشاطه الإسوي.

المواد والطرق: تكونت مجموعة الدراسة من 117 مريضا، مقسمة إلى 4 مجموعات: مرضى غسيل الكلى - 30، مرضى غسيل الكلى البريتوني - 30، مرضى زرع الكلى - 27، والعلاج المحافظ {{5} } مرضى. وتتكون المجموعة الضابطة من 30 متطوعا أصحاء. النتائج: تم العثور على اختلافات كبيرة في نشاط XOR في البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية (PPP) ضمن المجموعات التي تمت دراستها (p=0.001). كانت هناك علاقة بين نوع العلاج البديل الكلوي لجميع الأشكال الإسوية المؤكسدة في تعادل القوة الشرائية (ص)<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Theسبب مرض الكلى المزمنانعكس أيضًا في الاختلافات في نشاط XD وXO في تعادل القوة الشرائية.

الاستنتاجات: إن نوع العلاج البديل الكلوي المستخدم في مرضى مرض الكلى المزمن، وعمر المرضى، ومدة غسيل الكلى، وأسباب مرض الكلى المزمن، ومرحلة التقدم يؤثر بشكل كبير على نشاط XOR وأشكاله الإسوية.

الكلمات الدالة: الزانثين أوكسيدوريدوكتاز، الصفائح الدموية، العلاج ببدائل الكلى،فشل كلوي مزمن‎الانزيمات المضادة للأكسدة

ما هي المدة التي يستغرقها عمل سيستانشي؟

خلفية

إنزيم أوكسيدوريدوكتاز الزانثين (XOR) هو إنزيم هيدروكسيلاز يشارك في استقلاب البيورينات. إنه يحفز أكسدة الهيبوكسانثين إلى الزانثين والزانثين إلى حمض البوليك (UA). يمكن أن يختلف نشاط XOR: يمكن تحويل بروتين المتجانس إلى شكلين إسويين مختلفين. يتم التعبير عن نازعة هيدروجين الزانثين (XD) في الغالب في الأنسجة السليمة، ويتم إنشاء أوكسيديز الزانثين (XO) عن طريق تعديل XD بعد الترجمة، وبقايا السيستين المؤكسدة بالإضافة إلى التحلل البروتيني المحدود، مما يلعب دورًا مهيمنًا في الخلايا والأنسجة أثناء الإصابات [1-3 ]. أنشطة الأشكال الإسوية المذكورة تتعارض مع بعضها البعض [4]. يعمل XOR في وجود NAD+ كنازع هيدروجين، ومع الأكسجين الجزيئي كأكسيداز. تعد قدرة XOR على التحول بسرعة من مضادات الأكسدة إلى مواد مؤكسدة، في أنواع مختلفة من تلف الأنسجة، عنصرًا أساسيًا للاستجابة المناعية الفطرية السريعة، مفيدة، على سبيل المثال، في العدوى البكتيرية أو الفطرية [5].

يمكن أن يتفاعل وسيط التفاعل المكون من نازعة هيدروجين الزانثين (XDO) والأكسجين مع كل من NAD+ وO2 ولكنه يقدم درجة تقارب أعلى لـ NAD+ [6]. لم يتم عزل هذا الشكل الإسوي الوسيط، لكن تحديد نشاطه يسهل تتبع تحول XD إلى XO [7].

تم التحقيق على نطاق واسع في نشاط مصل XOR في الأمراض المختلفة. سبب الاهتمام بهذا الإنزيم هو ازدواجية عمله: القدرة على إنتاج مضادات الأكسدة، ومن ناحية أخرى، خلق أنواع الأكسجين التفاعلية. تحدث زيادة في نشاط XOR في الحالات المرضية مثل التهاب الكبد الفيروسي، وكريات الدم البيضاء المعدية، وأمراض المناعة الذاتية، والالتهاب الرئوي، والفصام، ومرض السكري من النوع الثاني. كما لوحظت الزيادة في نشاط XOR في مصل المرضى بعد زرع الكلى أو الكبد [8]. لقد ثبت أن الترميز الجيني لـ XOR قد يكون مسؤولاً عن النضج الكلوي، وتكون الشحوم في الكلى، وقد يمنع تحول الخلايا الظهارية إلى أنسجة اللحمة المتوسطة [9]. ومع ذلك، نظرًا لأفضل معرفتنا، لا توجد تقارير منشورة تبحث في نشاط XOR في البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية (PPP) والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) في المرضى الذين يخضعون للعلاج ببدائل الكلى. ترتبط أهمية نشاط XOR في هذه المجموعة من المرضى بزيادة تنشيط الصفائح الدموية، والذي يحدث بسبب الإجهاد التأكسدي والالتهاب الذي يصاحب مرض الكلى المزمن (CKD)، وغسيل الكلى، وزرع الكلى. علاوة على ذلك، أثناء غسيل الكلى وزرع الأعضاء، تتضرر الأنسجة والأوعية الدموية، وتكون الصفائح الدموية هي الخلايا الأولى التي تصل إلى موقع تلف الأنسجة، وتشارك بنشاط في المراحل الأولية من عملية الالتهاب والشفاء [10].

PRP وPPP عبارة عن أجزاء من بلازما الدم بتركيزات مختلفة من الصفائح الدموية. محتوى الصفائح الدموية في PRP وPPP هو الصفائح الدموية / مل والصفائح الدموية / مل، على التوالي. يتم الحصول على PPP وPRP عن طريق الطرد المركزي وغسل الدم الكامل للبشر بشكل متكرر بسرعات طرد مركزي مختلفة [11، 12].

يحتوي PPP، باعتباره منتجًا ثانويًا للطرد المركزي للدم المضاد للتخثر، على تركيز أقل من الصفائح الدموية مقارنة بالدم الطبيعي. المكونات الرئيسية لـ PPP هي الفيبرينوجين والفبرونكتين والثرومبين. تشارك التأثيرات البيولوجية لـ PPP في الإرقاء والتخثر، وتعمل كناقل لربط الخلايا، وتعزز الانقسام الفتيلي للخلايا الليفية والخلايا الظهارية [13]. على الرغم من أن PPP لا يتركز في الصفائح الدموية مثل PRP، فقد ثبت أن PPP يمكنه أيضًا الحفاظ على نمو الخلايا وبقائها. يعزز PPP وظائف الخلايا المرتبطة بشفاء الجروح ويسرع هجرة الخلايا وانتشار الخلايا الليفية [14، 15]. تحتوي البلازما الغنية بالصفائح الدموية على صفائح أكثر تركيزًا من البلازما الطبيعية (حوالي 150-400 × 103 خلية / ديسيلتر). إنه أحد التعريفات الأكثر شيوعًا لـ PRP في الأدبيات [16]. حتى الآن، تميزت دراسات محدودة بـ XOR ونشاطه الإسوي في البلازما الغنية بالصفائح الدموية أو الفقيرة في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن. تان وآخرون. أظهرت الخلايا المتضررة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) (في حالة العلاج البديل الكلوي المزمن) "تسرب" الأشكال الإسوية XOR، مما يؤدي إلى زيادة مستوى الإنزيم في البلازما [17]. تشرح هذه الآلية انخفاض نشاط XOR وأشكاله الإسوية في الصفائح الدموية مقارنة بـ PPP. لذلك، فإن نشاط إنزيم الأكسدة في PPP وPRP له أهمية كبيرة، حيث يمكن أن يساعد في الكشف عن العمليات الخلوية التي تحدث يوميًا. يمكن لمثل هذه التحقيقات أيضًا أن تسلط الضوء بشكل غير مباشر على شدة الإجهاد التأكسدي لدى هذه المجموعة من المرضى.

بيري وآخرون. وصف أيضًا أن إنزيم أوكسيدوريدوكتاز الزانثين يتم توزيعه في الكبد والأمعاء الدقيقة والغدة الثديية والخلايا البطانية. أثبتت طرق التوطين تحت الخلوي وجود إنزيم أوكسيدوريدوكتيز الزانثين في السيتوبلازم وعلى أغشية الخلايا. كما أنها تشير أيضًا إلى أن إنزيم أوكسيديزريدوكتاز الزانثين في البلازما قد يكون بسبب تظليل إنزيم أوكسيدوريدوكتاز الزانثين من أغشية الخلايا أو التسرب من السيتوبلازم. وهذا هو أحد الأسباب التي تجعلنا نختبر نشاط XOR في PPP وPRP لتمييز نشاط الإنزيم في الصفائح الدموية وخلايا الدم الأخرى الموجودة في البلازما [18]. واستنادا إلى نشاط الإنزيمات المضادة للأكسدة، يمكننا أيضا تحديد أي نوع من العلاج ببدائل الكلى هو أقل احتمالا لتعريض المريض للإجهاد التأكسدي. نظرًا للطبيعة المزدوجة لـ XOR، فإن فهم العلاقة بين نوع علاجات استبدال الكلى ونشاط الأشكال الإسوية XOR يمكن أن يكون مثيرًا للاهتمام ومفيدًا للغاية في اختيار نوع العلاج ببدائل الكلى.

المواد والأساليب

الموافقة الأخلاقية والموافقة

وافقت لجنة الأخلاقيات الحيوية في جامعة كلب صغير طويل الشعر الطبية في شتشيتسين على البحث الذي تم إجراؤه (رقم KB−0012/36/11). تم إبلاغ جميع المشاركين، بما في ذلك المتطوعين الأصحاء في المجموعة الضابطة، بغرض الدراسة ونطاقها وأعطوا موافقتهم على التبرع بالعينات ونشر البيانات الناتجة.

مجموعة الدراسة

كان هناك 147 مشاركًا: مجموعة مراقبة مكونة من 30 متطوعًا صحيًا (NK)، و117 مريضًا يعانون من مرض الكلى المزمن (CKD) الذين يحضرون عيادة أمراض الكلى وطب الكواكب والأمراض الباطنية التابعة لجامعة كلب صغير طويل الشعر الطبية في شتشيتسين. تم تقسيم المرضى إلى 4 مجموعات بناءً على العلاج الذي تلقوه: 30 مريضًا قبل وبعد غسيل الكلى (HD A وHD B): 30 مريضًا تلقوا غسيل الكلى البريتوني (PD)؛ 27 مريضاً قبل وبعد عمليات زرع الكلى (5-7 أيام بعد الجراحة) (TE، TE A)؛ تلقى 30 مريضاً العلاج المحافظ (CT) (المرحلة 2-5 من مرض الكلى المزمن). الجنس والعمر ومدة غسيل الكلى وسبب ومرحلة مرض الكلى المزمن وتركيز الكرياتينين في مجموعات الاختبار والسيطرة موضحة في الجدولين 1 و 2.

عينات

تم سحب عينات الدم (K2EDTA (8 مل)، 3.8٪ سترات ثلاثي الصوديوم (9: 1؛ حجم/حجم)، والمصل (8 مل)) من جميع المشاركين في الدراسة. تم سحب دم المريض الذي تم غسيله من خلال الناسور الشرياني الوريدي. تم استخدام بزل الوريد المحيطي لجميع المشاركين الآخرين. تم أخذ العينات من مرضى غسيل الكلى قبل (HD A) وبعد حوالي 10 دقائق من إيقاف المضخة (HD B). تم جمع دم مريض الزرع قبل الزرع (TE) وبعد 5-7 أيام من الجراحة (TE A). المرضى المعينون لمجموعة TE لم ينتموا إلى مجموعة مرضى غسيل الكلى أو غسيل الكلى البريتوني في هذه الدراسة. وكانوا مرضى مؤهلين للزراعة من جميع أنحاء بولندا. الغالبية العظمى من المرضى الذين خضعوا لزراعة الكلى كان لديهم تحليل نمطي سابق. تم طرد K2EDTA وعينات الدم المتخثرة عند 2600 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 20 درجة للحصول على البلازما والمصل على التوالي. للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) والبلازما الفقيرة بالصفائح الدموية (PPP)، تم طرد الدم المجمع بالسيترات في ظل الظروف عند 1100 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 20 درجة. تم نقل PRP الناتج إلى أنبوب جديد وطرده عند 6000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 20 درجة: تم نقل البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية (PPP) إلى أنبوب منفصل؛ تم شطف حبيبات الصفائح الدموية مرتين وتعليقها في محلول Tyroda (الرقم الهيدروجيني 7.4). تم تجميد البلازما والمصل وPPP وPRP عند -80 درجة حتى إجراء المقايسات. في مرضى غسيل الكلى، تم جمع الدم قبل إعطاء الهيبارين وبعد غسيل الكلى لمدة 4-5 ساعات في المتوسط ​​(نصف عمر الهيبارين - 4 ساعة) للقضاء على أي تأثير محتمل للهيبارين على نشاط XOR.

نشاط أكسيدوريدوكتاز الزانثين في البلازما والصفائح الدموية الفقيرة بالصفائح الدموية

تم تنفيذ القرارات باستخدام مقياس الطيف الضوئي Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. تم تسجيل تغييرات الانقراض عند 340 نانومتر (XD) و302 نانومتر (XDO، XO) لمدة 5 دقائق عند 30 درجة. تم قياس النشاط الأنزيمي على أنه تكوين حمض البوليك و NADH (الزيادات في A340 و A302) وتم التعبير عنه بـ mU× mL−1 (ملي وحدة لكل ملليلتر). تم حساب النشاط الأنزيمي مع الأخذ في الاعتبار معدلات التفاعل الأولية. تم قياس تكوين حمض البوليك عند 302 نانومتر (الأشكال الإسوية XDO وXO) لأن امتصاصه لا يزال مرتفعًا هناك، في حين أن التغيرات في تركيز NAD+ لا تساهم. تم استخدام معامل الانقراض لـ NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1] لحساب نشاط الأشكال الإسوية لإنزيم أوكسيدوريدوكتيز الزانثين NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

الجدول بالحجم الكامل

P * - دلالة إحصائية للاختلافات بين مجموعات HD وPD وCKD، واختبار TE وC الدقيق لـ Fisher للمتغيرات النوعية؛ للمتغيرات الكمية - ANOVA في اتجاه واحد و؛ P ** - دلالة إحصائية للاختلافات بين مجموعات HD وPD وCKD واختبار TE الدقيق لـ Fisher للمتغيرات النوعية للمتغيرات الكمية ANOVA أحادي الاتجاه أو؛ DM - اعتلال الكلية السكري. ها - ارتفاع ضغط الدم. GIK - التهاب الكلى الكبيبي. ADPKD - مرض الكلى المتعدد الكيسات الموروثة جسمية سائدة. NS - لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية.

الجدول بالحجم الكامل الدراسة (يعني ± SD)

P * - أهمية إحصائية للاختلافات بين مجموعات HD A وHD B وPD وCKD وTE وC للمتغيرات الكمية - Kruskal Wallis ANOVA أو ANOVA أحادي الاتجاه أو اختبار الطالب P ** - أهمية إحصائية للاختلافات بين HD A ، مجموعات HD B و PD و CKD و TE للمتغيرات الكمية ANOVA الخاصة بـ Kruskal Wallis أو تحليل ANOVA أحادي الاتجاه Kt / V - مؤشر غسيل الكلى (جزء الحجم V المنقى بواسطة التخليص K في الوقت t) NS لم يتم العثور على علاقات ذات دلالة إحصائية

التحليل الإحصائي لتقييم التوزيعات، تم استخدام اختبار KS (Kolmogorov-Smirnov)، والذي أظهر في حالة بعض المتغيرات (نشاط الأشكال الإسوية XD وXDO في PRP) توزيعًا غير طبيعي للمعلمات. تم استخدام اختبارات فيشر وتشي سكوير الدقيقة لتحليل البيانات الكمية. باستخدام اختبار الطالب وتحليل ANOVA للأنظمة أحادية المتغير، تم تقييم الاختلافات بين المتغيرات المرتبطة (المقترنة) وغير المرتبطة (غير المقترنة) في حالة المتغيرات ذات التوزيع الطبيعي. في حالة المتغيرات ذات التوزيعات غير الطبيعية، تم إجراء تحليل Kruskal-Wallis ANOVA لتقييم الاختلافات بين المعلمات، بالإضافة إلى اختبار Mann-Whitney U اللامعلمي للبيانات غير المقترنة أو اختبار Wilcoxon للبيانات المقترنة. تم استخدام نموذج الانحدار الخطي المتعدد لتحديد التقييم متعدد العوامل للعلاقات بين المعلمات المدروسة. تم إجراء التحليل الإحصائي للنتائج باستخدام Statistica 12 (StatSoft).