يتفاعل البروتين غير الهيكلي لفيروس زيكا 4B مع DHCR7 لتسهيل العدوى الفيروسية

خلاصة

يقوم فيروس زيكا (ZIKV) بتطوير بروتينات غير بنيوية لتجنب الاستجابة المناعية وضمان التكاثر الفعال في الخلايا المضيفة. تم الإبلاغ مؤخرًا عن أن إنزيم استقلاب الكولسترول 7- ديهيدروكوليستيرول اختزال (DHCR7) يؤثر على الاستجابات المناعية الفطرية في عدوى ZIKV. ومع ذلك، فإن البروتين الحيوي غير الهيكلي والآليات المشاركة في التهرب الفيروسي بوساطة DHCR7-لم يتم توضيحها بشكل جيد. في هذه الدراسة، أثبتنا أن عدوى ZIKV سهلت التعبير عن DHCR7. والجدير بالذكر أن DHCR7 المنتظم بدوره سهّل عدوى ZIKV، وقام حظر DHCR7 بقمع عدوى ZIKV. ميكانيكيًا، تفاعل البروتين غير الهيكلي ZIKV 4B (NS4B) مع DHCR7 للحث على تعبير DHCR7. علاوة على ذلك، قام DHCR7 بتثبيط كيناز 1 (TBK1) المرتبط بـ TANK والعامل التنظيمي للفيروسات 3 (IRF3)، مما أدى إلى تقليل إنتاج الإنترفيرون بيتا (IFN-) والجينات المحفزة بالإنترفيرون (ISGs). لذلك، نقترح أن يرتبط ZIKV NS4B بـ DHCR7 لقمع تنشيط TBK1 وIRF3، والذي بدوره يمنع IFN- وISGs، وبالتالي تسهيل التهرب من ZIKV. توسع هذه الدراسة الأفكار حول كيفية معاداة البروتينات غير الهيكلية الفيروسية للمناعة الفطرية لتسهيل العدوى الفيروسية عبر إنزيمات استقلاب الكوليسترول والوسائط.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

1 المقدمة

باعتباره فيروس فلافي ينقله البعوض، تم التعرف على فيروس زيكا (ZIKV) في البداية من قرود المكاك الريسوسي في أوغندا في عام 1947. وقد تعرض وباء ZIKV لعدة فاشيات في جميع أنحاء العالم، وأصبح يشكل تهديدًا صحيًا عالميًا تراكميًا بسبب التوسع الهائل عبر طرق البعوض، والسفر حول العالم، الناقلون بدون أعراض، والانتقال الجنسي. كانت معظم حالات الإصابة بفيروس ZIKV في الأوبئة الماضية بدون أعراض أو خفيفة (Wang et al., 2016)، ومع ذلك، في الأوبئة العديدة الأخيرة، أدت عدوى ZIKV إلى أمراض مدمرة، بما في ذلك العقابيل العصبية أثناء الحمل (صغر الرأس ووفاة الجنين) والاضطراب العصبي. (متلازمة غيلان باريه) لدى البالغين (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson and Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). الجهاز المناعي الفطري هو الخط الأول والحاسم للدفاع المناعي للمضيف ضد العدوى الفيروسية. بعد الإصابة بفيروس ZIKV، تم التعرف على الحمض النووي الريبي الفيروسي (RNA) الفيروسي عن طريق الجين I (RIG-I) المحفز لحمض الريتينويك داخل الخلايا (Chazal et al.، 2018؛ Hertzog et al.، 2018؛ Kato et al.، 2006)، والذي بدأ المناعة الفطرية في اتجاه المصب. الاستجابات، بما في ذلك تنشيط كيناز 1 (TBK1) المرتبط بـ TANK، وفسفرة العامل التنظيمي للفيروسات 3 (IRF3) ثم تؤدي إلى إنتاج إنترفيرون من النوع الأول (IFN-I) (فيتزجيرالد وآخرون، 2003؛ جرانت وآخرون، 2016؛ Xia et al., 2018) والتعبير عن العشرات من الجينات المحفزة بالإنترفيرون (ISGs) ذات التأثيرات المضادة للفيروسات المختلفة (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). ينتج الجهاز المناعي المضيف IFNs وISGs لتقييد العدوى الفيروسية، ومع ذلك، طور ZIKV نفسه مجموعة متنوعة من آليات الهروب لضمان البقاء الناجح والتكاثر في الخلية المضيفة، مثل تشفير بروتينات غير هيكلية محددة (NS). يولد ZIKV الجينومي RNA سبعة بروتينات غير هيكلية، بما في ذلك NS1 وNS2A وNS2B وNS3 وNS4A وNS4B وNS5 (Berthoux، 2020). يقوم ZIKV NS1 بتجنيد مضيف deubiquitinase USP8 لتحقيق الاستقرار في caspase -1 ويخفف من إشارات IFN من النوع الأول لصالح عدوى ZIKV (Zheng et al.، 2018). تم الإبلاغ عن أن NS1 المتحول يرتبط بـ TBK1 ويقلل فسفرة TBK1، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الإنترفيرون (Xia et al., 2018). يرتبط ZIKV NS3 ببروتينات السقالة البشرية ويعزلها (14-3-3ε و14-3-3η) (Riedl et al., 2019)، بينما يتفاعل NS4A مع MAVS لتخفيف RIG-I- وMDA{{50} } الاستجابات المناعية الفطرية بوساطة (ما وآخرون، 2018). والجدير بالذكر أن ZIKV NS5 يربط ويتحلل محول الإشارة ومنشط النسخ 2 (STAT2) لتخفيف إشارة IFN من النوع الأول (Grant et al.، 2016؛ Kumar et al.، 2016). علاوة على ذلك، ثبت أيضًا أن NS5 يتفاعل مع RIG-I ويقمع تعدد التوضع المرتبط بـ K63- لـ RIG-I، وبالتالي قمع إنتاج IFN- (Li et al., 2020). بالإضافة إلى ذلك، ثبت أيضًا أن ZIKV NS2A وNS2B وNS4A وNS4B تتغلب على إنتاج IFN من خلال استهداف العناصر المنفصلة في مسار RIG-I (Xia et al., 2018). لتحقيق التكاثر الفعال في خلايا الثدييات، يعتمد ZIKV أيضًا على مكونات التمثيل الغذائي للدهون الخلوية المضيفة لتشكيل غلاف وتجميع كامل للجسيمات الفيروسية (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). يعد الكوليسترول أحد مكونات الدهون في أغشية الخلايا ويشارك في وظائف بيولوجية متعددة (Ikonen، 2008). يتم تعديل توازن الكوليسترول الخلوي بشكل وثيق عن طريق تخليق الكوليسترول، بما في ذلك الامتصاص من جزيئات البروتين الدهني وإطلاقه إلى المستقبلات خارج الخلية. تعتمد جميع خلايا الثدييات تقريبًا على استقلاب الكوليسترول (Luo et al., 2020). أشارت الأدلة المتراكمة إلى أن استقلاب الكوليسترول يشارك في الاستجابة المناعية الفطرية ضد العدوى الفيروسية (Blanc et al.، 2013؛ Petersen et al.، 2014؛ York et al.، 2015). عند الإصابة الفيروسية، تغير تخليق الكوليسترول بشكل ملحوظ ورافقه تعبير معزز عن IFN-I وISGs في البلاعم (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). باعتباره الإنزيم الرئيسي في استقلاب الكولسترول، فإن كوليسترول-25- هيدروكسيلاز (CH25H) يحول الكولسترول إلى 25- هيدروكسي كوليستيرول (25HC)، والذي تم تحديده على أنه المنتج البيولوجي الذي يساهم في الاستجابة المناعية الفطرية ضد أغلبية كبيرة. من الفيروسات، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية 1 (HIV-1)، وفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV)، وفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1)، وفيروس الإيبولا (EBOV)، وZIKV، وفيروس هربس غاما الفئران ( MHV68)، وفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV)، وفيروس التهاب الدماغ الربيعي والصيفي الروسي (RSSEV) (Blanc et al.، 2013؛ Li et al.، 2017؛ Liu et al.، 2013). تقتصر الدراسات الحالية على دراسة كيفية قيام منتجات التمثيل الغذائي للكوليسترول (مثل 25HC) بالتلاعب في نقل الإشارة والمشاركة في المناعة الفطرية. حتى الآن، لا تزال الإنزيمات أو المواد الوسيطة في عملية التخليق الحيوي للكوليسترول غير موضحة بشكل جيد. باعتباره الإنزيم الأيضي الحيوي للكوليسترول، 7- ديهيدروكوليستيرول اختزال (DHCR7) يمكن أن يمحو الرابطة المزدوجة C (7–8) في الحلقة B من الستيرول ويحفز الكوليسترول من 7- ديهيدروكوليستيرول ({{100} }DHC) (لو وآخرون، 2015). 7-يعد DHC أيضًا أحد العناصر الرائدة في فيتامين د، وترتبط طفرات DHCR7 بارتفاع فيتامين د، مما يشير إلى أن DHCR7 يعرض تأثيرات بيولوجية معقدة في تحويل الكوليسترول وفيتامين د (كوان وآخرون، 2013؛ برابهو وآخرون. ، 2016 أ). أظهرت دراسة جيدة العرض أن صمت DHCR7 يمكن أن ينشط مسار PI3K-AKT3، مما يؤدي إلى فسفرة IRF3 Ser385 وتعزيز إنتاج الإنترفيرون لمنع العدوى الفيروسية المتعددة في المختبر وفي الجسم الحي (Xiao et al., 2020). ومع ذلك، فإن فهم استقلاب الكوليسترول بوساطة DHCR7-في التهرب المناعي بوساطة البروتين ZIKV NS غير محدد بشكل جيد. هنا، نوضح آلية متميزة يستهدفها ZIKV NS4B على DHCR7، وهو إنزيم رئيسي في تخليق الكوليسترول، لتخفيف استجابة IFN-I وتسهيل الإصابة بـ ZIKV. لقد وجدنا أن عدوى ZIKV زادت من تعبير DHCR7. ومن المثير للاهتمام أن DHCR7 المعزز يعزز الإصابة بفيروس ZIKV، في حين أن هدم DHCR7 أو استهدافه بالمثبطات يمكن أن يثبط عدوى ZIKV. علاوة على ذلك، يمكن لـ ZIKV NS4B ربط DHCR7 وبالتالي تحفيز تعبير DHCR7، مما يمنع تنشيط TBK1 وIRF3 وأدى إلى انخفاض إنتاج IFN- وISG. لذلك، نقترح أن يؤدي ربط ZIKV NS4B بـ DHCR7 إلى تقليل تنشيط IRF3، والذي بدوره يمنع IFN- وISGs لتسهيل التهرب من ZIKV. توسع هذه الدراسة رؤى جديدة حول كيفية إلغاء البروتين غير الهيكلي ZIKV للمناعة الفطرية لتسهيل العدوى الفيروسية من خلال التفاعل مع إنزيمات استقلاب الكوليسترول.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. المواد والأساليب

2.1. خطوط الخلية

تم شراء خلايا U251 من المركز الصيني لمجموعة ثقافة النوع (CCCTCC) (ووهان، الصين). تم شراء خلايا الكلى Cercopithecus aethiops (Vero)، وخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK 293T)، وخلايا سرطان الرئة الغدي البشري (A549) من مجموعة زراعة الأنسجة الأمريكية (ATCC). تم الحفاظ على الخلايا في وسط النسر المعدل (DMEM) (Gibco) في Dulbecco مع إضافة 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) (Gibco)، والبنسلين (100 وحدة / مل)، وكبريتات الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية و5 درجات مئوية. % ثاني أكسيد الكربون. تم استزراع خلايا الزاعجة البيضاء (C6/36) في الحد الأدنى من المتوسط ​​الأساسي (MEM) المكمل بـ 10% FBS والبنسلين (100 وحدة/مل) وكبريتات الستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) عند 28 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون.

2.2. تضخيم ZIKV والمعايرة والعدوى

تمت زراعة عزل ZIKV z16006 (رقم وصول GenBank، KU955589.1) في خلايا C6/36، وتم تقسيم ZIKV في قارورة تجميد وتخزينه عند 80 درجة مئوية. وتم قياس التتر ZIKV بواسطة فحص البلاك. تم إصابة الخلايا بـ ZIKV عند تعدد العدوى (MOI) المشار إليه لمدة ساعتين، تليها الغسيل بمحلول ملحي الفوسفات (PBS)، ثم تم تربيتها وحصادها وفحصها.

2.3. البلازميدات والكواشف

تم استخدام علم التعبير البلازميد pcDNA3.1 (þ) -3 لاستنساخ جينات ZIKV الفردية من الأجزاء المقابلة من ZIKV cDNA. لإنشاء pGEX6p -1- NS4B، تم استنساخ ZIKV NS4B من الباطن في ناقل pGEX6p -1 باستخدام ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech، Nanjing، China). تم استنساخ cDNAs الذي يشفر DHCR7 و RIG-I و TBK1 و IRF3 البشري في ناقل pCAGGS-HA أو pcDNA3.1 (þ) -3 ناقل العلم بواسطة طريقة الاستنساخ الجزيئي القياسية. تم إنشاء الطفرة الخاطئة G410S لـ DHCR7 باستخدام طريقة الطفرات الموجهة نحو الموقع. تم شراء مغلف أرنب أحادي النسيلة مضاد لـ ZIKV (GTX133314) من GeneTex (Irvine، CA، USA). أرنب متعدد النسيلة مضاد لـ DHCR7 (A8049)، أرنب أحادي النسيلة مضاد لـ ISG15 (A2416)، أرنب أحادي النسيلة مضاد لـ TBK1 (A3458)، أرنب أحادي النسيلة مضاد لـ P-TBK1 في Ser172 (AP1026)، أرنب متعدد النسيلة مضاد لـ IRF3 (A11118)، مضاد تم شراء -rabbit IgG (ac005) وIgG المضاد للفأر (ac011) من ABclonal Technology (ووهان، الصين). تم شراء Antimouse FITC والأجسام المضادة الثانوية Cy3 المضادة للأرنب من Abbkine (ووهان ، الصين). تم شراء أرنب أحادي النسيلة مضاد P-IRF3 في Ser396 (29047S) وأرنب أحادي النسيلة مضاد ISG56 (14769S) من Cell Signaling Technology (CST، Boston، MA، USA). تم شراء الفأر أحادي النسيلة المضاد للعلم (F3165) والأرنب أحادي النسيلة المضاد للـ HA (H6908) والفأر أحادي النسيلة المضاد لـ GAPDH (G9295) من Sigma (St Louis، MO، USA). تم شراء الجسم المضاد لمجموعة مضادات الفيروسات أحادية النسيلة (MAB10216) من Millipore (Mass، USA). تم شراء Lipofectamine 2000 (11668-027) وTrizol (15596018) من شركة Invitrogen Corporation (كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء Poly (I: C) من InvivoGen (سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.4. فحص البلاك

تم تخفيف ZIKV المحتوي على طاف باستخدام DMEM خالي من المصل وخلايا Vero المصابة في صفيحة بئر 12- لمدة ساعتين، يليها الغسيل باستخدام 1 مل PBS مرتين. تم خلط DMEM الذي يحتوي على 2% FBS و2% agarose ذو نقطة انصهار منخفضة جيدًا وفقًا لنسبة الحجم 1:1، وتم إضافة خليط 1 مل إلى كل بئر. وتمت زراعة الخلايا المصابة عند درجة حرارة 37 مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة 5-7 أيام. تم تثبيت الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4% لمدة ساعة واحدة وصبغها بـ 0.5% بنفسجي كريستالي لمدة 30 دقيقة. 12-تم غسل صفيحة البئر بالماء وتم حساب اللويحات.

2.5. إنتاج الفيروسة البطيئة والعدوى

كانت تسلسلات استهداف shRNAs لـ DHCR7 البشري كما يلي: sh-DHCR 7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30، sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. تم نقل ناقل pLKO.1 الذي يحمل shRNA مخلوط للتحكم السلبي (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) أو تسلسل الهدف المحدد إلى خلايا HEK293T مع psPAX2 و pMD2.G مع Lipofectamine 2 {{19} }00. تم حصاد الجزيئات الفيروسية التي تحتوي على مواد طافية عند 36 ساعة بعد ترنسفكأيشن ثم طردها بالطرد المركزي عند 210 جم لمدة 10 دقائق. تم ترشيح مرحلة طاف خالية من الخلايا من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة حطام الخلية. تم إصابة خلايا U251 بجزيئات الفيروسة البطيئة في وجود 8 ميكروغرام/مل من مادة البولي بروين. بعد 48 ساعة من الاستنبات، تم اختيار خلايا U251 باستخدام البيوروميسين (2 ميكروجرام/مل، سيجما). تم تحديد كفاءة الضرب لـ sh-DHCR7 بواسطة RT-PCR وتحليل اللطخة الغربية.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

2.6. لطخة غربية

تم إخماد الخلايا بواسطة المخزن المؤقت RIPA المكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني ومثبطات الفوسفاتيز على الجليد لمدة ساعة واحدة، ثم طردها عند 4 درجات مئوية، 13، 000 جم لمدة 1 {{1 0}} دقيقة لجمع الخلية المحللة. تم قياس تركيز البروتين في المحللة الخلوية عن طريق فحص بروتين حمض البيكينكونيك (BCA). تم فصل البروتين بواسطة SDS-PAGE ثم نقله إلى غشاء البولي فينيل ثنائي فلوريد (PVDF). تم حظر غشاء PVDF باستخدام المخزن المؤقت للحجب المناعي TBST (10 مليمول / لتر Tris-HCl، ودرجة الحموضة 7.4، و0.15 مول / لتر NaCl، و0.05٪ توين -20) الذي يحتوي على 5٪ BSA لمدة ساعة واحدة. بعد الغسيل باستخدام TBST، تم تحضين الغشاء بالأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانية ثم تم اكتشافه لاحقًا باستخدام نظام التصوير بالتألق الكيميائي (Bio-Rad).

2.7. فحص الكولسترول الكلي

تم اكتشاف إجمالي الكوليسترول في الخلايا باستخدام مجموعة فحص الكوليسترول الكلي للأنسجة من شركة Applygen Technologies Inc. (بكين، الصين). تم إخضاع معيار الكوليسترول 5 مليمول/لتر للتخفيف المتسلسل باستخدام الإيثانول اللامائي لرسم المنحنى القياسي، وتم حساب كميات الكوليسترول الإجمالي الخلوي وفقًا للمنحنيات القياسية. تم إجراء التجربة باتباع الإجراء الذي قدمته الشركة المصنعة.

2.8. فحوصات الهطول المناعي المشترك

تم نقل خلايا HEK293T بالبلازميدات المشار إليها. تم حصاد الخلايا وإزالتها باستخدام RIPA تحلل العازلة المكملة بمثبطات الأنزيم البروتيني. بعد الطرد المركزي عند 18 000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، تم جمع lysates الخلية وتحصينها بواسطة Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare، Milwaukee، WI، USA) لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية. البروتينات المرتبطة تم شطفها باستخدام 2 مخزن مؤقت للتحميل وتحليلها عن طريق التطعيم المناعي.

2.9. في الوقت الحقيقي PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من الخلايا باستخدام كاشف TRIzol (Invitrogen Life Technologies) وتم إنتاج cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي M-MLV (Promega، Madison، WI، USA). تم إجراء RT-PCR باستخدام مجموعات SYBR RT-PCR (DBI Bio-science) على Roche LC480. تم تعيين جليسرالديهايد -3- فوسفات ديهيدروجينيز (GAPDH) mRNA كمرجع داخلي لتطبيع الرنا المرسال وتم حساب مستويات التعبير الجيني باستخدام طريقة 2 ΔΔCT. يتم عرض تسلسلات الاشعال RT-PCR في الجدول التكميلي S1. 2.10. المجهر متحد البؤر

تم نقل خلايا U251 بالبلازميد وزرعها لمدة 3 0 ساعة، ثم غسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تم إصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة وتخللتها بـ PBS الذي يحتوي على 0.1٪ TritonX -100 لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني، تم إغلاق الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ من جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة. تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS واحتضانها بمضادات HA ومضادات FLAG ومضادات الفيروسات المصفرة، ثم تم تحضينها باستخدام FITC المضاد للفأر والأجسام المضادة الثانوية Cy3 المضادة للأرنب. تم تلوين الخلايا بـ 40 دياميدينو -2- فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد (DAPI) وتم إجراؤها باستخدام مجهر أوليمبوس متحد البؤر.

2.11. فحوصات GST المنسدلة

تم نقل البلازميد pGEX6p -1- NS4B إلى سلالة Escherichia coli (E. coli) BL21. تم تحفيز GST وGST-NS4B بواسطة IPTG بتركيز نهائي قدره 0.5 مليمول / لتر، وتمت زراعة الثقافات لمدة 6-8 ساعات إضافية عند 37 درجة مئوية. ثم بروتين GST وGST- تمت تنقية بروتين NS4B من بكتيريا E. coli. تم تحضين بروتين GST أو GST-NS4B بخرز الجلوتاثيون Sepharose (Novagen) وغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. تم تحضين بروتين GST وGST-NS4B مع بروتين الاندماج حقيقي النواة HA-DHCR7، والذي نشأ من البلازميدات التي تشفر HA-DHCR7- المحللة الخلوية HEK293T المعبر عنها لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية. تم غسل الرواسب خمس مرات، وغليها في 2 المخزن المؤقت لتحميل SDS، وتم اكتشافه بواسطة لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة لـ GST وanti-HA.

2.12. الطفرات الموجهة للموقع HA-DHCR7

تم تصنيع أزواج مناسبة من الاشعال المطفرة (الجدول التكميلي S1) واستخدامها لإنشاء البنية المتحورة بواسطة PCR. تم استخدام HA-DHCR7 كقالب لـ PrimeSTAR® HS Premix (Takara). بعد PCR، تم هضم البلازميد من النوع البري المتبقي في منتج PCR بشكل انتقائي بواسطة DpnI (New England Biolabs). تم نقل منتج PCR المهضوم إلى سلالة E. coli DH5 . تم تأكيد المتحولة المطلوبة عن طريق تحليل تسلسل سانجر.

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

2.13. تحليل احصائي

تكررت جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل مع نتائج مماثلة. يتم التعبير عن البيانات على أنها الانحراف المعياري المتوسط ​​(SD). تم تحديد أهمية التباين من خلال اختبار t غير المقترن للطالب من أجل ANOVA ثنائي المجموعة أو أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Dunnett المتعددة أو ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار مقارنات Sidak المتعددة لمقارنات المجموعات المتعددة باستخدام برنامج GraphPad Prism. (الإصدار 8.0.1). تم اعتبار قيمة P < 0.{{10}}5 ذات دلالة إحصائية، وتم تحديد P > 0.05 على أنها غير ذات دلالة إحصائية. بالنسبة لجميع البيانات، تم تقديم الأهمية كـ * P <0.05، ** P <0.01 و *** P <0.001.

3. النتائج

3.1. عدوى ZIKV تستحث تعبير DHCR7

أثبتت الأدلة المتراكمة أن استقلاب الكوليسترول يؤثر على الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف ضد عدوى الفيروس المصفرة، مثل ZIKV وفيروس حمى الضنك (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). يقوم DHCR7 بتشفير الإنزيم الذي يحول 7-DHC إلى كوليسترول، وهي الخطوة الأخيرة في التخليق الحيوي للكوليسترول (Moebius et al., 1998). اكتشفنا أولاً تعبير DHCR7 عند الإصابة بفيروس ZIKV. أصيبت الخلايا النجمية البشرية U251 بفيروس ZIKV، مما أدى إلى زيادة تعبير DHCR7 المعتمد على الجرعة في كل من الرنا المرسال والبروتين (الشكل 1A-C). لتأكيد هذه الظاهرة، قمنا بعد ذلك بفحص تعبير DHCR7 في خلايا فيرو ووجدنا أن عدوى ZIKV تسببت بشكل كبير في تعبير DHCR7 (الشكل 1D – F)، والذي كان متسقًا مع النتائج في خلايا U251.

فوائد cistanche-تقوية جهاز المناعة

3.2. يؤدي استهداف DHCR7 إلى إثارة نشاط حاسم لمكافحة ZIKV

لتقييم آثار DHCR7 ضد عدوى ZIKV، تم نقل الخلايا U251 وA549 باستخدام البلازميد المشفر HA-DHCR7 ثم أصيبت بعدوى ZIKV (MOI=1). أظهرت النتائج أن فرط التعبير DHCR7 عزز بشكل كبير تعبير ZIKV mRNA (الشكل 2A و B). والجدير بالذكر أنه مع تراكم بروتين DHCR7، زاد أيضًا التعبير عن البروتين الهيكلي ZIKV E (الشكل 2C وD). بالإضافة إلى ذلك، أجرينا كذلك اختبار البلاك باستخدام طاف من الشكل 2C ووجدنا أن فرط التعبير DHCR7 صعد بشكل كبير وحدات تشكيل البلاك، بالمقارنة مع مجموعة التحكم (الشكل 2E وF). تم الإبلاغ عن الطفرة الخاطئة G410S لـ DHCR7 لإلغاء نشاط الإنزيم (Fitzky et al.، 1998؛ Shim et al.، 2004؛ Witsch-Baumgartner et al.، 2000). لتحديد تأثيرات DHCR7 بشكل أكبر على عدوى ZIKV، قمنا بعد ذلك ببناء متحولة غير نشطة لـ DHCR7 (G410S). بالمقارنة مع النوع البري من DHCR7، فإن متحولة G410S يمكن أن تمنع بشكل كبير عدوى ZIKV (الشكل 2G). أجرينا أيضًا فحصًا مجهريًا متحد البؤر لتأكيد الملاحظة. كما هو مبين في الشكل 2H، أدى الإفراط في التعبير عن DHCR7 إلى زيادة الإصابة بفيروس ZIKV. لتحديد ما إذا كان نشاط إنزيم DHCR7 الداخلي أمرًا بالغ الأهمية لعدوى ZIKV، قمنا بتصميم اثنين من RNAs ذات دبوس الشعر القصير (shDHCR7-1 وsh-DHCR7-2) يستهدفان DHCR7 على وجه التحديد وأنشأنا خلية U251 الصامتة DHCR7- خطوط مع نظام shRNA (الشكل 3A). أخيرًا، اخترنا sh-DHCR7-1 لكفاءة إسكات أعلى. بالمقارنة مع shRNA للتحكم في خط الخلية، أظهرت خلايا ضربة قاضية DHCR7 هذه قابلية أقل للإصابة بعدوى ZIKV (الشكل 3B وC). استخدمنا بعد ذلك مثبط DHCR7 الانتقائي AY9944 الذي يمنع 7- DHC من التحدث إلى الكوليسترول (Xu et al.، 2011)، والذي ثبت أنه يمنع النشاط الأنزيمي DHCR7 (Horlick، 1966؛ Moebius et al.، 1998). بالمقارنة مع السيطرة، فإن إعطاء AY9944 يعتمد على الجرعة على تثبيط عدوى ZIKV في خلايا U251 (الشكل 3D – F). تم إجراء اختبار البلاك أيضًا في خلايا فيرو لإجراء مزيد من التقييم لتأثيرات DHCR7، وإظهار أن AY9944 يمكنه قمع عدوى ZIKV بشكل كبير (الشكل 3G وH). والجدير بالذكر أن الفحص المجهري متحد البؤر أظهر أن بروتين ZIKV E انخفض بشكل كبير في وجود AY9944 (الشكل 3I). أشارت هذه النتائج إلى أن استهداف DHCR7 يمكن أن يمنع الإصابة بفيروس ZIKV.

الشكل 1. عدوى ZIKV تستحث تعبير DHCR7. تم إصابة خلايا A – F U251 و Vero بـ ZIKV (MOI ¼ 0 و 1 و 2) لمدة 24 ساعة، وتم تحديد مستويات الحمض النووي الريبي (RNA) داخل الخلايا لـ ZIKV (A و D) و DHCR7 (B و E) بواسطة RT-PCR مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي. تم الكشف عن مستويات البروتين النسبية لأظرف DHCR7 وZIKV بواسطة لطخة غربية (C، F). البيانات مأخوذة من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل (يعني SD) أو بيانات تمثيلية (C، F). تم حساب الأهمية الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Dunnett المتعددة (A، B، D، E). **P < 0.01, ***P < 0.001. SD، الانحراف المعياري.

3.3. يمنع DHCR7 تنشيط TBK1 وIRF3 لتقليل إنتاج IFN وISGs

نظرًا لأن DHCR7 هو الإنزيم الحيوي لتحويل 7- DHC إلى كوليسترول (Moebius et al., 1998) ويمكن أن تزيد عدوى ZIKV من تعبير DHCR7، وبالتالي قمنا بقياس مستوى الكوليسترول عند الإصابة بـ ZIKV. لقد كشفنا أن عدوى ZIKV لها تأثير ضئيل على تخليق الكوليسترول في خلايا U251 وVero (الشكل 4A وB)، على الرغم من زيادة DHCR7 (الشكل 1A-D). نظرًا لتعزيز DHCR7 عند الإصابة بعدوى ZIKV والأدوار الرئيسية لـ IFNs في مواجهة عدوى ZIKV، حددنا بعد ذلك تأثير DHCR7 على مسار إشارات IFN-I. تم إصابة خلايا U251 الخاضعة للتحكم وDHCR7- بفيروس ZIKV أو تم نقلها بواسطة poly(I: C)، وتم استكشاف تعبير IFN. بالمقارنة مع مجموعة التحكم، فإن عدوى ZIKV أو علاج poly(I: C) عزز بشكل ملحوظ تعبير IFN- في DHCR 7- إسكات خلايا U251 (الشكل 4C وD). ISGs هي مؤثرات إجراءات الإنترفيرون وتلعب أدوارًا رئيسية في الدفاع المناعي الفطري ضد عدوى ZIKV. لقد أثبتنا أيضًا أن حظر DHCR7 يمكن أن يعزز بشكل كبير تعبير ISG15 و ISG56 في كل من مستويات mRNA والبروتين (الشكل 4E – J). على نحو ثابت، يمكن أن يؤدي علاج مثبط DHCR7 AY9944 إلى تحفيز تعبير IFN- وISG15 وISG56 (الشكل 4K، L). الأهم من ذلك أن المتحول غير النشط G410S يمكن أن يعكس جزئيًا التأثيرات المثبطة لـ DHCR7 على تعبير IFN- وISG (الشكل 4M، N). يعد تنشيط TBK1 و IRF3 ضروريًا لتحريض IFNs-ISGs، وبالتالي، قمنا بعد ذلك بفحص تأثير DHCR7 على تعبير وتنشيط TBK1 و IRF3. لقد أثبتنا أن DHCR7 لا يثبط مستوى البروتين المعتمد على الجرعة فحسب، بل يثبط أيضًا مستوى الفسفرة TBK1 وIRF3 (الشكل 5A-C). علاوة على ذلك، فإن الطفرة غير النشطة G410S عكست بشكل غير كامل التأثيرات المثبطة لـ DHCR7 على الفسفرة IRF3 وTBK1 (الشكل 5D). بما يتعارض مع نتائج فرط التعبير DHCR7، فإن علاج AY9944 يمكن أن يحفز تنشيط IRF3 وTBK1 في خلية U251 (الشكل 5E).

3.4. يتفاعل ZIKV NS4B مع DHCR7 لمنع فسفرة TBK1 وIRF3

كشفت الأدلة المتزايدة أن ZIKV طور بروتينات NS محددة لتسهيل التكاثر الفعال في الخلايا المضيفة عن طريق التهرب المباشر من المناعة الفطرية والتكيفية للمضيف عبر عدد كبير من الآليات المنفصلة. لقد أجرينا اختبار IP المشترك لفحص بروتين ZIKV NS الفردي الذي يمكن أن يتفاعل مع DHCR7. تم نقل خلايا HEK293T بشكل مشترك باستخدام pCMV-DHCR 7- HA والبلازميد الذي يعبر عن بروتين NS الفردي المدمج مع علامة العلم. كما هو مبين في الشكل 6A، يرتبط DHCR7 بـ NS4B فقط ولكنه يفشل في التفاعل مع بروتينات NS الأخرى. وأجريت فحوصات IP المشتركة المتبادلة وأظهرت أن بروتين NS4B تفاعل مع DHCR7 في خلايا HEK293T (الشكل 6B وC). لتأكيد التفاعل بين NS4B وDHCR7، أجرينا بعد ذلك مجهرًا متحد البؤر ووجدنا أن بروتين NS4B وبروتين DHCR7 تم تجميعهما في السيتوبلازم (الشكل 6D). أظهر اختبار GST المنسدل أيضًا تفاعل NS4B و DHCR7 (الشكل 6E). علاوة على ذلك، فإن ترنسفكأيشن عابر لـ NS4B في خلايا U251 يمكن أن يحفز بشكل كبير تعبير DHCR7 (الشكل 6F). الأهم من ذلك، أن NS4B يمكن أن يمنع الفسفرة اعتمادًا على الجرعة لكل من TBK1 وIRF3، والذي كان مرتبطًا بشكل إيجابي بالتنشيط المعزز لـ TBK1 وIRF3 استجابةً لـ DHCR7 (الشكل 6G وH). ومع ذلك، فإن فرط التعبير NS4B في خلايا HEK293T أدى إلى انخفاض كبير في مستوى البروتين لـ TBK1، ولكن كان له تأثير ضئيل على بروتين IRF3 (الشكل 6G وH). لتأكيد هذه الملاحظات بشكل أكبر، تم نقل NS4B إلى خلايا U251 ضربة قاضية DHCR7 وأظهر تأثيرات مثبطة على مستويات البروتين الداخلي والفسفرة لـ TBK1 وIRF3 (الشكل 6I). أظهرت هذه النتائج مجتمعة أن ZIKV NS4B تفاعل مع DHCR7 وتعبير DHCR7 المحسّن لمنع تنشيط TBK1 وIRF3 ومن ثم تسهيل الإصابة بـ ZIKV.

الشكل 2. الإفراط في التعبير عن DHCR7 يعزز تكرار ZIKV. تم نقل خلايا A – D U251 و A549 باستخدام HA-vector أو HA-DHCR7 بتركيزات محددة لمدة 12 ساعة ثم أصيبت بـ ZIKV لمدة 36 ساعة أخرى. تم الكشف عن مستويات ZIKV RNA بواسطة RT-PCR مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي (A، B)، وتم الكشف عن مستويات البروتين في غلاف ZIKV، وHA-DHCR7، وGAPDH بواسطة لطخة غربية (C، D). تم إصابة خلايا E و F Vero بالطاف المحتوي على ZIKV من الشكل 2C لمدة 48 ساعة لتحديد نسخ ZIKV عن طريق فحص البلاك. تم نقل خلايا G U251 باستخدام HA-vector أو HA-DHCR7 أو HA-DHCR7 (G410S) لمدة 12 ساعة وتم إصابتها بـ ZIKV لمدة 36 ساعة، ومستويات البروتين في غلاف ZIKV وHA-DHCR7 و تم الكشف عن GAPDH بواسطة لطخة غربية. تم نقل خلايا H U251 باستخدام HA-vector أو HA-DHCR7 (1 ميكروغرام) لمدة 12 ساعة مصابة بـ ZIKV لمدة 36 ساعة، ثم تم تحضينها بعد ذلك باستخدام الأجسام المضادة لفيروس الفأر والأجسام المضادة لـ HA في الأرانب، بعد تلطيخها بمضاد الفأر المترافق مع FITC و Cy3- الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب. كانت النوى ملطخة بـ DAPI. تم تصور الصور بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. شريط النطاق ¼ 100 ميكرومتر. البيانات مأخوذة من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل (يعني SD) أو بيانات تمثيلية (C، D، E، G، H). تم حساب الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل غير المقترن (F) أو ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Dunnett المتعددة (A، B). * ف < 0.05، *** ف < 0.001. SD، الانحراف المعياري.

4. مناقشة

يواجه النوع الأول من IFNs و ISGs الخاصة بهم سلسلة كبيرة من مسببات الأمراض ويلعبون دورًا حاسمًا في الدفاع المناعي للمضيف ضد ZIKV (Lazear et al.، 2016). للتهرب من المراقبة بوساطة IFN وتحقيق التكاثر الكافي، يقوم ZIKV بتطوير بروتينات NS تستهدف نقاطًا مختلفة من مسار إشارات IFN للهروب من الجهاز المناعي الفطري الخلوي (Lee et al.، 2021). أوضحت الدراسات المتصاعدة أن ZIKV NS1 وNS3 وNS4A وNS5 تمنع وحدات متميزة من مسار RIG-I/IFN-I وتسهل العدوى الفيروسية باستخدام آليات مستقلة ومتنوعة (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). ؛ ما وآخرون، 2018؛ ريدل وآخرون، 2019؛ شيا وآخرون، 2018؛ تشنغ وآخرون، 2018). ومع ذلك، فإن الآلية المحددة لـ ZIKV NS4B لمواجهة القيود المناعية غير محددة جيدًا. ZIKV NS4B هو بروتين كاره للماء للغاية يتكون من 251 حمضًا أمينيًا ويقع في غشاء الشبكة الإندوبلازمية مع محطة N (Zou et al.، 2014). تم التعرف على تثبيط NS4B لمسار إشارات IFN-I في فيروسات فلافي مختلفة (Ding et al.، 2013؛ Munoz-Jordan et al.، 2003، 2005؛ Shan et al.، 2021؛ Yi et al.، 2016؛ Zhang et al. آل، 2021). أفادت دراسة حديثة أن سلالة ZIKV INMI1 المعزولة في البرازيل تستخدم NS4B لاستعداء مسار إشارات IFN-I عن طريق سحق الفسفرة STAT1 وبالتالي مقاطعة النقل النووي STAT1 (Fanunza et al.، 2021). في هذه الدراسة، وجدنا آلية متميزة ألغى فيها ZIKV NS4B إنتاج الإنترفيرون عن طريق تثبيط فسفرة TBK1 وIRF3، وهو المكون الأساسي لمسار إشارات IFN-I. على وجه الخصوص، تم اكتشاف استبدال الأحماض الأمينية (G18R) في ZIKV NS4B، مما ساهم في انخفاض إنتاج الإنترفيرون وإضعاف تعبير ISG، وبالتالي تسهيل العدوى الفيروسية في الفئران، مما يشير إلى أهمية NS4B كمحدد للتسبب في المرض (جورمان وآخرون). ، 2018). أشارت الأدلة الناشئة إلى الأهمية الحاسمة لاستقلاب الكوليسترول في المشاركة في الاستجابة المناعية الفطرية (Akula et al.، 2016؛ Dang et al.، 2017؛ Reboldi et al.، 2014؛ York et al.، 2015). على الرغم من أن العديد من المواد الوسيطة في استقلاب الكوليسترول قد تم توثيقها لتكون لها تأثيرات واسعة النطاق مضادة للفيروسات (Blanc et al.، 2013؛ Li et al.، 2017؛ Liu et al.، 2013؛ Xiao et al.، 2020)، فقد أوضحت دراستنا آلية جديدة أن إنزيم التمثيل الغذائي للكوليسترول DHCR7 متورط في عدوى ZIKV عن طريق تخفيف تنشيط TBK1 و IRF3 لتسهيل العدوى الفيروسية. باعتباره إنزيمًا رئيسيًا يشارك في استقلاب الديسموسترول والكوليسترول، يمثل DHCR7 تحولًا لتحويل 7- DHC إلى فيتامين د في خلايا الجلد المعرضة للأشعة فوق البنفسجية (برابهو وآخرون، 2016 ب). علاوة على ذلك، يتم وضع DHCR7 ليس فقط عند بوابة مسار Bloch ولكن أيضًا في نهاية مسار Kandutsch-Russell (Prabhu et al., 2016a, 2016b)، والذي يلعب دورًا حيويًا في التحكم في تخليق الكوليسترول. قد يؤدي الحديث المتبادل لـ DHCR7 وتفاعله مع الإنزيمات الأخرى في عدة مسارات إلى تمكين وظائف متعددة في أنواع أو أعضاء مختلفة من الخلايا. كشفت دراسة سابقة أن حجب DHCR7 يمكن أن يقلل من الديسموسترول، السلائف المباشرة للتخليق الحيوي للكوليسترول، وبالتالي يوفر حماية كافية ضد عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). الأهم من ذلك، شياو وآخرون. أظهرت أن عدوى VSV تقلل من تعبير DHCR7، مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الكوليسترول، ولكن تراكم DHC أكثر بكثير 7- في البلاعم والكبد (Xiao et al., 2020). قدمت البلاعم المعالجة بـ 7-DHC استجابة معززة مضادة للفيروسات؛ في حين أظهرت إضافة الكولسترول حماية طفيفة. قد تكون مثبطات DHCR7 وإدارة 7-DHC من الأساليب المفيدة لمكافحة الالتهابات الفيروسية مثل HIN1 وHSV وVSV. في هذه الدراسة، وجدنا أن مثبط DHCR7 AY9944 يمكنه قمع عدوى ZIKV. ومع ذلك، كشفت دراستنا أن عدوى ZIKV تسببت في تعبير DHCR7، ولكن كان لها تأثير ضئيل على التخليق الحيوي للكوليسترول في الخلايا الدبقية. لم نفحص مستوى 7- تعبير DHC بعد عدوى ZIKV، ومع ذلك، من المفيد إجراء المزيد من التحقيق فيما إذا كان 7-DHC وAY9944 لهما فعالية علاجية تآزرية لعلاج المرضى الذين أصيبوا بعدوى ZIKV العدوى في الدماغ. أدى الإفراط في التعبير عن DHCR7 إلى تعزيز عدوى ZIKV، في حين أدى علاج مثبط DHCR7 الانتقائي (AY9944) إلى زيادة إنتاج IFN بقوة ضد عدوى ZIKV. يعد تنشيط TBK1 وIRF3 أمرًا حيويًا لتهيئة إشارات IFN-I. أظهر التحقيق السابق أن إسكات DHCR7 أو علاج DHC 7- ينشط مسار PI3K-AKT3 لفوسفوريلات IRF3، ولكن ليس TBK1 في البلاعم (Xiao et al., 2020). ومع ذلك، أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن جرعة DHCR7 قللت من تعبير IRF3 وTBK1، وكذلك فسفرة IRF3 وTBK1. أشارت هذه التحقيقات إلى أن DHCR7 قد يساهم في الإصابة بفيروس ZIKV في آلية مستقلة عن استقلاب الكوليسترول في الدماغ. لقد تم توضيح جيدًا أن ZIKV استخدم بروتينات NS للتفاعل المباشر مع المكونات المختلفة لمسار RIG-I/IFN-I للتهرب من الاستجابة المناعية وتسهيل تكاثر الفيروس. لقد أبلغنا سابقًا عن تفاعل ZIKV NS5 مع RIG-I لتخفيف إنتاج IFN (Li et al.، 2020). أظهر آخرون أن ZIKV NS1 وNS2B يستهدفان TBK1 وNS3 يستهدفان RIG-I وMDA5 لتقليل إنتاج IFN-I وISGs (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). ومع ذلك، فإن وظيفة بروتينات ZIKV NS التي تستهدف استقلاب الكوليسترول تظل بعيدة المنال إلى حد كبير. في هذه الدراسة، قمنا أيضًا بتوضيح التفاعل غير المبلغ عنه بين إنزيم استقلاب الكوليسترول DHCR7 وبروتينات ZIKV NS. لقد أظهرنا أن DHCR7 مرتبط بشكل خاص بـ NS4B، وليس ببروتينات NS الأخرى. قدمنا ​​الأدلة الحاسمة على أن ZIKV NS4B تفاعل مع DHCR7، وحفز بشكل كبير تعبيره، والذي كان متسقًا مع النتائج في خلايا U251 عند الإصابة بـ ZIKV. الأهم من ذلك، بصرف النظر عن إظهار مشاركة DHCR7 وZIKV NS4B بشكل مباشر، وجدنا أيضًا أن ZIKV NS4B زاد من تعبير DHCR7 لمنع فسفرة TBK1 وIRF3 وتسهيل الإصابة بـ ZIKV. بالاتفاق مع نتائجنا، كشفت دراسة حديثة أن نقص DHCR7 يمكن أن ينشط إشارات IRF3 وIFN لتثبيط VSV والفيروسات الأخرى في البلاعم.

الشكل 3. ضربة قاضية لـ DHCR7 تقلل من عدوى ZIKV في خلايا U251. تم نقل خلايا U251 باستخدام جزيئات الفيروسة البطيئة التي تحتوي على shRNA ضد DHCR7 (shDHCR 7-1 وsh-DHCR 7-2) أو تسلسل غير مستهدف (sh-NTC)، متبوعًا باختيار بوروميسين لمدة 14 يومًا. تم تحديد كفاءة ضربة قاضية بواسطة RT-PCR. كانت خلايا B، C DHCR 7- إسكات U251 (sh-DHCR7) وخلايا sh-NTC U251 مصابة أو مصابة بفيروس ZIKV (MOI=1) لمدة 36 ساعة. تم الكشف عن مستوى ZIKV RNA داخل الخلايا بواسطة RT-PCR مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي (B) وتم اكتشاف مستويات البروتين في غلاف ZIKV وDHCR7 وGAPDH بواسطة لطخة غربية (C). تمت معالجة خلايا D وE U251 باستخدام مثبط DHCR7 AY9944 عند التركيز المشار إليه لمدة ساعتين، ثم الإصابة بـ ZIKV (MOI=1) لمدة 48 ساعة. تم إخضاع الخلايا لـ RT-PCR للكشف عن ZIKV RNA (D). تم اكتشاف مستويات البروتين في غلاف ZIKV وDHCR7 وGAPDH بواسطة اللطخة الغربية (E). تمت معالجة خلايا F U251 باستخدام مثبط DHCR7 AY9944 عند التركيز المشار إليه لمدة 36 ساعة، وتم اكتشاف DHCR7 وGAPDH بواسطة لطخة غربية. تم إصابة خلايا G و H Vero بالطاف المحتوي على ZIKV من الشكل 3E لمدة 48 ساعة لتحديد نسخ ZIKV عن طريق فحص البلاك. تمت معالجة خلايا I U251 باستخدام AY9944 عند التركيز المشار إليه لمدة ساعتين، ثم الإصابة بـ ZIKV في MOI=1 لمدة 36 ساعة. تم تصور الصور بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. شريط النطاق ¼ 100 ميكرومتر. البيانات مأخوذة من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل (يعني SD) أو بيانات تمثيلية (C وE وF وG وI). يتم حساب الأهمية الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Dunnett المتعددة (A، D، H) أو ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار مقارنات Sidak المتعددة (B). *** ف <0.001. SD، الانحراف المعياري.

الشكل 4. DHCR7 يمنع إنتاج IFN- وISG. تم إصابة خلايا A وB U251 وVero بـ ZIKV (MOI ¼ 0 و0.5 و1) لمدة 24 ساعة وتم قياس الكوليسترول الخلوي بواسطة مجموعة فحص إجمالي الكوليسترول في الأنسجة. تم إصابة خلايا C – H DHCR 7- إسكات U251 (sh-DHCR7) وخلايا sh-NTC U251 بـ ZIKV (MOI=1) أو عولجت بـ Poly (I: C) (1 ميكروغرام / مل) لمدة 6 ساعات. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) الخلوي وإخضاعه لـ RT-PCR للتعبير عن mRNA باستخدام GAPDH كعنصر تحكم داخلي. تم تطبيع التعبيرات النسبية لـ IFN- وISGs مع تلك الخاصة بعينات sh-NTC في المجموعة الوهمية، وأظهرت تغييرات الطية بشكل مفرط. IFN- (C، D)، ISG15 (E، F) وISG56 (G، H). تم إصابة خلايا I، J DHCR 7- إسكات U251 (sh-DHCR7) وخلايا sh-NTC U251 بـ ZIKV (MOI=1) أو تم نقلها بواسطة Poly (I: C) (1 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة، وتم اكتشاف مستويات البروتين ISG15 وISG56 وGAPDH بواسطة لطخة غربية. عولجت خلايا K U251 بالجرعة المشار إليها من AY9944 لمدة ساعتين، ثم أصيبت بـ ZIKV (MOI=1) لمدة 6 ساعات. تم الكشف عن مستوى IFN-RNA بواسطة RT-PCR مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي. عولجت خلايا L U251 بالجرعة المشار إليها من AY9944 لمدة ساعتين ثم أصيبت بـ ZIKV (MOI=1) لمدة 24 ساعة. تم الكشف عن مستويات البروتين ISG15، ISG56، وGAPDH بواسطة لطخة غربية. تم نقل خلايا M U251 باستخدام HA-vector أو HA-DHCR7 أو HA-DHCR7 (G410S) لمدة 24 ساعة وتم إصابتها بـ ZIKV (MOI=1) لمدة 6 ساعات. تم الكشف عن مستويات IFN-RNA بواسطة RT-PCR مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي. تم نقل خلايا N U251 باستخدام HA-vector أو HA-DHCR7 أو HA-DHCR7 (G410S) لمدة 24 ساعة، ثم أصيبت بـ ZIKV (MOI=1) لمدة 24 ساعة. تم الكشف عن مستويات البروتين ISG15، ISG56، وGAPDH بواسطة لطخة غربية. البيانات مأخوذة من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل (يعني SD) أو بيانات تمثيلية (I، J، L، N). يتم حساب الأهمية الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Dunnett المتعددة (A، B، K، M) أو ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار مقارنات Sidak المتعددة (C – H). ns، P > 0.05، *** P <0.001. SD، الانحراف المعياري.

الشكل 5. DHCR7 يمنع تفعيل TBK1 وIRF3. تم نقل خلايا A وB HEK293T بشكل مشترك باستخدام بلازميد ترميز TBK 1- مع DHCR 7- معبرًا عن البلازميد أو المتجه الفارغ (A). تم نقل خلايا HEK293T بشكل مشترك باستخدام بلازميد تشفير IRF3-، وبلازميد تشفير RIG-I، بالإضافة إلى DHCR7- الذي يعبر عن البلازميد أو المتجه الفارغ (B). تم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن وتعرضت لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها [anti-TBK1، anti-P-TBK1(S172)، anti-IRF3، anti-PIRF3(S396)، anti-HA، and anti-GAPDH ]. تم نقل خلايا C U251 بالجرعة المشار إليها من DHCR7 معبرة عن ناقل البلازميد أو الفارغ لمدة 24 ساعة. تم بعد ذلك إصابة الخلايا بـ ZIKV (MOI=1) التي تم حصادها بعد 6 ساعات من الإصابة وتعرضت لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها [anti-TBK1، anti-P-TBK1(S172)، anti-IRF3، anti-P-IRF3 ( S396)، ومكافحة HA، ومكافحة GAPDH]. تم نقل خلايا D U251 باستخدام HA-vector أو HA-DHCR7 أو HA-DHCR7 (G410S) لمدة 24 ساعة. تم بعد ذلك إصابة الخلايا بـ ZIKV (MOI=1) التي تم حصادها بعد 6 ساعات من الإصابة وتعرضت لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها [anti-TBK1، anti-P-TBK1(S172)، anti-IRF3، anti-PIRF3(S396) ، ومكافحة HA، ومكافحة GAPDH]. عولجت خلايا E U251 بالجرعة المشار إليها من AY9944 لمدة ساعتين وتم إصابتها بـ ZIKV (MOI=1) لمدة 6 ساعات، ثم تم تعريضها لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها [مضاد لـ TBK1، مضاد لـ P-TBK1 (S172)، مضاد لـ -IRF3، ومضاد P-IRF3 (S396)، ومضاد GAPDH]. البيانات مأخوذة من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل وتظهر كبيانات تمثيلية (A – E).

الشكل 6. يتفاعل ZIKV NS4B مع DHCR7 لمنع فسفرة TBK1 وIRF3. تم نقل خلايا HEK293T بشكل مشترك مع البلازميدات التي ترمز HA-DHCR7، والبلازميدات التي تشفر البروتينات غير الهيكلية ZIKV (FLAG-NS1، FLAG-NS3، FLAG-NS4A، FLAG-NS4B، وFLAG-NS5) أو بلازميد تحكم فارغ لمدة 3 0 ح. تم تحصين المحللات الخلوية باستخدام الأجسام المضادة المضادة للعلم ثم تحليلها عن طريق التطعيم المناعي باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها. تم نقل خلايا B وC HEK293T بشكل مشترك مع البلازميدات التي ترمز HA-DHCR7 أو البلازميدات التي تشفر FLAG-NS4B أو بلازميد التحكم الفارغ لمدة 30 ساعة. تم إخماد مناعة الخلايا باستخدام الأجسام المضادة لـ HA (B) أو الأجسام المضادة لـ FLAG (C) ثم تحليلها عن طريق التطعيم المناعي باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها. تم نقل خلايا D U251 باستخدام البلازميد FLAG-NS4B مع ترميز البلازميدات باستخدام HA-DHCR7. تم تحليل توطين FLAG-NS4B (الأخضر)، HA-DHCR7 (الأحمر)، علامة النواة DAPI (الأزرق)، والدمج باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. شريط النطاق ¼ 10 ميكرومتر. تم تحضين lysates خلية E من خلايا HEK293T المنقولة بواسطة HA-DHCR7 مع بروتين GST أو بروتين GST-NS4B الذي تم تحضينه بخرز الجلوتاثيون-سيفاروز. تم اكتشاف المخاليط بواسطة لطخة غربية تحتوي على أجسام مضادة لـ HA ومضادة لـ GST (أعلى). تم الكشف عن Lysates من خلايا HEK293T المنقولة والبروتينات النقية بواسطة لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة لـ HA والأجسام المضادة لـ GST (أسفل). تم نقل خلايا F U251 باستخدام ترميز البلازميد FLAG-NS4B (0، 1، 2 ميكروغرام). تم اكتشاف مستويات البروتين النسبية لـ DHCR7 وFLAG-NS4B وGAPDH بواسطة لطخة غربية. تم نقل خلايا G و H HEK293T بشكل مشترك باستخدام البلازميد المعبر عن NS4B أو ناقلات فارغة، جنبًا إلى جنب مع البلازميد المشفر TBK 1- (F)، IRF 3- المعبر عن البلازميد، والبلازميدات التي تشفر RIG-I (G) . تم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن وتعرضت لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها [anti-TBK1، anti-P-TBK1(S172)، anti-IRF3، anti-P-IRF3(S396)، anti-FLAG، and antiGAPDH ]. تم نقل خلايا I DHCR 7- إسكات U251 (sh-DHCR7) وخلايا sh-NTC U251 باستخدام البلازميد المعبر عن NS4B أو ناقلات فارغة. تم حصاد الخلايا بعد 6 ساعات من ترنسفكأيشن وتعرضت لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها [anti-TBK1، anti-P-TBK1(S172)، anti-IRF3، anti-P-IRF3(S396)، anti-FLAG، and antiGAPDH ]. البيانات هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة.

5. الاستنتاجات

باختصار، كشفت دراسة سابقة أن إنزيم استقلاب الكوليسترول DHCR7 متورط في الاستجابة المناعية الفطرية ضد الالتهابات الفيروسية المختلفة. أظهرت دراستنا أن ZIKV NS4B تفاعل مع DHCR7 وتسبب في تعبير DHCR7. تمنع زيادة DHCR7 بشكل كبير تنشيط TBK1 وIRF3 وتؤدي إلى انخفاض إنتاج IFN- وISG، مما يسهل بالتالي عدوى ZIKV في الخلايا الدبقية. كشفت هذه النتائج عن آلية جديدة للهروب المناعي الفيروسي حيث يتغلب ZIKV على الاستجابة المناعية من خلال استهداف DHCR7 مباشرة باستخدام NS4B.

مراجع

Akula، MK، Shi، M.، Jiang، Z.، Foster، CE، Miao، D.، Li، AS، Zhang، X.، Gavin، RM، Forde، SD، Germain، G.، Carpenter، S.، Rosadini، CV، Gritsman، K.، Chae، JJ، Hampton، R.، Silverman، N.، Gravallese، EM، Kagan، JC، Fitzgerald، KA، Kastner، DL، Golenbock، DT، Bergo، MO، Wang، D ، 2016. السيطرة على الاستجابة المناعية الفطرية عن طريق مسار الميفالونات. نات. إيمونول. 17، 922-929.

Berthoud، L.، 2020. تقييد الفيروسات المصفرة. فيرول. الخطيئة. 35، 363-377.

Blanc، M.، Hsieh، WY، Robertson، KA، Kropp، KA، Forster، T.، Shui، G.، Lacaze، P.، Watterson، S.، Griffiths، SJ، Spann، NJ، Meljon، A.، Talbot، S.، Krishnan، K.، Covey، DF، Wenk، MR، Craigon، M.، Ruzsics، Z.، Haas، J.، Angulo، A.، Griffiths، WJ، Glass، CK، Wang، Y. , Ghazal, P., 2013. عامل النسخ STAT-1 يربط بين تخليق البلاعم لـ 25- هيدروكسي كوليستيرول والاستجابة المضادة للفيروسات للإنترفيرون. الحصانة 38، 106-118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Gawche, F., 2016. تفشي متلازمة غيلان باري المرتبطة بعدوى فيروس زيكا في بولينيزيا الفرنسية: حالة -دراسة السيطرة. لانسيت 387، 1531-1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. يتعرف RIG-I على 5' منطقة جينومات حمى الضنك وفيروس زيكا. مندوب الخلية 24، 320-328.

Chen، Q.، Gouilly، J.، Ferrat، YJ، Espino، A.، Glaziou، Q.، Cartron، G.، El Costa، ​​H.، AlDaccak، R.، Jabrane-Ferrat، N.، 2020. تؤدي إعادة البرمجة بواسطة فيروس زيكا إلى إثارة التهاب في المشيمة البشرية. نات. مشترك. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. يمنع ضبط النفس للأوكسيستيرول في تخليق الكوليسترول تنشيط AIM2 الالتهابي. الخلية 171، 1057-1071 e1011.

Ding، Q.، Cao، X.، Lu، J.، Huang، B.، Liu، YJ، Kato، N.، Shu، HB، Zhong، J.، 2013. فيروس التهاب الكبد الوبائي C NS4B يمنع تفاعل STING و TBK1 للتهرب من المناعة الفطرية للمضيف. جي هيباتول. 59، 52-58.

Fanunza، E.، Grandi، N.، Quartu، M.، Carletti، F.، Ermellino، L.، Milia، J.، Corona، A.، Capobianchi، MR، Ippolito، G.، Tramontano، E.، 2021 يعادي فيروس زيكا INMI1 NS4B إشارات الإنترفيرون عن طريق تثبيط الفسفرة STAT1. الفيروسات 13, 2448.

Fitzgerald، KA، McWhirter، SM، Faia، KL، Rowe، DC، Latz، E.، Golenbock، DT، Coyle، AJ، Liao، SM، Maniatis، T.، 2003. IKKε و TBK1 هي مكونات أساسية لتشوير IRF3 مسار. نات. إيمونول. 4، 491-496.

Fitzky، BU، Witsch-Baumgartner، M.، Erdel، M.، Lee، JN، Paik، Y.-K.، Glossmann، H.، Utermann، G.، Moebius، FF، 1998. الطفرات في Δ {{ 3}}جين إنزيم اختزال الستيرول في المرضى الذين يعانون من متلازمة سميث-ليملي-أوبيتز. بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 95، 8181-8186.

جورمان، إم جي، كاين، إي إيه، زايتسيف، ك.، بيجلي، إم سي، فيغر-لوكاريلي، جيه، أوسيليني، إم بي، تريباثي، إس، موريسون، جيه، يونت، بي إل، دينون 3rd، KH، روكرت، C .، Young، MC، Zhu، Z.، Robertson، SJ، McNally، KL، Ye، J.، Cao، B.، Mysorekar، IU، Ebel، GD، Baric، RS، Best، SM، Artyomov، MN، Garcia -Sastre، A.، Diamond، MS، 2018. نموذج فأر ذو كفاءة مناعية لعدوى فيروس زيكا. ميكروب مضيف الخلية 23, 672–685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre ، أ.، 2016. يستهدف فيروس زيكا STAT2 البشري لمنع إشارات الإنترفيرون من النوع الأول. ميكروب مضيف الخلية 19، 882-890.

هيرتزوج، جيه، دياس جونيور، إيه جي، ريجبي، آر إي، دونالد، سي إل، ماير، إيه، سيزجين، إي، سونج، سي، جين، بي، هابليتز، بي، إيجيلنج، سي، كول، A., Rehwinkel, J., 2018. تؤدي الإصابة بعزلة برازيلية من فيروس Zika إلى توليد الحمض النووي الريبي (RIG-I) المحفز وبروتين NS5 الفيروسي الذي يحجب تحريض وإشارات IFN من النوع الأول. يورو. جي إمونول. 48، 1120-1136.

Horlick، L.، 1966. تأثير مثبط جديد للتخليق الحيوي للكوليسترول (AY 9944) على ستيرول المصل والأنسجة في الفئران. J. الدهون الدقة. 7، 116-121.

Ikonen، E.، 2008. الاتجار بالكوليسترول الخلوي وتقسيمه. نات. القس مول. خلية بيول. 9، 125-138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. الأدوار التفاضلية لـ MDA5 و RIG-I المروحيات في التعرف على فيروسات الحمض النووي الريبي. الطبيعة 441، 101-105.

Kuan، V.، Martineau، AR، Griffiths، CJ، Hypp€onen، E.، Walton، R.، 2013. طفرات DHCR7 المرتبطة بحالة فيتامين D الأعلى سمحت بالهجرة البشرية المبكرة إلى خطوط العرض الشمالية. بي إم سي إيفول. بيول. 13، 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. فيروس زيكا يمنع إنتاج الإنترفيرون من النوع الأول والمصب إرسال الإشارات. جمهورية إمبو 17، 1766-1775.

Lazear، HM، Govero، J.، Smith، AM، Platt، DJ، Fernandez، E.، Miner، JJ، Diamond، MS، 2016. نموذج فأر لإمراض فيروس زيكا. ميكروب مضيف الخلية 19، 720-730. Lee، LJ، Komarasamy، TV، Adnan، NAA، James، W.، Rmt Balasubramaniam، V.، 2021. الغميضة: التفاعل بين فيروس زيكا والاستجابة المناعية للمضيف. أمام. إيمونول. 12, 750365.

لير، HC، وينشتاين، JB، كايل، JE، لي، JY، برامر، LM، ستراتون، KG، كيمبثورن، D.، نافراتيل، AR، Tafesse، EG، هورنمان، T.، ميسر، WB، دينيس، EA، Metz، TO، Barklis، E.، Tafesse، FG، 2020. تحدد خريطة الدهون العالمية شبكة أساسية لتكاثر فيروس زيكا. نات. مشترك. 11, 3652.

لي، أ.، وانغ، دبليو، وانغ، واي.، تشين، ك.، شياو، إف.، هو، د.، هوي، إل.، ليو، دبليو، فنغ، واي.، لي، جي، Tan، Q.، Liu، Y.، Wu، K.، Wu، J.، 2020. الموقع المحافظ NS5 مطلوب لفيروس Zika لتقييد إشارات RIG-I. أمام. إيمونول. 11، 51.

لي، سي.، دينغ، واي كيو، وانغ، إس.، ما، إف.، ألياري، آر.، هوانغ، إكس واي، تشانغ، إن إن، واتانابي، إم.، دونغ، إتش إل، ليو، بي، لي، إكس إف، Ye، Q.، Tian، M.، Hong، S.، Fan، J.، Zhao، H.، Li، L.، Vishlaghi، N.، Buth، JE، Au، C.، Liu، Y.، Lu ، N.، Du، P.، Qin، FX، Zhang، B.، Gong، D.، Dai، X.، Sun، R.، Novitch، BG، Xu، Z.، Qin، CF، Cheng، G. ، 2017. 25- يحمي هيدروكسي كوليستيرول المضيف من عدوى فيروس زيكا وصغر الرأس المرتبط به في نموذج الفأر. الحصانة 46، 446-456.

Liu، CI، Liu، GY، Song، Y.، Yin، F.، Hensler، ME، Jeng، WY، Nizet، V.، Wang، AH، Oldfield، E.، 2008. مثبط التخليق الحيوي للكوليسترول يحجب فوعة المكورات العنقودية الذهبية . العلوم 319، 1391-1394.

ليو، SY، Aliyari، R.، Chikere، K.، Li، G.، Marsden، MD، Smith، JK، Pernet، O.، Guo، H.، Nusbaum، R.، Zack، JA، Freiberg، AN، Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. يمنع الإنترفيرون المحفز للكوليسترول -25- هيدروكسيلاز على نطاق واسع دخول الفيروس عن طريق إنتاج 25- 25- هيدروكسي كوليستيرول. الحصانة 38، 92-105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. آليات وتنظيم توازن الكوليسترول. نات. القس مول. خلية بيول. 21، 225-245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. تتفاعل الإنزيمات الطرفية لتخليق الكوليسترول، DHCR24، وDHCR7، جسديًا ووظيفيًا. J. الدهون الدقة. 56، 888-897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. يحجب البروتين غير الهيكلي لفيروس زيكا 4A إشارات RLR-MAVS. أمام. ميكروبيول. 9, 1350. موبيوس، في إف، فيتزكي، بو، لي، جي إن، بايك، واي كيه، جلوسمان، إتش، 1998.

الاستنساخ الجزيئي والتعبير عن إنزيم الدلتا البشري 7-اختزال الستيرول. بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 95، 1899-1902.

Munoz-Jordan، JL، Laurent-Rolle، M.، Ashour، J.، Martinez-Sobrido، L.، Ashok، M.، Lipkin، WI، Garcia-Sastre، A.، 2005. تثبيط إشارات إنترفيرون ألفا / بيتا بواسطة بروتين NS4B من الفيروسات المصفرة. جي فيرول. 79، 8004-8013.

Munoz-Jordan، JL، Sanchez-Burgos، GG، Laurent-Rolle، M.، Garcia-Sastre، A.، 2003. تثبيط إشارات الإنترفيرون عن طريق فيروس حمى الضنك. بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 100، 14333-14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW، Bates، P.، Briley Jr.، K.، 2014. المسار التنظيمي الرئيسي للستيرول الخلوي مطلوب لعدوى فيروس الأنديز. باثوج بلوس. 10، ه1003911.

بيرسون، TC، Diamond، MS، 2020. التهديد المستمر للفيروسات المصفرة الناشئة. نات. ميكروبيول. 5، 796-812. برابهو، إيه في، لو، دبليو، لي، دي، شارب، إل جيه، براون، إيه جيه، 2016 أ. DHCR7: مفتاح إنزيم حيوي بين إنتاج الكوليسترول وفيتامين د. بروغ. الدقة الدهون. 64، 138-151.

برابهو، إيه في، لو، دبليو، شارب، إل جيه، براون، آي جيه، 2016 ب. يؤدي التحلل بوساطة الكوليسترول في 7- إنزيم ديهيدروكوليستيرول المختزل إلى تحويل التوازن من تخليق الكوليسترول إلى فيتامين د. جي بيول. الكيمياء. 291، 8363-8373. Randall، G.، 2018. استقلاب قطرات الدهون أثناء الإصابة بفيروس حمى الضنك. اتجاهات الميكروبيول. 26، 640-642.

Rasmussen، SA، Jamieson، DJ، Honein، MA، Petersen، LR، 2016. فيروس زيكا والعيوب الخلقية - مراجعة الأدلة على العلاقة السببية. ن. إنجل. جيه ميد. 374، 1981-1987.

Reboldi، A.، Dang، EV، McDonald، JG، Liang، G.، Russell، DW، Cyster، JG، 2014. التهاب. 25-يعمل هيدروكسي كوليستيرول على كبح الالتهاب الناجم عن الإنترلوكين-1-في اتجاه مجرى الإنترفيرون من النوع الأول. العلوم 345، 679-684.

Riedl، W.، Acharya، D.، Lee، JH، Liu، G.، Sherman، T.، Chiang، C.، Chan، YK، Diamond، MS، Gack، MU، 2019. يحاكي فيروس Zika NS3 الخلية { {2}}حافز ملزم لاستعداء RIG-I- وMDA5-المناعة الفطرية. ميكروب مضيف الخلية 26, 493-503 e496.

Rodgers، MA، Villareal، VA، Schaefer، EA، Peng، LF، Corey، KE، Chung، RT، Yang، PL، 2012. يحدد تحديد ملامح مستقلب الدهون استقلاب الديسموسترول كهدف جديد مضاد للفيروسات لفيروس التهاب الكبد C. ج. صباحا. الكيمياء. شركة نفط الجنوب. 134، 6896-6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. تمنع IFITMs تكرار فيروس زيكا. مندوب الخلية 15، 2323-2330.

Schneider، WM، Chevillotte، MD، Rice، CM، 2014. الجينات المحفزة بالإنترفيرون: شبكة معقدة من دفاعات المضيف. آنو. القس إيمونول. 32، 513-545.