لقاح الإنفلونزا الحي المضعف ثنائي التكافؤ يحمي من الانجراف H1N2 و H3N2 السريرية المعزولة في الخنازير الجزء 1

خلاصة:

يمكن أن تسبب فيروسات الأنفلونزا أ (IAVs) مرضًا تنفسيًا شديد العدوى للعديد من أنواع الثدييات. في الخنازير ، تتسبب IAVs في ارتفاع معدلات الاعتلال وأمراض الوفيات المنخفضة في المجموعات المعرضة للإصابة والتي يمكن أن يكون لها تأثيرات مالية وإنتاجية كبيرة. يمكنها أيضًا أن تقدم فرصًا للطفرات وإعادة تجميع الجينات ، مما ينتج عنه سلالات من الإنفلونزا ذات احتمالية حدوث جائحة.

الأنفلونزا أ مرض تنفسي شديد العدوى يشكل تهديدًا خطيرًا للصحة العامة العالمية. أظهرت الدراسات المتعلقة بالمناعة أن نظام المناعة القوي يمكن أن يجعل الناس أكثر قدرة على محاربة الفيروس عندما يصابون بفيروس الأنفلونزا ، وبالتالي تقليل حدوث المرض وشدته.

المناعة هي قدرة جهاز المناعة لدينا على محاربة الأمراض. يتكون جهاز المناعة البشري من جزأين: المناعة الفطرية والمناعة المكتسبة. الجهاز المناعي الفطري هو ما نولد به ولديه قدرة الجسم كله على الدفاع ضد الأمراض. جهاز المناعة المكتسب هو المناعة التي نمتلكها تدريجيًا في حياتنا ، بما في ذلك بشكل أساسي المناعة الخلطية المكونة من الخلايا المناعية والأجسام المضادة ، والمناعة الخلوية المكونة من الخلايا التائية والخلايا المناعية.

أظهرت الدراسات أنه من خلال الحفاظ على نمط حياة ونظام غذائي صحي وممارسة الرياضة والحصول على ما يكفي من الفيتامينات والعناصر الغذائية الأخرى ، يمكنك تحسين نظام المناعة لديك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للقاح أيضًا أن يعزز مناعة الجسم ضد فيروسات الأنفلونزا ويقلل من حدوث المرض.

يشترك البشر والحيوانات في فيروسات الإنفلونزا أ ، لذلك غالبًا ما تتحور. تكون مناعة الناس منخفضة خاصة في الخريف والشتاء ، ويمكن لفيروس الأنفلونزا أ أن يهاجم بسهولة من خلال الاستفادة من هذه الفرصة. ولكن إذا أصررنا على تطوير أسلوب حياة صحي ، وتقوية التمارين ، والتطعيم بشكل فعال ، فيمكننا تحسين مناعتنا والتعامل بشكل أفضل مع غزو فيروس الأنفلونزا أ. بالإضافة إلى ذلك ، إذا وجدت أن لديك أعراضًا تشبه أعراض الأنفلونزا ، فيجب عليك طلب العلاج الطبي وتلقي العلاج في الوقت المناسب ، حتى يتمكن جسمك من التعافي بسرعة.

باختصار ، هناك تأثير متبادل بين فيروس الأنفلونزا أ والمناعة. إن تقوية مناعة الفرد ، والحفاظ على نمط حياة ونظام غذائي صحيين ، وخاصة قبول التطعيم ، كلها تدابير فعالة للوقاية من فيروس الأنفلونزا أ ومكافحته. لنكن إيجابيين ونتحرك نحو أسلوب حياة أكثر صحة فيما يتعلق بالوقاية من فيروس الأنفلونزا أ! يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين المناعة. يمكن لـ Cistanche تحسين المناعة بشكل كبير ، لأن رماد اللحوم يحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة بيولوجيًا ، مثل السكريات ، واثنين من عيش الغراب ، و Huang Li ، وما إلى ذلك. يمكن لهذه المكونات أن تحفز أجهزة المناعة المختلفة. الخلايا الشبيهة بالخلايا ، مما يزيد من نشاطها المناعي.

انقر فوق فوائد cistanche tubulosa

لذلك ، من المهم جدًا منع الإصابة بالأنفلونزا في الخنازير ومكافحتها ، والطريقة الرئيسية للقيام بذلك هي من خلال التطعيم. الأنواع الفرعية من IAV الأكثر انتشارًا في الخنازير في جميع أنحاء العالم هي H1N1 و H1N2 و H3N2 ؛ ومع ذلك ، فإن التنوع الجيني لهذه الفيروسات يمكن أن يختلف اختلافًا كبيرًا حسب المنطقة. لقد طورنا سابقًا لقاحًا حيًا موهنًا ثنائي التكافؤ يعتمد على الإيلاستاز باستخدام اثنين من عزلات فيروس أنفلونزا الخنازير الكندية (swIAV) ، A / Swine / Alberta / SD0191 / 2016 (H1N2) [SD191] و A / Swine / Saskatchewan / SD0069 / 2015 (H3N2 ) [SD69] ، التي تحمي من السلالات المتماثلة.

في هذه الدراسة ، نوضح أن هذا اللقاح يوسع الحماية في الخنازير إلى سلالات H1N2 و H3N2 غير المتجانسة الحالية وغير المتجانسة ، A / Swine / MB / SD0467 / 2019 (H1N2) [SD467] و A / Swine / AB / SD0435 / 2019 (H3N2) [SD435].

أثار اللقاح استجابة مناعية قوية في المصل والرئة وقلل من تكاثر الفيروس وكذلك أمراض الرئة المرتبطة بهذه السلالات. لذلك ، يظل هذا اللقاح ثنائي التكافؤ مرشحًا قويًا من شأنه أن يكون مفيدًا لسوق لقاح أنفلونزا الخنازير في أمريكا الشمالية.

الكلمات الدالة:

إنفلونزا. مصل؛ انثي خنزير.

1 المقدمة

تعد فيروسات الإنفلونزا أ (IAV) من مسببات الأمراض المهمة للعديد من الأنواع ، بما في ذلك الخنازير. يمكن أن تسبب العدوى أمراض الجهاز التنفسي شديدة العدوى في الخنازير [1]. تؤدي عدوى الإنفلونزا في الخنازير إلى مرض خفيف مع معدل وفيات منخفض للغاية ، ولكن معدلات الإصابة بالمرض في القطيع يمكن أن تصل إلى 100٪ [2]. ينتج عن هذا خسائر اقتصادية للمزارعين بسبب انخفاض زيادة الوزن في الخنازير المصابة ، وانخفاض أداء الإنتاج ، والفشل التناسلي في الخنازير [3،4].

يمكن أن تؤدي العدوى المشتركة للإنفلونزا مع مسببات أمراض الجهاز التنفسي الأخرى للخنازير أيضًا إلى تطور مرض الجهاز التنفسي الخنازير ، ونتيجة لذلك ، زيادة الوفيات والخسائر الاقتصادية [5].
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخنازير معرضة للإصابة بـ IAVs للطيور والبشرية وكذلك IAV الخنازير (swIAV) بسبب وجود روابط الجالاكتوز حمض السياليك للطيور والثدييات في الجهاز التنفسي [6]. هذا يجعل من الممكن حدوث إعادة التصنيف عند الإصابة بسلالات متعددة ، مما قد يؤدي إلى إنتاج سلالات جديدة ذات احتمالية حدوث جائحة [4،7].

نظرًا لأن البشر لديهم نفس توزيع ارتباط الجالاكتوز بحمض السياليك في جميع أنحاء الجهاز التنفسي ، فإن الأحداث غير المباشرة ثنائية الاتجاه ممكنة بين البشر والخنازير. كان أول حدث معروف لهذا خلال جائحة الإنفلونزا عام 1918 عندما تم إدخال IAV للخنازير من البشر [8]. ظلت هذه السلالة مستقرة في مجموعات الخنازير حتى التسعينيات ، عندما أعيد تصنيف سلالات H3N2 البشرية والطيور مع سلالة H1N1 المنتشرة لإنتاج سلالات معاد تصنيفها مزدوجة وثلاثية من الأنواع الفرعية H1N1 و H1N2 و H3N2 [8،9].

أدى شريط الجين الثلاثي المعاد تشكيله المطوَّر حديثًا (TRIG) إلى فترة من التنويع السريع لـ IAV في خنازير أمريكا الشمالية [10]. شريط TRIG هذا مستقر للغاية ويسهل استبدال تركيبات HA و NA المختلفة [5]. منذ عام 2005 ، انتشرت العديد من السلالات المزودة بشريط TRIG الداخلي المقترن بجينات HA و NA البشرية عبر قطعان الخنازير في الولايات المتحدة الأمريكية [9].

حدث الانتشار الملحوظ التالي في عام 2009 ، عندما انتشرت سلالة H1N1 من الخنازير (H1N1pdm2009) إلى البشر ، مما أدى إلى جائحة إنفلونزا 2009 [11]. تم تسجيل انتقال العدوى من إنسان إلى خنازير (الأمراض الحيوانية المنشأ العكسية) للوباء البشري H1N1 IAV (H1pdm) عدة مرات في خنازير أمريكا الشمالية ، مما أدى إلى إنشاء سلالة جديدة و swIAVs إعادة تشكيل جديدة [8،10،12].

في المجموع ، تم تسجيل سبع مجموعات متميزة من المستضدات H1 وأربع مجموعات متميزة من فيروسات H3 في خنازير أمريكا الشمالية [5]. في الآونة الأخيرة ، حدد برنامج مراقبة swIAV في آسيا فيروس النمط الجيني 4 (G4) الشبيه بالطيور الأوراسي السائد ، مع H1pdm والجينات الداخلية المعاد تشكيلها الثلاثية.

تم قياس هذا الفيروس G4 في 10.4 في المائة من عمال الخنازير الذين تم اختبارهم ، ويقدم علامات على احتمال حدوث جائحة ، مع القدرة على الانتقال إلى البشر ومستضدات مختلفة عن الفيروسات البشرية المنتشرة حاليًا [7]. لذلك من المهم للغاية منع ومكافحة عدوى الأنفلونزا في الخنازير من منظور صناعة الخنازير والصحة العامة ، والطريقة الرئيسية للقيام بذلك هي من خلال التطعيم [4].

في الولايات المتحدة ، أكثر أنواع اللقاح شيوعًا هو الفيروس المعطل بالكامل (WIV) ، ولكن تمت الموافقة أيضًا على لقاح ناقل الحمض النووي الريبي الذي يعبر عن HA ولقاح فيروس الأنفلونزا الحي الموهن (LAIV) المقتطع من NS 1- [4] . الأنواع الفرعية من IAV الأكثر انتشارًا في الخنازير في جميع أنحاء العالم ، بما في ذلك أمريكا الشمالية ، هي H1N1 و H1N2 و H3N2 [13].

يمكن أن يختلف التنوع الجيني لهذه الفيروسات اختلافًا كبيرًا حسب المنطقة ، وهناك اختلافات في التطور الجيني لـ swIAV في كندا والولايات المتحدة الأمريكية ، خاصة في فيروسات النوع الفرعي H1 [12]. أشارت المراقبة في كندا بين عامي 2009 و 2016 إلى أن الكتل الجينية لـ H1 التي كانت سائدة في الولايات المتحدة ، H1g (1A.3.3.3) و H1d -1 (1B.2.2) ، لم يتم اكتشافها في كندا ، و كانت فيروسات H1 في كندا شديدة التباين عن تلك الموجودة في الولايات المتحدة [12].

تم تحديد كليد H1 جديد (H1a -3) في كندا بدأ في مانيتوبا وخضع للنمو السريع قبل أن ينتشر في جميع أنحاء البلاد وإلى الولايات المتحدة الأمريكية. فيما يتعلق بفيروسات H3 ، تم توثيق ستة سلالات من H3 في الخنازير الأمريكية (IV-A إلى IV-F) ، ومن هؤلاء ، تم العثور على ثلاثة في الخنازير الكندية (IV-B و IV-C و IV-E) [12 ].

هذا يسلط الضوء على أهمية المراقبة الإقليمية والوعي بالسلالات المنتشرة لإبلاغ برامج اللقاحات الفعالة ويشير إلى أن اللقاحات المصممة على أساس IAV المنتشرة في الخنازير الأمريكية قد لا تحمي الخنازير الكندية [12].

في السابق ، تم إنشاء لقاح ثنائي التكافؤ باستخدام اثنين من عزلات swIAV الكندية ، A / Swine / Alberta / SD0191 / 2016 (H1N2) [SD191] و A / Swine / Saskatchewan / SD0069 / 2015 (H3N2) ، وهما ممثلان عن H {{ 9}} مجموعة مستضدية ومجموعة مستضدية H3 جديدة من غرب كندا (مجموعة الخنازير IV-E) ، على التوالي [14]. هذا اللقاح الجديد هو لقاح حي موهن للفيروس تم تصنيعه باستخدام أشكال تعتمد على الإيلاستاز من SD191 و SD69 و SD191 − R342V و SD 69- K345V. أظهرت الدراسات أنه كان وقائيًا ضد كل من SD191 و SD69 ، بالإضافة إلى سلالة H1N2 غير متجانسة A / Swine / Saskatchewan / SD0142 / 2015 (H1N2) التي تم عزلها أيضًا من غرب كندا [14].

منذ ذلك الحين ، استمرت سلالات swIAV المنتشرة في الانجراف. تم جمع عزلات إكلينيكية حديثة من الخنازير في غرب كندا وعزلها من عينات حقلية في الكلية الغربية للطب البيطري ، جامعة ساسكاتشوان ، ساسكاتون ، كندا. A / Swine / MB / SD0467 / 2019 (H1N2) [SD467] هو عضو في مجموعة مستضدات H -3 ولكن لديها خمسة بدائل للأحماض الأمينية من بين 54 موقعًا رئيسيًا لمستضد H1 مقارنة بـ SD191 [10 ، 15 ، 16].

A / Swine / AB / SD0435 / 2019 (H3N2) [SD435] هو عضو في مجموعة IV-E ولكنه انجرف ليشمل استبداليين من الأحماض الأمينية من أصل ستة مواقع رئيسية لمستضد H3 [17].

في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم ما إذا كان LAIV المعتمد على الإيلاستاز ثنائي التكافؤ سيصمد أمام العزلات السريرية الجديدة ، ويمكننا الإبلاغ عن أنه يحمي الخنازير عند مواجهة سلالات swIAV المتداولة حاليًا SD467 (H1N2) و SD435 (H3N2).

2. المواد والأساليب

2.1. الخلايا والفيروسات

تم الحفاظ على خلايا كلية مادين داربي للكلاب (MDCK) (ATCC ، #CRL -2936) في الحد الأدنى الأساسي المتوسط ​​(MEM) (Sigma-Aldrich ، M4655 ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) تحتوي على 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS) (Thermo Fisher Scientific ، أوتاوا ، أونتاريو ، كندا 16000-044) ، وتم الاحتفاظ بها في حاضنة مرطبة بنسبة 5 بالمائة لثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تم عزل A / Swine / Alberta / SD0435 / 2019 (H3N2) [SD435] و A / Swine / Manitoba / SD0467 / 2019 (H1N2) [SD467] swIAV من العينات الميدانية في الكلية الغربية للطب البيطري ، جامعة ساسكاتشوان ، ساسكاتون ، SK ، كندا.

تم إنقاذ فيروسات اللقاح SD191 − R342V و SD 69- K345V كما هو موضح سابقًا [14]. نمت جميع الفيروسات في خلايا MDCK في وجود 0. 2 في المائة من ألبومين المصل البقري (BSA) (Sigma-Aldrich، A7 0 30) مع 1 ميكروغرام / مل لتر - [(التولوين { {11}} سلفوناميد) -2- فينيل] إيثيل كلورو ميثيل كيتون (TPCK) - التربسين (فيروسات WT) أو 0.5 ميكروغرام / مل من الإيلاستاز البشري (فيروسات تعتمد على الإيلاستاز) (Sigma-Aldrich، E8140).
2.2. تصميم التجارب على الحيوانات

تم الحصول على أربعة وعشرين من الخنازير سلبية swIAV البالغة من العمر أربعة أسابيع من Prairie Swine Center Inc. (ساسكاتون ، SK ، كندا). تم اختيار هذه الخنازير بشكل عشوائي وقسمت إلى أربع مجموعات بها سبعة خنازير لكل مجموعة تم تحصينها ، وخمسة خنازير لكل مجموعة تم تحصينها.

يتم وصف مهمة المجموعة في الشكل 1A. تم إيواء هذه المجموعات في غرف منفصلة بناءً على مجموعات التطعيم (تم تجميع المجموعات A plus B و C plus D معًا) وسمح لها بالتأقلم لمدة سبعة أيام قبل الإصابة.

في عمر خمسة أسابيع (اليوم 0) وكذلك في عمر ثمانية أسابيع (اليوم 21) ، تم تحصين الخنازير في المجموعتين A و B داخل القصبة الهوائية باستخدام 4 مل من MEM ، بينما تم تلقيح المجموعتين C و D بلقاح ثنائي التكافؤ يحتوي على 1 × 106 PFU لكل SD191 − R342V و SD 69- K345V في 4 مل MEM. بعد عشرة أيام (اليوم 31) ، تم تحدي الخنازير إما باستخدام MEM (وهمي) أو 1 × 106 PFU من SD 435- WT (H3N2) أو SD 467- WT (H1N2).

تمت مراقبة الخنازير لمدة خمسة أيام بعد التحدي ، مع أخذ درجات حرارة المستقيم يوميًا وأخذ مسحات من الأنف من كلا الخياشيم في الأيام 1 و 3 و 5. تم جمع المصل بعد التطعيم الأول (اليوم 20) والثاني (اليوم 30) من أجل مقايسة تحييد فيروس المصل (SVN) ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

في اليوم الخامس بعد التحدي ، تم قتل جميع الخنازير بطريقة إنسانية ، وتم استخراج الرئتين وتقييمهما لوجود آفات جسيمة مميزة لـ swIAV. كما تم جمع عينات أنسجة الرئة لعزل الفيروس (الشكل 1 ب).

2.3 بيان الأخلاق

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان بالجامعة (UACC) ومجلس أخلاقيات أبحاث الحيوان (AREB) بجامعة ساسكاتشوان. تمت الموافقة على هذا البروتوكول في 12 نوفمبر 2021 (بروتوكول استخدام الحيوان رقم 20190064). تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقًا للمعايير المطلوبة من قبل المجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC) في منظمة اللقاحات والأمراض المعدية (VIDO) ، جامعة ساسكاتشوان ، ساسكاتون ، SK ، كندا.

2.4 أخذ العينات

تم وضع مسحات الأنف من كل فتحة في 1 مل من MEM التي تحتوي على 1 × مضاد حيوي مضاد للفطريات (Thermo Fisher Scientific ، أوتاوا ، ON ، كندا ، 15240-062) وتم تجميدها عند -80 درجة مئوية حتى تم إجراء qRT-PCR. تم قتل جميع الخنازير بطريقة إنسانية عن طريق الحقن في الوريد من الإيثانول (240 مجم / مل من بنتوباربيتال الصوديوم ؛ 2 مل لكل 4.5 كجم). عند القتل الرحيم ، تمت إزالة الرئتين بالكامل لتحديد النسبة المئوية للآفات ذات اللون الأرجواني والأحمر ، والآفات الثابتة وكذلك الالتهاب الرئوي.

تم تحديد النسب بناءً على أوزان شحمة الرئة بالإضافة إلى حجم الرئة بالكامل [18]. كما تم أخذ عينات الرئة من الفص القمي الأيمن والقلب والحجاب الحاجز للمعايرة الفيروسية. تم خلط عينات الرئة هذه بأحجام متساوية 10 بالمائة وزن / حجم MEM تحتوي على 1 × مضاد حيوي - مضاد للفطريات للمعايرة.

الشكل 1. تجميع الخنازير وتصميم التجربة لتقييم الفعالية الوقائية لـ LAIV ثنائي التكافؤ ضد العزلات السريرية الجديدة. تم تلقيح الخنازير (n=5 لمجموعات MEM / MEM و n=7 للمجموعات ثنائية التكافؤ / ثنائية التكافؤ) داخل القصبة الهوائية بـ 4 مل من MEM أو اللقاح الثنائي التكافؤ المكون من 1 × 1 0 6 PFU من كل SD191 − R342V و SD 69- K345V في اليومين 0 و 21. في اليوم 31 ، تم تحدي الخنازير داخل الرغامى باستخدام MEM أو 1 × 106 PFU من SD435 (H3N2) أو SD467 (H1N2). (أ)

جدول التحصين والتحدي وأخذ العينات لهذه التجربة الحيوانية. سُمح لأربعة وعشرين خنازيرًا سلبية swIAV بعمر أربعة وعشرين أسبوعًا بالتأقلم لمدة سبعة أيام قبل الإصابة. في عمر خمسة أسابيع (اليوم 0) وكذلك في عمر ثمانية أسابيع (اليوم 21) ، تم تحصين الخنازير في المجموعتين A و B داخل القصبة الهوائية باستخدام 4 مل من MEM ، بينما تم تلقيح المجموعتين C و D بلقاح ثنائي التكافؤ يحتوي على 1 × 106 PFU لكل SD191 − R342V و SD {11}} K345V في 4 مل MEM.

بعد عشرة أيام (اليوم 31) ، تم تحدي الخنازير إما باستخدام MEM (وهمي) أو 1 × 106 PFU من SD 435- WT (H3N2) أو SD 467- WT (H1N2). تمت مراقبة الخنازير لمدة خمسة أيام بعد التحدي ، مع أخذ درجات حرارة المستقيم يوميًا وأخذ مسحات من الأنف من كلا الخياشيم في الأيام 1 و 3 و 5. تم جمع المصل بعد التطعيم الأول (اليوم 20) والثاني (اليوم 30). في اليوم الخامس بعد التحدي (اليوم 36) تم قتل جميع الخنازير بطريقة إنسانية ، وتم استخراج الرئتين للتقييم. (ب) تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com.

2.5 مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

لصنع مستضدات الطلاء ، تم نشر SD435 و SD467 في خلايا MDCK وتنقيتها باستخدام تنبذ فائق متدرج من السكروز. حدث تعطيل للفيروسات عن طريق إضافة 97 في المائة من بروبيولاكتون إلى الفيروس بتركيز 1: 1000 (ت / ت) (Thermo Fisher Scientific ، AAB2319703). تم هز هذا الخليط عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، وتم تحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لتسهيل التحلل المائي لـ -بروبيولاكتون ، ثم تخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

لقياس مستويات IgG الخاصة بـ swIAV الناتجة عن التطعيم والتحدي ، تم أخذ مصل الخنازير بعد التطعيم الأول (اليوم 20) والثاني (اليوم 30) ، وقبل التشريح (اليوم 36).

تم تطبيق الفيروسات المنقاة المعطلة بالبروبيولاكتون SD435 (1 ميكروغرام / مل) و SD467 (2 ميكروغرام / مل) ، المخففة في طبقة عازلة لطلاء الكربونات / البيكربونات (درجة الحموضة 9.6) على لوحات بئر Immulon -2 96- عند 1 {{ 12}} 0 L / بئر (Thermo Labsystems ، أوتاوا ، أونتاريو ، كندا ، 3655) وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد فترة الحضانة طوال الليل ، تم غسل الألواح المطلية أربع مرات باستخدام TBST (0. 1 M Tris ، 0.17 M NaCl ، و 0.05 بالمائة Tween 20) ، والتي تمت إضافة التخفيفات التسلسلية بأربعة أضعاف من المصل أو BALF إلى طبق من نسختين ، متبوعًا بساعتين حضانة في درجة حرارة الغرفة. تمت إضافة المصل بتخفيف ابتدائي قدره 1:10 ، وأضيف BALF غير مخفف.

تم تشغيل عينات من مصل التحكم الإيجابي المحدد مسبقًا والضوابط السلبية المناسبة ، والمصل ، و BALF من الخنازير غير المحصنة في دراسة سابقة على كل طبق [14]. تم غسل الألواح أربع مرات باستخدام TBST ، وبعد ذلك الماعز المضاد للخنازير IgG (H plus L) من الفوسفاتيز المسمى بالفوسفاتيز (1: 5000) (Sigma Aldrich ، SAB3700435) أو IgA المضاد للفئران (Serotec ، MCA658) ( تمت إضافة 1: 300) المخفف في TBST وتركها للاحتضان عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

تم تطوير IgA ELISAs عن طريق إضافة الأجسام المضادة IgG (H plus L) الماعز المضادة للفئران (CALTAG ، Burlingame ، CA ، USA ، M3 0 015) ومحلول الفوسفاتيز القلوي الستربتافيدين (Jackson ImmunoResearch ، West Grove ، PA) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، تم غسل كل من صفيحي IgG و IgA أربع مرات باستخدام TBST ، حيث كانت ركيزة فوسفات p-nitrophenyl (PNPP) [10 ملغ / مل من فوسفات نيتروفينيل ثنائي (تريس) بلوري الملح (Sigma-Aldrich) ، 1 في المائة من ثنائي إيثانول أمين ( تمت إضافة Sigma-Aldrich) ، 0.5 مجم / مل MgCl ، ودرجة الحموضة 9.8] (1 مجم / مل) واحتضانها عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

تم إيقاف التفاعل من خلال إضافة 0 .3 M ethylenediaminetraacetic acid (EDTA) ، وقراءة الصفائح في مقياس طيف ضوئي عند 405 نانومتر بمرجع يبلغ 490 نانومتر. تم تعريف عيار العينة على أنه أعلى تخفيف يكون فيه OD لتلك العينة أعلى من الحد المحدد (متوسط ​​OD لعينة سالبة معروفة بالإضافة إلى ضعف الانحراف المعياري).

2.6. مقايسة تحييد الفيروس (VN)

تم طلاء خلايا MDCK (3.5 × 104) في 96- ألواح جيدة. تم تعطيل حرارة المصل و BALF عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تمت إضافة تخفيفات مضاعفة من المصل و BALF إلى اللوحة الرباعية ، وتم تحضين 60 ميكرولتر من المصل المخفف أو BALF بحجم متساوٍ من SD435 أو SD456 يحتوي على 100 TCID50 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

تمت إضافة 100 ميكرولتر من الخليط بعد ذلك إلى خلايا MDCK ، وتم توثيق التأثير الممرض للخلايا (CPE) في 48 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة (pi). كان عيار الجسم المضاد المعادل هو أعلى تخفيف لكل عينة مصل يحمي الخلايا تمامًا من CPE في ما لا يقل عن 2 من 4 آبار.

2.7. التحديد الفيروسي

عند الجمع ، تم وضع عينات الرئة على الفور على الجليد وتجميدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى المعالجة. للمعالجة ، تم وزن كل نسيج رئوي وتمت إضافة تركيز 10 بالمائة (وزن / حجم) من MEM مع 1 × مضاد حيوي مضاد للفطريات (Thermo Fisher Scientific ، 15240-062). تم تجانس أنسجة الرئة في TissueLyser II (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) عند 30 هرتز لمدة 5 دقائق ، تليها الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم جمع المادة الطافية المتجانس وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

تم تدوير مسحات الأنف لمدة 15 ثانية وطردها عند 1600 × جم لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم جمع المواد الطافية وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. تم تحديد التتر الفيروسي بواسطة مقايسة TCID50 للرئة و RT-PCR الكمي لمسحات الأنف.

2.8 استخراج الحمض النووي الريبي والكمي RT-PCR (qRT-PCR)
لتحديد مستويات الحمض النووي الريبي الفيروسي من SD467 و SD435 في مسحات الأنف بعد التحدي ، تم إجراء qRT-PCR. تم عمل منحنى قياسي باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من SD435 و SD467 من عيار معروف. باختصار ، تم استخدام RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen، Toronto، ON، Canada، 74136) لاستخراج vRNA من 200 ميكرولتر من غسول الأنف.

تم تحويل الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] باستخدام الإنفلونزا الأولية العالمية Uni12 و SuperScript III Transcriptase (Invitrogen ، Burlington ، ON ، كندا) [19]. تم إجراء qPCR في ثلاث نسخ على نظام StepOnePlus TM Real-Time PCR (Applied Biosystems ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام Power SYBR Green PCR Master Mix (النظم الحيوية التطبيقية) ، 5 ميكرولتر cDNA ، و 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من البادئات الأمامية والخلفية. تم تشغيل تفاعلات PCR عند درجة حرارة التلدين 58 درجة مئوية لمدة 40 دورة. جميع تسلسلات qPCR الاشعال متاحة عند الطلب.

2.9 تحليل احصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism 8. تم استخدام اختبارات Mann-Whitney و Kruskal-Wallis غير البارامترية. يتم الإشارة إلى الاختلافات الجوهرية بواسطة * (p <0. 0 5) ، ** (p <0. 0 1) ، *** (p <0.001) ، أو **** (p <0.0001). ns=غير مهم.

For more information:1950477648nn@gmail.com