نهج البروتينات القائم على الاكتشاف يحدد البروتين إيزوميراز ثنائي كبريتيد (PDIA1) كمؤشر حيوي لإجهاد الخلية في داء السكري من النوع 1

ملخص

تم ربط استجابات الإجهاد في الخلفية داخل الخلية بزيادة موت الخلايا وتسريع تنشيط المناعة في مرض السكري من النوع 1 (T1D). في الوقت الحاضر ، لا توجد معلومات حول توقيت ونطاق هذه الاستجابات بالإضافة إلى التغييرات المرتبطة بالأمراض في تعبير بروتين خلية الجزيرة أثناء تطور T1D.

الطريقة تم إجراء قياس طيف اكتساب الكتلة المستقل للبيانات على الجزر التي تم جمعها طوليًا من الفئران NOD وفئران NOD-SCID التي أصبحت مصابة بداء السكري من خلال النقل بالتبني للخلايا التائية.

النتائج في الجزر التي تم جمعها من إناث فئران NOD في عمر 10 و 12 و 14 أسبوعًا ، وجدنا تنظيمًا مقيدًا بالوقت للبروتينات المشاركة في تخفيف الإجهاد والحفاظ على وظيفة الخلية ، متبوعًا بفقدان التعبير عن البروتينات الواقية التي بشرت ببدء مرض السكري . تم تعديل إشارات EIF2 واستجابة البروتين غير المطوية وإشارات mTOR ووظيفة الميتوكوندريا والفسفرة المؤكسدة بشكل شائع في كل من الفئران NOD وفئران NOD-SCID التي أصبحت مصابة بداء السكري الحاد عن طريق نقل الخلايا التائية بالتبني. تم تنظيم إيزوميراز ثنائي كبريتيد البروتين A1 (PDIA1) في جزر NOD وأقسام البنكرياس من المتبرعين بالأعضاء البشرية بإيجابية الأجسام المضادة أو T1D. علاوة على ذلك ، زادت مستويات البلازما PDIA1 في فئران NOD قبل الإصابة بالسكري وفي مصل الأطفال الذين يعانون من ظهور T1D حديثًا مقارنةً بالضوابط غير المصابة بالسكري. التفسير حددنا مجموعة أساسية من المسارات المعدلة عبر نماذج الماوس المميزة لـ T1D وحددنا PDIA1 كعلامة حيوية بشرية محتملة لإجهاد الخلية في T1D. تمويل المعاهد الوطنية للصحة (R01DK093954 و DK127308 و U01DK127786 و UC4DK104166 و R01DK060581 و R01GM118470 و 5T32DK 101001-09). جائزة VA Merit I01BX001733. JDRF (2- SRA -2019-834- SB ، 2- SRA -2018-493- AB ، 3- PDF -20016-

199- AN و 5- CDA -2022-1176- AN و 3- PDF -2017-385- AN).

حقوق النشر تم نشرها بواسطة Elsevier BV هذه مقالة مفتوحة الوصول بموجب ترخيص CC BY-NC-ND (http: // creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.{5}}/).

الكلمات المفتاحية: إجهاد الخلية ؛ مرض السكر النوع 1؛ إيزوميراز ثنائي كبريتيد البروتين A1 ؛ البروتيوميات. المؤشرات الحيوية

البحث في السياق

انقر فوق Cistanche لهرمون التستوستيرون الداعم

الأدلة قبل هذه الدراسة

يتطور مرض السكري من النوع الأول (T1D) على مدار إطار زمني يمتد لسنوات عديدة ونتيجة للتفاعل المعقد وثنائي الاتجاه بين خلية البنكرياس والجهاز المناعي. ربطت النتائج المستخلصة من نماذج خارج الجسم الحي لـ T1D وأقسام البنكرياس من متبرعين بأعضاء بشرية مصابين بداء السكري التغيرات في كتلة الخلية ووظيفتها مع تنشيط مجموعة متنوعة من مسارات الإجهاد ، والتي يُعتقد أن العديد منها يسرع موت الخلايا ويزيد من مناعة الخلية. ومع ذلك ، فإن غالبية الدراسات الحالية قد فحصت الأنسجة في نقطة زمنية واحدة ، مما أدى إلى رؤية محدودة لتسبب المرض الذي يفتقر إلى الدقة بشأن توقيت ونطاق استجابات الخلايا أثناء تطور المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تمت ترجمة عدد قليل من النتائج بين أنسجة الفئران والأنسجة البشرية وإلى فحوصات العلامات الحيوية المحتملة.

القيمة المضافة لهذه الدراسة

لتوصيف التغييرات في بروتين الجزيرة أثناء تطور T1D ، تم عزل الجزر من الفئران NOD وفئران NOD-SCID المصابة بمرض السكري الحاد من خلال النقل بالتبني للخلايا التائية وتحليلها باستخدام مطياف الكتلة الاكتساب المستقل للبيانات (DIA-MS). في الجزر التي تم جمعها طوليًا من نموذج فأر NOD التقدمي المزمن ، كان هناك تنظيم مقيد بالوقت للبروتينات المشاركة في الحفاظ على وظيفة الخلية وتخفيف الإجهاد ، متبوعًا بفقدان التعبير عن العديد من البروتينات الوقائية التي تسبق تطور مرض السكري. في بداية مرض السكري ، حدد تحليل البروتينات مجموعة مشتركة من المسارات المعدلة في كل من جزر NOD و NOD-SCID. تضمنت المسارات المتورطة عبر النموذجين إشارات EIF2 واستجابة البروتين غير المطوية وإشارات mTOR وخلل الميتوكوندريا والفسفرة التأكسدية. لترجمة نتائجنا إلى البشر ، ركزنا على بروتين إيزوميراز ثنائي كبريتيد البروتين A1 (PDIA1) ، وهو عبارة عن بروتين ثيول أوكسيريدوكتاز موضعي بكثرة ويفرز ER والذي يلعب دورًا في إفراز الأنسولين ومعالجة proinsulin والحماية من إجهاد الخلية ER. في تجارب الاستثارة المناعية ، تحققنا من نمط ثنائي الطور للتعبير عن PDIA1 أثناء تقدم T1D في جزر NOD ، ووجدنا زيادة في تعبير PDIA1 في الجزر البشرية التي عولجت خارج الجسم الحي باستخدام السيتوكينات وفي الجزر من أنسجة البنكرياس التي تم جمعها من متبرعين بالأعضاء البشرية بإيجابية الأجسام المضادة ومع T1D. علاوة على ذلك ، ارتفعت مستويات البلازما لـ PDIA1 في فئران NOD السابقة لمرض السكري وفي مصل الأطفال الذين يعانون من T1D حديثًا مقارنة بالعمر والجنس غير المصابة بالسكري.

الآثار المترتبة على كل الأدلة المتاحة

تسلط دراستنا الضوء على قيمة تطبيق مناهج البروتينات غير المتحيزة في النماذج قبل السريرية لتحديد مسارات الخلايا الرئيسية المشاركة في التطور الزمني لـ T1D. باستخدام هذه الإستراتيجية ، حددنا مجموعة مشتركة من المسارات المعدلة عبر العديد من نماذج الماوس المتميزة لـ T1D وحددنا PDIA1 باعتباره علامة بيولوجية محتملة مرتبطة بـ T1D في البشر.

مقدمة

ينتج داء السكري من النوع الأول (T1D) عن التدمير المناعي للخلايا المنتجة للأنسولين ويتلاعب سريريًا بعد حدوث انخفاض عتبة في كتلة الخلية ووظيفتها. تشير البيانات المأخوذة من مجموعات سريرية من الأفراد الموجودين في الجسم المضاد الذاتي إلى وجود العديد من نقاط التفتيش الأيضية التي يمكن التنبؤ بها أثناء تقدم T1D. في المرحلة المبكرة من المرض وبعد تطور الأجسام المضادة الذاتية ، هناك خسارة قابلة للقياس للاستجابات المبكرة للببتيد C وانخفاض إفراز الببتيد C أثناء اختبار تحمل الجلوكوز الفموي (OGTT) الذي يمكن اكتشافه حتى ست سنوات قبل التشخيص السريري. 2 يتبع ذلك مرحلة ثانية من قياسات OGTT C-peptide مستقرة نسبيًا. حساسية الجلوكوز إلى جانب انخفاض حساسية الأنسولين وارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. من نماذج الأمراض خارج الجسم الحي وأقسام البنكرياس من المتبرعين بالأعضاء البشرية المصابين بداء السكري ربطت التغيرات في كتلة الخلية ووظيفتها بتنشيط مجموعة متنوعة من الخلايا مسار الإجهاد الجوهري - طرق ، مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER) والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والتعبير المفرط لـ HLA من الفئة الأولى ، والتغيرات في أنماط التضفير البديلة ، وكلها متورطة في موت الخلايا وزيادة مناعة الخلية.

في الوقت الحاضر ، هناك عامل مقيد رئيسي في علاج أو الوقاية من T1D هو نقص المعرفة فيما يتعلق بتوقيت وطبيعة الخلل الوظيفي للخلايا قبل ظهور المرض السريري. من المحتمل أن تمثل حالة المرض خلال فترة ما حول التشخيص نافذة رئيسية للتدخل العلاجي الفعال .15 لا يمكن سريريًا التصوير الطولي لحجرة الخلية وأخذ عينات من البنكرياس في الأفراد الأحياء. توفر الدراسات التي أجريت باستخدام الجزر المعزولة أو أقسام البنكرياس من المتبرعين بالأعضاء المصابين بداء السكري معلومات مهمة حول التسبب في المرض ؛ ومع ذلك ، فإنها تتيح فقط عرضًا خاطفيًا فرديًا لتسبب المرض. يمكن أن يحسن الاستبانة المؤقتة للبرامج الجزيئية التي تم تعديلها داخل الخلية أثناء تطوير T1D استراتيجيات العلاج والواسمات الحيوية لدى البشر.

لقد تم استخدام فأر غير مصاب بالسكري (NOD) على نطاق واسع لدراسة التسبب في المرض T1D لأكثر من ثلاثة عقود .19-21 تظهر الجزر المأخوذة من إناث الفئران NOD دليلاً على تغلغل الخلايا المناعية في وقت مبكر يصل إلى أربعة أسابيع من العمر ، 22 وأغلبية من إناث فئران NOD يصابون بمرض السكري. على النقيض من ذلك ، تظل غالبية فئران NOD الذكور خالية من مرض السكري .19،23 بما يتوافق مع الأنماط التي لوحظت في البشر ، ووظيفة الخلية وتراجع الكتلة في فئران NOD الإناث خلال مرحلة ما قبل مرض السكري. في التحليلات المقطعية ، تم تحديد مجموعات فرعية من مسارات الإجهاد المتداخلة في خلايا من الفئران NOD وفي الجزر البشرية من متبرعين بالأعضاء بقطر 20 ، 24 ، 25 لذلك ، التحليل الطولي لجزر البنكرياس لإناث الفئران NOD أثناء التقدم قد يسمح T1D بتحديد مسارات الإجهاد التي يتم تنشيطها قبل تدمير الخلية ، وبالتالي تمكين تحديد المؤشرات الحيوية السريرية وتطوير العلاجات المحتملة.

لاكتساب نظرة ثاقبة على المسار الزمني للتغيرات الجزيئية في الخلية أثناء تقدم T1D ، استخدمنا نهجًا قائمًا على اكتساب الكتلة الطيفية (DIA-MS) المستقل للبيانات لمراقبة التغيرات الطولية في بروتين الجزيرة أثناء تطور المرض المبكر والمتأخر في الفئران إيماءة. لتوضيح فائدة هذا النهج في إعطاء الأولوية لبروتينات الخلايا كمؤشرات حيوية T1D ، ركزنا على بروتين ثنائي كبريتيد أيزوميراز A1 (PDIA1) كمثال على البروتين المفرز الذي تم التعبير عنه بشكل مختلف في جزر NOD أثناء تقدم مرض السكري. لقد أظهرنا زيادة تعبير جزيرة PDIA1 في جزر NOD الفأرية أثناء تطور T1D وفي أقسام البنكرياس من متبرعين بالأعضاء البشرية بإيجابية الأجسام المضادة أو مع T1D. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير مقايسة التلألؤ الكهربائي عالي الحساسية لقياس مستويات PDIA1 المتداولة. باستخدام هذا الاختبار ، أظهرنا زيادة مستويات البلازما PDIA1 في الفئران NOD قبل السكري وفي مصل الأطفال الذين يعانون من T1D حديثًا مقارنةً بضوابط الأطفال المتطابقة مع العمر والجنس.

أساليب

الحيوانات والإجراءات التجريبية

Female NOD/ShiLTJ (NOD), NOD-BDC2.5, and NOD-SCID mice were purchased from Jackson Laboratory. Female outbred CD1 mice  were  purchased  from  Charles River Laboratories. Only female NOD  mice  were utilized for this study, as spontaneous T1D development occurs almost exclusively in female mice (∼80–85% diabetes incidence in our vivarium), making it very difficult to study diabetes pathogenesis in male NOD mice (∼10% diabetes incidence).26,27 Mouse studies were conducted in accordance with the ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)guidelines.28 Mice were allowed to acclimate for at least two weeks upon arrival prior to the initiation of experi- ments. Blood glucose was monitored weekly in all the mouse models and diabetes was defined as a blood glucose >250 مجم / ديسيلتر لقياسين متتاليين. تم تسجيل جلوكوز الدم ووزن الجسم في يوم عزل الجزيرة لكل فئة عمرية من الفئران المستخدمة لتحليل المصب (الشكل التكميلي S1). تم عزل جزر البنكرياس أو حصاد البنكرياس في النقاط الزمنية المحددة باستخدام الطرق الموصوفة سابقًا.

تم انتقاء جزر الفأر يدويًا وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وتخزينها على شكل حبيبات عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم الحصول على الدم لتحليل البلازما في وقت القتل الرحيم عن طريق ثقب في القلب ، وتم نقله إلى أنبوب Becton Dickinson Vacutainer K2EDTA (Cat # 365974) ، وتم تفريغه عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم اقتطاع عينات البلازما المنفصلة في أنابيب كريوت سعة 1.5 مل وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

تم تحضير معلقات خلية الطحال أحادية الخلية لتجارب النقل بالتبني من 12- فئران NOD-BDC2.5 عمرها أسبوع ، كما هو موصوف سابقًا ، تم تنقية 31 CD4 بالإضافة إلى خلايا T عن طريق الاختيار السلبي (Cat # 558131 ، BD Biosciences) ، ، تم تنشيطه في {9}} لوحات الآبار (5 × 106 خلايا/ بئر) ، مغلفة بأجسام مضادة لـ CD3 و anti-CD28 (1 ملغ/ مل لكل منهما) ، وتم توسيعها لمدة 72 ساعة في T -75 (5 × 106 خلايا/ass) في متوسطة RPMI 1640 كاملة

(1 بالمائة بنسلين / ستربتومايسين و 10 بالمائة FBS) تحتوي على 100 وحدة / مل IL -2. تم جمع الخلايا لاحقًا وغسلها مرتين بمحلول ملح متوازن من Hanks (HBSS) ، وتم تخفيفها إلى 5 × 10 خلايا / مل في HBSS. 32 متلقي 8- فئران مناعية عمرها أسبوع - تلقت الفئران NOD- SCID 1 × 106 T عن طريق الحقن داخل الصفاق ، وتم قياس نسبة الجلوكوز في الدم يوميًا لمدة 21 يومًا. تم استخدام الفئران NOD-SCID المتطابقة مع العمر والتي تلقت HBSS وحدها كعناصر تحكم. عُرِّف ظهور مرض السكري على أنه قراءتان متتاليتان لغلوكوز الدم

أكبر من أو يساوي 250 مجم / ديسيلتر.

تم إجراء تلطيخ التألق المناعي والتلوين المناعي الكمي (IF) للتحقيق في النتائج الرئيسية من تحليل MS. brie y y ، formalin-exed paraf-n-pancedded (FFPE) من الأنسجة البنكرياسية من الفئران المستقلة من الفئران المتطابقة مع العصر السكري ، تم الحصول عليها في 7 ، 9 ، 11 ، 13 أسبوعًا من العمر والفئر من 5 ميكرومتر و deparaf - nized. تم ترطيب المقاطع مرتين باستخدام زيلين طازج لمدة 5 دقائق وسلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة (100-70 بالمائة). تم إجراء استرجاع مضاد للجينات باستخدام محلول السترات وملطخ باستخدام أجسام مضادة ضد PDIA1 (تشوير الخلية ، Cat # 3501S ، RRID: AB _2156433) ، PRDX3 (Abcam ، Cat #

ab73349 ، RRID: AB _1860862) ، 14-3-3 / YWHAB

(Sigma ، Cat # HPA011212 ، RRID: AB _1844334) ، الأنسولين (Dako ، Cat # IR002 ، RRID: AB _2800361) ، الجلوكاجون (Abcam ، Cat # ab10988 ، RRID: AB {{5} })، يقطع

(Thermofisher Scienti ، cat# ma 1-250 ، rrid: ab _ 2292611) ، و bip (تقنية إشارات الخلية ، Cat# 3177s ، rrid: ab _2119845). وبالمثل ، تم استلام أقسام الأنسجة البنكرياسية البشرية من المتبرعين بالأعضاء غير المصابين بالسكري ، والمتبرعين بالأعضاء الذين يعانون من إيجابية الأجسام المضادة ولكن ليس لديهم مرض السكري ، والمتبرعين بالأعضاء الذين يعانون من T1D (الجدول التكميلي S5) من شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس (nPOD). لـ PDIA1 والأنسولين والجلوكاجون باستخدام الأجسام المضادة الأولية المذكورة أعلاه. تضمنت الأجسام المضادة الثانوية Alexa 488- المسمى بخنزير الماعز المضاد لخنزير غينيا ، و Alexa 568- المسمى حمار مضاد للأرانب ، و Alexa 647- المسمى بالأجسام المضادة للفأر الحمير. كانت النوى ملطخة بـ DAPI. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر LSM800 (زايس ، ألمانيا) ومُحدد باستخدام برنامج Image-J (NIH) كما هو موضح سابقًا .30 من كل فأر (4-7 فئران / مجموعة) ، تم اختيار 3-7 جزر بشكل عشوائي للتصوير ، وبالنسبة لأقسام البنكريتيك البشري ، تم اختيار 5-10 جزر من كل متبرع عشوائياً للتصوير. تم حساب شدة تألق خلية الجزيرة الكلية الطبيعية بشكل مستقل من قبل شخصين يعملان بطريقة أعمى.

جمع عينات المصل البشري

تم الحصول على مصل الصيام من الأطفال الذين يعانون من ظهور T1D حديثًا وعناصر تحكم صحية غير مصابة بالسكري متطابقة مع العمر والجنس (الجدول الإضافي S1). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة أو موافقة الوالدين وموافقة الطفل من جميع المشاركين. وقد تم تشخيص الأطفال المصابين بالنوع الأول من المرض حديثًا في غضون 48 ساعة من جمع الدم وتم نقلهم إلى المستشفى في مستشفى رايلي للأطفال. كان موضوعات طب الأطفال الضابطة من عيادة خارجية ، ولم يأخذوا أي وصفة طبية مزمنة ، وكانوا خاليين من أي مرض مزمن أو حاد في غضون أسبوعين قبل أخذ العينات.

قياس مصل الدم والبلازما PDIA1

تم فحص ثلاثين ميكرولتر من عينات بلازما الماوس المخففة ذات شقين أو ثلاثين ميكرولتر من أربعة أضعاف عينات المصل البشري المخفف. تم استخدام بروتين rPDIA1 المخفف تسلسليًا بأربعة أضعاف بتركيز ابتدائي 2500 نانوغرام / مل لتوليد منحنى قياسي. نظرًا لأن بروتين PDIA1 للإنسان والفأر يشتركان في 93.725 بالمائة من تجانس التسلسل ، فقد تم استخدام بروتين rPDIA1 البشري كمعيار لقياس عينات الإنسان والفأر. لتقدير المستويات المتداولة لـ PDIA1 في عينات بلازما المصل البشري والفأر ، تم تحضين ألواح MSD المعيارية ذات البقعة الواحدة مع 5 ميكروغرام / مل من جسم مضاد الالتقاط (Sigma ، Cat # HPA018884 ، RRID: AB _1854896) طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، وتم اتباع نفس الإجراءات الموضحة أعلاه تحت عنوان "تطوير الفحص". بعد حضانة العينة ، تم غسل الألواح كما هو موضح أعلاه واحتضانها باستخدام الجسم المضاد للكشف عن الفئران PDIA1 (Thermo Fisher Scienti c، Cat # MA 3-019، RRID: AB _ 2163120) لمدة ساعة واحدة في شاكر مداري عند RT. تم بعد ذلك غسل الألواح واحتضانها باستخدام ماوس MSD Sulfo-Tag لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة في شاكر. أخيرًا ، تمت قراءة الألواح باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقراءة في قارئ لوحة Quick Plex SQ 120 (MSD) ، وتم تحليل البيانات كما هو موضح أعلاه.

يتم توفير تفاصيل معالجة وتحليل عينات قياس الطيف الكتلي ، وثقافة الجزيرة البشرية والطبقة المناعية ، وتطوير المقايسة لقياس البلازما والمصل PDIA1 في المواد والطرق التكميلية والجدول التكميلي S3.

أخلاق مهنية

تم الحفاظ على الفئران في مركز الموارد الحيوانية بمختبر كلية الطب بجامعة إنديانا بموجب البروتوكولات التي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة إنديانا (رقم البروتوكول: 20104 MD / R / HZ / E / AR). تم الحصول على مصل الصيام من الأطفال الذين يعانون من ظهور T1D حديثًا وضوابط صحية غير مصابة بالسكري متطابقة مع العمر والجنس بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة إنديانا (رقم البروتوكول: 1411938757). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة أو موافقة الوالدين وموافقة الطفل من جميع المشاركين

إحصائيات

لتحديد حجم العينة ، استخدمنا https: // clincalc. كوم / احصائيات / برنامج sampleize.aspx. في بداية الدراسة ، جمعنا عينات جزيرة من إجمالي 79 فأر لتحليل DIA-MS. باستخدام معايير مراقبة الجودة الصارمة الموضحة في الطرق التكميلية ، تم استبعاد ما مجموعه 18 عينة بعد تحليل قياس الطيف الكتلي. على الرغم من هذه الاستثناءات ، كان حجم العينة لكل مجموعة عند أو أعلى من 3 فئران / مجموعة ، والتي وفرت 8 0 بالمائة من القوة لاكتشاف الاختلافات بين المجموعات بافتراض الخطأ من النوع الأول وهو 0. 05، استنادًا إلى معدل حدوث المرض المؤسس بنسبة 80-85 في المائة في مستعمرة NOD. تم تحليل تغيرات وفرة البروتين في بروتينات الجزيرة في مجموعات عينات مختلفة باستخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA). تم تحديد الاختلافات في وفرة البروتين بين مجموعتين باستخدام اختبارات الطالب t. تم اختبار الفروق بين مجموعتين أو أكثر باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. تم اعتبار AP 0.05 مهمًا. تم تصور البروتينات المعبر عنها تفاضليًا باستخدام خرائط الحرارة (https: // software.broadinstitute.org/morpheus/) مع تحليل المجموعات الهرمية غير الخاضعة للرقابة. تم ترشيح متوسط ​​المسارات التي تم تطبيعها لأعلى ولأسفل باستخدام تغيير 1.5 مرة على البيانات المحولة من السجل 2 وتم إجراء الإثراء الوظيفي لمجموعات البروتين بتعبير مختلف باستخدام تحليل مسار الإبداع. تم استخدام اختبار الصيادين الدقيق لفحص أهمية التخصيب باستخدام P المصححة من Bonferroni< 0.05. For analysis of PDIA1 in human cohorts, we used the mean ± S.D. of PDIA1 fluorescent intensities (n = 4 mice/group) to calculate sample size requirements. Based on these calculations, a sample size of 10 per group provided 80% power with a type I error α of 0.05. Data other than mass spec- trometry were analysed using GraphPad Prism version

9. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± SEM أو متوسط ​​± SD

دور الممولين

لم تلعب مصادر التمويل لهذا المشروع أي دور في تصميم الدراسة ، أو جمع البيانات ، أو التحليل ، أو التفسير ، أو الكتابة ، أو تحرير المخطوطة.

نتائج

تحليل التغيرات الزمنية في بروتين NOD أثناء تطور المرض

لتوصيف التغيرات الزمنية في تعبير بروتين الجزيرة أثناء تقدم مرض السكري ، تم عزل جزر البنكرياس من الفئران CD1 و NOD المطابقة للعمر في عمر 1 0 و 12 و 14 أسبوعًا وفي وقت ظهور مرض السكري (يعني ± SD كان عمر تطور مرض السكري 17 ± 3.3 أسبوعًا) وتم تحليله باستخدام بروتينات DIA (الشكل 1). يوضح الشكل التكميلي S1 بيانات الجلوكوز في الدم ووزن الجسم للفئران في يوم عزل الجزيرة. تم قياس كمية 1160 بروتينًا في المتوسط ​​و 897 بروتينًا متداخلًا في جزر الماوس NOD و CD1 (الشكل التكميلي S3). نظرًا لأن الفئران CD1 ليست معرضة لمرض السكري وتظهر مستويات السكر في الدم المنظمة بإحكام ، استخدمنا الفئران CD1 المتطابقة مع الجنس والعمر لتطبيع وفرة البروتين في جزر NOD. لتحديد البروتينات المعبر عنها تفاضليًا في كل نقطة زمنية ، تم تحليل النتائج باستخدام التطبيع الوسيط ، وهو معيار ترشيح بقيمة 1. 5- ضعف في وفرة البروتين ، و P 0.05. كما هو مبين في الشكل التكميلي S4 (أ و ب) مكررات بيولوجية عبر كل مجموعة تجريبية متجمعة معًا ، مما يشير إلى إمكانية استنساخ نهج البروتينات لدينا. توضح اللوحات c – e في الشكل التكميلي S4 أنماط البروتينات المعبر عنها تفاضليًا والتجمع الهرمي بين المجموعات التجريبية. يتم تضمين القائمة الكاملة للبروتينات المعبر عنها تفاضليًا بين المجموعات التجريبية في الجدول التكميلي S3. حددنا 411 بروتينًا خاضعًا للتنظيم و 502 بروتينًا خاضعًا للتنظيم في جزر صغيرة من فئران NOD عمرها 10 أسابيع ؛ 364/524 في الأسبوع 12 و 530/220 في الأسبوع 14. تم تحديد ما مجموعه 344 بروتينًا منظمًا و 584 بروتينًا خاضعًا للتنظيم في جزر صغيرة من فئران NOD في وقت تطور الديانات. ولوحظت نتائج مماثلة (434/275) في جزر من الفئران NOD-SCID-BDC2.5 التي تصيبت بداء السكري الحاد. أخيرًا ، تم تحديد ما مجموعه 428 بروتينًا أعلى و 474 بروتينًا خاضعًا للتنظيم في جزر من فئران NOD المقاومة لمرض السكري.

في تحليل المكون الرئيسي (PCA) ، تم تجميع الفئران NOD في أعمار مختلفة لمرحلة ما قبل السكري (10 و 12 و 14 أسبوعًا) بشكل أساسي كمجموعة واحدة ، في حين تم تجميع الفئران المصابة بمرض السكري بشكل واضح (الشكل 2 أ). يظهر في الشكل 2 ب أعلى 30 بروتينًا معبرًا عنها اختلافًا (DE) من الفئران الفردية. كشف تحليل المجموعات الهرمي غير الخاضع للإشراف لبروتينات DE عن خسارة تعتمد على الوقت في الأنسولين وتعبير جزيرة أميلويد متعدد الببتيد (IAPP) (الشكل 2 ج). بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا تنظيمًا مقيدًا بالوقت للعديد من البروتينات المتورطة في وساطة الإجهاد والحفاظ على وظيفة الخلية الطبيعية أثناء مرحلة ما قبل السكري (الشكل 2 ج). تضمنت البروتينات التي تظهر هذا النمط من التعبير البروتين المرتبط بالأكتين 2/3 المركب 2 (ARPC2) ، والذي ينظم النقل بوساطة الهيكل الخلوي للأكتين للحويصلات الإفرازية ، و 34-36 كولاجين 1A1 (COL1A1) ، والكولاجين 1A2 (COL1A2) ، وهي خارج الخلية. بروتينات المصفوفة ، 37،38 والميتالوثيونين MT1 و MT2 ، والتي تثبط الاستجابات المناعية. دوره في عمليات التمثيل الغذائي ، بما في ذلك إشارات mTOR ، واستقلاب الأحماض الأمينية ، ووظيفة الميتو كوندريا. 41،42 تمت إعادة تنظيم أيزوميراز ثاني كبريتيد البروتين (PDIA1) بشكل مماثل خلال الأسابيع 12-14. والجدير بالذكر أن PDIA1 هو اختزال ثيول يلعب دورًا مهمًا في طي البرونسولين وتنظيم وظيفة ER. - الأدوار الوقائية التي بشرت بتطور مرض السكري (الشكل 2 ج).

يوضح الشكل 3 أ أفضل 10 مسارات منظمة ، بينما يوضح الشكل 3 ب أفضل 10 مسارات منظمة في التحليل الطولي للجزر من الفئران NOD باستخدام تحليل مسار الإبداع. أثناء التقدم في مرض السكري ، تم تنظيم المسارات المتعلقة بـ Cdc42 ، وإشارات الإنتجرين ، والأكتين ، والالتصاق الظهاري ، وإشارات mTOR (الشكل 3 أ). إشارات EIF2 ، التي تشارك في بدء ترجمة mRNA العالمية وهي هدف أثناء استجابة البروتين غير المكشوفة وإجهاد ER ، تم تنظيم 44،45 بشكل ملحوظ في الأسبوعين 12 و 14 وفي الفئران المصابة بداء السكري (الشكل 3 أ). تم تمثيل التغييرات في وظيفة الميتوكوندريا في كل من المسارات المنظمة لأعلى ولأسفل ، بينما اشتملت الطرق المنظمة بشكل كبير على العديد من المسارات الأيضية ، بما في ذلك دورة TCA ، والفسفرة المؤكسدة ، وأكسدة الأحماض الدهنية ، وتفاعلات الجلوتاثيون الأكسدة والاختزال. تم أيضًا تنظيم إشارات Sirtuin ونضج البلعمة (الشكل 3 ب والأشكال التكميلية S5 و S6).

مقارنة بين النماذج التلقائية والمستحثة من T1D

لتحديد القواسم المشتركة والاختلافات في بروتينات الجزيرة بين نموذج NOD المزمن والعفوي ونموذج عدواني حاد لتدمير الخلايا بوساطة مناعية ، قمنا بمقارنة نتائج البروتينات من الجزر المعزولة من الفئران والجزر NOD المصابة بداء السكري المعزولة في وقت تطور مرض السكري من الفئران NOD-SCID التي خضعت لنقل بالتبني من CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية من الفئران NOD.BDC2.5. تصاب الفئران في المجموعة الأخيرة بفرط سكر الدم الكبير في حوالي 7 أيام بعد النقل بالتبني (الشكل التكميلي S1). على الرغم من الاختلاف الواضح في الدورة الزمنية لتطور مرض السكري مقارنة بنموذج NOD المزمن ، فإن 65 بالمائة من البروتينات المحددة كانت شائعة في كلا النموذجين (الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، اقترحت مقارنة المسارات القانونية الوظيفية أنه تم تنشيط مسارات مماثلة في كلا النموذجين. تضمنت المسارات المتداخلة الرئيسية تعديل إشارات EIF2 واستجابة البروتين غير المطوية ، والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والفسفرة التأكسدية ، وإشارات mTOR (الشكل 4 ب). تشير هذه النتائج إلى أنه بغض النظر عن نوع الذبذبة (حادة أو مزمنة) ، يتم تنشيط أنماط مماثلة من إجهاد الخلية ، مما يؤكد أهمية هذه المجموعة الأساسية من المسارات في التسبب في مرض T1D.

مقارنة البروتينات لفئران NOD التي طورت مرض السكري والتي ظلت خالية من مرض السكري

لقد استنتجنا أن مقارنة الفئران NOD المصابة بداء السكري وفئران NOD التي ظلت خالية من مرض السكري من خلال المتابعة الممتدة قد تسلط الضوء على المسارات الوقائية داخل الخلية أثناء تنشيط المناعة. تم إجراء التحليل البروتيني على الجزر الصغيرة من 46 إلى 48 أسبوعًا

الفئران NOD التي ظلت خالية من مرض السكري ، وتمت مقارنة النتائج بالجزر التي تم جمعها من الفئران NOD في وقت تطور مرض السكري. لحساب الفروق التي قد تكون مدفوعة بالعمر ، تم تطبيع البيانات من كل مجموعة NOD إلى عناصر التحكم المطابقة للعمر CD1 الخاصة بهم. بالمقارنة مع الفئران NOD التي طورت مرض السكري ، كانت الفئران NOD التي ظلت خالية من مرض السكري تحتوي على عدد أقل بشكل ملحوظ من البروتينات التي تم التعبير عنها بشكل مختلف بالنسبة لعناصر التحكم CD1 المطابقة للعمر (الشكل التكميلي S4a). أشار تحليل المكون الرئيسي إلى وجود فصل واضح بين المجموعة المقاومة لمرض السكري وفئران NOD المصابة بداء السكري (الشكل 5 أ) ؛ بيانات من مكررات بيولوجية فردية موضحة في الشكل 5 ب. بعد ذلك ، تم إجراء تحليل التجميع الهرمي غير الخاضع للإشراف باستخدام المسافة الإقليدية وطريقة الارتباط المتوسطة (الشكل 5 ج). كشفت البيانات من هذا التحليل عن تنظيم العديد من البروتينات الفريدة المرتبطة سابقًا بتخفيف إجهاد الخلية. من بين البروتينات الأعلى التي تم تنظيمها في الفئران المقاومة لمرض السكري والتي تم تنظيمها في الفئران المصابة بداء السكري ، كان IAPP ومضادات الأكسدة -1 (ATOX1) ، وهو مركب نحاسي ثبت أنه يحمي من بيروكسيد الهيدروجين والأكسدة الفائقة. - المراهقون الذين يظهرون هذا النمط من التعبير كانوا من البروتينات - بعض الوحدات الفرعية بيتا 10 (PSB10) ، والتي تشارك في الحفاظ على توازن البروتين ، 47 بروتين شبيه بالكوكتوزين (COTL1) ، وهو بروتين مرتبط بـ F-actin يلعب دورًا في النمو الخلوي ، 48 و S100A4 ، والذي يعمل كمستشعر الكالسيوم داخل الخلايا

في الشكل 5 د ، يُظهر تحليل إثراء المسار المسارات العشرة الأولى المنتظمة بشكل ملحوظ في الفئران NOD المقاومة للسكري مقارنة بفئران NOD التي طورت مرض السكري. في الفئران NOD المقاومة لمرض السكري ، كان هناك تعديل ملحوظ للمسارات المشاركة في الحفاظ على التوازن الخلوي ، وإصلاح الأنسجة ، وإزالة الأنسجة (أي البلعمة في الخلايا الضامة والوحيدات) ، وإشارات مستقبلات أريل هيدروكربون ، والتي ترتبط بتخفيف التهاب الانسولين في الفئران NOD .51 تمشيا مع هذا ، لاحظنا تنظيمًا سلبيًا للمسارات المتعلقة بخلل الميتوكوندريا ، ونضج البلعوم ، والتفسخ التأكسدي ، واستجابة البروتين غير المطوية في جزر الفئران NOD المقاومة لمرض السكري (الشكل 5 هـ). ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تحديد إشارات الهيكل الخلوي الأكتيني وإشارات الوصلة الظهارية الملتصقة بين كل من المسارات المنظمة لأعلى ولأسفل ، مع وجود بروتينات مميزة متورطة في الفئات الأعلى والأسفل المنظمة.

تحليل أهداف البروتين المحددة عن طريق التألق المناعي والطفحة المناعية

للتحقق من النتائج الرئيسية من التحليل البروتيني ، تم إجراء تلطيخ التألق المناعي لقطاعات أنسجة البنكرياس باستخدام مجموعة منفصلة من الفئران NOD تتراوح أعمارهم بين 9-13 أسبوعًا وعند بداية مرض السكري. تم اختيار ثلاثة أهداف بروتينية ، PDIA1 و 14-3-3 و PRDX3 ، لإجراء تجارب التحقق من الصحة استنادًا إلى أفضل النتائج من التحليل الموضح في الشكل 2 ب وأدوارها المعروفة في الحفاظ على وظيفة الخلية. زادت بيانات البروتينات ، وشدة تلطيخ جزيرة PDIA1 (الشكل 6 أ) و 14-3-3 (الشكل 6 ب) من 9 إلى 13 أسبوعًا في الفئران NOD ، متبوعة بفقدان كبير لتعبير البروتين المستهدف عند بداية T1D. التغييرات في شدة تلطيخ PRDX3 لم تتغير بشكل ملحوظ خلال النقاط الزمنية لمرض السكري ؛ ومع ذلك ، انخفض تعبير PRDX3 بشكل ملحوظ عند بداية T1D في الفئران NOD (الشكل 6 ج).

لاختبار مدى ملاءمة نتائجنا في T1D البشري ، تم الحصول على أقسام أنسجة البنكرياس من متبرعين غير مصابين بالسكري ، والمتبرعين بالأعضاء الذين لديهم إيجابية الأجسام المضادة (AAb plus) ، والمتبرعين بالأعضاء الذين لديهم T1D ثابت. تم إجراء تحليل التألق المناعي لـ PDIA1 والأنسولين والجلوكاجون وكشف عن زيادة ملحوظة في تعبير PDIA1 في جزر البنكرياس للأفراد الذين يعانون من AAb plus ومع T1D مقارنة بالمتبرعين غير المصابين بالسكري (الشكل 7 أ و ب).

PDIA1 هو بروتين مقيم في ER له دور مؤسس في نضوج الأنسولين .43 لذلك ، لفهم ما إذا كان هناك ارتباط بين إجهاد ER و PDIA1 في ظل ظروف إجهاد الخلية ، اتخذنا نهجًا في المختبر من خلال علاج الجزر البشرية مع أو بدون السيتوكينات المؤيدة للإنزيم (IL -  1 بالإضافة إلى IFN) أو الجلوكوز المرتفع (22.5 مم) لمدة ساعة و 24 ساعة. في ظل كل من ظروف الإجهاد المزمن (أي علاج لمدة 24 ساعة) ، لاحظنا وجود تنظيم موازٍ لـ PDIA1 و IRE1 (الشكل 7 ج و د). تم زيادة تعبير BIP ولكن ليس إلى حد كبير. تمشيا مع هذه البيانات ، أظهر تحليل التألق المناعي لأقسام أنسجة البنكرياس NOD ارتفاعًا كبيرًا في CHOP في الأسبوع 11 (الشكل التكميلي S7a و b). ومع ذلك ، لم يكن هناك اختلاف في تعبير BIP بين الفئات العمرية المختلفة لفئران NOD.

تحليل تعميم PDIA1 كعلامة بيولوجية مرتبطة بـ T1D

بالإضافة إلى دوره داخل الخلايا كمختزل للثيول ، فإن 43،54،55 PDIA1 هو بروتين مُفرَز. في مستويات PDIA1 المتداولة ، قمنا بتطوير اختبار عالي الحساسية للتلألؤ الكيميائي باستخدام تقنية Meso Scale Discovery. تم قياس PDIA1 باستخدام PDIA1 المخفف تسلسليًا (1: 4) المؤتلف ، وأظهر هذا التحليل أنه يمكن اكتشاف PDIA1 في نطاق 0. 152 نانوغرام / مل إلى 2500 نانوغرام / مل (الشكل 8 أ). باستخدام البلازما التي تم جمعها من نفس الفئران المستخدمة في تحليل البروتينات الطولية الموضحة في الشكل 2 ، وجدنا أن مستويات البلازما لـ PDIA1 قد زادت بشكل ملحوظ في فئران ما قبل السكري مقارنة بفئران CD1 في عمر 10 و 14 أسبوعًا (الشكل 1). 8 ب - د). ومع ذلك ، لم تكن مستويات PDIA1 مختلفة بين الفئران NOD في وقت ظهور مرض السكري وفئران CD1 المتطابقة مع العمر (الشكل 8 هـ). بالإضافة إلى ذلك ، كانت مستويات PDIA1 أقل من النطاق القابل للاكتشاف في البلازما من فئران NOD-SCID المصابة بداء السكري والتي خضعت لنقل الخلايا التائية بالتبني.

بعد ذلك ، طبقنا هذا الاختبار على عينات مصل تم جمعها من الأطفال خلال 48 ساعة من البداية السريرية لـ T1D (ن= 14 ؛ متوسط ​​العمر (متوسط ​​± SD)= 11 .57

± 4.05 سنة 8 ذكور 6 أنثى) وفي المصل جمعت

من ضوابط طب الأطفال غير السكري (ن=10 ؛ متوسط ​​العمر=12. 1 ± 4.20 ؛ 6 ذكور ؛ 4 إناث) (الجدول التكميلي S1). كانت مستويات مصل PDIA1 أعلى بشكل ملحوظ في موضوعات طب الأطفال مع ظهور T1D حديثًا مقارنة بالمجموعة الضابطة ، مما يشير إلى أن PDIA1 قد يكون مفيدًا كمؤشر بيولوجي T1D سريري بشري (الشكل 8f).

مناقشة

في هذه الدراسة ، حددنا التغييرات الزمنية في تعبير بروتين خلية الجزيرة أثناء تطور T1D باستخدام ثلاثة نماذج ماوس متميزة من T1D وبروتينات DIA عالية الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك ، أوهمنا فائدة اتباع نهج غير متحيز لإعطاء الأولوية لبروتينات الخلية كمؤشرات حيوية T1D في البشر ، وتحديد PDIA1 كمثال واحد على البروتين المفرز الذي تم التعبير عنه بشكل تفاضلي في جزر NOD أثناء تقدم مرض السكري وفي الجزر البشرية من المتبرعين بالأعضاء مع الأجسام المضادة الذاتية الإيجابية ومرض السكري. أخيرًا ، باستخدام مقايسة التلألؤ الكهربي عالي الحساسية لقياس مستويات PDIA1 المتداولة ، أظهرنا زيادة مستويات البلازما PDIA1 في الفئران NOD قبل السكري وفي مصل الأطفال الذين يعانون من ظهور T1D حديثًا مقارنة بضوابط الأطفال المتطابقة مع العمر والجنس.

كشف تحليل البروتيوميات لنماذج الفئران الثلاثة عن العديد من الموضوعات البارزة. في مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها من مجموعة NOD الطولية ، لاحظنا زيادة مبكرة ولكنها مقيدة بالوقت في التعبير عن العديد من البروتينات المرتبطة بالوظيفة الإفرازية ، وطي البرونسولين ، وتخفيف الإجهاد ، بما في ذلك البروتينات المشاركة في ER وإشارات الإجهاد التأكسدي. ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا الأسبوع -14 كنقطة تأثر محتملة ، حيث أدى فقدان التعبير عن هذه البروتينات الواقية إلى بداية T1D. تمشيا مع هذه الملاحظة ، فإن تحليل المسار الكنسي للبروتينات المعبر عنها تفاضليًا من الأسابيع 10 و 12 و 14 و dia- betes بداية حددت تنظيم المسارات المرتبطة بتخليق الأنسولين المعيب والعديد من مسارات الإجهاد الخلوي ، بما في ذلك خلل الميتوكوندريا ، وإجهاد ER ، وتنشيط UPR. لاحظنا وجود تنظيم سفلي لمسارات الإشارات التي كانت حاسمة للتخفيف من الإجهاد الخلوي المستمر ، بما في ذلك إشارات الأكسدة والاختزال من الجلوتاثيون ، والتي من المعروف أنها تتعارض مع تأثيرات أنواع الأكسجين التفاعلية ، ونضج البلعمة ، والذي يشارك في إزالة الحطام الخلوي 58،59

يذكرنا هذا النمط ثنائي الطور بالبيانات الأيضية المأخوذة من مجموعات التاريخ الطبيعي للأفراد الموجودين في الجسم المضاد الذاتي والذين يتقدمون إلى T1D ، حيث توجد تغييرات تعويضية في بنية إفراز الأنسولين والتي تحافظ إلى حد كبير على نسبة السكر في الدم حتى 12 شهرًا قبل ظهور المرض ، يليها فقدان الأنسولين الإفراز والتدهور السريع في ضبط نسبة السكر في الدم 12-6 قبل أشهر من تشخيص مرض السكري

تتوافق النتائج أيضًا مع الدراسات المقطعية التي حللت أنماط التعبير الجيني والبروتيني في أقسام البنكرياس من متبرعين بشريين مصابين بداء السكري 60-63 وفي الدراسات السابقة على نماذج الفئران لمرض السكري ، حيث كان الدور البارز لـ ER وخلل الميتوكوندريا تم تحديد 8،12،64،65 لقد وجدنا أن هذه المسارات يتم تنشيطها في وقت مبكر من عملية المرض ، وهناك تداخل مستمر بين العديد من مسارات الإجهاد النشطة الرئيسية في نموذج الماوس NOD وفي النموذج الحاد والمحفز لـ T1D في وقت ظهور مرض السكري. تسلط أوجه التشابه بين التحليل البروتيني لهذين النموذجين الضوء على أهمية هذه المجموعة الأساسية من المسارات في التسبب في المرض T1D.

للتحقق من النتائج من تحليل البروتينات ، أجرينا تجارب التألق المناعي ، مع التركيز على ثلاثة أهداف تم تحديدها في مجموعة NOD الطولية ، 14-3-3 ، و PRDX3 ، و PDIA1. أعضاء عائلة البروتين 14-3-3 متورطون في العديد من مسارات الإشارات الأيضية وتم ربطها بالحماية من موت الخلايا المبرمج في خلايا البنكرياس .42 يمنع PRDX3 الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، وقد ثبت أن الإفراط في التعبير عنه يحمي من الإجهاد التأكسدي الناجم عن مقاومة الأنسولين وارتفاع السكر في الدم .52،66 PDIA1 هو عبارة عن مركب ثيول أوكسيريدوكتاز موضعي بكثرة في ER والذي له دور في إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز ، ومعالجة الأنسولين ، والحماية من إجهاد ER .43 بالاتفاق مع التقارير السابقة ، لاحظنا علاقة إيجابية بين التعبير عن علامات الإجهاد ER و PDIA1 في الجزر البشرية المعالجة بالسيتوكينات الأولية أو الجلوكوز المرتفع. علاوة على ذلك ، لاحظنا زيادة مستويات PDIA1 في أقسام البنكرياس من المتبرعين بالأعضاء البشرية بإيجابية الأجسام المضادة ومع مرض السكري.

من الجدير بالذكر أن PDIA1 هو بروتين مُفرَز. في أنواع الخلايا الأخرى ، يتم زيادة إطلاق PDIA1 في حالة الإصابة والإجهاد. 67،68 تم ربط PDIA1 خارج الخلية بتنظيم تكوين الجلطة أثناء تضخم الأوعية الدموية ، 69،70 ولكن الفهم الكامل للدور خارج الخلية لهذا البروتين هو تفتقر إلى. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم التعرف على الأجسام المضادة لـ PDIA1 في الأفراد الذين يعانون من T1D حديثًا ، 71 مما يشير إلى أن PDIA1 المشتق من الخلية يعمل كمستضد T1D الذاتي. لذلك ، افترضنا أن زيادة التعبير الخلوي لـ PDIA1 قد تتأثر في الدورة الدموية وأن قياس PDIA1 قد يكون مفيدًا كمؤشر حيوي T1D. لاختبار هذا الاحتمال ، قمنا بتطوير مقايسة التلألؤ الكهربائي عالي الحساسية لقياس مستويات المصل والبلازما لـ PDIA1. باستخدام هذا الاختبار ، قمنا بتوثيق زيادة في البلازما PDIA1 في الفئران NOD قبل السكري وفي مصل الأطفال الذين يعانون من T1D حديثًا.

دراستنا لها العديد من القيود التي ينبغي الاعتراف بها. أولاً ، هناك اختلافات كبيرة بين نماذج الفئران و T1D البشري ، 72-74 مما يقلل من الحاجة إلى التحقق من صحة النتائج من الفئران في العينات البشرية. لقد تحققنا من النتائج الرئيسية باستخدام الجزر البشرية وأقسام البنكرياس من المتبرعين بالأعضاء البشرية. نظرًا للطبيعة التدريجية لتدمير الجزر في نماذج الفئران الخاصة بنا ، فقد كنا مقيدين بكمية مادة البداية في تحليل البروتينات لدينا ، والتي انعكست في حقيقة أن 18 عينة جزيرة فشلت في الوصول إلى معايير مراقبة الجودة الصارمة الخاصة بنا. هذا التقييد ، إلى جانب الافتقار إلى درع بروتيني محدد لخلايا جزيرة الفئران ، حد من العدد الإجمالي للبروتينات التي حددناها بشكل دقيق. ومع ذلك ، فقد تجاوزنا هذا القيد من خلال استخدام بحث DIA-Umpire خالٍ من المكتبات واستراتيجية تتضمن التحقق النهائي من علامة المرشح لدينا. أخيرًا ، يتمثل أحد القيود في جميع دراسات البروتينات التي تستخدم الجزر السليمة في أن البيانات تمثل مجموعة غير متجانسة من خلايا الغدد الصماء والمناعة. لذلك ، فإن النتائج قد لا تعكس فقط التغيرات في بروتين الخلية.

وثقت دراستنا زيادة مستويات المصل من PDIA1 في مجموعة صغيرة من الأطفال المصابين بالتهاب T1D حديث الظهور. في حين أن المؤشرات الحيوية ذات القدرة على مراقبة إجهاد الخلية غير جراحي تفتقر في T1D ، فمن المهم أن نلاحظ أن دراستنا عبارة عن دراسة مقطعية صغيرة ويجب إجراء التحقق من الصحة في مجموعات أكبر. سيكون من الضروري اختبار مستويات PDIA1 في العينات التي تم جمعها من الأفواج السريرية المتبعة طوليًا أثناء تقدم T1D. سيوفر مثل هذا التحليل نظرة ثاقبة ضرورية حول ما إذا كان PDIA1 يمكن أن يمنع مخاطر T1D. أشار تحليلنا لأقسام البنكرياس البشري إلى أن مستويات PDIA1 تزداد في جزر البنكرياس لدى الأفراد المعرضين للخطر والذين تكون لديهم أجسام ذاتية إيجابية. ما إذا كان PDIA1 هو مجرد علامة على إجهاد الخلية أو أنه قد يعكس تغيرات كتلة الخلية غير واضح من بياناتنا ويجب اختباره في دراسات المتابعة. من الجدير بالذكر أن مستويات PDIA1 كانت أعلى عند الأطفال الذين يعانون من بداية جديدة لـ T1D ، في حين كانت مستويات البلازما في PDIA1 أكثر اختلافًا في الفترات الزمنية السابقة لمرض السكري في الفئران NOD. تتوافق هذه البيانات مع النتائج الأحدث التي تُظهر أن هناك كتلة خلوية كبيرة متبقية في البشر عند بداية T1D ، 75،76 بينما في كلا نموذجي الفئران المدروسين هنا ، يتم تدمير الخلايا تمامًا تقريبًا بحلول وقت ظهور مرض السكري.

على الرغم من هذه القيود ، تسلط دراستنا الضوء على قيمة مناهج البروتينات غير المتحيزة لتحديد مسارات الخلايا المشاركة في التطور الزمني لـ T1D. باستخدام هذه الاستراتيجية ، حددنا مجموعة مشتركة من المسارات المعدلة والمتعلقة بالأمراض عبر العديد من نماذج الفئران المتميزة من T1D. أخيرًا ، حددنا زيادة تعبير PDIA1 كعلامة على إجهاد الخلية المبكر في T1D ، وتشير بياناتنا إلى أن قياس المصل أو البلازما PDIA1 قد يكون بمثابة علامة بيولوجية مفيدة سريريًا تستحق اختبار متابعة إضافي في المجموعات السكانية المعرضة لخطر الإصابة بـ T1D.

المساهمون

قامت FS و CEM بوضع تصور للدراسة وتصميمها. أجرى FS و RNB تجارب. أعدت KR و JV عينات LC-MS / MS وتشغيلها. قام كل من DS و XL و HW و PK بإجراء تحليلات حسابية. MRM و RGM و M-LY و MJM فسرت النتائج. فسرت FS و CEM البيانات وكتبت المخطوطة. قدم جميع المؤلفين تنقيحات وتعديلات نقدية للمخطوطة. قرأ جميع المؤلفين المخطوطة النهائية ووافقوا عليها. CEM هو الضامن لهذا العمل. لقد تحقق كل من FS و CEM من البيانات الأساسية لهذه المخطوطة.

بيان مشاركة البيانات

البيانات المقدمة كجزء من هذه المخطوطة متاحة من المؤلف المصور عند الطلب. تم إيداع بيانات البروتينات في قاعدة بيانات البروتينات PRIDE (معرف الانضمام: PXD035504).

إعلان المصالح

قاد CEM و FS طلب براءة اختراع مؤقت لاستخدام PDIA1 كواسم حيوي لمرض السكري. عملت CEM في المجالس الاستشارية المتعلقة بمبادرات التجارب السريرية البحثية لـ T1D: Provention Bio و Dompe و Isla Technologies و MaiCell Technologies. يعمل CEM كرئيس لجمعية المناعة لمرض السكري (IDS) ، والمدير التنفيذي المشارك لشبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بمرض السكري (nPOD) ، والمستشار العلمي في TrialNet ، والباحث الرئيسي في الجزيرة المتكاملة للمعاهد الوطنية للصحة

برنامج التوزيع (IIDP). لم تتعامل هذه الأنشطة بشكل مباشر مع الموضوعات التي تم تناولها في هذه المخطوطة. يعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة التي تمنح R01 DK093954 و DK127308 (إلى CEM) و R01 DK060581 (إلى RGM) و U01DK127786 و UC4 DK 104166 (إلى RGM و CEM) وجائزة VA Merit I01BX001733 (إلى CEM) ، 2- SRA -2019-834- SB و JDRF 2- SRA -2018-493- AB (إلى CEM و RGM) و

هدايا من Sigma Beta Sorority ومؤسسة Ball Brothers ومؤسسة George and Frances Ball (إلى CEM). كان FS مدعومًا من زمالة JDRF لما بعد الدكتوراه (3- PDF -20016-199- AN و JDRF 5- CDA -2022-1176- AN). تم دعم XW من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01GM118470. تم دعم RNB من قبل زمالة JDRF لما بعد الدكتوراه (3- PDF -2017-385- AN). تم دعم MRM من قبل T32 BTDR Fellowship Award (5T32DK 101001-09) وأموال ليزلي بوتورف للزمالة من جامعة بوردو. تم إجراء هذا البحث بدعم من شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بمرض السكري (nPOD ؛ RRID: SCR _014641) ، وهو مشروع تعاوني لأبحاث مرض السكري من النوع 1 بدعم من JDRF (nPOD: 5- SRA {{) 18}} QR) و The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant # 2018PG-T1D053، G -2108-04793). المحتوى والآراء المعبر عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية لـ nPOD. منظمات مشتريات الأعضاء (OPO) التي تشارك مع nPOD لتوفير موارد البحث مدرجة في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/ npod-Partners. يقر المؤلفون بدعم Islet and Physiology Core and the Translation Core of the Indiana Diabetes Research Centre (P30DK097512). نشكر الدكتور إميلي أندرسون بوكوم والدكتور جان كاجستورا على مساعدتهما في تحرير نص هذه المخطوطة.