Dab1 متماثل الزيجوت - // هو سبب جديد محتمل للتشوهات الخلقية الجسدية المتنحية في الكلى والمسالك البولية للفئران
Feb 28, 2022
مقدمة
الفئران المتحولة Yotari ، التي تم الحصول عليها عن طريق اكتساب عفوي لطفرة في جين Dab1 ، تظهر تشوهات نسيجية في الجهاز العصبي المركزي [1،2] ، تشبه إلى حد بعيد تلك الموجودة في الفئران reeler (reelin //) ، مما يشير إلى أن reelin و DAB1 ينتميان إلى نفس مسار الإشارات [1-4]. تم الإبلاغ عن الانحرافات في مسار ريلين / DAB1 مرتبطة باضطرابات نفسية مختلفة [5-7]. ومن المثير للاهتمام أنه إلى جانب الجهاز العصبي المركزي ، تم تأكيد وجود بروتينات DAB1 و reelin أيضًا في الجهاز العصبي المحيطي وبعض الأنسجة الخارجية. تم العثور على وجود DAB1 في خلايا الفئران الجرثومية [8] والجنين البشريالكلى[9] بينما تم الإبلاغ عن تعبير ريلين أثناء نمو الجنين البشري والفأر ، وكذلك في بعض الخلايا البطانية على طول الأوعية الدموية في الفأر البالغ [9-11]. قد يؤدي مسار reelin / DAB1 الكنسي إلى إطلاق بروتينات مميزة في اتجاه التيار ، بما في ذلك مستقبلات NOTCH2 ، والتي تلعب أدوارًا مهمة في قرارات مصير الخلية والتمايز أثناءالكلىالتنمية [12-14]. مستقبلات NOTCH2 مطلوبة لتكوين الأنابيب وخلايا البودات القريبة [13] ، ولكن بمجرد تحقيق نضوج النيفرون ، يتم إسكات هذا المسار في الغالب [15]. في الحالات الحادةأمراض الكلى,قد يساهم التعبير المتزايد عن NOTCH2 في التجديد ، بينما يرتبط التعبير المستمر سببيًا بالتليف الخلالي والتصلب الكبيبي [15]. يمكن أن يؤدي تقليل تنظيم إشارات NOTCH إلى تقليل الالتهام الذاتي بشكل كبير ويسبب ضعف تمايز الخلايا البودوسية أثناء التطور [16].
وبالتالي ، تلعب الخلايا البودوسية المختلة دورًا حاسمًا في مرض الكبيبات ، خاصة في المتلازمة الكلوية مجهولة السبب للإنسان [17 ، 18] وفي المتلازمة الكلوية ذات التغيير الأدنى (MCNS) [19]. ومن ثم ، فإن الالتهام الذاتي يحافظ على التوازن الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، بينما في الحالات المرضية ، يمكن أن يتطور إلى الموت الذاتي [20]. واصم الالتهام الذاتي المستخدم على نطاق واسع هو LC3B ، وهو بروتين هيكلي لأغشية البلعمة الذاتية [21]. يساهم الحديث المتبادل المعقد بين الالتهام الذاتي وموت الخلايا المبرمج في الحفاظ على توازن التماثل الساكن كاستجابة للبيئة الدقيقة للخلية. من المعروف أن أحداث موت الخلايا المبرمج تزداد خلال العددالكلى[22] وتتضاءل إلى حد كبير بمجرد انتهاء النضج ، إلا في ظروفإصابة كلوية[23]. مما لا يمكن إنكاره ، موت الخلايا المبرمج هو آلية معقدة يتم تنظيمها من خلال تفاعل العديد من المسارات ولكن في الغالب تتفاعل مع تنشيط caspase3 (CASP3) ، والذي يعد تنشيطه أحد العلامات الأكثر استخدامًا للكشف عن موت الخلايا المبرمج [23].
في هذا التقرير ، كنا نهدف إلى تحليل كيفية تأثير الإسكات الوظيفي لجين Dab1الكلىمورفولوجيا والتعبير عن وتوطين ريلين ، NOTCH2 ، LC3B ، وبروتينات CASP3 المشقوق في الفئران بعد الولادةالكلى. نفترض أن هذه البروتينات يتم التعبير عنها في فأر ما بعد الولادةالكلى،ويساهم تفاعلها الوظيفي في الحفاظ على هيكلها ووظيفتها. بالإضافة إلى ذلك ، حيث تم تأكيد وجود DAB1 أثناء الجنين البشريالكلىالتنمية [9] ، يمكن افتراض أن تعطيله قد يسبب اضطرابًا في مجموعة واسعة من التشوهات الخلقيةالكلىوالمسالك البولية (CAKUT).
الكلمات الدالة:يوتاري. وظائف الكلى تطور الكلى بعد الولادة تلطيخ المناعي. المجهر الإلكتروني النافذ
سيحسن الكستانش وظيفة الكلى / وظيفة التجشؤ
المواد والأساليب
جمع العيناتكطفرات تقليدية خالية من Dab1 ، استخدمنا فئران yotari (Dab1 /) التي سبق وصفها بواسطة Howell et al. [24]. كانت بادئات PCR المستخدمة في التنميط الجيني للفئران yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT و CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC ، النوع البري من موضع Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT و CCTTGTTTCTTTGCTTAA-GCTGT. تم رفع الفئران C57BL / 6 N وإيوائها في مجموعات في أقفاص البولي كربونات القياسية (بما في ذلك واحد على الأقل من كل نمط وراثي) مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها (23 ± 2 درجة مئوية) مع إضاءة 12 ساعة / دورة مظلمة. في أيام ما بعد الولادة 4 و 11 و 14 (P4 و P11 و P14) ، تم تخدير الفئران بعمق باستخدام البنتوباربيتال وتروية عبر القلب لمدة 1 0 دقيقة مع محلول ملحي للفوسفات (PBS ، ودرجة الحموضة 7.2) و 4 في المائة بارافورمالدهيد (PFA) ) في 0.1 M PBS.الكلىتمت إزالتها وفاكسيدها بـ 4 بالمائة PFA في 0. 1 M PBS بين عشية وضحاها للتحليلات النسيجية التقليدية (الهيماتوكسيلين - يوزين (H&E) ، تلطيخ المناعي والتألق المناعي) وفي 2 بالمائة PFA زائد 2.5 بالمائة خليط الجلوتارالدهيد (GA) للفحص بالمجهر الإلكتروني. بعد التخمير ، تم تحضير الأنسجة لمزيد من الفحص النسيجي ، كما وصفنا سابقًا [25،26].
تألق مناعي وتلطيخ مناعيبعد إزالة البارافين والإماهة ، تم تسخين المقاطع لمدة 2 0 دقيقة في 0. 01 M سيترات (درجة الحموضة 6.0) في وعاء بخار الماء ، وبعد ذلك ، تم تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. تم تطبيق المخزن المؤقت للحظر (ab 64226 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) لمدة 30 دقيقة لاستبعاد تلطيخ غير محدد. ثم تم تحضين المقاطع في غرفة الرطوبة طوال الليل باستخدام الأجسام المضادة الأولية (الجدول 1). بعد الغسيل في برنامج تلفزيوني ، تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية (الجدول 1) لمدة ساعة واحدة وغسلها في برنامج تلفزيوني مرة أخرى. بعد ذلك ، تم تلطيخ النوى بـ 4060 - ديميدينو -2- فينيليندول (DAPI) لمدة دقيقتين ، وغسلها في برنامج تلفزيوني ، ومغطاة بالغطاء. أجرينا اختبار الامتصاص المسبق بحيث تم استخدام كل جسم مضاد أولي مع الببتيد المقابل وقمنا بتطبيق توليفتهما على الأقسام. أظهرت النتائج عدم وجود تلطيخ للأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء الضوابط مع حذف الجسم المضاد الأولي لتحديد مستويات الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية.
بالنسبة لتلطيخ مناعي الأكسيداز ، تم استخدام مضاد CASP3 للأرنب polyclonal (1: 1 {5}} 0 تخفيفات ، ab13847 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) كجسم مضاد أولي لمدة ساعة واحدة في غرفة الرطوبة بعد معالجة القسم بـ 0.1 في المئة H2O2. بعد الغسل في برنامج تلفزيوني ، تم إجراء الكشف الثانوي باستخدام الرابط وستربتافيدين بيروكسيديز ، كل خمس عشرة دقيقة (داكو سيتوميشن ، CA 93013 الولايات المتحدة الأمريكية ، لوت 03477) وديامينوبنزيدين (داكو ، CA 93013 الولايات المتحدة الأمريكية ، لوت 10051369) ، يتم التحكم فيهما بعناية لتجنب تلطيخ الخلفية. كانت النوى ملطخة بالهيماتوكسيلين ، وشطفت في ماء الصنبور لمدة 10 دقائق ، وجفاف الذبابة القصيرة في سلسلة تصاعدية من محاليل الإيثانول ، ومغطاة بالغطاء.
تحضير الأنسجة للميكروسكوب الإلكتروني (TEM)بعد الخلط بمزيج من 2 بالمائة PFA و 2.5 بالمائة GA في 0. 1 M PBS لمدة ساعتين ، تم غسل العينات باستخدام PBS وتم إصلاحها لاحقًا في محلول مائي من 2 بالمائة رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعتين. تم غسل جميع العينات مرتين في برنامج تلفزيوني ، وتم تجفيفها بدرجات تصاعدية من الإيثانول وتم تضمينها في Epon 812 (معدات مختبرات TAAB ، القراءة ، المملكة المتحدة). تم قطع المقاطع التسلسلية (بسمك 70 نانومتر) على Ultracut UCT ultramicrotome (Leica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانيا) وملطخة بنسبة 1 في المائة من أسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص.
الحصول على البيانات وتحليلهاتم إجراء التحليل باستخدام مجهر epiflfluorescence (أوليمبوس BX51 ، طوكيو ، اليابان) مزودًا بكاميرا رقمية DP71 (أوليمبوس) ، ومجهر إلكتروني للإرسال JEM 1400 (JEOL ، طوكيو ، اليابان) يعمل عند 80 كيلو فولت وتم تصويره بشحنة JEOL- نظام الكاميرا المقترن (CCD) (تقنيات الفحص المجهري المتقدمة ، دانفرز ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وأخيراً ، مجهر فيفلد ساطع (BX40 ، أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان). تمت معالجة جميع الصور التي تم تحليلها باستخدام برنامج ImageJ و Adobe Photoshop (Adobe ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). لكل مجموعة تم فحصها ، استخدمنا ثلاثة إلى أربعة حيوانات. جمعت كل شيءالكلىتم قطعها عند أقسام بسماكة 5 ميكرومتر ، كحد أقصىالكلى length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0 75 ، تشير إلى اتفاق ممتاز [27].
تحليل احصائيتم إجراء اختبار t ثنائي الذيل لتحليل الاختلافات في متوسط القطر بين PCT و DCT و G للحيوانات البرية و yotari. تم تقديم القطر على أنه يعني ± الانحراف المعياري (SD). تم تعيين مستوى الدلالة على p <0. 0="" 5.="" تم="" استخدام="" اختبار="" anova="" ثنائي="" الاتجاه="" متبوعًا="" باختبار="" tukey="" للمقارنة="" المتعددة="" لفحص="" الاختلافات="" في="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الإيجابية="" بين="" pct="" و="" dct="" والكبيبات="" في="" جميع="" الأوقات.="" تم="" التعبير="" عن="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الإيجابية="" على="" أنها="" متوسط="" الخطأ="" المعياري="" للمتوسط="" (sem).="" تم="" تحديد="" مستوى="" الدلالة="" عند="" p=""><0.05. تم="" إجراء="" التحليل="" في="" برنامج="" graphpad="" (برنامج="" graphpad="" ،="" لا="" جولا="" ،="" كاليفورنيا="" ،="" الولايات="" المتحدة="">
نتائج
تلطيخ الهيماتوكسيلين - يوزين (H&E) وقياس قطر الكلىتلطيخ H&E للأقسام المتوسطة منالكلىفي جميع النقاط الزمنية التي تم فحصها يسلط الضوء على الصغيرةالكلىالنمط الظاهري لفئران yotari مقارنة بالنوع البري (الشكل 1 أ). في 4P يعنيالكلىكان قطر حيوانات اليوتاري حوالي 55 ميكرومتر من حوالي 75 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك ، كان هذا الاختلاف ملحوظًا في نقاط زمنية لاحقة بسبب النمو البطيء لـالكلىفي yotari مقارنة بالنمو التدريجي لـالكلىفي الحيوانات البرية. لتحديد ما إذا كان التخفيض في العامالكلىالحجم كان ناتجًا عن انخفاض في حجم قطعة النيفرون ، قمنا بحساب متوسط قطر PCT و DCT و G لكل مجموعة. في الواقع ، كان هناك انخفاض في متوسط القطر G و PCT و DCT في مجموعة yotari مقارنة بالنوع البري (الشكل 1 ب ، ف <0. 05).="" بالإضافة="" إلى="" ذلك="" ،="" أظهر="" تلطيخ="" h&e="" قشرة="" أرق="">كلويامتداد الحوض في حيوانات اليوتاري و DCT المتوسع قليلاً عند 14P. الهيكل الأساسي ونمط النضج الكبيبي هو نفسه في كلا المجموعتين من الحيوانات المدروسة.
التحليل النسيجي الوصفي على أساس TEM Microphotographsعلى الصور المجهرية التي تم الحصول عليها بواسطة TEM ، أظهرت الكبيبات في الفئران من النوع البري المظهر النموذجي لجميع أجزاء حاجز الترشيح ، والتي تم تطويرها بشكل طبيعي ويمكن التعرف عليها (الشكل 2 أ). كان من السهل تمييز خلايا Podocytes ، وعمليات القدم podocyte والعنيقات ، وفتحات الترشيح ، والأغشية القاعدية الكبيبية ، وتجويف الشعيرات الدموية مع البطانة fenestrated (الشكل 2 أ). من ناحية أخرى ، في الكبيبات في فئران yotari ، يمكن ملاحظة تلف خلايا podocyte التدريجي مع إضعاف عملية القدم ونقص شقوق الترشيح (الشكل 2 ب-د). لوحظت هذه التغييرات في البنية التحتية في جميعالكلىفحص واشتمل على معظم الكبيبات التي تم فحصها. لم يلاحظ أي شذوذ في معاهدة التعاون بشأن البراءات أو DCT لفئران yotari من الحيوانات البرية (الشكل 2e-h). في معاهدة التعاون بشأن البراءات ، تم تعريف واجهات الخلايا بشكل سيئ بسبب عدم انتظام أغشية الخلايا وتداخل الخلايا مع جيرانها. كان السيتوبلازم وفيرًا ، ويحتوي على نوى متميزة ، وميتوكوندريا مطولة ، ونقوش قاعدية ، والعديد من الحفر الأنبوبية بين الميكروفيلي ، والتي شكلت حدود الفرشاة في الغشاء القمي. كشف التكبير العالي عن السطح القمي للخلايا الظهارية PCT التي تحتوي على ميكروفيلي طويل لتشكيل حدود الفرشاة وتقاطعات ضيقة بين حدود الخلايا اللمعية للخلايا الظهارية الأنبوبية المجاورة (الشكل 2 هـ ، و). من ناحية أخرى ، احتوى السطح القمي للخلايا الظهارية DCT على عدد قليل من الميكروفيلي القصير والعديد من الحويصلات (الشكل 2 ز ، ح).
الشكل 2. صور مجهرية مجهرية للإرسال (TEM) من النوع البري و yotariالكلىأظهرت الكبيبات للحيوانات البرية (أ) حاجز ترشيح مطور بشكل طبيعي مع البطانة المثقبة (E) للشعيرات الدموية (C) ، والغشاء القاعدي (BM) ، وخلايا القدم (P) ذات السنيقات (PE) ، وشقوق الترشيح (FS). ). في الالكلىلحيوانات اليوتاري ، يمكن ملاحظة محو العنيقات ونقص شقوق الترشيح (العلامات النجمية ، ب-د). لم يلاحظ أي شذوذ في الأنابيب الملتوية القريبة (PCT) أو الأنابيب الملتفة البعيدة (DCT) لفئران yotari مقارنة بالحيوانات البرية (e-h). في معاهدة التعاون بشأن البراءات ، كان السيتوبلازم وفيرًا ، ويحتوي على نوى مميزة جيدًا (N) ، وميتوكوندريا مطولة (M) ، وحفر قاعدية (BI) ، والعديد من الحفر الأنبوبية (TP) بين microvilli ، والتي شكلت حدود الفرشاة (BB) في غشاء قمي (هـ ، و). كشف التكبير العالي عن السطح القمي للخلايا الظهارية PCT التي تحتوي على ميكروفيلي طويل لتشكيل حدود الفرشاة وتقاطعات ضيقة (TJ) بين حدود الخلايا اللمعية للخلايا الظهارية الأنبوبية المجاورة (هـ ، و). من ناحية أخرى ، يحتوي السطح القمي للخلايا الظهارية DCT على عدد قليل من الميكروفيلي القصير والعديد من الحويصلات (g ، h). شريط المقياس في الصور (أ - د) والأشكال الداخلية (هـ - ح) هو 1 ميكرومتر ؛ شريط المقياس في الصور (ه - ح) هو 2 ميكرومتر.
توطين وتجميع كل من Reelin و DAB1تم التعبير عن ريلين بشكل ضعيف مع تفاعل خفيف إلى متوسط (الجدول 2) في الكبيبات و DCT لجميع الحيوانات التي تم فحصها في جميع النقاط الزمنية المرصودة (p <0. 0="" 5="" ،="" الشكل="" 3="" أ).="" فقط="" في="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" لفئران="" yotari="" كانت="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الإيجابية="" أعلى="" بكثير="" من="" الحيوانات="" البرية="" (p=""><0.05 ،="" الشكل="" 3="" أ).="" في="" الخلايا="" الكبيبية="" ،="" كان="" توطين="" التلوين="" حول="" النواة="" ،="" بينما="" في="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" و="" dct="" ،="" كان="" منتشرًا="" في="" جميع="" أنحاء="" السيتوبلازم="" (الشكل="" أ="" ،="">
الشكل 4. تلطيخ التألق المناعي لليوتاري بعد الولادةالكلىمع علامة ريلين (أ) وتلطيخ مناعي مزدوج من النوع البري بعد الولادةالكلىمع علامات DAB1 و reelin (ب). (أ ، ب) تم دمج تلطيخ DNA DAPI النووي مع DAB1 ، ويتم عرض reelin المناعي بالتوازي (دمج). النقاط الزمنية المرصودة هي P4 و P11 و P14. يتم تمييز التعبير عن العلامات التي تم فحصها في الكبيبات (G) والأنابيب الملتوية القريبة (PCT) والأنابيب الملتوية البعيدة (DCT) بالأسهم ، بينما تشير العلامات النجمية إلى التعبير عن الريلين في المصفوفة خارج الخلية (أ). تُظهر الإدخالات التعبير الأبرز في الصورة. كشف تلطيخ DAPI النووي عن ضعف التلون في DAB1 و reelin ، في الغالب في DCT (رأس السهم). شريط المقياس 20 ميكرومتر ويشير إلى جميع الصور.
لم يكن هناك تقريبًا أي تفاعل مناعي لـ DAB1 في الكبيبات و PCT للحيوانات البرية عند P4 ، بينما زادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ذات التفاعل الخفيف (الجدول 2) بشكل ملحوظ في P11 و P14 (p <0. 05،="" الشكل="" 3="" ب).="" في="" dct="" ،="" تم="" التعبير="" عن="" dab1="" في="" الغالب="" في="" الأجزاء="" القمية="" والجانبية="" من="" أغشية="" الخلايا="" (الشكل="" 4="" ب)="" مع="" تفاعل="" قوي="" (الجدول="" 2).="" كانت="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الإيجابية="" أعلى="" بكثير="" مما="" كانت="" عليه="" في="" الهياكل="" السابقة="" ،="" حوالي="" 60="" في="" المائة="" (الشكل="" 3="" ب)="" ،="" خاصة="" في="" البقعة="" الكثيفة="" (الشكل="" 4="" ب).="" لم="" يكن="" هناك="" تقريبًا="" أي="" تقاطع="" بين="" dab1="" و="" reelin="" باستثناء="" dct="" للحيوانات="" البرية="" في="" p14="" (رأس="" السهم="" ،="" الشكل="" 4="" ب).="" الجزيئات="" الحيوية="" 2021="" ،="" 11="" ،="" 609="" 8="" من="" 14="" الشكل="" 4.="" تلطيخ="" التألق="" المناعي="" لليوتاري="" بعد="">الكلىمع علامة ريلين (أ) وتلطيخ مناعي مزدوج من النوع البري بعد الولادةالكلىمع علامات DAB1 و reelin (ب). (أ ، ب) تم دمج تلطيخ DNA DAPI النووي مع DAB1 ، ويظهر التألق المناعي للريلين بالتوازي (دمج). النقاط الزمنية المرصودة هي P4 و P11 و P14. يتم تمييز التعبير عن العلامات التي تم فحصها في الكبيبات (G) ، والأنابيب الملتوية القريبة (PCT) والأنابيب الملتوية البعيدة (DCT) بالأسهم ، بينما تشير العلامات النجمية إلى تعبير الريلين في المصفوفة خارج الخلية (أ). تُظهر الإدخالات التعبير الأبرز في الصورة. كشف تلطيخ DAPI النووي عن ضعف التلون في DAB1 و reelin ، في الغالب في DCT (رأس السهم). شريط المقياس 2 0 ميكرومتر ويشير إلى جميع الصور. لم يكن هناك تقريبًا أي تفاعل مناعي لـ DAB1 في الكبيبات و PCT للحيوانات البرية عند P4 ، بينما زادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ذات التفاعل الخفيف (الجدول 2) بشكل ملحوظ في P11 و P14 (P <0.05 ،="" الشكل="" 3="" ب).="" في="" dct="" ،="" تم="" التعبير="" عن="" dab1="" في="" الغالب="" في="" الأجزاء="" القمية="" والجانبية="" من="" أغشية="" الخلايا="" (الشكل="" 4="" ب)="" مع="" تفاعل="" قوي="" (الجدول="" 2).="" كانت="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الإيجابية="" أعلى="" بشكل="" ملحوظ="" مما="" كانت="" عليه="" في="" الهياكل="" السابقة="" ،="" حوالي="" 60="" في="" المائة="" (الشكل="" 3="" ب)="" ،="" خاصة="" في="" البقعة="" الكثيفة="" (الشكل="" 4="" ب).="" لم="" يكن="" هناك="" تقريبًا="" أي="" تقاطع="" بين="" dab1="" و="" reelin="" باستثناء="" dct="" للحيوانات="" البرية="" في="" p14="" (رأس="" السهم="" ،="" الشكل="" 4="">
أنماط التعبير المكاني والزماني لـ NOTCH2 و LC3Bكانت النسبة المئوية للخلايا الموجبة NOTCH {0} أقل من 2 0 في المائة في الكبيبات لكل من الأنماط الجينية الحيوانية في جميع النقاط الزمنية المرصودة. فقط عند P14 كانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية أعلى بكثير في الكبيبات لحيوانات yotari من الحيوانات البرية (P <0.05 ،="" الشكل="" 3="" ج).="" كانت="" كثافة="" التلوين="" خفيفة="" إلى="" معتدلة="" (الجدول="" 2)="" ،="" وتقع="" في="" الغالب="" حول="" النواة="" (الشكل="" 5="" أ-و).="" في="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" و="" dct="" لكل="" من="" الطرز="" الوراثية="" الحيوانية="" زادت="" نسبة="" الخلايا="" الإيجابية="" بمرور="" الوقت.="" في="" p14="" ،="" كانت="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الإيجابية="" أعلى="" بكثير="" في="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" و="" dct="" لحيوانات="" yotari="" من="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" و="" dct="" للحيوانات="" البرية="" (p=""><0.05 ،="" الشكل="" 3="" ج).="" كانت="" شدة="" الإشارة="" في="" جميع="" النقاط="" الزمنية="" المرصودة="" خفيفة="" إلى="" معتدلة="" (الجدول="" 2)="" ومنتشرة="" في="" جميع="" أنحاء="" السيتوبلازم="" (الشكل="" 5="" أ-و).="" الشكل="" 5.="" تلطيخ="" التألق="" المناعي="" من="" النوع="" البري="" بعد="" الولادة="" و="">الكلىمع علامات NOTCH2 و LC3B وتلطيخ مناعي مع علامة caspase3 المشقوق (CASP3). (أ - و) تم دمج تلطيخ DNA DAPI النووي مع NOTCH2 و LC3B. النقاط الزمنية المرصودة هي P4 و P11 و P14. يتم تمييز التعبير عن علامات NOTCH2 و LC3B في الكبيبات (G) والأنابيب الملتوية القريبة (PCT) والأنابيب الملتفة البعيدة (DCT) بالأسهم. يمكن ملاحظة تفاعل LC3B القوي بشكل خاص في كبسولة بومان من الكبيبات المتحللة (علامة النجمة ، هـ). تُظهر الإدخالات التعبير الأبرز في الصورة. تم التعبير عن CASP3 بشكل سيئ في جميع النقاط الزمنية المرصودة. كان التعبير المهم الوحيد في الكبيبات لفئران yotari على P14 (الأسهم). شريط المقياس 2 0 ميكرومتر ويشير إلى جميع الصور. الجزيئات الحيوية 2 0 21 ، 11 ، 609 9 من 14 3 .4. أنماط التعبير المكاني والزماني لـ NOTCH2 و LC3B كانت النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ NOTCH 2- أقل من 20 بالمائة في الكبيبات لكل من الأنماط الجينية الحيوانية في جميع النقاط الزمنية المرصودة. فقط عند P14 كانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية أعلى بشكل ملحوظ في الكبيبات لحيوانات yotari من الحيوانات البرية (p <0.05 ،="" الشكل="" 3="" ج).="" كانت="" كثافة="" التلوين="" خفيفة="" إلى="" معتدلة="" (الجدول="" 2)="" ،="" وتقع="" في="" الغالب="" حول="" النواة="" (الشكل="" 5="" أ-و).="" في="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" و="" dct="" لكل="" من="" الطرز="" الوراثية="" الحيوانية="" زادت="" نسبة="" الخلايا="" الإيجابية="" بمرور="" الوقت.="" في="" p14="" ،="" كانت="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الإيجابية="" أعلى="" بشكل="" ملحوظ="" في="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" و="" dct="" لحيوانات="" yotari="" من="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" و="" dct="" للحيوانات="" البرية="" (p=""><0.05 ،="" الشكل="" 3="" ج).="" كانت="" شدة="" الإشارة="" في="" جميع="" النقاط="" الزمنية="" المرصودة="" خفيفة="" إلى="" معتدلة="" (الجدول="" 2)="" ومنتشرة="" في="" جميع="" أنحاء="" السيتوبلازم="" (الشكل="" 5="">
الشكل 5. تلطيخ المناعي من النوع البري بعد الولادة و yotariالكلىمع علامات NOTCH2 و LC3B وتلطيخ مناعي مع علامة caspase3 المشقوق (CASP3). (أ - و) تم دمج تلطيخ DNA DAPI النووي مع NOTCH2 و LC3B. النقاط الزمنية المرصودة هي P4 و P11 و P14. يتم تمييز التعبير عن علامات NOTCH2 و LC3B في الكبيبات (G) والأنابيب الملتوية القريبة (PCT) والأنابيب الملتفة البعيدة (DCT) بالأسهم. يمكن ملاحظة تفاعل LC3B القوي بشكل خاص في كبسولة بومان من الكبيبات المتحللة (علامة النجمة ، هـ). تُظهر الإدخالات التعبير الأبرز في الصورة. تم التعبير عن CASP3 بشكل سيئ في جميع النقاط الزمنية المرصودة. كان التعبير الوحيد ذو الدلالة في الكبيبات في فئران yotari على P14 (الأسهم). شريط المقياس 20 ميكرومتر ويشير إلى جميع الصور.
في الكبيبات و DCT لكل من الأنماط الجينية الحيوانية ، زادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية LC3B بمرور الوقت (p <0. 0="" 5="" ،="" الشكل="" ثلاثي="" الأبعاد).="" في="" p11="" و="" p14="" ،="" كانت="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" الموجبة="" أعلى="" بشكل="" ملحوظ="" في="" الكبيبات="" لحيوانات="" yotari="" من="" الكبيبات="" للحيوانات="" البرية="" (p=""><0. 05="" ،="" الشكل="" ثلاثي="" الأبعاد).="" في="" الكبيبات="" لحيوانات="" اليوتاري="" كانت="" كثافة="" التلوين="" في="" الغالب="" معتدلة="" إلى="" قوية="" (الجدول="" 2)="" الموجودة="" في="" الفضاء="" المحيط="" النووي="" والنووي="" (الشكل="" 5="" أ-و)="" ،="" في="" جميع="" النقاط="" الزمنية="" المرصودة="" ،="" بينما="" في="" الكبيبات="" من="" الفئران="" البرية="" ،="" كانت="" الكثافة="" معتدلة="" في="" الغالب="" (الجدول="" 2).="" احتوت="" معاهدة="" التعاون="" بشأن="" البراءات="" لحيوانات="" اليوتاري="" والحيوانات="" البرية="" على="" حوالي="" 20="" في="" المائة="" من="" الخلايا="" الإيجابية="" في="" جميع="" النقاط="" الزمنية="" المرصودة="" (p=""><0.05 ،="" الشكل="" ثلاثي="">
تعبير CASP المشقوق -3لم يكن هناك تقريبًا أي تعبير عن CASP المنشط -3 في ملفالكلىمن الحيوانات البرية في جميع النقاط الزمنية المرصودة. في PCT و DCT لفئران yotari ، كانت عدة خلايا فردية إيجابية CASP -3- (الشكل 3 هـ). فقط في الكبيبات من كلى اليوتاري في P14 (الشكل 5 هـ) ، زادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية بشكل ملحوظ مقارنةً بـالكلىمن الفئران البرية (ف <0. 05 ، الشكل 3 هـ).
مناقشة
الكلىالتشكل والتطوير عمليات معقدة منسقة بدقة من خلال التفاعل بين عدد كبير من الجينات. العيوب الخلقيةالكلىوالمسالك البولية (CAKUT) هي العيوب الخلقية الأكثر شيوعًا والتي تشكل 23 بالمائة من جميع هذه العيوب وتمثل السبب الرئيسي للمرحلة النهائيةامراض الكلىفي الأطفال [28،29]. قد تكون الاضطرابات الجينية المفردة هي المصدر الأساسي لـ CAKUT ، وحتى الآن ، تم تحديد طفرة في أكثر من 20 جينًا كسبب لـ CAKUT [30]. كما أظهر عملنا السابق تعبيرًا رائعًا عن DAB1 أثناء جنين الإنسان الطبيعيالكلىفي التطور [9] ، افترضنا أن DAB1 قد يلعب دورًا مهمًا خلال الثديياتالكلىتطوير. لإثبات فرضيتنا ، قمنا بالتحقيق فيالكلىأنماط التشكل والتعبير عن reelin و NOTCH2 و LC3B وبروتينات CASP3 المنشطة في فئران Dab1 بالضربة القاضية.
سيحسن الكستانش من آلام الكلى / الكلى
التقسيم من خلال الفئران yotariالكلىكشفت عن قشرة أرق ومتوسط أصغر بشكل ملحوظالكلىوأقطار PCT و DCT و G مقارنة بالحيوانات البرية. الانخفاض فيالكلىيُعرف الحجم الناجم عن الوقف غير الكافي من النيفرون باسمكلوينقص تنسج الدم ، وهو أحد أكثر اضطرابات CAKUT شيوعًا ، والذي يؤهب لارتفاع ضغط الدم عند البالغين وأمراض الكلى المزمنة [31]. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت الصور الدقيقة التي تم التقاطها باستخدام TEM أن فئران yotari أظهرت تلفًا بارزًا في خلية البودوسيت مع انحناء عملية القدم وعدم وجود فتحات الترشيح. بعد الإصابة ، تخضع الخلايا البودوسية لعملية إمح حيث تفقد بنيتها ، مما يؤدي إلى انخفاض في وظيفة حاجز الترشيح [32]. تتميز جميع أشكال المتلازمة الكلوية ، وكذلك تصلب الكبيبات القطعي البؤري (FSGS) ، بعيوب في بنية أو وظيفة خلية القدم [33].
أظهرت دراستنا الحالية أعلى تعبير عن DAB1 في الأجزاء القمية والجانبية لأغشية الخلايا في DCT ، بينما كان REELIN مبعثرًا في الغالب في جميع أنحاء سيتوبلازم معاهدة التعاون بشأن البراءات. في النقاط الزمنية التي تم فحصها ، لم يلاحظ أي تغيرات مورفولوجية في نبيبات فئران yotari ، ولكن من الضروري إجراء مزيد من التحقيقات لتوضيح دور DAB1 في المقصورات tubulointerstitial. كان هناك تآلف عرضي لبروتينات DAB1 و REELIN ، معظمها في DCT. هذه الخمسات تتبع عملنا السابق فيما يتعلق بالتعبير عن هذين البروتينين أثناء الجنين البشريالكلىالتنمية [9]. قد يشير هذا إلى أن DAB1 و reelin لهما أدوار مماثلة في الإنسان والفأرالكلىعن طريق تنشيط بعض المسارات النهائية ، مثل Crk و MAPK و PI3K / Akt / mTOR [34–36]. كشفت بياناتنا أيضًا عن زيادة تعبير الريلين في الكبيبات في فئران yotari. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت دراسة سابقة أن الفسفرة DAB1 وزيادة تعبير الريلين في الكبيبات مصحوبًا بارتفاع ضغط الدم ، وبروتينية ، وإصابة في الخلايا البادوسية في الفئران المصابة بـ Ang II [10].
بالإضافة إلى ذلك ، كشف تلطيخ التألق المناعي عن زيادة التعبير عن مستقبلات NOTCH2 في الكبيبات في فئران yotari P14. من المعروف أن تعبير NOTCH2 يتم تنظيمه بمجرد تحقيق نضج النيفرون ، إلا في ظروفإصابات كلوية ،مثل اعتلال الكلية السكري و FSGS [15،37]. أظهرت الفئران المصابة بالمتلازمة الكلوية التي يسببها Adriamycin أيضًا تعبيرًا متزايدًا عن NOTCH2 المنشط ، والذي يحسن التليف الفيفي [38]. في النقاط الزمنية التي تم فحصها ، لم نلاحظ زيادة في التليف ، ولكن يبقى توضيح الدور الدقيق لـ NOTCH2 المعبر عنه في yotari بعد الولادةالكلى.سيكون من الضروري إجراء مزيد من الملاحظة حول ما إذا كانت التغييرات الفيفيبروتية تحدث في المراحل اللاحقة. ومع ذلك ، هناك بالفعل بعض التكوينات التي تشير إلى أن التأثير قصير المدى لزيادة تنشيط NOTCH2 مرتبط بفائدة بقاء قوية لخلايا القدم المصابة ، والتي تُفقد في النماذج طويلة المدى ، مثل اعتلال الكلية السكري [39].
من المحتمل أن يعكس تعبير LC3B الأعلى في الكبيبات في فئران yotari P11 و P14 تراكمًا للبلعمة الذاتية في الخلايا البادئة. لتوضيح أن الالتهام الذاتي قد تم تسريعه. من الضروري تحليل نسبة تعبيرات البروتين LC 3- II و LC 3- I. في ظل الظروف العادية ، تكون الالتهام الذاتي ضرورية للحالة الطبيعيةوظائف الكلى[40] ، وخاصة في خلايا الأقدام. بسبب قدرتها المحدودة على انقسام الخلايا واستبدالها ، فإنها تظهر مستوى قاعدي مرتفع من الالتهام الذاتي [41]. على الرغم من هذه الفرضيات ، فقد تم الإبلاغ عن ارتفاع في تعبير LC3B في العديد من أمراض الكبيبات [42-44] ، بشكل رئيسي بالارتباط مع عملية القدم وتطور المتلازمة الكلوية ، كما هو ملاحظ في فئران خروج المغلوب الشرطية لمستقبل البرورينين [45،46]. تشير جميع هذه الدراسات إلى دور وقائي للالتهام الذاتي المعزز في الحالات المرضية ، مدعومًا بشكل أكبر بخمس حالات اعتلال الكلية الناجم عن الأدرياميسين ، حيث يتم تنشيط الالتهام الذاتي للحماية من إصابة خلايا القدم [43] ، وكذلك في مرض الكبيبات المرتبط بالعمر حيث يتأخر التدهور الوظيفي التدريجي للوظائف الكلى[40]. تحليل الإنسانالكلىأظهرت الخزعات أيضًا دليلًا على زيادة الالتهام الذاتي بالاقتران مع انحناء عملية القدم في العديد من أمراض الكبيبات ، بما في ذلك المتلازمة الكلوية ذات التغيير الأدنى (MCNS) ، والتي تعد أحد أكثر الأسباب شيوعًا للمتلازمة الكلوية مجهولة السبب [19]. في حالات اعتلال الكلية السكري والحاد الناجم عن عديدات السكاريد الدهنيةإصابة الكلى ،تحسين الالتهام الذاتي مع بعض العلاجات من خلال تثبيط مسار PI3K / AKT / mTOR يحسن وظائف الكلى [47 ، 48]. تشير كل هذه العناصر إلى أن الالتهام الذاتي له دور لا غنى عنه في حماية الخلايا من أجل التكيف مع الإجهاد فيإصابة في الكلى، وقد يكون تعديلها استراتيجية علاجية واعدة ، على الرغم من أن الالتهام الذاتي ، في بعض الظروف ، يمكن أن يكون ضارًا أيضًا ويتطور إلى موت الخلايا.
سيحسن الكستانش الفشل الكلوي / الفشل الكلوي
باستثناء الارتفاع في الالتهام الذاتي ، يمكن أيضًا ملاحظة زيادة مستوى موت الخلايا المبرمج في الكبيبات في فئران yotari P14. يمنع الالتهام الذاتي عادة موت الخلايا المبرمج ، ولكن في ظل ظروف مرضية محددة ، يمكن أن يكون له تأثير معاكس على بقاء الخلية من خلال تعزيز موت الخلايا المبرمج وتعزيزه [42]. بعد الولادة ، موت الخلايا المبرمج فيالكلىيتضاءل بشكل كبير ، إلا في ظروفإصابة الكلى ،مثل المتلازمة الكلوية مجهولة السبب حيث تساهم في تطور المرض [23]. سبب جديد محتمل للتشوهات الخلقية المتنحية الجسدية للالكلىوالمسالك البولية. ومع ذلك ، فإن الدور الرئيسي خلال DAB1الكلىالتنمية لا تزال غير واضحة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت هذه الفئران تشوهات في عملية القدم ومستوى متزايد من بروتينات الريلين و NOTCH2 و LC3B والبروتينات المشقوقة CASP3 في الكبيبات التي قد تؤدي إلى إصابات الكبيبات ، مثل المتلازمة الكلوية ، والتي ترتبط بنقص تنسج الدم ، والتي قد تكون سببًا محتملاً للوفاة من هذه الحيوانات خلال فترة الفطام. لتأكيد هذه الفرضية ، من الضروري تقديم معلومات إضافية بشأن ضغط الدم ومعايير المختبر الطبي الأخرى ، مثل مستويات الكرياتينين والألبومين والبروتينات في الدم.
