نموذج جديد للماوس الرنح لتوسع الشعيرات الرنح الناجم عن طفرة غير منطقية ذات صلة سريريًا (الجزء الأول)

لمعرفة المزيد من المعلومات الرجاء الاتصالdavid.wan@wecistanche.com

الملخص

يعد ترنح توسع الشعيرات (AT) و Ataxia مع Apraxia من النوع 1 (AOA1) اضطرابات عصبية مدمرة ناتجة عن طفرات فارغة في جينات استقرار الجينوم ، AT المتحور (ATM) و Aprataxin (APTX) ، على التوالي. إن فهمنا الآلي والمخزون العلاجي لعلاج هذه الاضطرابات غير موجود بشكل كبير ، ويرجع ذلك في جزء كبير منه إلى فشل النماذج الحيوانية السابقة ذات الطفرات الفارغة المماثلة في تلخيص الفقد المميز للتنسيق الحركي (أي الرنح) والعيوب المخيخية المرتبطة به. بزيادةسامة للجيناتالإجهاد من خلال إدخال طفرات فارغة في كل من جينات Atm (هراء) و Aptx (خروج المغلوب) في نفس الحيوان ، لقد أنشأنا نموذجًا جديدًا للماوس يطور لأول مرة نمطًا ظاهريًا رنحيًا شديدًا بشكل تدريجي مرتبط بضمور الجزيئي المخيخي طبقة. وجدنا أن الخواص الفيزيائية الحيوية للخلايا العصبية المخيخية مضطربة بشكل كبير (على سبيل المثال ، انخفاض سعة الغشاء ، وعتبات جهد العمل المنخفض ، وما إلى ذلك) ، بينما تظل خصائص المدخلات المتشابكة دون تغيير إلى حد كبير. هؤلاءاضطراباتيغير بشكل كبير النشاط العصبي العصبي في Purkinie ، بما في ذلك الانخفاض التدريجي في إطلاق النار المحتمل للعمل التلقائي

التردد المرتبط بكل من ضمور المخيخ والرنح خلال السنة الأولى من حياة الحيوان. تُظهر الفئران الطافرة المزدوجة أيضًا استعدادًا عاليًا للإصابة بالسرطان (الأورام التوتية) والتشوهات المناعية (ضعف نمو الخلايا الصعترية المبكرة ونضج الخلايا التائية) ، وهي أعراض مميزة لـ AT. أخيرًا ، من خلال إدخال طفرة فارغة من النوع اللامعقول ذات الصلة سريريًا في Atm ، نوضح أن مركبات قراءة الجزيئات الصغيرة (SMRT) يمكنها استعادة إنتاج أجهزة الصراف الآلي ، مما يشير إلى إمكاناتها كعلاج AT مستقبلي.

انقر هنا لمعرفة المزيد عن Cistanche

1 - 0 مقدمة

ترنح توسع الشعيرات (AT) نادر (1 في ~ 100 ، 000) (سويفت وآخرون. 1986) ، وهو اضطراب وراثي جسمي متنحي يتسم بالاستعداد للسرطان ، ونقص المناعة ، ورنح شديد الاختراق وشديد مرتبط ضمور المخيخ (Rothblum-Oviatt et al. 2016 ؛ Boder and Sedgwick 1958 ؛ Levy and Lang 2018). يموت مرضى AT عادةً في العقد الثاني أو الثالث من العمر (كروفورد وآخرون 2006) من السرطانات اللمفاوية أو التهابات الجهاز التنفسي أو مضاعفات الرنح - لسوء الحظ ، لم يتغير البقاء على قيد الحياة بشكل كبير منذ الخمسينيات (ميكول وآخرون 2011 ؛ روثبلوم- Oviatt وآخرون 2016). في حين أن تطور المرض وسبب الوفاة يختلفان بشكل كبير بين المرضى ، تم الإبلاغ عن الانخفاض التدريجي الشديد في التنسيق الحركي على أنه له أكبر تأثير سلبي على نوعية حياة المريض (جاكسون وآخرون ، 2016). الرعاية بشكل عام ملطفة ، موجهة نحو تقليل ، أو الحد ، أو القضاء على السرطانات أو الالتهابات. لا توجد علاجات طويلة الأمد متاحة لعلاج الترنح وما يرتبط به من خلل وظيفي وضمور في المخيخ. يحدث AT بسبب نقص أو خلل في أجهزة الصراف الآلي (ال متحور) البروتين (سافيتسكي وآخرون 1995). كودون الإنهاء المبكر (PTC) الذي يسبب طفرات غير منطقية يمثل ما يصل إلى نصف الحالات المعروفة ، مع وجود طفرات خطأ وحذف تساهم أيضًا (Concannon and Gatti 1997 ؛ Sandoval et al. 1999). ATM عبارة عن كيناز عائلة سيرين / ثريونين PIKK الذي يلعب دورًا رئيسيًا في الاستجابة لتلف الحمض النووي (DDR) ، حيث يحمي الخلايا من عشرات الآلاف من آفات الحمض النووي التي تحدث كل يوم (Lindahl and Barnes 2000 ؛ Kastan and Bartek 2004 ؛ Shiloh و Ziv 2013) .في الشكل الأحادي النشط ، فسفرة ATM عدة بروتينات رئيسية توقف إنتاج DNA جديد (توقف دورة الخلية) (Ando et al. 2012) ، وبعد ذلك ، اعتمادًا على شدة الضرر ، تبدأ في إصلاح الحمض النووي أو الخلية المبرمجة الموت (أي موت الخلايا المبرمج) (أندو وآخرون 2012 ؛ راشي إلكليس وآخرون 2006). تم تحديد العديد من أهداف مسار DDR النهائية لأجهزة الصراف الآلي ، بما في ذلك p53 و CHK2 و BRCA1 و SMC1 و NBS1 (Matsuoka et al.2007). لإعادة تركيب تضفير الحمض النووي الطبيعي الذي يحدث أثناء إعادة ترتيب الجينات في نضوج الخلايا الليمفاوية التائية والبائية (تشاو ويانغ وكسو 2000 ؛ ماتي وجويدوس ودانسكا 2006 ؛ فاكشيو وآخرون 2007 ؛ شوبرت وريتشينباخ وزيلين 2002 ). على الرغم من أن أدوارها لا تزال آخذة في الظهور ، فقد تورطت أجهزة الصراف الآلي أيضًا في توازن الإجهاد التأكسدي (Guo et al. 2010) والتخفيف (Valentin-Vega and Kastan 2012 ؛ Pizzamiglio و Focchi و Antonucci 2020). من غير الواضح سبب تسبب نقص أجهزة الصراف الآلي في ترنح ، لكنه بعيد عن بروتين DDR الوحيد المرتبط بالرنح ، مثل Aprataxin (APTX) (Aicardi وآخرون 1988) ، إعادة التركيب العضلي 11 homolog 1 (MRE11) (Sedghi وآخرون 2018) ، Nibrin (NBS1) (van der Burgt وآخرون 1996) ، Senataxin (SETX) (موريرا وآخرون 2004) ، و Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1 (TDP1) (Takashima et al.2002) عند الغياب أو الخلل الوظيفي يمكن أن يسبب ترنح متعلق بالمخيخ. يشير هذا إلى أن السمات العصبية لمتلازمات عدم استقرار الجينوم لها سبب أساسي شائع ، على الرغم من أن هذا لم يتم إثباته ميكانيكيًا بعد (McKinnon 2009 ؛ Rass و Ahel و West 2007). العامل الرئيسي الذي يحد من قدرتنا على تحديد سبب تأثير فقدان بروتينات DDR ، مثل ATM ، بشكل انتقائي على المخيخ ويسبب ترنحًا تدريجيًا هو عدم وجود نموذج حيواني يلخص هذه الأعراض العصبية (Lavin 2013). تم إنشاء العديد من نماذج القوارض AT على مدار السنوات العديدة الماضية عن طريق إدخال طفرات جينية تسبب خللًا وظيفيًا في البروتين (تفتقر إلى نشاط كيناز) أو نقصًا تامًا (Herzog وآخرون 1998 ؛ Xu و Baltimore 1996 ؛ Elson et al 1996 ؛ Spring et al. 2001 ؛ كامبل وآخرون 2015 ؛ كويك وآخرون 2016 ؛ تال وآخرون 2018 ؛ لافين 2013) ؛ تم الإبلاغ عن وجود minipig مؤخرًا (Beraldi et al. 2017). ومع ذلك ، لا أحد يعاني من رنح صريح وتدريجي مع خلل وظيفي في المخيخ وضمور يلخص المرض البشري ، على الرغم من تطور جوانب أخرى من الاضطراب مثل سرطان الغدة الدرقية والعقم والتشوهات المناعية. لا يزال من غير الواضح سبب فشل هذه النماذج الحيوانية السابقة في عرض النمط الظاهري الترنحي التدريجي (لافين 2013). من الممكن أن توفر التعويضات الجزيئية الخاصة بالأنواع في الفئران زيادات عن الحاجة أو مسارات بديلة تقلل من آثار نقص أجهزة الصراف الآلي في الدماغ (El-Brolosy and Stainier 2017). من الممكن أيضًا أن يكون العمر الافتراضي القصير للنماذج السابقة (Barlow وآخرون 1996) قصيرًا جدًا بالنسبة للآليات العشوائية التي تؤدي إلى اختلال وظيفي وضمور المخيخ لتتراكم وتؤثر على السلوك الحركي. تشمل التحديات الأخرى التلاعب الجيني الذي يحتمل أن يتسرب منه والذي ينتج عنه مستويات منخفضة من بروتين ATM أو شظايا نشطة مع نشاط كيناز متبقي ، مما يحد من أمراض الأعصاب (Li et al. 2011). أثر فقدان مثل هذا النموذج الحيواني الحاسم له

كانت كبيرة ، مما حد بشدة من الدراسات التجريبية من تحديد الآليات الخلوية والجزيئية وإعاقة التطور قبل السريري واختبار العلاجات التي تشتد الحاجة إليها. نختبر هنا ما إذا كانت زيادة الإجهاد السام الجيني ، من خلال وضع الطفرات الصفرية ليس فقط في جين Atm ، ولكن أيضًا في جين Aptx ذي الصلة ، يؤدي إلى نموذج فأر أكثر تمثيلا يعرض خللًا في المخيخ ، وضمورًا ، وتطور الرنح التدريجي. لقد اخترنا أيضًا إلغاء Aptx لأن نقصه يسبب اضطرابًا شبيهًا بـ AT في البشر يسمى ترنح مع تعذر الأداء العيني من النوع 1 (AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T) في جين Atm الشائع لعائلة كبيرة من مرضى AT في شمال إفريقيا (جلعاد ، بار شيرا ، وآخرون 1996). ينتج عن هذه الطفرة كودون إنهاء سابق لأوانه (PTC) في ما يمكن أن يكون عادةً حمض أميني 35 وفقدان ترجمة ATM. هنا ، قمنا بالإبلاغ عن تجارب إثبات المبدأ التي توضح أن الطفرات الجينية ذات الصلة سريريًا المدمجة في نموذج فأر AT قابلة للقراءة من خلال المركبات وبالتالي فهي مناسبة للاختبار قبل السريري لمركبات SMRT.

2 - 0 النتائج

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>ينتج عن طفرة T في PTCs مختلفة في الجين البشري مقارنة بالماوس Atmالجين — TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>تقوم طفرة T بتحويل كودون CAG المشفر للجلوتامين (Q) إلى كودون توقف TAG ويشار إليه بـ Atm235 × (Atmm1.103c رسميًا). يؤدي وجود PTC إلى فقدان تعبير ATM ، إما أن يتم تقليله بمقدار النصف تقريبًا في الزيجوت المتغاير الذي يعبر عن نسخة ماوس عادية واحدة من

أو Atm Q35v35 ×) (الشكل أو Atm 835 ×) ، أو بالكامل في الجين متماثل الزيجوت (Atm؟ 35 × R35 × Atm gene (أجهزة الصراف الآلي 35 × زائد 1 درجة مئوية).

Atm35x7R35 × ؛ تم إنشاء الفئران Aptx ^ (متحولة مزدوجة) عن طريق عبور الفئران أحادية الطور AtmF3xR3x (متجانسة على خلفية C57BL / 6J) وفئران Aptx (مختلطة C57BL / 6J و 129 الخلفية) إلى الفئران Aptx *. F 1-5 littermate Atm "؛ تم عبور فئران Aptx * لتوليد صراف آلي متغاير الزيجوت داخل الفضلات لإنشاء أعداد كافية من الأنماط الجينية التجريبية والتحكمية المرغوبة لتحديد كيفية تأثير فقدان الكميات المختلفة من ATM و APTX على النمط الظاهري للحيوان ( الشكل 1 د).

مثل نماذج الماوس AT السابقة التي تعاني من نقص ATM ، لم ينتج عن نقص ATM أو APTX وحده في الفئران المصابة بالرنح (الفيديو 1 و 2). ومع ذلك ، فإن النقص في كلا البروتينين (Atm35k35x ؛ Aptx ') يؤدي إلى تطور نمط ظاهري رنح شديد وتدريجي (الشكل 1E ، الفيديو 3 و 4).

2.2 الفئران التي تعاني من نقص في أجهزة الصراف الآلي قللت من البقاء على قيد الحياة وارتفاع معدل الإصابة بأورام التوتة

قمنا بتقييم الصحة العامة وتطوير التحكم والفئران التجريبية التي تعبر عن مستويات مختلفة من ATM و APTX (الشكل 2). وجدنا أن Atm735xR35 × ؛ نمت الفئران Aptx ^ 'أبطأ بنسبة 55 في المائة ووصلت إلى أوزان هضبة تقديرية تقل بنسبة 35 في المائة عن الأنماط الجينية الضابطة (رتبة لوغاريتمية ، n =21 إلى 40 ، p<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0. 4 لجميع المقارنات الزوجية ؛ الشكل 2- شكل S1B]. بشكل عام ، مات ثلث الفئران المصابة بنقص أجهزة الصراف الآلي من المضاعفات المتعلقة بسرطانات الغدة الصعترية الكبيرة (التوتة) الموجودة في التجويف الصدري (الشكل 2C). لم يؤثر وجود أو عدم وجود APTX على انتشار السرطان ، وكانت الفئران التي لديها نسخة واحدة على الأقل من أجهزة الصراف الآلي خالية من السرطان حتى P400 على الأقل. بشكل عام ، كان لنقص أجهزة الصراف الآلي ولكن ليس لنقص APTX تأثيرات وخيمة على صحة الفئران وبقائها على قيد الحياة.

2.3 كل من نقص ATM و APTX ضروريان لإحداث خلل حركي تدريجي

التطور التدريجي للرنح الشديد هو السمة المميزة لـ AT التي يتم تلخيصها في ATM؟ 35 / R35x ؛ فئران Aptx ولكن لم يتم اختبار أي من الأنماط الجينية الأخرى الضابطة التي اختبرناها. بشكل عام ، وجدنا عجزًا في التنسيق الحركي يظهر بين 21 0 و 4 0 0 يومًا بعد الولادة في Atm735Xk3x ؛ Aptxmice ولم تجد أي دليل على ترنح في الفئران مع نسخة واحدة على الأقل من جين Atm أو Aptx (الشكل 3 أ ، ب). لاختبار العمود الرأسي ، Atm735xR3x × ؛ استغرقت فئران Aptx ضعف الوقت اللازم للنزول عند P4 0 0 مقارنةً بـ Atm *؛ Aptx *، Atm *؛ Aptx '، Atm735xR35 × ؛ Aptx * أو Atm35 × * ؛ فئران Aptx (ذكر: 29.1 ± 0.9 ثانية (ن =3) مقابل 7.5 ± 0.4 ثانية (ن =12) ، 12.5 ± 2.5 ثانية (ن =9) ، 9.2 ± 0.9 ثانية (رقم =10) ، 8.6 ± 0.9 ثانية (ن =11) ، 1- طريقة ANOVA ، F4. 40=19. 9 ، ص<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4 خواص الغشاء والتشابك مضطربة في عصبونات بوركينجي التي تعاني من نقص ATM و APTX

عصبونات بوركينجي (PN) هي نوع فرعي رئيسي من الخلايا العصبية الموجودة في قشرة المخ. إنها تظهر استثارة جوهرية كبيرة ، وتطلق إمكانات العمل تلقائيًا بمعدلات أعلى بكثير من معظم الخلايا العصبية الأخرى في الدماغ (50 إلى 100 هرتز أكثر في كثير من الحالات). يشكل نشاطهم الناتج المخيخي عن طريق تثبيط منشط للخلايا العصبية للنواة المخيخية ، والتي تبرز إلى مراكز التنسيق الحركي في الدماغ الأمامي وجذع الدماغ والحبل الشوكي. يرتبط الخلل الوظيفي للدماغ المخيخي بعدة أشكال من الرنح وهو متورط في AT (Hoxha وآخرون 2018: Cook. Fields. و Watt 2021: Shiloh Aptx * -X / R35X.2020). لذلك ، قمنا بفحص ما إذا كانت الخصائص الفيزيولوجية الكهربية لـ PNs في المخيخ Atm غير طبيعية. نظرًا لأن نشاط خط الأساس PN والاستجابة للمدخلات يتم توسطهما من خلال مجموعة أساسية من خصائص الغشاء السلبي والنشط (الشكل 4) ، قمنا بتسجيل ومقارنة خصائص الغشاء لـ PNs في أقسام المخيخ الحادة التي تم حصادها من Atm35XR35 × ؛ Aptx * و Atm * ؛ الفئران Aptx * (P350 إلى 400). تم تسجيل PNs من Atm35xR35 × ؛ كان لدى فئران Aptx أغشية "أكثر إحكامًا" بشكل ملحوظ ، حيث أظهرت مقاومة غشاء أعلى (Rm) من تلك الموجودة في Atm ؛ فئران Aptx * [47.7 ± 5.6 (ن =15) مقابل.

3 0. 2 ± 1.47 (ن =23) MQ، t-test، p -0. 0 08؛ الشكل 4 ب] وعرض ثابت وقت غشاء أسرع () [3.6 ± 0.4 (n =15) مقابل 5.1 ± 0.3 (n =23) ms ، t-test ، p =0 .009 ؛ الشكل 4 ب]. تشير هذه النتائج إلى أن السعة الكلية للغشاء (Cm=t / Rm) لـ Atm35x / 35x ؛ Aptx ^ PNs تقل بشكل ملحوظ [98.25 ± 19.23 (n =15) مقابل 175.6 ± 12.67 (n =23) pF ، t-test ، p =0. 0025 ؛ الشكل 4 ب]. على المستوى الخلوي ، يشير هذا إلى أن PNs ​​التي تعاني من نقص ATM و APTX بها أقل (أي منطقة منخفضة) أو أغشية أرق

من تلك الموجودة في wildtype PNs ، وهي نتيجة توحي بوجود عجز في النمو أو عملية تنكس عصبي ؛ Aptx / و (DellOrco وآخرون 2015). قمنا بعد ذلك بتقييم الاستثارة الجوهرية لـ PNs في AtmR35xR3x ؛

أجهزة الصراف الآلي * ؛ الفئران * Aptx من خلال دراسة توليد وديناميكيات عمل PN المحتملة (AP). لوحظ عجز كبير في قدرة PNs على إطلاق النار باستمرار استجابة للحقن الحالي في Atm؟ 35 × 3x ؛ Aptx ^ الفئران (الشكل 4C). ارتبطت حالات العجز هذه باضطرابات كبيرة في السعة والعتبة ومنطقة إمكانات العمل المستحثة [السعة: 66.2 ± 0. 7 (ن =14) مقابل. 72.1 ± 1.4 (ن =13) AmV، t-test، p =0. 0 03 ؛ الحد الأدنى: -55. 2 ± 1.5vs. -48. 61 ± 1.9 mV، t-test، p =0. 0196؛ المنطقة: 17.96 ± 0.6vs.

2 0. 63 ± 1.0 ميللي فولت * مللي ثانية ، اختبار t ، p =0. 048؛ الشكل 4C]. تُظهر هذه التجارب معًا اضطرابات كبيرة في الخصائص الفسيولوجية PN التي من المحتمل أن تعطل قدرتها على العمل بشكل طبيعي في المخيخ عند / mR35 × R35 × ؛ فئران Aptx.

اختبرنا بعد ذلك ما إذا كانت خصائص PN الخارجية و / أو المشبكية قد تأثرت أيضًا في AtmR35xR3sx. الفئران Aptx *. قمنا أولاً بفحص التيارات المثيرة العفوية بعد التشابك (iPSC) الناتجة عن المشابك الحبيبية من الخلية إلى PN (أي مدخلات الألياف المتوازية). لم يتم اكتشاف أي اختلاف في حجم UPSC ، مما يشير إلى أن وظيفة أطراف محور الخلية الحبيبية (أي الألياف المتوازية) كانت طبيعية نسبيًا في AtmR35KR35X ؛ كان Aptx'cerebellum [18.92 ± 1.3 (n {{1 0}}). 23.4 ± 3.3 (n {15}}) pA، t-test، p =0. 477؛ Fig.4D] (Yamasaki، Hashimoto، and Kano 2 0 {{5 {{58} }}} 6). ومع ذلك ، تم العثور على زيادة كبيرة في تردد sEPSC ، وهي ظاهرة يمكن أن تعزى إما إلى زيادة في العدد الإجمالي للمشابك ، أو زيادة في حجم مجموعة الحويصلات المشبكية التي يمكن إطلاقها بسهولة ، أو زيادة في احتمال الناقل العصبي الافراج في PNs من fAtmR35XR35X ؛ Aptx'mice [18.75 ± 2.8Hz (n =11) مقابل 11.4 ± 1. 0 Hz (n =11)، t-test، p =0. {{ 69}} 47 ؛ الشكل 4 د]. اكتشفنا بعد ذلك إطلاقًا متشابكًا محفزًا ودونة قصيرة المدى عن طريق التسجيل المتزامن من PNs ​​والتحفيز كهربائيًا إما خلية حبيبية (أي ألياف متوازية) أو محاور زيتون أقل شأنا (أي ، ألياف متسلقة) مع اندفاع ثنائي النبض (2- نبضات ، 5 0 مللي ثانية على حدة). تم العثور على الخصائص التشابكية للألياف المتوازية لتكون طبيعية ، ولم تظهر أي اختلافات كبيرة في التيسير قصير المدى المتوقع (Atluri and Regehr 1996) أو ثابت عرض نصف العرض والانحلال لـ EPSC المستحث [PPR: 1.3 ± 0. 0 3 (عدد =10) مقابل 1.4 ± {{9 0}}. {{1 {1 {1 0 6}} 5}} 1 }} 5 (n =13)، t-test، p =0. 162؛ halfwidth: 3.9 ± 0. 6 vs 4.9 ± 0. 4 ms، t -test، p =0. 175؛ time ثابت: 3.5 ± 0. 5 vs 4.7 ± 0.4 ms، t-test، p =0. 054؛ Fig. 4E]. في المقارنة ، وجدنا استجابات متشابكة من الألياف إلى PN ، والتي عادةً ما تعرض انخفاض النبض الزوجي (Hansel and Linden 2000) ، وانخفاض t بمقادير أكبر بكثير في Atm / 3338 / R35X ؛ Aptx'mice [PPR: 0.6 ± 0.03 (ن=6) مقابل 0.7 ± 0.02 (ن =9) ، اختبار t ، p =0. 03 ؛ الشكل 4F]. العرض الإجمالي وثابت وقت الاضمحلال للإثارة التيارات كانت أصغر أيضًا [عرض نصف العرض: 2.3 ± 0.6 (ن =6). 3.0 ± 0.2 (ن =9) مللي ثانية ، اختبار t ، p =0. 004 ؛ ثابت الوقت (سريع) : 1.1 ± 0.14 مقابل 2.9 ± 0.4 مللي ثانية ، اختبار t ، p =0. 001]. في حين أن هذه النتائج يمكن أن تكون ناتجة عن عجز ما قبل المشبكي ، مثل انخفاض مخازن الحويصلات في طرف محور ليفي متسلق ، فإن الحجم الأولي غير المتأثر لـ EPSC [2.4 ± 0.4 (n =6) مقابل. 1.9 ± 0.2 nA (n =9) ، اختبار t ، p =0. 3] يشير إلى عجز جوهري أكثر ، مثل انخفاض تدفق Ca2 * من الشبكة الإندوبلازمية ، والذي يمكن أن يؤثر بشكل كبير على المدى الطويل - اللدونة التشابكية ذات المدة الحاسمة لوظيفة المخيخ (Hoxha et al. 2018 ؛ Kano and Watanabe 2017). بشكل عام ، من المحتمل أن تؤدي الاضطرابات في خصائص PN السلبية والنشطة التي نلاحظها هنا إلى حدوث خلل وظيفي كبير في المخيخ في AtmR35X / R35X ؛ Aptx'mice.

2.5 يسبب نقص ATM و APTX اضطرابًا تدريجيًا في النشاط العصبي PN المرتبط بالتشجيرتقلص وضمور المخيخ العام Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0. 3 عبر جميع المقارنات الزوجية ؛ الشكل 4- S3). وجدت الدراسات السابقة التي أجريت عبر العديد من نماذج الفئران للرنح الوراثي ، بما في ذلك الرنح العرضي والعديد من المتغيرات من الرنح النخاعي المخيخي ، أن الاضطراب الفسيولوجي في إطلاق PN لا يغير تردده فحسب ، بل يغير أيضًا انتظامه (Kasumu and Bezprozvanny 2012؛ Jayabal et al. 2016؛ Stoyas وآخرون .2020 ؛ Cook و Fields و Watt 2021). قارنا كلاً من معامل التباين (CV) والتباين في الفترات المجاورة (CV2) بين AtmR35X / R35X ؛ Aptx / وفئران التحكم (الشكل 4- التين S4 ، S5). لم يتم الكشف عن أي اختلاف في هذه المعلمات عبر الجنس أو العمر أو التركيب الجيني. تمشيا مع النتائج السلوكية ، تم العثور على خلل وظيفي في المخيخ فقط في AtmR35XR35X ؛ Aptx'mice التي طورت رنحًا وليس في الفئران مع التعبير الجزئي أو الكامل عن ATM أو APTX.

2.5 نقص ATM و APTX يؤدي إلى ضمور المخيخ

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>0. 3 لجميع الأنماط الجينية الأربعة في P460 ، من =10 إلى 20]. علاوة على ذلك ، وجدنا أن حجم المخيخ لم يختلف بين الذكور وأنثى أصغر بنسبة 22 بالمائة في المتوسط ​​عبر الأنماط الجينية في هذا العمر [2- way ANOVA، F (2. 153) =1. 9، p =0. 2]. لذلك ، التنكس العصبي المخيخي في Atm35XR35 × ؛ ترتبط الفئران Aptx * ، التي تبدأ بعد P120 ، بنقص ATM و APTX. وجدنا أن ضمور المخيخ مرتبط بتخفيض انتقائي في عرض الطبقة الجزيئية حيث توجد التشعبات PN (الشكل 5 ب). تمشيا مع التغيرات الزمنية في الحجم الإجمالي للمخيخ وتردد إطلاق PN والسلوك ، عرض ML في Atm35 × R35X ؛ كانت الفئران Aptx * طبيعية في الفئران الأصغر سنًا ولكن عرضها تدريجيًا مع زيادة شدة الرنح 【P400∶120.2 ± 2.1 ميكرومتر ن =5） مقابل 140.2 ± 4.8 ميكرومتر ن =5） ، { {31}} طريقة ANOVA ، فو 42=45. 04 ، ص<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

تعد الالتهابات الجيبية الرئوية المزمنة المرتبطة بنقص المناعة أحد الأسباب الرئيسية للوفاة لدى مرضى AT (Morrell و Cromartie و Swift 1986 ؛ Bhatt and Bush 2014). يرتبط نقص المناعة بالعجز في تكوين الخلايا الليمفاوية B و T التي تم ربطها بعيوب في عمليات إعادة ترتيب جينات مستقبلات المستضد أثناء توليد هذه الخلايا في نخاع العظم والغدة الصعترية ، على التوالي (Staples et al. 2008). تشمل العيوب الناتجة في أعداد الخلايا الليمفاوية الناضجة انخفاضًا في الخلايا التائية المساعدة CD4t والخلايا التائية القاتلة CD8 * (Schubert و Reichenbach و Zielen 2002). لذلك ، قمنا بفحص النسب المئوية للخلايا التائية في الدم المحيطي ومجموعات سكانية فرعية مختلفة في الغدة الصعترية لـ Atm35xR35 × ؛ الفئران Aptx * التي تستخدم مستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCR) وتعبير المستقبل المشترك CD4 / CD8. في الدم المحيطي ، لاحظنا انخفاضًا كبيرًا في الكسر الكلي لخلايا CD3 * T في الفئران مع انخفاض أو غياب تعبير ATM مقارنة بالفئران البرية (الشكل 6). وقد تفاقم هذا الانخفاض بسبب النقص المصاحب لـ APTX. أدت أوجه القصور في أجهزة ATM و APTX إلى خفض الخلايا التائية في الدم المحيطي بنسبة تزيد عن 65 بالمائة مقارنةً بالضوابط من النوع البري. كان تأثير نقص APTX مضافًا إلى تأثير نقص ATM ، مما يشير إلى آلية عمل مختلفة لكل من هذين البروتينين في توليد الخلايا التائية. ارتبط الانخفاض في النسبة المئوية للخلايا التائية في الدم المحيطي في الغالب بانخفاض عدد الخلايا التائية المساعدة CD4 بالإضافة إلى المساعدة (الشكل 6 ب). من المثير للاهتمام ، أن نسبة الخلايا التائية CD8 plus تمت زيادتها فقط في AtmR35X / R35 × ؛ الفئران Aptx * (الشكل 6 ب). مرة أخرى ، لاحظنا تأثيرًا تفاضليًا لنقص ATM و APTX كما يتضح من آثار هذه الطفرات على إجمالي جزء T-cel. نظرًا لانخفاض أعداد الخلايا التائية في الدم ، قمنا بعد ذلك بتقييم تطور الخلايا التائية في الغدة الصعترية. في هذا العضو ، يخضع أسلاف الخلايا التائية المشتقة من نخاع العظم لإعادة ترتيب الجينات TCR متبوعًا بالاختيار الإيجابي لتقييد MHC والاختيار السلبي للنسخات ذاتية النشاط. يمكن اتباع مراحل تطور الغدة الصعترية من خلال مراقبة التعبير عن تعبير CD4 و CD8 في الخلايا التوتية. ينتقل تطور هذا البرنامج التنموي من الخلايا التوتية السلبية المزدوجة (CD4CD8) إلى الخلايا التوتية الموجبة المزدوجة (CD4 * CD8) ثم إلى الخلايا التوتية أحادية الموجبة (CD4 * أو CD8 *). بالإضافة إلى ذلك ، في المرحلة المزدوجة السلبية ، يمكن تحديد أربعة مجموعات سكانية فرعية مختلفة ، بناءً على تعبير CD25 و CD44 ، والمعروفين باسم DN1 (CD44 * CD25) ، DN2 (CD44 * CD25 *) ، DN3 (CD44 CD25 *) و DN4 (CD44 درجة CD25) (جيرمان 2002). تحدث إعادة ترتيب الجينات أثناء تطور الخلية التوتية مرتين - مرة واحدة في مرحلة الخلية التوتية السلبية المزدوجة في مرحلة CD25 * CD44 (Krangel 2009) ثم مرة أخرى في مرحلة الخلايا التوتية الإيجابية المزدوجة قبل التقدم إلى مجموعات CD4 * و CD8t فردية إيجابية (ليفاك وآخرون 1999). تم ربط نقص أجهزة الصراف الآلي بعيوب في كلتا نتيجتي إعادة الترتيب في الفئران (Vachio 2007 ، Hathcock 2013). لذلك ، قمنا بمقارنة نسبة الخلايا في الغدة الصعترية التي تعبر عن علامات سطح الخلية التنموية المختلفة في الفئران التي تعاني من نقص أجهزة الصراف الآلي والتحكم (الشكل 7). AtmR35xR35 × ؛ Aptx و Atm35 × ؛ Aptx ^ لكن ليس AtmR35XR35 ؛ كان لدى الفئران Aptx * نسب مرتفعة بشكل ملحوظ من خلايا CD44 * CD25 و CD44 * CD25t و CD44CD25 * مقارنةً بالنوع البري (الشكل 7 أ) يبدو أن هذه النسب المتزايدة ترجع جزئيًا إلى عائق نضج خلايا CD44CD25t في CD44CD25 خلايا سالبة مزدوجة ، ككسر خلايا CD44CD25 من Atm735xR35 × ؛ Aptx' و Atm35 × plus ؛ يعتبر Aptx'mice أقل بكثير من wildtype (الشكل 7A) ، ومما يثير الاهتمام أن نقص APTX بحد ذاته كان له أكبر تأثير على فقدان خلايا DN4 ، مما يشير إلى أن نقص APTX ، بدلاً من نقص ATM ، هو المسؤول عن هذا التأثير. على حد علمنا ، فإن هذا الاكتشاف يشير لأول مرة إلى APTX في إعادة ترتيب الجينات أثناء عملية إعادة تركيب TCR. بعد ذلك ، نظرنا في نسب الخلايا الزعترية CD4 * CD8t مقارنةً بـ CD4tCD8 و CD4CD8 بالإضافة إلى الخلايا التوتية المفردة الموجبة في هذه السلالات الأربعة المختلفة. بالاتفاق مع نتائجنا في الدم والدراسات السابقة ، وجدنا أن الفئران التي تعاني من نقص في أجهزة الصراف الآلي ولكن ليس الفئران الخاضعة للتحكم عرضت تعبيرًا منخفضًا عن الخلايا التوتية الإيجابية المفردة CD4 * CD8 و CD4CD8 * (الشكل 7 ب). تدعم هذه النتائج دور أجهزة الصراف الآلي في إعادة ترتيب TCR a / δ الجين أثناء تطوير خلية الغدة الصعترية （Bredemeyer et al.2006 ، وهو دور مستقل عن الدور الذي تلعبه APTX في النضج المبكر للخلايا التوتية.

2.7 تتغلب جزيئات القراءة على PTC لاستعادة تعبير ATM

كان الأساس المنطقي الأساسي لإدخال طفرة هراء ذات صلة سريريًا في جين Atm هو إنشاء فأر قابل للاختبار قبل السريري الحرج لمجموعة جديدة من مركبات SMRT. لقد أظهرنا سابقًا أن مركبات SMRT تستعيد إنتاج بروتين ATM في خطوط الخلايا اللمفاوية الأرومية اللمفاوية المشتقة من المريض من خلال التغلب على أكواد الإنهاء المبكر (PTC) الناتجة عن الطفرات غير المنطقية (Du et al. 2013). لإثبات مدى ملاءمة هذا النموذج الحيواني الجديد AT لاختبار مركب SMRT ، اخترنا أن نفحص بشكل مباشر قدرتها على استعادة تعبير ATM باستخدام نهج نباتي يتغلب على التحديات المتعلقة بالتسليم في الجسم الحي (على سبيل المثال ، التوافر البيولوجي ، مسار التسليم ، إلخ). تم قياس تعبير ATM في عينات من الطحال ، حيث يتم التعبير عن ATM عادةً عند مستويات عالية ، والمخيخ ، وهو نسيج هدف رئيسي للاضطراب. هل فضحنا هذه الأنسجة المستأصلة ، التي تم حصادها من أجهزة الصراف الآلي متماثلة اللواقح؟ 35 × و Atm؟ 35 فأرًا إما بمركب SMRT مرشح (GJ103) أو أمينوغليكوزيد معروف سابقًا بخصائص قراءة (G418) ثم قام بقياس تعبير ATM بواسطة طقطقة مناعية لتقييم الاستعادة. في كلا النوعين من الفئران التي تعاني من نقص في أجهزة الصراف الآلي ، تمت استعادة تعبير أجهزة الصراف الآلي باستمرار في الطحال والمخيخ بواسطة كل من G418 و GJ103 (الشكل 8). توضح هذه النتائج أن مركبات SMRT الخاصة بنا يمكن أن تمكن من قراءة ما لا يقل عن 2 من الطفرات غير المنطقية الثلاثة التي تسبب PTCs وتوفر الأساس المنطقي لاختبار الفعالية في الجسم الحي في دراسات المتابعة.