طفرة KLHL3 متجانسة جديدة كسبب لنقص الألدوستيرونية الكاذب المتنحية من النوع الثاني التي تم تشخيصها في وقت متأخر من الحياة

مقدمة المجرد:

نقص الألدوستيرونية الكاذب من النوع الثاني (PHA II) هو اضطراب مندلي، يتميز بحماض فرط بوتاسيوم الدم وانخفاض مستويات الرينين في البلازما، ويرتبط عادةً بارتفاع ضغط الدم. تتسبب الطفرات في WNK1 وWNK4 وCUL3 وKLHL3 في حدوث PHA II، مع طفرات سائدة في WNK1 وWNK4 وCUL3 وإما طفرات سائدة أو متنحية في KLHL3. تم الإبلاغ عن 14 عائلة مصابة بطفرات KLHL3 المتنحية، مع التشخيص في سن 3 أشهر إلى 56 عامًا، عادةً في الأفراد ذوي وظائف الكلى الطبيعية.

الطرق: أجرينا تحقيقات سريرية وجينية على مريض يعاني من ارتفاع ضغط الدم الناتج عن فرط بوتاسيوم الدم واستخدمنا محاكاة الديناميكيات الجزيئية والتعبير غير المتجانس في خلايا COS7 والنشاف الغربي للتحقيق في تأثير طفرة مرض مرشح KLHL3 على تعبير بروتين WNK4.

انقر هنا للحصول على التركيبة العشبية للسيستانش للكلى

النتائج: أظهرت المريضة، وهي امرأة تبلغ من العمر 58-عامًا من عائلة قريبة، ارتفاع ضغط الدم، وحماض فرط بوتاسيوم الدم المستمر المرتبط بألم شديد في العضلات، وتحصي الكلية، وأمراض الكلى المزمنة (CKD)، وأمراض القلب التاجية. العلاج مع هيدروكلوروثيازيد يصحح فرط بوتاسيوم الدم وارتفاع ضغط الدم وآلام العضلات. كشف التحليل الوراثي عن طفرة متجانسة p.Arg431Trp في موضع KLHL3 محفوظ للغاية. اقترحت عمليات المحاكاة انخفاض استقرار البروتين المتحول، وهو ما أكدته اللطخة الغربية. بالمقارنة مع KLHL3 من النوع البري، أدى النقل الجزئي لـ p.Arg - 431 Trp KLHL3 إلى زيادة مستويات بروتين WNK4، مما يُستنتج أنه يسبب زيادة إعادة امتصاص NaCl عبر الناقل الحساس للثيازيد وPHA II.

الاستنتاجات: حتى في المرضى الذين يحضرون في وقت متأخر من الحياة وفي وجود مرض الكلى المزمن، ينبغي الاشتباه في PHA II إذا كانت مستويات الرينين منخفضة والحماض فرط بوتاسيوم الدم وارتفاع ضغط الدم غير كافية لمرحلة مرض الكلى المزمن، وخاصة في ظل وجود تاريخ عائلي مشبوه.

مقدمة

يؤثر ارتفاع ضغط الدم الشرياني الجهازي على أكثر من 1.1 مليار شخص بالغ في جميع أنحاء العالم [1] ويعتبر عامل الخطر الأكثر أهمية القابل للتعديل للمراضة والوفيات الناجمة عن جميع الأسباب في جميع أنحاء العالم [2]. ما يقرب من 90٪ من المرضى البالغين لديهم ما يسمى ارتفاع ضغط الدم الأساسي أو الأساسي مع مسببات الجينات والبيئة متعددة العوامل [2]، في حين يمكن تحديد السبب الكامن وراء ارتفاع ضغط الدم في الباقي. الأسباب الشائعة لارتفاع ضغط الدم الثانوي هي الألدوستيرونية الأولية، وانقطاع التنفس الانسدادي أثناء النوم، وأمراض الكلى المتني، وتضيق الشريان الكلوي [3]. في حالات نادرة، يتم توريث ارتفاع ضغط الدم كصفة أحادية الجينات. عادة ما يعاني المرضى المصابون من انخفاض مستويات الرينين في البلازما، في حين تختلف مستويات الألدوستيرون والكهارل اعتمادًا على المسببات الكامنة [4]. غالبًا ما تظهر الأشكال المندلية لارتفاع ضغط الدم في مرحلة الطفولة أو الشباب. نادراً ما يتم فحص البالغين لارتفاع ضغط الدم أحادي الجين. وبالتالي، فإن انتشاره بين عامة السكان لا يزال غير معروف. في مجموعة مختارة (معايير الاشتمال واحدة على الأقل من: العمر عند بداية المرض أقل من أو يساوي 35 عامًا، أو ارتفاع ضغط الدم المقاوم، أو ارتفاع ضغط الدم مع شذوذات الكهارل، أو شذوذات هرمونية، أو نتائج تصوير غير طبيعية، أو علامات سريرية موحية)، تم فحص 37 جينًا مرشحًا، وتم تحديد المتغيرات المسببة للأمراض أو المحتملة في 33 من 1179 حالة (2.8%) [5].

تركز هذه الدراسة على نقص الألدوستيرونية الكاذب من النوع الثاني (PHA II)، وهو شكل من أشكال ارتفاع ضغط الدم المندلي الذي يتميز بحماض فرط بوتاسيوم الدم وانخفاض مستويات الرينين في البلازما [6]. يُعرف PHA II أيضًا بارتفاع ضغط الدم الناتج عن فرط بوتاسيوم الدم العائلي. تم وصفه لأول مرة في عام 1964 من قبل بافر وبولين في شاب يعاني من ارتفاع ضغط الدم الشديد وفرط بوتاسيوم الدم على الرغم من أن وظائف الكلى طبيعية [7] والذي تم وصفه أيضًا من قبل ستوكس وزملائه [8] وأرنولد وهيلي [9] وأظهروا انخفاضًا في مستوى البوتاسيوم في الدم. رينين البلازما. بعد تقرير فتاة تبلغ من العمر 10-عامًا تعاني من قصر القامة وارتفاع ضغط الدم وفرط بوتاسيوم الدم الشديد واحماض الدم الخفيف والشلل الدوري والرينين المكبوت في عام 1970 بواسطة جوردون وآخرون. [10]، يُشار إلى هذه المتلازمة أحيانًا باسم متلازمة جوردون.

في عام 2001، تم تحديد الطفرات في جينات سيرين-ثريونين كيناز التي لا تحتوي على ليسين (WNK) WNK1 وWNK4 كأسباب لـ PHA II [11]، كما تم تحديد طفرات أخرى في KLHL3 (تشفير شبيه الكلش 3) وCUL3 (تشفير تم وصف جينات كولين 3) في عام 2012 [12، 13]. الأشكال الفرعية PHA II الناتجة عن الطفرات في WNK1 وWNK4 وCUL3 هي اضطرابات سائدة جسمية، في حين يمكن توريث طفرات KLHL3 إما بطريقة جسمية سائدة أو بطريقة جسمية متنحية [12]. يتميز KLHL3 بمجال BTB للمحطة N، متبوعًا بمجال BACK وبنية مروحة ذات ستة شفرات للمحطة C تتكون من ما يسمى بالتكرارات الشبيهة بـ kelch (كما هو موضح في الشكل 1 د، 2 أ). تتجمع طفرات KLHL3 المهيمنة داخل أو بين شفرات المروحة، في حين يتم توزيع الطفرات المتنحية في جميع أنحاء البروتين [12]. الحالات المتنحية أقل شيوعًا من الحالات السائدة؛ في المجمل، تم نشر 21 مريضًا من 14 عائلة مصابة بطفرات KLHL3 المتنحية [12-15] (الجدول 1).

الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء ارتفاع ضغط الدم في PHA II هي زيادة إعادة امتصاص كلوريد الصوديوم عبر الناقل الحساس للثيازيد (Na-Cl cotransporter، NCCT) في النبيبات الملتوية البعيدة للكلية، والعلاج بالثيازيدات يصحح كلا من ارتفاع ضغط الدم وتشوهات الكهارل في المرضى الذين يعانون من PHA II. [16]. باختصار، WNK1 وWNK4 فسفوريلات OSR1 (الجين التأكسدي المستجيب للإجهاد 1) وSPK (Ste20- كيناز غني بالبرولين ألانين)، والذي بعد ذلك يفسفر وينشط NCCT [17، 18]. KLHL3 عبارة عن محول ركيزة لـ ubiquitin ligase CUL3؛ يعمل مركب KLHL3-CUL3 على نشر كينازات WNK وبالتالي يعزز تدهورها [19]. يؤدي فقدان وظيفة ليغاز اليوبيكويتين أو ضعف الارتباط بأنزيمات WNK إلى زيادة وفرة WNK، وزيادة فسفرة NCCT [18]، وزيادة امتصاص كلوريد الصوديوم في النبيبات الملتوية البعيدة. في الأجزاء اللاحقة من النيفرون، يتم تقليل إعادة امتصاص كلوريد الصوديوم عبر ENaC (قناة الصوديوم الظهارية) وإفراز K+ عبر ROMK (قناة البوتاسيوم النخاعية الخارجية الكلوية) [20، 21]. تُظهر فئران خروج الدم KLHL3 نقص تنسج النبيبات الملتوية البعيدة، وزيادة قوية في مستويات WNK1 وWNK4، وزيادة فسفرة OSR1 وSPK وNCC في الكلى. علاوة على ذلك، فإنها تظهر فرط بوتاسيوم الدم، وفرط كلور الدم، والحماض الأيضي [22]. هنا، قمنا بالإبلاغ عن مريض مصاب بـ PHA II المتنحية، ووصفنا الطفرة الجينية الأساسية والفيزيولوجيا المرضية

المواد والأساليب

تم إعداد الحمض النووي لتحضير الحمض النووي وتسلسل سانجر من عينة دم وريدية محيطية باستخدام QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء تسلسل PCR القياسي وتسلسل Sanger ثنائي الاتجاه المباشر للحمض النووي الجينومي باستخدام الاشعال المنشورة لـ KLHL3 [13] وWNK1 وWNK4 [11] وCUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) و CUL 3_9 R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC -3 ′) الاشعال لـ CUL3. تم إجراء تسلسل سانجر في Eurofins Genomics.

محاذاة التسلسل

تم تحديد تسلسلات البروتين المتجانسة باستخدام NCBI Protein BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) وقاعدة بيانات eggNOG (//eggnogdb.embl.de). تشمل التسلسلات المعروضة KLHL3 البشري وأخصائيي تقويم العظام: Homo sapiens (NP_059111.2)، Mus musculus (NP_001349344.2)، Gallus Gallus (XP_015149442.1)، Danio rerio (XP_021328460.1)، سيونا الأمعاء (XP_009862126.1)، ذبابة الفاكهة السوداء (NP_724095.1)، وCaenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . تم تحديد نظائر البشر من خلال الأبحاث الأدبية وتضمين KLHL1 إلى KLHL42 كما هو موضح في الجدول التكميلي 1 عبر الإنترنت (للاطلاع على جميع المواد الإضافية عبر الإنترنت، راجع www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. تمت محاذاة التسلسلات باستخدام الإصدار 2.10.5 من Jalview [24]. كانت بنية المجال من UniProt (Q9UH77، تم الوصول إليها في 13 أبريل 2021) وتم تصورها باستخدام DOG [25].

البلازميدات والطفرات الموجهة للموقع

كانت البلازميدات pTRE2hyg WNK4 وpFN21A KLHL3 هدايا لطيفة من الدكتور شينيتشي أوشيدا (جامعة طوكيو للطب وطب الأسنان). لإدخال طفرة p.R431W، تم تصميم الاشعال باستخدام Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10}) }F) و5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3 ′ (KLHL3_R431W_1R). وتظهر المخلفات المتحولة بالخط العريض. تم إجراء الطفرات الموجهة نحو الموقع باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة نحو الموقع QuikChange مع PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Agilent Technologies، Santa Clara، CA، USA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تسلسل [كدنا] بواسطة سانجر في Eurofins Genomics. تم تحضير البلازميدات باستخدام مجموعة QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.

زراعة الأنسجة، ترنسفكأيشن عابرة، وصمة عار الغربية

تم استزراع خلايا COS7 في DMEM + L- الجلوتامين، و1 0٪ FBS، و1٪ بنسلين / ستربتومايسين (جميع Gibco، Thermo Fisher). بالنسبة للعدوى، تم زرع الخلايا على 6-ألواح بئر بكثافة 1.9 × 105 خلايا/بئر ونمت إلى كثافة 90% تقريبًا. تم نقل الخلايا باستخدام 1 ميكروغرام pTRE2hyg WNK4 و 2 ميكروغرام pFN21A (ناقل فارغ أو نوع KLHL3 البري [WT]) أو KLHL3 R431W cDNA باستخدام Lipofectamine 2 000 (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام اثنين من الحيوانات المستنسخة المستقلة لترنسفكأيشن. بعد ثمانية وأربعين ساعة من ترنسفكأيشن ، تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني بارد وتم إخمادها في 10 مللي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5) و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملم EDTA و 1٪ NP40 يحتوي على كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني الكامل (روش ، ميرك). تم الطرد المركزي للمحلول عند درجة حرارة 20,000 جم لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة، وتم تخزين الطاف عند -20 درجة. تم تحديد تركيزات البروتين في نسختين (قياسية) أو ثلاث نسخ (عينات) بواسطة اختبار BCA (بيرس، ثيرمو فيشر) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تجزئة حوالي 20 ميكروغرام من البروتين الكلي بواسطة SDSPAGE ونقلها إلى غشاء PVDF (1.5 ساعة، 100 فولت). تم حظر الأغشية في الحليب الجاف 2% في TBST. تم إجراء اللطخة الغربية باستخدام مضاد HaloTag للأرنب متعدد النسيلة (Promega #G9281، 1:500، 4 درجات طوال الليل)، يليه الغسيل والحضانة باستخدام IgG المضاد للأرنب IgG (H + L) -HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46) }}، dianova، 1:20، 000، ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة)، والغسيل، والكشف الكيميائي المعزز (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent، GE Healthcare). تمت إزالة البقع باستخدام ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth)، وتم تجميدها في حليب جاف بنسبة 2٪ في TBST طوال الليل عند 4 درجات، وتم تحضينها باستخدام فأر أحادي النسيلة مضاد لـ FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804، Merck، 1:1، {{69} }، 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة)، تليها IgG الحمير IgG المضادة للفأر (H + L) -HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151، dianova، 1:20، 000، 1 ساعة في الغرفة درجة الحرارة)، كشف ECL، تجريد، وحجب على النحو الوارد أعلاه. تم بعد ذلك تحضين البقع باستخدام الأكتين أحادي النسيلة للفأر (Sigma-Aldrich # A2228، Merck، 1: 5000، ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة) وIgG المضاد للفأر IgG للحمار، متبوعًا مرة أخرى باكتشاف ECL. تم قياس كمية النطاقات باستخدام برنامج Image Lab على ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). تم تقسيم شدة النطاقات التي اكتشفها الجسم المضاد لـ HaloTag والجسم المضاد لـ FLAG M2، على التوالي، على شدة النطاقات المقابلة التي اكتشفتها الأجسام المضادة للأكتين - - المضادة. لتقييم مستويات التعبير عن KLHL3، تم نقل الخلايا على النحو الوارد أعلاه ولكن باستخدام 0 ميكروغرام، 0.5 ميكروغرام، 1 ميكروغرام، 2 ميكروغرام، 4 ميكروغرام، و8 ميكروغرام من pFN21A KLHL3 WT أو R431W. تم إجراء الكهربائي للهلام والنشاف على النحو الوارد أعلاه. بالنسبة لفحص مطاردة سيكلوهيكسيميد، تم زرع الخلايا على النحو الوارد أعلاه وتم نقلها كما هو مذكور أعلاه ولكن باستخدام 2 ميكروغرام pFN21A KLHL3 WT أو 4 ميكروغرام KLHL3 R431W. بعد ثمانية وأربعين ساعة من ترنسفكأيشن، تمت إضافة 100 ميكرومتر سيكلوهيكسيميد، وتم إفساد الخلايا بعد النقاط الزمنية المحددة. وكانت خطوات التحليل الإضافية على النحو الوارد أعلاه.

الشكل 2. عمليات محاكاة MD لمجالات WT وp.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch. عرض من أعلى إلى أسفل لمجال Kelch (PDBID: 4CH9)، ملون بواسطة شفرات المروحة (K1 – K6). تتم الإشارة إلى موقع الطفرة بنجمة صفراء، والمنطقة محل الاهتمام باللون الرمادي (البقايا 425-465)، والببتيد WNK4 (غير مدرج في عمليات المحاكاة) شفاف وملون باللون الرمادي. ب الفرق في MSFs في مجال Kelch المعين على العمود الفقري للبروتين. تتم الإشارة إلى موقع الطفرة بنجمة صفراء. يشير اللون الأحمر إلى أجزاء أكثر ديناميكية (أقل استقرارًا) من البروتين. ج RMSD للبروتين الكامل (أعلى)، والمخلفات 425-465 (وسط)، وجيب الربط WNK 4- (أسفل) من التركيب البلوري لثلاث نسخ متماثلة محاكاة مستقلة (خطوط غامقة ومتوسطات تشغيل). د قطع الكمان من hbonds (يسار) ومسافة COM (وسط) بين K3 (البقايا 425-441) و K4 (442-465) - شفرات المروحة والكهرباء الساكنة لجيب الربط (يمين). e التراكب الهيكلي للواجهة K3 – K4 من الإطار النهائي (1.1 μs) لكل نسخة متماثلة (WT، أزرق؛ R431W، رمادي) مع النماذج التجريبية / الأولية (أسود). يتم عرض العمود الفقري للبروتين كرسوم متحركة، مع عرض البقايا 431 كعصي. MSF، متوسط ​​التقلبات المربعة.

محاكاة الديناميكيات الجزيئية

يعتمد نموذج WT على البنية البلورية للأشعة السينية (PDBID: 4CH9) لمجال Kelch البشري المعقد مع جزء الببتيد WNK4 [26]. تمت إضافة الذرات والأغطية الطرفية المفقودة باستخدام الأداة المساعدة psfgen في إصدار الديناميكيات الجزيئية المرئية 1.9.3 [27]. تم إنشاء نموذج KLHL3 المتحول (R431W) باستخدام الإصدار 9.18 من Modeller [28]. كان نطاق البقايا النهائي لكل نظام هو 300–585. تم تحييد N- وC-termini لنماذج WT وR431W بواسطة الأسيتيل وN-methylamidation، على التوالي. تم تعيين حالات البروتون الافتراضية لكل بقايا قابلة للمعايرة وفقًا للتحليل باستخدام PROPKA الإصدار 3.0 [29]. تمت إزالة الببتيد WNK4 من عمليات محاكاة الإنتاج بسبب الانفصال عن KLHL3 بعد عمليات محاكاة الموازنة الأولية.

تم إجراء جميع عمليات المحاكاة باستخدام إصدار حزمة برامج GROMACS 2021 [30]. تم استخدام معلمات مجال القوة CHARMM36m لذرات البروتين [31]. تم وصف الأيونات باستخدام معلمات CHARMM الافتراضية، وتم استخدام نموذج TIP3P للمياه [32]. تم استخدام خطوة زمنية تكامل قدرها 1 fs لخطوة الموازنة الأولية، مع استخدام 2 fs لجميع عمليات المحاكاة اللاحقة. تم تقييد جميع الروابط التي تحتوي على الهيدروجين باستخدام LINCS [33]. تم حساب تفاعلات Van der Waals غير المرتبطة باستخدام إمكانات Lennard-Jones بنصف قطر قطع يبلغ 1.2 نانومتر؛ تم إيقاف تشغيل القوى بسلاسة في حدود 1.2-1.0 نانومتر. تم حساب جميع الكهرباء الساكنة باستخدام طريقة Ewald [34] لشبكة الجسيمات الملساء مع مسافة قطع في الفضاء الحقيقي تبلغ 1.2 نانومتر. بعد المحاكاة الأولية في المجموعة متساوية الحرارة (NVT) ، تم إجراء جميع عمليات المحاكاة اللاحقة في المجموعة متساوية الضغط متساوي الحرارة (NPT) عند درجة حرارة 310.15 كلفن باستخدام منظم الحرارة لقياس السرعة [35] مع ثابت زمني قدره 0.5 ps. تم تطبيق منظم الحرارة بشكل منفصل على البروتين والمذيبات (أي الماء والأيونات)؛ تم استخدام نفس المجموعات لإزالة حركة مركز الكتلة (COM). تم فرض ضغط قدره 1 بار باستخدام إما Berendsen [36] أو Parrinello-Rahman [37] الباروستات بطريقة متناحية مع ثابت زمني قدره 5 ps.

تم حل طرازي WT وR431W في صندوق مكعب بأبعاد أولية تبلغ 1.2 × 1.2 × 1.2 نانومتر 3 . تم تحييد كل نظام باستخدام 150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. بعد التقليل الأولي لطاقة الانحدار الشديد، تمت معايرة كل نظام في مجموعة NVT لمدة 5 نانوثانية مع قيود الموضع على جميع ذرات البروتين. تم إجراء خطوة موازنة لاحقة في مجموعة معاهدة حظر الانتشار النووي لمدة 5 نانوثانية بنفس القيود كما في الخطوة السابقة. تمت إزالة قيود الموضع من جميع السلاسل الجانبية لمحاكاة موازنة 5-ns النهائية. تم إنشاء ثلاثة هياكل أولية من المرحلة النهائية للموازنة لمحاكاة الإنتاج المستقل لنظامي WT وR431W مع إزالة جميع قيود الموضع. تمت محاكاة كل تكرار إنتاج لمدة 1.1 ميكروثانية؛ تمت إزالة أول 0.1 ميكروثانية من التحليل.

لتقييم الاستقرار الهيكلي على مدار عمليات المحاكاة، تم حساب الانحرافات التربيعية لمتوسط ​​الجذر (RMSDs) من التركيب البلوري لذرات C للبروتين بأكمله، بالإضافة إلى واجهة K3 – K4 (البقايا 425-465) و WNK4- جيب الربط (البقايا 339، 355، 360، 386، 402، 407، 432، 449، 451، 481، 498، 528، و 577). تم حساب المتوسطات الجارية لآثار RMSD وتراكبها مع البيانات الأولية.

تم تصور تأثير الطفرة على الاستقرار الهيكلي من خلال حساب الفرق في متوسط ​​التقلبات المربعة لذرات البروتين C، بمتوسط ​​​​على الإطارات والنسخ المتماثلة ورسم الخرائط لبنية البروتين WT. تم إنشاء جميع تصورات البروتين باستخدام ChimeraX [38]. تميز تأثير طفرة R431W على واجهة K3 (البقايا 425-441) إلى K4 (البقايا 442-465) بتحليل رابطة الهيدروجين (H-bond) ومسافة COM بين المجموعتين. تم تقييم الروابط H في كل إطار باستخدام أداة GROMACS gmx hbond، مع قطع المسافة والزاوية بمقدار 3.5 Å و30 درجة على التوالي. تم تقييم مسافات COM بالمثل في كل إطار - تم تصور توزيعات كل من مسافات Hbonds و COM كمؤامرات للكمان. تم حساب المتوسطات على المسارات والنسخ المتماثلة.

تم حساب الكهرباء الساكنة لجيب الربط WNK4- باستخدام g_elpot [39]. تم تقييم المسار الزمني للجهد الكهروستاتيكي في جيب الربط من خلال تحديد حجم كروي يبلغ نصف قطره 8 Å، متمركزًا في المركز الهندسي للمخلفات التي تشتمل على جيب الربط. لتقييم التباين في الكهرباء الساكنة، تم حساب متوسطات الكتلة 50-ns. تم تصور توزيع الإمكانات الكهروستاتيكية داخل جيب الربط لطفرة WT وR431W على شكل مخططات كمان، مع حساب المتوسطات على كتل ومسارات 50-ns.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

احصل على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد للكلى.