إستراتيجية جديدة لفحص المكونات النشطة في Cistanche Tubulosa بناءً على تحليل علاقة تأثير الطيف وصيدلة الشبكة Ⅱ

3. النتائج والمناقشة

3.1. بصمات HPLC

3.1.1. التحقق من صحة طريقة

أظهر التحقق من صحة طريقة HPLC أن الانحراف المعياري النسبي (RSD) لدقة الطريقة وإمكانية التكاثر والاستقرار كان أقل من 2.85 بالمائة لمنطقة الذروة النسبية (n = 11) و 0. 77 بالمائة لوقت الاحتفاظ النسبي (ن = 11). ظهرت دقة نفس العينة في النطاق 0. 0 5 - {{1 0}. 77 بالمائة للوقت النسبي و 0. 28– 2.7 0 بالمائة للمساحة النسبية للقمم المشتركة. كانت قابلية تكرار التجربة في نطاق 0. 0 3 - 0. 20 بالمائة للوقت النسبي و 0.23 - 2.59 بالمائة للمنطقة النسبية للقمم المشتركة. كان استقرار العينة 0.09-0.24 في المائة لوقت الاحتفاظ النسبي و 0.75 - 2.85 في المائة للمنطقة النسبية للقمم المشتركة. أشارت هذه النتائج إلى استيفاء البصمة المحددة. العلاقات الخطية لحمض الجينيبوسيدك ،إشنكوسايد, أكتيوسيد, توبولوسيد أ، وإيزوكتيوسيدموضحة في الجدول S4. كانت قيمة R square 1. 0000 ، مما يشير إلى خطية جيدة. أظهرت نتائج استرجاع العينات أن متوسط ​​المستردات من حمض الجينيبوسيدك ، إشنكوسايد ،أكتيوسيد, توبولوسيد أ، وإيزوكتيوسيدكانت 100.37 في المائة ، و 103.59 في المائة ، و 98.46 في المائة ، و 100.81 في المائة ، و 101.19 في المائة ، وكان تحديد وضع اللاجئ لاسترداد العينات أقل من 2.68 في المائة.

انقر هنا للحصول على مزيد من التفاصيل حول Cistanche Active Components

3.1.2. منطقة الذروة (PA) ووقت الاحتفاظ النسبي (RRT)

يتم عرض بصمات الأصابع المرجعية وبصمات الأصابع من HMs و WEs و HRs من 11 دفعة من C. tubulosa في الشكل 2. تم تحديد أحد عشر قممًا ، والتي أظهرت فصلًا جيدًا ودقة ، على أنها قمم مشتركة بين HMs و WEs و HR. تم التعرف على المركبات القياسية الخمسة على أنها حمض جينيبوسيدك (A2) ،إشنكوسايد(A8),أكتيوسيد (A9), توبولوسيدأ (أ 10) وإيزوكتيوسيد(أ 11). المركب القياسي ،إشنكوسايد، التي كانت موجودة في جميع مخططات الكروماتوجرام (متوسط ​​زمن الاحتفاظ 12. 86 دقيقة) مع منطقة ذروة مناسبة وثبات جيد ، تم اختيارها باعتبارها ذروة مرجعية واستخدامها لحساب أوقات الاستبقاء النسبية (RRTs) للعشرة الأخرى القمم المشتركة. تقع فرق الرد السريع لهذه الأشكال المختلفة في النطاق 0 .16–1.51. تم سرد PA ومعامل التباين (CV بالمائة) لهذه القمم الشائعة في الجداول S5-S7. من البيانات ، قيم النسبة المئوية للسيرة الذاتية لـ PA بأشكال مختلفة هي 25.78 بالمائة - 142.02 بالمائة ، 23.36 بالمائة - 150.38 بالمائة ، و 28.91 بالمائة - 112.78 بالمائة من HMs و WEs و HRs ، على التوالي. تكشف هذه النتائج عن اختلافات كبيرة في تركيز كل منهماCistanche tubulosaمركب بين الأشكال المختلفة. تظهر بصمات الأصابع HM و WE و HRs في الشكل 3.

الشكل 2 الشكل 2 بصمات HPLC للعينات القياسية

3.1.3. محتويات HMs و WEs و HRs

خمسة مكونات قياسية لـC. tubulosaتم قياس. يتم عرض محتويات المكونات الرئيسية في الجدول 1. والمقارنة بين HMs و WEs و HRs مبينة في الجدول 2 والشكل 4. PhGs في C. tubulosa نشطة بيولوجيًا ولكنها حساسة للحرارة. يمكن استخلاص المكونات الحساسة للحرارة المذابة في الماء بكفاءة باستخدام طريقة معقولة. بشكل عام ، يتم استخراج Cistanche herba بالماء ثم تبخيرها في محلول مركز للتحليل الكيميائي التالي [26 ، 27 ، 30]. بعد الاستخلاص والتركيز ، تم استخدام تقنية التجفيف بالرش وتم تعديل الإجراء من المادة السابقة. تمت إزالة الماء بسرعة من البخار السائل ، ثم تم الحصول على مقتطفات جافة من المواد الخام من النباتات. في هذه الخطوة ، تعتبر إضافة مالتوديكسترين حاملة شائعة لتعزيز التشتت وإطالة وقت التخزين. من خلال سلسلة من عمليات التصنيع ، تم بعد ذلك ضغط النباتات العشبية في شكل حبيبات مع إضافات. لم يتم تضمين هذه الخطوة لإضافة السواغات في التجربة. بشكل عام ، تتضمن عملية الإنتاج لدينا الاستخراج والتركيز والتجفيف بالرش ، كما هو موضح في القسم 2.2 ، بالتوازي مع عملية إنتاج الحبيبات. من أجل إنتاج هذه المنتجات شبه النهائية ، يجب اتباع الخطوات الثلاث المذكورة أعلاه. يتضمن إجراء تشكيل WEs التركيز والتجفيف بالرش ، مما يؤدي بسهولة إلى فقدان المكونات الحساسة للحرارة ، ولكن يتم الحصول على الموارد البشرية بعد استخراج وتجفيف HMs. نتساءل عما إذا كان من الممكن أن تظل المكونات النشطة في الموارد البشرية. وفقًا لنتائجنا ، انخفض محتوى فيرباسكوسايد بشكل كبير من HMs إلى WEs و HRs (وعلى التوالي). يتم فحص الثبات الحراري لـ verbascoside من خلال مراقبة التغيرات في منطقة الذروة من خلال HPLC أثناء عملية التسخين. بعد التسخين لمدة 4 ساعات ، يتم ترك 41.6 بالمائة من فيرباسكوسايد. يشير إلى أن فيرباسكوسيد حساس للحرارة [31]. ظلت Isoacteoside و tubuloside A و echinacoside في WEs مستقرة بعد إجراءات المعالجة المعقدة. أثناء عملية التجفيف طويلة الأمد ، أظهر تراكم الدرجات الحمضية انخفاضًا ملحوظًا ، والذي يمكن أن يُعزى إلى التدهور الحراري لهذه المكونات الحساسة للحرارة [32]. من حيث المكونات المستهدفة الأخرى ، لم تختلف HR و WE بشكل كبير باستثناء verbascoside. سيمكننا فهمنا لهذا الاختلاف من تطوير معايير جودة أفضل للأعشاب الثمالة في المستقبل وتطويرها في المنتجات.

الجدول 1 محتويات 11 دفعات من C. tubulosa

الجدول 2 مقارنة محتويات المكونات الرئيسية (ن = 11).

,

الشكل 4 تحديد محتوى خمسة مكونات من أشكال مختلفة (ن = 11). ، ns: غير مهم.

3.1.4. تحليل تشابه بصمات الأصابع

تم تقييم أوجه التشابه بين مجموعات C. tubulosa الثلاث. كانت قيم تشابه المواد العشبية - المياه المستخلصة ، والمواد العشبية - المخلفات العشبية ، ومستخلص الماء - بقايا الأعشاب في النطاقات 0. 943 - 0. 994، 0. 847– { {9}}. 995 ، و 0. 938-1. 000 ، على التوالي (الجدول 3).

الجدول 3 أوجه التشابه بين HM-WE و HM-HR و WE-HR لـ 11 دفعة من C. tubulosa.

3.2 نتائج اختبار نشاط مضادات الأكسدة

تم تحديد الأنشطة المضادة للأكسدة لأشكال مختلفة من C. tubulosa باستخدام DPPH ، ومقايسات قدرة الكسح ، وتم عرض النتائج ذات الصلة في الشكل 5. في الجدول S8 ، كانت نطاقات DPPH ، ونتائج فحص قدرة الكسح { {2}}. 0 4–37.8 0 ، 0.98–843.90 ، 0.32–27.65 مجم / مل لثلاث أشكال مختلفة من بين 11 دفعات من C. tubulosa. في ثلاثة اختبارات نشاط مضاد للأكسدة ، أظهر HMs و WEs نشاط تثبيط وثيق ، بينما أظهرت HRs أضعف تثبيط.

تم العثور على WEs المجففة بالرش لإظهار أنشطة كبيرة حتى في تركيزات منخفضة. أشار تقرير سابق إلى أن Vernonia amygdalina WE المجففة بالرش قد حققت 5 0 في المائة من تثبيط الكسح عند 0.17 مجم / مل [33]. إن تطبيق أوقات الاستخراج الطويلة ودرجات الحرارة المرتفعة سيف ذو حدين. من ناحية أخرى ، تعمل زيادة وقت الاستخراج ودرجة حرارة مدخل تجفيف الرذاذ على تحسين الإنتاجية والكفاءة. علاوة على ذلك ، تحقق المستخلصات نشاطًا قويًا مضادًا للأكسدة وتركيزات أعلى من المكونات البيولوجية مقارنة بتلك النباتات [34]. من ناحية أخرى ، فإن الهواء الداخل شديد الحرارة يحط من المركبات النشطة بيولوجيًا. أدت درجات حرارة مدخل الهواء المرتفعة إلى فقدان نشاط مستخلص بايدنس بيلوسا المضاد للأكسدة وعُزيت إلى انخفاض في المركبات الفينولية [35]. تتوافق النتائج الحالية مع التقرير المذكور أعلاه. على سبيل المثال ، أظهر WE في S6 قدرات تثبيط جذرية أضعف من كل من HM و HR. علاوة على ذلك ، أظهر HR في S5 قدرات تنظيف DPPH وأنيون superoxide أقوى من HM و WE. يتكون هيكل PhGs من روابط جليكوسيدية ومجموعات أسيتيل تتحلل بالماء بسهولة تحت تأثير إنزيمي أو تتحلل في درجات حرارة عالية. قد تكون ردود الفعل هذه مسؤولة عن انخفاض في بعض المكونات الرئيسية أثناء الإنتاج على نطاق واسع. ومع ذلك ، قد يؤدي التحلل المائي أو الأزمرة لمكونات معينة إلى تسريع تخليق المكونات الأخرى. هذه التحولات شائعة عند معالجة أعشاب السيستان [36-38]. إن مادة PhGs قابلة للذوبان في الماء تعني أنه يمكن استخدام معظم المكونات البيولوجية عن طريق استخراج المياه. استمر الجدل القائل بأن غالبية المكونات النشطة في WEs على مدى عقود ، لذلك يبدو من المعقول افتراض أنه يمكن التخلص من المواد المتبقية الرطبة بعد الاستخراج. ومع ذلك ، فمن غير الصحيح اعتبار الموارد البشرية من C. tubulosa كنفايات. يشير الباحثون إلى أن PhGs غير مستقرة ، وأنها عرضة للتحلل الأنزيمي أو التحلل المائي [39]. قد تقدم تفاعلات التحلل المائي أو المشابهات التي تساهم في انخفاض المكونات البيولوجية داخل الطب النباتي أثناء المعالجة في نفس الوقت فرصًا جديدة لاستغلال الموارد البشرية. من خلال تحويل طرق الاستخراج التقليدية ، يمكن تطوير المخلفات الطبية واستخدامها بشكل أكثر فعالية. تم إجراء التحلل المائي الأنزيمي لتحويل بقايا الجينسنغ باناكس إلى سكريات أحادية. زادت غلة السكريات والجينسنوسيدات ، مثل السكر وحمض السكسينيك وعديد السكاريد الجينسنغ والجينسنوسيدات [40]. يتم إعادة استخراج مخلفات Sophora flavescens بواسطة الموجات فوق الصوتية باستخدام أسيتات الإيثيل [41]. تم تلخيص التقنيات المحدثة لاستخدام المخلفات العشبية بواسطة Huang et al. [42].

بناءً على نتائج PLSR و BCA ، تم فحص القمم الخمسة الأولى من الأشكال المختلفة باستخدام مقايسات DPPH وأنيون الأكسيد الفائق وجذر الهيدروكسيل لتحديد أهم القمم. النتائج موضحة في مخطط فين (الشكل 7). A2 و A6 و A8 و A10 هي القمم المشتركة التي تشترك فيها HM و WE و HR (الشكلان 7 (أ) و 7 (ج)) في مقايسات الكسح الفائق للأكسيد وجذر الهيدروكسيل ، في حين أن HM و WE و حصة الموارد البشرية لا قمم مقايسة DPPH. وفي الوقت نفسه ، تُظهر نماذج BCA أن A1 و A2 و A3 و A6 هي القمم المشتركة بين HM و WE و HR (الأشكال 7 (د) –7 (و)). والجدير بالذكر أن التداخلات في مخطط Venn تشير إلى أن نموذج BCA يبدو أكثر ملاءمة من نموذج PLSR ، حيث يظهر النموذج السابق مزيدًا من التكرار. تم تحليل معاملات نموذج BCA وقيم IC قدرة مضادات الأكسدة عبر RDA. نظرًا لأن RDA الموضح في الشكل 8 ، فإن A1 و A3 و A6 من HM و HR مرتبطة بشكل إيجابي بمؤشرات مضادات الأكسدة ، باستثناء أن A3 يرتبط سلبًا بقدرة الكسح الجذري للهيدروكسيل. A1 و A6 من WE لديهما علاقات قوية مع DPPH وأنيون الأكسيد الفائق. تُظهر قمم A6 التي لوحظت من الأشكال المختلفة أقوى اتصال بجذور DPPH وأنيون الأكسيد الفائق وجذور الهيدروكسيل. يُظهر A1 و A3 أيضًا اتصالًا مشابهًا.

الشكل 7

مخططات فين لنموذج PLSR و BCA: (أ) مقايسة DPPH. (ب) مقايسة الكسح. (ج) تم تحليل مقايسة الكسح بواسطة نموذج PLSR. (د) مقايسة DPPH. (هـ) مقايسة الكسح. (و) تم تحليل مقايسة الكسح بواسطة نموذج BCA. كان القسم المتداخل هو جزء القمم الشائعة بواسطة HM و WE و HR.

3.4. التحليل القائم على علم الصيدلة الشبكي

3.4.1. بناء شبكة التصوير المقطعي المحوسب

تم الحصول على إجمالي 4359 هدفًا متعلقًا بالنشاط المضاد للأكسدة من قاعدة بيانات GeneCards وقاعدة بيانات OMIM. في الوقت نفسه ، تم فحص المكونات النشطة من قاعدة بيانات TCMSP وقاعدة بيانات SwissTargetPrediction. بعد ذلك ، تم جمع 198 هدفًا وتوحيدها من خلال قاعدة بيانات UniPort. كان هناك 159 جينًا مستهدفًا مشتركًا بين المكونات النشطة والأمراض المرتبطة بمضادات الأكسدة (انظر الشكل S1). تم إنشاء شبكة التصوير المقطعي المحوسب لتوضيح العلاقة بين المركبات والأهداف الجينية الرئيسية (الشكل 9).

الشكل 9 شبكة CT. أظهرت الشبكة الارتباط بين المكونات النشطة والأهداف الجينية الرئيسية.

3.4.2. بناء شبكة PPI وفحص الأهداف الرئيسية

تم تصور PPI باستخدام قاعدة بيانات STRING (الشكل 10). تضمنت الشبكة 159 عقدة و 2528 حافة. في شبكة التفاعل بأكملها ، قد تكون المكونات المتصلة أو العقد التي تحتوي على المزيد من النقاط المستهدفة هي المكون الرئيسي أو الجين المستهدف الذي يلعب دورًا مضادًا للأكسدة في C. tubulosa. تم تنزيل النتائج وإدخالها في Cytoscape للتصور. كلما زادت قيمة DC ، زاد قتامة اللون ، وزادت قيمة النتيجة المجمعة ، زادت سماكة الحافة. وجدنا أن RAC-alpha serine / threonine-protein kinase (AKT1) ، interlukin -6 (IL6) ، عامل نخر الورم (TNF) ، وعامل النمو البطاني الوعائي A (VEGFA) كانت في موقع مركزي (الشكل 11) ، مشيرة إلى أنها كانت أهدافًا رئيسية عندما تمارس المكونات النشطة تأثيرًا مضادًا للأكسدة. يُذكر أن إشنكوسايد يقلل من الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا عن طريق تنظيم كينازات البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK) و AKT وأشكالها الفسفرة [43]. تكهن الباحثون بأن التأثير المضاد لمرض السكر للجليكوسيدات لنبات المطثية النبيلة قد يكون بسبب نشاط مضادات الأكسدة لـ PhGs عن طريق تقليل تنظيم السيتوكينات المسببة للالتهابات ، مثل IL -6 و TNF- [44]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يضعف إشنكوسايد نمو خلايا سرطان المبيض عن طريق تقليل تنظيم التعبير عن VEGFA لتثبيط تكوين الأوعية ، والذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بنظام ROS لـ ROS الذي يحفز التعبير عن إشارات VEGF [46].

الشكل 10 شبكة PPI.

3.4.3. تحليل الإثراء وإنشاء شبكة CTP

تعمل المركبات المضادة للأكسدة المحتملة على العديد من الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك BP و CC و MF. في الشكل 12 (أ) ، يتم عرض أفضل 10 مسارات. استجابت الأهداف المتوقعة من شبكة PPI بشكل أساسي للعديد من العمليات البيولوجية ، مثل المركبات الحلقية العضوية ، والمحفزات الغريبة الحيوية ، والمواد غير العضوية ، ومستويات الأكسجين ، والتنظيم الإيجابي لحركة المكونات الخلوية. أظهر تحليل المكونات الخلوية أن الجينات كانت مرتبطة بشكل أساسي بطوف الغشاء ، والمصفوفة خارج الخلية ، وتجويف الحبيبات الإفرازية ، ومعقد منظم النسخ ، والجزء القمي من الخلية. تشارك هذه الأهداف أيضًا في العديد من الوظائف الجزيئية ، بما في ذلك ارتباط عامل النسخ المرتبط بالحمض النووي ، ونشاط تجانس البروتين ، والربط الخاص بمجال البروتين ، وربط مستقبلات السيتوكين.

الشكل 12 تحليل التخصيب: (أ) تحليل التخصيب GO. (ب) تحليل التخصيب KEGG.

للتحقيق في الوظائف البيولوجية لهذه المحاور الرئيسية ، تم إجراء تحليل لتخصيب المسار. من نتائج التخصيب KEGG ، تم رسم مخطط فقاعي لإظهار أفضل 20 مسارًا. كلما كانت البقعة أكبر ، تم تضمين المزيد من الجينات في المسار. كما هو مبين في الشكل 12 (ب) ، كانت المسارات الرئيسية لـ C. tubulosa مرتبطة بمسارات السرطان ، والدهون وتصلب الشرايين ، ومسار إشارات AGE-RAGE في مضاعفات مرض السكري ، والتسرطن الكيميائي - تنشيط المستقبلات ، ومسار إشارات MAPK. تم دراسة تأثير C. tubulosa على موت الخلايا المبرمج والتوازن الخلوي الأكسدة والاختزال. تشير البيانات إلى أن C. tubulosa يمكن أن يكون مرشحًا واعدًا للعلاج المضاد لسرطان القولون [47]. تم العثور على مستخلص C. Deserticola في كبار السن [48].

يوضح الشكل 13 العلاقة بين المسارات والأهداف ذات الصلة والعلاقة بين الجينات المستهدفة المتداخلة والمكونات النشطة بيولوجيًا لـ C. tubulosa. تم إنشاء رؤية عالمية لشبكة CTP ، والتي تتكون من 12 مكونًا و 159 هدفًا و 20 مسارًا. تمت مشاركة معظم الأهداف بواسطة المركبات النشطة المرشحة. كانت هذه المكونات النشطة المرشحة ذات درجات الترابط العالية مسؤولة عن الترابط العالي لشبكة CTP ، وخاصة الكيرسيتين (الدرجة = 131). تم تعيين غالبية الأهداف ، مثل AKT1 و IL6 و TNF و VEGFA ، إلى مسارات KEGG المرتبطة بمسارات السرطان.

الشكل 13 شبكة CTP.

4 - نتائج

في هذه الدراسة ، بحثنا في المقام الأول في المواقف المعقدة عند النظر في علاقات تأثير الطيف بين HM و WE و HRC. tubulosa. بصمات HPLC وفحوصات مضادات الأكسدةتم استخدامها لتحديد الاختلافات بين Hs و WEs و HRsC. tubulosa. وفقًا لبصمات HPLC ، كانت 11 قمة شائعة بين 11 دفعة من Hs و WEs و HRs. حمض الجينيبوزيد ،إشنكوسايد, فيرباسكوسايد, توبولوسيد أ، وإيزوكتيوسيدتم تحديدها من بين هذه القمم. تم تحديد محتويات هذه المكونات الخمسة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التأثيرات المضادة للأكسدة لـC. tubulosaتباينت Hs و WEs و HR بسبب التعديلات في التركيبات الكيميائية الناتجة عن ظروف التصنيع المعقدة. بناءً على نماذج إحصائية متنوعة ، أشارت دراسة علاقة تأثير الطيف إلى أن ذروة A6 قد تكون العنصر الأكثر حسماً بين الأشكال الثلاثة لـC. tubulosa. استندت الدراسة إلى علم الصيدلة الشبكي لاستكشاف الآليات المحتملة لـC. tubulosaعلىمضادات الأكسدةمن خلال فحص المركبات والتنبؤ بالأهداف الرئيسية وإنشاء الشبكات وإجراء تحليل التخصيب. توفر نتائجنا أساسًا نظريًا لإعادة تدوير المخلفات العشبية وإمكاناتC. tubulosaفي علاجالأمراض المرتبطة بمضادات الأكسدة.