ألجينات أوليغوساكاريد يخفف من شيخوخة القلب التي يسببها د-الجالاكتوز عن طريق تنظيم وظيفة الميتوكوندريا عضلة القلب والنزاهة في الفئران

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص

الشيخوخة عامل خطر حاسم لتطور أمراض القلب والأوعية الدموية المرتبطة بالعمر. لذلك ، يجب دراسة الآليات الجزيئية للشيخوخة والتدخلات الجديدة لمكافحة الشيخوخة بعمق. يمتلك الجينات قليل السكاريد (AOS) أنشطة دوائية عالية وتأثيرات مفيدة. تم إجراء دراستنا للتحقق مما إذا كان يمكن استخدام AOS كدواء مضاد للشيخوخة للتخفيف من شيخوخة السيارة. تم إنشاء فئران الشيخوخة C57BL / 6J الناتجة عن D-galactose (D-gal) عن طريق الحقن تحت الجلد لـ D-gal (200 مجم-كجم-يوم) لمدة 8 أسابيع. تم إعطاء AOS (50،100 و 150 مجم ؛ كجم / لتر) داخل المعدة خلال الأسابيع الأربعة الماضية. نتيجة لذلك ، منع AOS اختلال وظائف القلب في الفئران التي يسببها شيخوخة D-gal ، بما في ذلك جزء القذف المحفوظ جزئيًا (نسبة EF في المائة) والقصور الجزئي (نسبة FS).فوائد القسطمنع AOS التنظيم الأعلى الناجم عن D-gal للببتيدات المدرة للصوديوم A (ANP) ، والببتيد الناتريوتريك للدماغ (BNP) وعلامات الشيخوخة p53 و p21 بطريقة تعتمد على الجرعة. لمزيد من استكشاف الآليات المحتملة التي تساهم في التأثير الوقائي المضاد للشيخوخة لـ AOS ، تم تحليل حل وسط الميتوكوندريا المرتبط بالعمر. أشارت بياناتنا إلى أن AOS يخفف من شيخوخة القلب التي يسببها D-gal من خلال تحسين biogen-esis الميتوكوندريا ، والحفاظ على سلامة الميتوكوندريا وتعزيز الإزالة الفعالة للميتوكوندريا الضعيفة. قلل AOS أيضًا من إنتاج ROS وحالة الإجهاد التأكسدي ، مما أدى بدوره إلى زيادة منع الميتوكوندريا القلبية من التدمير. تُظهر هذه النتائج معًا أن AOS قد يكون عاملًا علاجيًا فعالًا للتخفيف من شيخوخة القلب.

الكلمات الدالة

سكاريد الجينات ، شيخوخة القلب ، د-جالاكتوز ، الميتوكوندريا ، الإجهاد التأكسدي

1|المقدمة

يمكن تعريف الشيخوخة على نطاق واسع بأنها تراكم الضرر الخلوي المعتمد على الوقت ، والذي يتسبب في التدهور الوظيفي التدريجي للأنسجة والأعضاء. بشكل عام ، تشمل التغيرات المرتبطة بالعمر في القلب تضخم البطين الأيسر وزيادة تليف عضلة القلب وقصور القلب.مستخلص سيستانش المضاد للإشعاعالشيخوخة عامل خطر حاسم لتطور أمراض القلب والأوعية الدموية المرتبطة بالعمر ، مما يؤدي إلى زيادة ملحوظة في انتشار أمراض القلب والأوعية الدموية بين السكان المسنين .23 وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات علاج أكثر فعالية لعلاج قصور القلب الناجم عن الشيخوخة. .

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

الجينات هو عديد السكاريد الطبيعي المشتق من الأعشاب البحرية المستخرج من الطحالب البنية. يتم إنتاج الألجينات قليلة السكاريد (AOS) عن طريق إزالة بلمرة الجينات ، والتي لها مزايا فريدة متعددة مثل الذوبان في الماء ، وغير السامة ، وغير المناعي ، والقابل للتحلل البيولوجي. تمارس AOS أنشطة بيولوجية واعدة. يمتلك هذا السكاريد القليل من الحماية للأعصاب ، ونقص شحميات الدم ، ومضاد للأكسدة ، و "مضاد للالتهابات ،" مضاد للتجمع ، "مضاد للأورام ، 10 خصائص مضادة للبكتيريا وتنظيم المناعة" ، بالإضافة إلى قمع السمنة ، وأنشطة المنتج النهائي للجليكيشن المتقدمة (AGE) .4 والجدير بالذكر أنه لم يتم استكشاف أي دراسات حول قدرة AOS على الحماية من شيخوخة القلب.

الميتوكوندريا عبارة عن عضيات ذات غشاء مزدوج وتؤدي وظائف متعددة في الطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي. تولد الميتوكوندريا القلبية 90 في المائة من ATP وتلعب دورًا حيويًا في الحفاظ على صحة القلب.cistanche هيربايعد الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تسريع عملية الشيخوخة في الثدييات ، أحد أكثر آليات الشيخوخة أهمية. التحكم عن طريق الالتهام الذاتي ، وانخفاض إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، والتغيرات في ديناميات الميتوكوندريا ، وزيادة تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وتراكم موعات في الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA). مزيج من الضرر المتزايد وتقليل التجديد في الميتوكوندريا قد يساهم في نهاية المطاف في عملية الشيخوخة. 20- لضعف القلب المرتبط بالعمر

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

تم استخدام نماذج حيوانية الشيخوخة التي يسببها D-galactose (D-gal) على نطاق واسع لدراسة آليات الشيخوخة وتأثيرات مكافحة الشيخوخة للأدوية. عملية الشيخوخة وتسبب في نهاية المطاف تغييرات هيكلية ووظيفية في نظام القلب والأوعية الدموية .22 لذلك ، في الدراسة الحالية ، قمنا بتأسيس نموذج شيخوخة الفئران التي يسببها D-gal لتقييم منهجي للنشاط المضاد لشيخوخة القلب في AOS وإجراء مزيد من التحقيق الآلية الكامنة المحتملة.

2|المواد والأساليب

2.1|الأدوية والكواشف

تم الحصول على D-galactose من Sigma-Aldrich. تم شراء AOS من شركة Qingdao BZ Oligo Biotech Co.، Ltd. تم الحصول على مجموعة مقايسة Malondialdehyde (MDA) من معهد Jiancheng Bioengineering. تم الحصول على الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرنب ضد BNP و PGC -1 a و p 67- phox و gp 91- phox من Abcam Inc. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر ضد p53 من شركة Abcam Inc. تم الحصول على الأجسام المضادة متعددة النسيلة من الأرانب ضد بيكلين -1 و p-mTOR من تقنية تشوير الخلية. تم الحصول على الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرنب ضد p21 والجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ضد p 47- phox من Santa Cruz Biotechnology، Inc. تم شراء أجسام أرنب متعددة النسيلة ضد mTOR من مجموعة Proteintech Group، Inc. و JC {{14} } تم شراء مجموعة الفحص المحتملة لغشاء الميتوكوندريا من شركة Beijing Solarbio Science & Technology Co.، Ltd. تم الحصول على مجموعة TIANamp Genomic DNA kit من Tiangen Biotech (Beijing) CO.، LTD.cistanche نمو القضيبتم شراء مجموعة أدوات فحص PCR لـ Mouse mtDNA من Beijing Tiandz Gene Technology CO.، Ltd. تم شراء Goat Anti-Rabbit IgG (H ＋ L) (peroxidase / HRP مترافق) و Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (peroxidase / HRP مترافق) من Elabscience Biotechnology Co.، Ltd. تم شراء جميع المواد الكيميائية والكواشف الأخرى من الموردين التجاريين القياسيين دون تحديد خلاف ذلك.

2.2|الحيوانات

تم الحصول على ذكر 8- فئران C57BL / 6J عمرها أسبوع (20 ± 2 وزن جسم ، ن =40) من شركة Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co، LTD. تم إطعام جميع الفئران بنظام غذائي عادي وتم إيواؤها في دورة مظلمة لمدة 12- ساعة / 12- ساعة تحت ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في مركز الحيوانات المختبرية بالقسم الطبي بجامعة تشينغداو . تتوافق جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات مع "دليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر" الذي نشرته المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة وسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام حيوانات المختبر. تمت الموافقة على بروتوكولات الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات بجامعة تشينغداو (رقم الموافقة: QYFYWZLL25840).

2.3|نموذج الشيخوخة المستحث بـ D-gal وإدارة الدواء

تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى خمس مجموعات (ن =8 كل مجموعة): مجموعة التحكم ، D-gal ، D-gal بالإضافة إلى جرعة منخفضة من AOS (D-gal plus AOS -50) ، D-gal plus جرعة متوسطة من مجموعات AOS (D-gal plus AOS -100) و D-gal بالإضافة إلى جرعة عالية من AOS (D-gal plus AOS -150). تم إحداث الشيخوخة في الفئران C57BL / 6J من خلال الحقن تحت الجلد لـ D-gal (200 مجم / كجم ، Sigma-Aldrich) لمدة 8 أسابيع. بعد أربعة أسابيع من حقن D-gal ، تمت معالجة مجموعات D-gal plus AOS -50 و D-gal plus AOS -100 و D-gal plus AOS -150 داخل المعدة باستخدام AOS ( 50 و 100 و 150 مجم-كجم 2- دل) لمدة 4 أسابيع أخرى ، على التوالي. تلقت مجموعة التحكم وفئران مجموعة D-gal إدارة داخل المعدة لمحلول ملحي مكافئ.

2.4|تخطيط صدى القلب

تم إجراء تخطيط صدى القلب على الفئران المخدرة باستخدام Vevo2100 (VisualSonics) مع محول طاقة 30- ميغاهرتز في نهاية التجربة. تم قياس المعلمات التالية كما هو موضح سابقًا: جزء طرد البطين الأيسر (EF) وتقصير كسور البطين الأيسر (FS) .25

2.5|التحليل النسيجي

تم إصلاح عينات القلب بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة ثم دمجها في البارافين وتقطيعها إلى 4- طبقات سميكة. تم استخدام تلطيخ H&E و Masson ثلاثي الألوان لتصور بنية القلب والتليف القلبي ، على التوالي. تم فحص الشرائح تحت مجهر ضوئي مقلوب (TE 200 ، نيكون). تم تحليل البيانات المقابلة وحسابها من قبل المحققين الذين أعموا عن تعيين مجموعة العلاج.

2.6|المجهر الإلكتروني للإرسال

تم تحديد البنية التحتية للميتوكوندريا باستخدام التحليل المجهري الإلكتروني. بعد الدراسة السابقة ، تم قطع 26 من أنسجة البطين الأيسر الطازج إلى كتل 1 مم وثبتها في 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد لمدة ساعتين عند 4 درجات. بعد التثبيت اللاحق في 1 في المائة من رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، تم تجفيف أنسجة البطين الأيسر ثم دمجها في الراتنج. تم جمع المقاطع المسلسلة فائقة الرقة (30-40 نانومتر) على شبكات نحاسية وتم تلطيخها أخيرًا بـ 0. 5٪ يورانيل أسيتات تليها 1٪ سيترات الرصاص. تم تحديد تحليل البنية التحتية للمقاطع الملطخة تحت المجهر الإلكتروني للإرسال Tecnai G 2 12 (شركة FEI).

2.7|تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP)

تم قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام التلوين المناعي {{0} JC وقياس التدفق الخلوي. تم استخدام قوالب القلب الطازجة لتحضير المقاطع المجمدة أو استخراج الميتوكوندريا. تم استخدام المقاطع المجمدة لتلوين JC {2}} الفلوري المناعي وفقًا لبروتوكول التصنيع.فوائد الصلصا cistancheتم تحديد الفلورة عند الإثارة / الانبعاث 485/580 نانومتر (أحمر) والإثارة / emis-sion 485/530 نانومتر (أخضر) باستخدام مجهر مضان.

بالإضافة إلى ذلك ، تم عزل الميتوكوندريا من أنسجة القلب الطازجة باستخدام مجموعة استخراج الميتوكوندريا وفقًا للطريقة التي تم نشرها بواسطة Peng et al. ثم تم استخدام الميتوكوندريا المستخرجة لفصل تكامل MMP من خلال قياس كثافة الفلورسنت لـ JC { {2}}. باختصار ، تم تحضين الميتوكوندريا باستخدام JC -1 في JC -1 Assay Buffer لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم تطبيق Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone لتعطيل MMP وعمل كعنصر تحكم إيجابي باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم تحليل العينات عند 488 و 575 نانومتر عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج CellQuest (Becton Dickinson).

2.8|قياس رقم نسخة mtDNA

تم قياس عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا بواسطة PCR في الوقت الحقيقي الكمي (qPCR). باختصار ، تم تجانس أنسجة القلب وإزالة البروتينات والحمض النووي الريبي باستخدام بروتيناز K و RNaseA. تم استخراج الحمض النووي الكلي بواسطة مجموعة TIANamp الجينومية DNA ثم تم قياسها بواسطة مقياس الطيف الضوئي QuickDrop من الأجهزة الجزيئية (هوليستون ، ماساتشوستس). تم استخدام مجموعة مسبار PCR mtDNA لتضخيم mtDNA للعينة بواسطة نظام الكشف عن PCR (Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd). تم حساب رقم نسخة mtDNA من منحنى التحكم الإيجابي qPCR وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

2.9|الكشف في الموقع عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)

كما هو موضح سابقًا ، تم إجراء تلوين مضان DHE لتقييم مستوى إنتاج ROS في الموقع. 2 باختصار ، تم دمج أنسجة القلب الطازجة في مركب OCT ثم تم تجميدها فورًا باستخدام جهاز cryostat بدرجة -20. تم تقطيع أنسجة القلب المجمدة إلى شرائح نسيجية بسمك 6- um. تم غسل شرائح القلب بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات 1 (PBS) ثم حضنت بمحلول DHE (5 ميكرومول / لتر) في غرفة رطبة محمية بالضوء عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تم شطف أقسام القلب المستعرضة بـ 1 × PBS. أخيرًا ، تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان ، وتم قياس شدة التألق بواسطة برنامج ImageJ بواسطة اختبار أعمى.

2.10|قياس بيروكسيد الدهون

كمنتجات الأكسدة الثانوية الرئيسية لبيروكسيد الدهون ، تم قياس تركيز malondialdehyde (MDA) في متجانسات المصل والقلب وفقًا لتعليمات MDA Assay kit (معهد Jiancheng Bioengineering Institute).

2.11|تحليل لطخة غربية

تم تجانس أنسجة القلب في محلول RIPA يحتوي على مثبطات الفوسفاتاز والبروتياز وطردها عند 12 00 دورة في الدقيقة عند 4 درجات لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، تم جمع المادة الطافية لإجراء تجارب فرعية. تم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA. تم وضع كميات متساوية من البروتينات في هلام SDS-PAGE بنسبة 10 بالمائة ونقلها إلى أغشية PVDF (Roche). تم حظر الأغشية بمحلول مانع للتسرب لمدة ساعة واحدة وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية المقابلة عند 4 درجات طوال الليل. بعد ذلك ، تم غسل الأغشية في TBS-T واحتضانها بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة. بعد ذلك ، تم غسل الأغشية في TBS-T وتصور باستخدام كواشف إزالة النشاف الغربية ECL (Bio-Rad). تم قياس تعبير البروتين عن طريق تحليل قياس الكثافة للنطاقات باستخدام برنامج ImageJ. تم استخدام بروتين التدبير المنزلي GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. تم عرض ra-tios التخفيف للأجسام المضادة الأولية والثانوية على النحو التالي: ANP (1: 1000) ، BNP (1: 2000) ، p53 (1: 1000) ، p21 (1: 1000) ، PGC -1 أ (1: 1000) ، SIRT3 (1: 1000) ، بيكلين -1 (1: 1000) ، p-mTOR (1: 1000) ، mTOR (1: 1000) ، p 47- phox ( 1: 500) ، p 67- phox (1: 1000) ، gp 91- phox (1: 2000) ، GAPDH (1: 2000) ، Goat Anti-Rabbit IgG (H ＋ L) (بيروكسيداز / HRP مترافق) (1: 5000) و Goat Anti-Mouse lgG (H L) (peroxidase / HRP مترافق) (1: 5000).

2.12|تحليل احصائي

تم التعبير عن البيانات على أنها تعني ± SEM. تم إلغاء تحديد ذات دلالة إحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Student-Newman Keuls اللاحق (SNK).<.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

3|النتائج

3.1|آثار AOS على وظائف القلب والتعبير عن علامات الشيخوخة في الفئران التي يسببها الشيخوخة D-gal

تم استخدام تخطيط صدى القلب لتحليل وظيفة القلب لدى الفئران. أظهرت الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal انخفاضًا ملحوظًا في نسبة EF و FS. ومع ذلك ، منع AOS بشكل كبير من ضعف القلب في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، بما في ذلك نسبة EF المحفوظة جزئيًا ونسبة FS (الشكل 1A-C). كما هو موضح في الشكل 1D-G ، لم يكن هناك فرق إحصائي في معدل ضربات القلب بين كل مجموعة. تميل الفئران D-galactose إلى زيادة LVEDD (قطر نهاية البطين الأيسر الانبساطي) و LVPWd (سمك الجدار الخلفي للبطين الأيسر عند نهاية الانبساط) ، ولكن لم يكن هناك فرق معتد به إحصائيًا مقارنة بالفئران الضابطة. ومع ذلك ، تم زيادة LVESD (قطر نهاية البطين الأيسر الانقباضي) بشكل كبير في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وخفض AOS LVESD في رجل يعتمد على الجرعة. تم تحديد تعبير ANP و BNP في أنسجة القلب بواسطة لطخة غربية لمزيد من التحقق من وظيفة القلب للفئران في كل مجموعة. كما هو مبين في الشكل 1H-I ، زادت مستويات ANP و BNP بشكل كبير في الفئران التي تسبب الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وخفضت AOS بشكل ملحوظ مستويات ANP و BNP في رجل يعتمد على الجرعة. أشارت هذه البيانات إلى أن AOS منع ضعف القلب في الفئران التي يسببها الشيخوخة D-gal. علاوة على ذلك ، اكتشفنا تعبير البروتين لعلامات الشيخوخة p53 و p21. كما هو متوقع ، تمت زيادة تعبير البروتين p53 و p21 بشكل كبير في أنسجة القلب للفئران التي تسبب الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وخفضت AOS بشكل ملحوظ تعبير p53 و p21 بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1J-K).

3.2|تأثير AOS على التغيرات النسيجية القلبية في فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal

للتحقيق في تغيرات بنية عضلة القلب للفئران ، كانت شرائح أنسجة القلب ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). كما هو مبين في الشكل 2 أ ، بالمقارنة مع الفئران الضابطة ، أظهرت الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal بنية غير طبيعية لعضلة القلب ، تتميز بشكل أساسي بترتيب مضطرب لخلايا عضلة القلب وزيادة المساحة بين الخلايا. خفضت إدارة AOS بشكل كبير الترتيب المضطرب والمسافة بين خلايا عضلة القلب. أظهر تلطيخ H&E أيضًا أن منطقة خلايا عضلة القلب البطينية اليسرى قد زادت بشكل كبير في فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وقلل علاج AOS بشكل كبير منطقة عضلة القلب بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 2 ب ، د).

من أجل توضيح درجة التليف القلبي ، تم إجراء تلطيخ ماسون ثلاثي الكروم للمقاطع العرضية للقلب. كما هو مبين في الشكل 2C ، E ، زاد تراكم الكولاجين في عضلة القلب الخلالية والمناطق المحيطة بالأوعية الدموية بشكل كبير في الفئران التي تسبب الشيخوخة التي يسببها D-gal. ومع ذلك ، بالمقارنة مع مجموعة D-gal ، خفضت معالجة AOS بشكل ملحوظ النسبة المئوية لمنطقة الكولاجين بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 2C ، E). تشير هذه البيانات إلى أن AOS منعت التغيرات المورفولوجية التي يسببها D-gal والتليف القلبي في الفئران C57BL / 6J.

3.3|تأثير AOS على البنية التحتية للميتوكوندريا القلبية لفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal

استخدمنا بعد ذلك المجهر الإلكتروني للإرسال لاكتشاف التغيير في البنية التحتية للميتوكوندريا القلبية. كما هو مبين في الشكل 3 ، كانت الميتوكوندريا العضلية القلبية لفئران التحكم طبيعية من الناحية الهيكلية وأظهرت كرستيات واضحة ومصفوفة إلكترونية واضحة. ومع ذلك ، تم تضخيم بعض الميتوكوندريا في عضلة القلب لفئران D-gal ، والتورم والفقدان الجزئي للكرستيات ، ومنع علاج AOS من تدمير الهيكل الفائق للميتوكوندريا القلبية في فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal.

3.4|تأثير AOS على MMP القلبي لفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal

كمحدد مهم للحالة الوظيفية للميتوكوندريا ، تم قياس MMP باستخدام تلطيخ التألق JC -1 وقياس التدفق الإلكتروني. بشكل عام ، عندما تكون إمكانات غشاء الميتوكوندريا عالية ، يتجمع JC -1 في الميتوكوندريا ويصدر تألقًا أحمر ، بينما يوجد JC -1 كمونومر في العصارة الخلوية وينبعث من الفلورة الخضراء عندما تكون الميتوكوندريا ذات إمكانات غشاء منخفضة. يمكن أن تعكس نسبة التألق الأحمر إلى التألق الأخضر شدة MMP. كما هو مبين في الشكل 4A-B ، أشارت نتيجة تلطيخ مضان JC -1 إلى أن مستوى MMP القلبي في الفئران التي يسببها D-gal للشيخوخة كان أقل بشكل كبير من تلك الموجودة في الفئران الضابطة ، وأن إدارة AOS محمية ضد D- انخفاض بوساطة الجالاكتوز من MMP. في

3.5|تأثير AOS على التكوُّن الحيوي للميتوكوندريا وتعبير البروتين الالتهام الذاتي في قلوب فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal

استخدمنا لطخة غربية لتحديد تعبير البروتين لعلامة التكوّن الحيوي مي توكوندريا PGC -1 أ. كما هو متوقع ، لوحظ انخفاض كبير في تعبير PGC -1 عن البروتين في القلب للفئران التي تسبب الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وزاد AOS بشكل كبير من PGC -1 وهو تعبير في جرعة تعتمد على الجرعة بطريقة (الشكل 5A-B). أظهرت الدراسات أن SIRT3 يلعب دورًا مهمًا في الحفاظ على الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. لذلك ، اكتشفنا أيضًا تعبير SIRT3 في أنسجة القلب. أظهرت نتيجتنا أن انخفاضًا ملحوظًا في تعبير بروتين SIRT3 في فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وزاد AOS بشكل كبير من تعبير بروتين SIRT3 بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 5C-D). علاوة على ذلك ، أظهرت نتيجة اختبار mtDNA PCR أن عدد نسخة mtDNA انخفض بشكل كبير في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وقام AOS بتجعيد رقم نسخة mtDNA بشكل كبير بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 5E). أشارت هذه البيانات إلى أن AOS قد نظمت التكوين الحيوي للميتو كوندريا في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal.

استخدمنا بعد ذلك لطخة غربية لتحديد تعبير وفسفرة منظمات الالتهام الذاتي الحرجة في أنسجة القلب. كما هو مبين في الشكل 5F-I ، لوحظ انخفاض كبير في تعبير بروتين البيكلين -1 وزيادة ملحوظة في فسفرة mTOR في أنسجة القلب للفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal. كما هو متوقع ، زادت AOS بشكل ملحوظ من تعبير بيكلين -1 وخفضت فسفرة mTOR بطريقة تعتمد على الجرعة.

3.6|تأثير AOS على إنتاج ROS والإجهاد التأكسدي في قلوب فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal

حددنا إنتاج ROS في القلوب باستخدام تلطيخ DHE الفلوري. كما هو مبين في الشكل 6A-B ، وجدنا أن كثافة مضان DHE للخلية القلبية الوريدية اليسرى قد تحسنت بشكل كبير في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، و AOS قللت بشكل كبير من كثافة عضلة القلب البطين الأيسر DHE.

للتحقيق في تأثير AOS على حالة الإجهاد التأكسدي في قلوب فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، استخدمنا لطخة غربية لتعطيل التعبير البروتيني عن أوكسيديز NADPH في أنسجة القلب. تم زيادة تعبير الفوكس للوحدة الفرعية NADPH أوكسيديز p 47- phox و p 67- phox و gp 91- بشكل ملحوظ في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal. ومع ذلك ، انخفض AOS التعبير عن تلك الوحدات الفرعية NADPH أوكسيديز بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 6C-D).

نظرًا لأن MDA يعتبر علامة حيوية مفترضة لبيروكسيد الدهون في الكائنات الحية ، علاوة على ذلك ، اكتشفنا تركيز MDA لتقييم حالة الإجهاد التأكسدي في الجسم الحي. كما هو مبين في الشكل 6E-F ، تم تأكيد زيادة حالة الإجهاد التأكسدي في الفئران التي يسببها شيخوخة D-gal من خلال تركيز أعلى من MDA في متجانسات المصل والقلب. خفضت إدارة AOS مستويات MDA بطريقة تعتمد على الجرعة بالمقارنة مع مجموعة D-gal. بشكل جماعي ، أشارت هذه البيانات إلى أن AOS قلل بشكل كبير من إنتاج ROS وحالة الإجهاد التأكسدي في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal.

4|نقاش

الشيخوخة عبارة عن تغيرات منهجية مزمنة ومتعددة الأعضاء في الجسم. أصبحت أمراض القلب والأوعية الدموية المتزايدة المرتبطة بالعمر وما يترتب عليها من عبء مالي يمثل تحديًا سائدًا في جميع أنحاء العالم. تحسين فترة الصحة وتأخير قصور القلب الناجم عن الشيخوخة.

الجينات عبارة عن بوليمر خطي من عديد السكاريد المستخرج من طحالب البحر البني. نظرًا لوزنها الجزيئي العالي ولزوجها ، يصعب على الجينات عبور أغشية الخلايا والحواجز البيولوجية المنطقية ، مما يحد من استخدامها. جذب AOS المشتق من التحلل المائي للألجينات اهتمامًا متزايدًا بسبب وزنه الجزيئي المنخفض ولزوجته. AOS مركب قابل للذوبان في الماء وغير سام وغير مناعي وقابل للتحلل البيولوجي وله أنشطة بيولوجية أفضل بكثير من الجينات. تشير الدلائل إلى أن AOS ، بصفته أحد مضادات الأكسدة قليلة السكاريد ، لديه القدرة على حماية الأمراض التنكسية العصبية والسمية القلبية الحادة لدوكسوروبيسين من خلال تثبيط إجهاد الشبكة الإندوبلازمية وإجهاد الأكسيد. hyperlipidae-mia ، ارتفاع السكر في الدم وارتفاع ضغط الدم وقمع السمنة .27 ومع ذلك ، لم يتم إثبات قدرة AOS على الحماية من الشيخوخة.

تشير الدراسات السابقة إلى أن القلب المتقدم في السن يُظهر سماته الوظيفية والوظيفية الفريدة ، بما في ذلك إعادة التشكيل التدريجي للقلب وتدهور احتياطي القلب. . تعرض نماذج الشيخوخة المبكرة التي يسببها D-gal أنماطًا ظاهرية متشابهة من التغيرات القلبية مقارنة بالشيخوخة الطبيعية في القوارض. والمناطق المحيطة بالأوعية الدموية ، وأدت إدارة AOS إلى تثبيط إعادة تشكيل القلب الناجم عن D-gal في الفئران C57BL / 6J. في هذه الأثناء ، وجدنا أن AOS يمنع حدوث اختلال وظيفي في القلب في الفئران التي يسببها شيخوخة D-gal ، بما في ذلك نسبة EF و FS المحفوظة جزئيًا ، وخفض التعبير عن ANP و BNP. كما تم استخدام تخطيط صدى القلب لتحليل التغيرات في بنية القلب لدى الفئران. تميل الفئران D-galactose إلى زيادة LVEDD و LVPWd ، ولكن لم يكن هناك فرق ذو دلالة إحصائية مقارنة بالفئران الضابطة. ومع ذلك ، تمت زيادة LVESD بشكل كبير في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وخفض AOS LVESD بطريقة تعتمد على الجرعة. قد يكون سبب هذه الظاهرة هو أن نموذج التقادم المتسارع لمحاكاة D-galactose له وقت نمذجة قصير نسبيًا ، مما يؤثر بشكل أساسي على وظيفة الميتوكوندريا كما هو موضح أدناه ويؤدي إلى خلل في وظيفة القلب. حدثت تغييرات كبيرة في بنية القلب ولكنها لم تسفر عن فروق ذات دلالة إحصائية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت بياناتنا أيضًا أن إدارة AOS قللت بشكل كبير من تعبير علامات الشيخوخة p53 و p21 بطريقة تعتمد على الجرعة. لمزيد من استكشاف الآليات المحتملة التي تسهم في القدرة الوقائية المضادة للشيخوخة لـ AOS ، تم تحليل وعد الميتوكوندريا المرتبط بالعمر.

يحتوي القلب على العديد من الميتوكوندريا بناءً على طلبها غير العادي على ATP. تولد الميتوكوندريا ATP من خلال الفسفرة المؤكسدة للأحماض الدهنية والكربوهيدرات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضًا إنشاء الجذور الحرة باستمرار أثناء هذه العملية. وتجدر الإشارة إلى أن توازن الميتوكوندريا أمر حيوي للحفاظ على وظيفة خلايا عضلة القلب وحيويتها .3 درجة بالفعل ، أوضحت الدراسات المستقلة في القلب المتقدم في السن أن ميتوكوندريا عضلة القلب تصبح ضعيفة أثناء الشيخوخة. تظهر عضلة القلب وجود الميتوكوندريا المتضخمة والمتضخمة ، مع تشوه ma-trix وفقدان cristae. "في هذه الدراسة ، مقارنة بالفئران الضابطة ، تم تضخم بعض الميتوكوندريا عضلة القلب لفئران D-gal ، وتورم وفقدان جزئي للكرستيات. خفف علاج AOS من تدمير البنية الفائقة للميتوكوندريا القلبية في الفئران التي يسببها الشيخوخة D-gal. بالتوازي ، تسبب D-gal في انخفاض ملحوظ في مستوى MMP القلبي ، وإدارة AOS المحمية ضد D-gal بوساطة تشير هذه النتائج إلى أن AOS منع الميتوكوندريا القلبية من التدمير في الفئران التي يسببها D-gal للشيخوخة.

لقد لوحظ أن العمليات المتعددة للميتوكوندريا المعرضة للخطر متورطة في التسبب في أمراض القلب المسن ، بما في ذلك تغيير التكوُّن الحيوي للميتوكوندريا وإزالتها. وفي الوقت نفسه ، فإن الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وضعف إزالة المي توكوندريا المدمرة ، يؤدي بدوره إلى زيادة التعرض لإصابة الإجهاد في القلب المسن. coactivator 1a (PGC -1 a) ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الطاقة ، وقد ثبت أنه يلعب دورًا رئيسيًا في تنظيم التكوين الحيوي للميتوكوندريا ووظيفتها. إلى شيخوخة السيارة وتطور فشل القلب. "2 توضح الدراسة السابقة أن تنشيط البروتين p53 المرتبط بالعمر يؤدي مباشرة إلى حل وسط مي توكوندريا من خلال قمع العديد من الأنظمة الرئيسية للتكوين الحيوي للميتوكوندريا ، بما في ذلك PGC -1 أ. 43 تشير أدلة الأدلة المتراكمة أيضًا إلى أن تنشيط PGC -1 بواسطة التدخل الدوائي أو الجيني يمنع التغيرات المرتبطة بالشيخوخة في القلب. "Sirtuins (SIRTs) المعترف بها كمنظمين لا يمكن الاستغناء عنها لعملية الشيخوخة. يلعب SIRT3 ، المترجمة في مصفوفة الميتوكوندريا ، دورًا مهمًا في الحفاظ على الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، وتعديل التمثيل الغذائي للميتوكوندريا وتنظيم عموم الحياة ، وقد ثبت أن نقص سيرت 3 يؤدي إلى اضطرابات في القلب ويضعف الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الفئران. 45 في هذه الدراسة ، أظهرنا أن انخفاضًا ملحوظًا في ضغط البروتين PGC -1 و SIRT3 قد لوحظ في أنسجة القلب للفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، وزاد AOS بشكل كبير من PGC -1 أ و SIRT3 البروتين بطريقة تعتمد على الجرعة. علاوة على ذلك ، أظهرت نتيجة اختبار mtDNA PCR أن عدد نسخ mtDNA كان انخفاضًا كبيرًا في الفئران التي يسببها الشيخوخة D-gal ، وزاد AOS بشكل كبير من رقم نسخة mtDNA بطريقة تعتمد على الجرعة. مجتمعة ، أشارت هذه البيانات إلى أن AOS نظمت التكوين الحيوي للميتوكوندريا في الفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal.

كما هو مذكور أعلاه ، فإن الإزالة الفعالة للميتوكوندريا الضعيفة أمر حيوي للحفاظ على توازن خلايا عضلة القلب. الآلية المعروفة التي يتم من خلالها قلب الميتوكوندريا هي من خلال الالتهام الذاتي. يُقترح أن تلعب الالتهام الذاتي دورًا مهمًا في تنظيم التوازن القلبي في الحالة القاعدية وكذلك في الاستجابة للإجهاد. يقلل المستوى المنخفض من الالتهام الذاتي أثناء عملية الشيخوخة من تدهور العضيات المدمرة والبروتينات السامة ويؤدي إلى تراكم الميتوكوندريا غير الوظيفية وغير الطبيعية ، مما يؤدي في النهاية إلى خلل في وظائف القلب. لقد ثبت أن تحفيز الالتهام الذاتي يحسن وظيفة القلب في نماذج القوارض عن طريق إزالة الميتوكوندريا المختلة ، وبالتالي تحسين البيئة الخلوية الكلية والتخفيف في النهاية من الأمراض المرتبطة بالشيخوخة في القلب .48 في هذه الدراسة ، أظهرنا أن مستوى الالتهام الذاتي انخفض بشكل كبير في القلب. أنسجة فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal ، و AOS عززت بشكل كبير مستوى الالتهام الذاتي بطريقة تعتمد على الجرعة. كشفت هذه التغييرات أن AOS عزز الإزالة الفعالة للميتوكوندريا ذات الصلة بالعمر من خلال البلعمة الذاتية المنظمة. كما نوقش سابقًا ، فإن الجزء الأكبر من إنتاج ROS ، الناتج عن مجمعات سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا (ETC) ، curs كمنتج ثانوي من الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا .4 تشير الأدلة التجريبية إلى أن الميتوكوندريا التالفة على مدار الشيخوخة تولد كميات متزايدة من ROS ، ضرر كبير تسببه الجذور الحرة ويؤدي في النهاية إلى دوامة ردود فعل أمامية مؤيدة للخطأ من تسوس الميتوكوندريا. . بالإضافة إلى ETC ، فإن أوكسيديز النيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADPH) أوكسيديز هو أحد المصادر الرئيسية خارج الميتوكوندريا لـ ROS ، والتي قد تكون مسؤولة عن الإجهاد التأكسدي أثناء عملية الشيخوخة وتفاقم الضرر التأكسدي للميتوكوندريا. بالإضافة إلى هذه الآليات ، أظهرت دراسة حديثة أيضًا أن توليد ROS المنخفض في الميتوكوندريا يساهم في إنتاج مستوى منخفض من تلف الحالة المستقرة لـ mtDNA. عام يساهم في طول العمر المتفوق. أظهر تقرير حديث أن مثبط أوكسيديز NADPH يقمع الخلل الوظيفي في الميتوكون دريال في نواة القوقعة البطنية لفئران الشيخوخة التي يسببها D-gal. يعتبر MDA علامة حيوية مفترضة لبيروكسيد الدهون في الكائنات الحية ، ويمكن استخدام تركيز MDA لتقييم حالة الإجهاد التأكسدي في الجسم الحي. في هذه الدراسة ، وجدنا أن إدارة AOS يخفف إنتاج ROS ، ويقلل من التعبير عن NADPH أوكسيديز ويقلل من مستوى MDA في فئران الشيخوخة التي يسببها D-gal. تشير نتائجنا الحالية إلى أن AOS قلل بشكل فعال من حالة الإجهاد التأكسدي في الفئران التي يسببها شيخوخة D-gal ، والتي قد تكون عاملاً وقائيًا مهمًا آخر لـ AOS للتخفيف من ضرر الميتوكوندريا.

في هذه الدراسة ، أوضحنا أولاً أن AOS يخفف من شيخوخة القلب التي يسببها D-gal من خلال تحسين التكوين الحيوي للميتوكوندريا ، والحفاظ على سلامة الميتوكوندريا وتعزيز الإزالة الفعالة للميتوكوندريا المعطلة في الفئران C57BL / 6J. بالإضافة إلى ذلك ، يقلل AOS أيضًا من إنتاج ROS وركائز الإجهاد التأكسدي ، والتي بدورها تمنع تدمير الميتوكوندريا القلبية. قد يكون AOS عاملًا علاجيًا فعالًا للتخفيف من شيخوخة القلب. في هذه الدراسة ، استخدمنا ذكور الفئران فقط ولم نستثني الفروق بين الجنسين في تأثيرات AOS. ومن المثير جدًا أن جزيء الالتصاق بين الخلايا المتغصن المحدد للخلايا -3- يمسك بربيطة غير إنتيجرين (DC-SIGN) 1 (DSCL1 ، عامل مضاد للالتهابات) يقلل من استقطاب البلاعم والخلل الانبساطي في قلب الفأر الأنثوي وليس الذكر.

في الختام ، اقترحت النتائج التي توصلنا إليها أن AOS يخفف من شيخوخة القلب التي يسببها D-gal من خلال تنظيم وظائف الميتوكوندريا في عضلة القلب وسلامتها في الفئران. يعرض AOS مجموعة واسعة من الأنشطة البيولوجية الواعدة وقد يكون عاملًا علاجيًا فعالًا للتخفيف من شيخوخة القلب.

تم استخراج هذه المقالة من J Cell Mol Med. 2021 ؛ 25: 7157-7168. wileyonlinelibrary.com/journal/jcmm|7157