إستراتيجية فطرية لاستشعار مسببات الأمراض تتضمن التواجد في كل مكان لبروتينات السطح البكتيرية الجزء 1

مقدمة

يؤدي الغزو الممرض إلى مجموعة من الاستجابات المناعية التي تحفزها آليات المراقبة لدى المضيف. يبدأ هذا بشكل عام من خلال التعرف على الهياكل الجزيئية الميكروبية المحفوظة والمعروفة باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (PAMPs). يؤدي الاستشعار الفعال لهذه PAMPs عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) بسرعة إلى استجابات مناعية مختلفة للمضيف عبر تنشيط مسارات الإشارات المعقدة التي تؤدي إلى إزالة مسببات الأمراض.

في السنوات الأخيرة ، مع تطور التكنولوجيا الحيوية والتحسين المستمر لتكنولوجيا البحث ، أصبح لدى الناس فهم أعمق للعلاقة بين الجزيئات الميكروبية والمناعة. الجزيئات الميكروبية المحفوظة هي فئة من الجزيئات الميكروبية التي يمكن التعرف عليها من قبل الكائنات الحية وتحفيز الاستجابات المناعية. وهي تشمل بشكل أساسي المكونات الجزيئية للكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا والفيروسات والفطريات ، وهي محفوظة للغاية ومحددة. أظهرت الدراسات أن الجزيئات الميكروبية المحفوظة يمكن أن تقاوم مسببات الأمراض المختلفة وتعزز المناعة من خلال تنشيط جهاز المناعة في الجسم.

تؤدي الجزيئات الميكروبية المحفوظة إلى استجابات التهابية ومناعية عن طريق تنشيط الجزيئات المهمة في الجهاز المناعي ، مثل الخلايا التائية والخلايا البائية والضامة. بعد التعرف على الجزيئات الميكروبية المحفوظة ، ستطلق هذه الخلايا وسائط مناعية مختلفة ، بما في ذلك السيتوكينات والكيموكينات ، وبالتالي تجذب الخلايا المناعية الأخرى للانضمام إلى الاستجابة المناعية. في الوقت نفسه ، يمكن أيضًا للجزيئات الميكروبية المحفوظة أن تعمل كمستضدات لتنشيط استجابات الجسم المضاد في الجسم ، وبالتالي تكوين حماية الجسم المضاد. يمكن أن يؤدي تفاعل هذه الخلايا والعوامل المناعية إلى حماية الجسم بشكل أفضل من مسببات الأمراض.

أظهرت العديد من الدراسات أن الجزيئات الميكروبية المحفوظة يمكنها تحسين مناعة الجسم ، وبالتالي منع وعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض ، مثل الأمراض المعدية ، وأمراض الحساسية ، والسرطان ، وما إلى ذلك. جزيء ميكروبي محفوظ على سطح مستضد فيروس التهاب الكبد B. يمكن تحفيز الاستجابة المناعية للجسم عن طريق تلقيح اللقاح ، لتكوين الجسم المضاد السطحي لفيروس التهاب الكبد B ، لتحقيق الغرض من منع الإصابة بفيروس التهاب الكبد B.

في الختام ، هناك صلة قوية بين الجزيئات الميكروبية المحفوظة والمناعة. من خلال الاستفادة الكاملة من الوظيفة المناعية للجزيئات الميكروبية المحفوظة ، يمكن تحسين مناعة الجسم ، ويمكن الوقاية من الأمراض المختلفة ومعالجتها بشكل أفضل. لذلك ، يجب أن نولي اهتمامًا نشطًا للبحوث التطبيقية للجزيئات الميكروبية المحفوظة وتعزيز تطبيقها في الوقاية من الأمراض وعلاجها. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين المناعة. يمكن لـ Cistanche تحسين المناعة بشكل كبير ، لأن رماد اللحوم يحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة بيولوجيًا ، مثل السكريات ، واثنين من عيش الغراب ، و Huangli ، إلخ. يمكن لهذه المكونات أن تحفز جهاز المناعة. تعمل أنواع مختلفة من الخلايا على زيادة نشاطها المناعي.

انقر فوق الفوائد الصحية من cistanche

حتى الآن ، تم اكتشاف وتمييز العديد من فئات PRR ، مثل المستقبلات الشبيهة بحمض الريتينويك ، والجين I (RIG-I) الذي يحفز حمض الريتينويك ، والمستقبلات الشبيهة بـ NOD ، ومستقبلات الحمض النووي (مستشعرات العصارة الخلوية للحمض النووي) (1 ). هذه PRRs هي في طليعة كل من التعرف على مسببات الأمراض خارج الخلوية وداخلها وتستشعر فئات مختلفة من الجزيئات في الميكروبات بما في ذلك البروتينات والدهون والكربوهيدرات والأحماض النووية (2). هذا أمر محوري لوقف تطور المرض وتعزيز بقاء المضيف.

تعد مراقبة البيئة داخل الخلايا لتقييد انتشار العوامل الممرضة أمرًا بالغ الأهمية للحفاظ على عقم العصارة الخلوية. يوفر خرق آليات الدفاع هذه ملاذًا للممرض من المناعة الفطرية خارج الخلية ويوفر فرصة للتكاثر السريع والانتشار داخل المضيف (3). لذلك ، فإن آليات استشعار مسببات الأمراض القوية وأنظمة الدفاع المستقلة الخلوية ضرورية لتقييد مسببات الأمراض الغازية. التواجد في كل مكان هو إحدى الاستراتيجيات التي تلعب دورًا محوريًا في التعرف على العوامل الممرضة والقضاء عليها (4).

يعمل المسار التدهور الذي يمليه الانتشار الشامل كحدود نهائية ضد البكتيريا التي تعيش في العصارة الخلوية والتي غالبًا ما تتجنب قتل الخلايا البطانية التقليدية عن طريق تمزيق الفجوات المحتوية على مسببات الأمراض لغزو العصارة الخلوية المضيفة. تم تحديد العديد من ليغازات اليوبيكويتين المضيفة E3 لتزيين الشحنات بما في ذلك مسببات الأمراض داخل الخلايا بسلاسل بولي يوبيكويتين (Ub) (5) ، وعلى الرغم من اكتشاف عدد قليل من الأهداف البكتيرية مثل بروتينات الغشاء الخارجي (6) ، لا تزال هناك معرفة واسعة بشأن استراتيجية تحديد الركيزة محدود.

أظهرت دراسة حديثة أن بروتينات المستجيب المفرزة تحتوي على المجال المرتبط باليوبيكويتين (UBA) في Mycobacterium tuberculosis (Mtb) الذي يقوم بتجنيد شقوق اليوبيكويتين بشكل سلبي ، مما يؤدي في النهاية إلى توصيل العامل الممرض إلى البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B-light chain 3 (LC3) - autophagosomes المرتبطة (7). إلى جانب ذلك ، تم توضيح ركائز اليوبيكويتين غير العادية مثل عديدات السكاريد الدهنية (LPS) والجليكان بأناقة في اثنين من مسببات الأمراض البكتيرية ، مما يعرض تنوع ركائز التواجد (8 ، 9).

بشكل مكمل ، تم العثور على Rickettsia parkeri لتعديل بنشاط البروتينات السطحية ، وحمايتها من الانتشار والقتل اللاحق (10). تؤكد هذه الدراسات المستقلة معًا على أهمية توطين سطح ركيزة يوبيكويتين. ومع ذلك ، فإن هوية الركيزة البروتينية في الممرض وكيف يمكن تحديدها بدقة من قبل المضيف E3 ligase تظل بعيدة المنال.
عدد قليل جدًا من ليغازات اليوبيكويتين المضيفة ، مثل التكرار الغني باللوسين والحركة المعقمة التي تحتوي على 1 (LRSAM1) ، باركين ، بروتين الإصبع الدائري 166 (RNF166) ، RNF213 ، Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E 3- تم الإبلاغ عن بروتين يوبيكويتين ligase 1 (ARIH1) ، و SMAD الخاص بـ E 3- ubiquitin protein ligase 1 (Smurf1) ، و Skip-Cullin-F-box protein 2 الذي يحتوي على مركب (SCFFBXO2) لتزيين الفجوات الممرضة أو المحتوية على مسببات الأمراض مع مجموعة متنوعة من طبولوجيا سلسلة يوبيكويتين (8 ، 9 ، 11-18). والجدير بالذكر ، على وجه الخصوص ، أن LRSAM1 من خلال التواجد الذاتي يمكن أن يولد إشارة قوية من اليوبيكويتين حول البكتيريا لتجنيد آلية البلعمة الذاتية (19 ، 20). تشارك ليغازات اليوبيكويتين المسؤولة عن تحديد العوامل الممرضة أيضًا في الحفاظ على التوازن الخلوي ، مما يخلق نظامًا مقتصدًا للغاية للاستخدام الفعال والأمثل للموارد.

من بين العديد من هياكل سلاسل اليوبيكويتين التي تشكلت على العامل الممرض ، فإن زخرفة M 1- Ub تؤدي بشكل أساسي إلى تحريض الالتهاب (21) ، بينما تستهدف كل من طبولوجيا سلسلة K 48- و K 63- الميكروبات بشكل فعال نحو الالتهام الذاتي أو نظام البروتوزوم ، على التوالي (22). لقد أوضحنا مؤخرًا أن سلسلة K 48- Ub لها تأثير مضاد للجراثيم أكثر انتشارًا مقارنةً بـ K 63- Ub (23). بشكل عام ، يتم تمييز البروتينات الخلوية الموجهة للتحلل البروتوزومي بواسطة روابط K 48- Ub الخاصة بسلسلة Ub. يتم توجيه الإشارة الحرجة للتعرف على الركيزة بواسطة هذه الروابط بشكل أساسي بواسطة نموذج ديغرون (24).

في هذه الدراسة ، حددنا وجود أشكال ديغرون في البروتينات السطحية لبكتيريا متنوعة نسبيًا من أصل موجب الجرام وسالب الجرام. إن استهداف مثل هذه الركائز بواسطة آلية الانتشار يدفع بكفاءة القضاء على العوامل الممرضة من الخلية المضيفة. باستخدام هذا ، نوضح تحويل بروتين سطحي غير قابل للتكاثر إلى ركيزة يوبيكويتين عن طريق هندسة إدخال الدرجون لتعزيز التصفية البكتيرية. يحتمل أن يكون هذا المبدأ البسيط والعام لتحديد الركائز البكتيرية بمثابة آلية محفوظة للتعرف على مسببات الأمراض الخلوية ، مما يعد بأن يكون فعالًا ومتعدد الأغراض في درء الالتهابات البكتيرية.

نتائج

تعزز سلسلة K 48- Ub استشعار مسببات الأمراض البكتيرية الخلوية

عند استشعار غزو العصارة الخلوية من قبل مسببات الأمراض ، قام المضيف بتمييزها بسلاسل poly-Ub لتحريك إزالتها (22). نظرًا لأن سلاسل polyUb هذه تتكون أساسًا من K 48- و K 63- Ub ، فقد اكتشفنا أولاً غلبة هذه الأنواع من السلاسل والموقع المكاني لها على اثنين من مسببات الأمراض المتميزة نسبيًا ، العقدية الرئوية (SPN) والسالمونيلا المعوية المصلي تيفيموريوم (STM) ، الذي يسبب الالتهاب الرئوي والتهاب المعدة والأمعاء عند البشر ، على التوالي. بالنسبة لمسببات الأمراض هذه ، تم توثيق البقاء والانتشار داخل العصارة الخلوية للخلية المضيفة (13 ، 25). باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بربط يوبيكويتين ، لاحظنا أن نسبة أعلى بكثير من البكتيريا داخل الخلايا تم تمييزها بنوع سلسلة K 48- Ub (حوالي 26 بالمائة لـ SPN و 37 بالمائة لـ STm) على عكس K 63- Ub (الشكل 1 أ).

أشار تحليل الموقع المكاني عن طريق الفحص المجهري للإضاءة المنظم (SIM) إلى أن العصارة الخلوية (خالية من بقايا الفراغ) أو البكتيريا المعرضة للخلايا (داخل الجسيم الداخلي التالف) مرتبطة بشكل أساسي بـ K 48- Ub ، بينما K 63- Ub تم وضع إشارة على الجسيمات الداخلية التالفة ، وتم تمييزها بـ Galectin -8 (Gal8 ؛ علامة استشعار تلف الجسيم الداخلي) (الشكل 1 ، B إلى E) (26). حوالي 99 و 76 في المائة من K 48- المنتشرة في كل مكان من SPN و STm ، على التوالي ، كانت خالية من Gal8 (الشكل 1F). تم التحقق من صحة الوجود البكتيري في العصارة الخلوية عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني (TEM) والتلوين المناعي باستخدام علامة غشاء FM 4-64 (الشكل S1 ، A إلى F). وجدنا 78.4 و 80.4 بالمائة K 48- Ub إيجابية SPN و STm ، على التوالي ، خالية من أي ارتباط غشاء ، بينما 77.7 و 74.4 بالمائة K 63- Ub إيجابي SPN و STm ، على التوالي ، محصورين داخل الفجوة (الشكل 1G). بشكل جماعي ، اقترحت هذه النتائج أن طلاء السطح البكتيري بسلاسل K 48- Ub هو آلية رئيسية لاستشعار مسببات الأمراض يستخدمها المضيف للتعرف على الميكروبات التي تعيش في العصارة الخلوية.

Degron هو رمز عام لانتشار البكتيريا

حاولنا بعد ذلك تحديد الركيزة لتواجد K48 على سطح البكتيريا. بشكل حاسم ، مضيف E3 ubiquitin ligases ، الذي تم الإبلاغ عن مشاركته في الانتشار البكتيري ، متورط أيضًا في الوظائف الخلوية الحاسمة (12 ، 14) حيث تعمل سلاسل K 48- كإشارة رئيسية للبروتين الخلوي. افترضنا أنه يمكن اعتماد مبادئ مماثلة من قبل المضيف لتحديد الركيزة K 48- Ub على السطح البكتيري. بالنسبة للبروتينات المضيفة ، تم الإبلاغ عن وجود نموذج ثلاثي (تسلسل أولي للغرون متبوعًا ببقايا ليسين قريب ومنطقة مضطربة بينهما) شرطًا أساسيًا لتواجد K48 (24).

قمنا بفحص البروتينات السطحية لـ SPN بحثًا عن وجود ميزات مماثلة (الشكل 1H) ، وتحديد BgaA و PspA كأهداف مفترضة للتواجد في كل مكان (الشكل 1H والشكل S2 و A و B). BgaA هو عبارة عن - جلاكتوزيداز تم الإبلاغ عنه أنه يعمل بمثابة مادة لاصقة لـ SPN ، بينما PspA هو بروتين مرتبط بالكولين يربط اللاكتوفيرين وهو ضروري للتهرب التكميلي (27 ، 28). لاحظنا انخفاضًا بنسبة 50 إلى 53 بالمائة تقريبًا في ارتباط نوع سلسلة Ub K 48- لكل من طفرات ΔbgaA و ΔpspA ، دون أي تغيير في مستويات K 63- Ub (الشكل 1I). كان هذا التخفيض واضحًا (حوالي 75 بالمائة) في سلالة مزدوجة الضربة القاضية (bgaAΔpspA) ، مما يشير إلى الطبيعة غير الزائدة لركائز اليوبيكويتين هذه (الشكل 1I).

علاوة على ذلك ، فإن التعبير عن BgaA-T (نسخة مقطوعة من البروتين ، تتكون من الأحماض الأمينية من 1 إلى 1049) و PspA في الخلايا المضيفة يؤدي إلى انتشارها مع K 48- طوبولوجيا Ub (الشكل 1J). تم تأكيد صحة الأهداف المتوقعة عن طريق التكميل ، وتم تعزيز النموذج باستخدام ΔhysA (بروتين سطح SPN الذي لا يفي بمعايير درجة حرارة ثلاثية الأطراف) كعنصر تحكم لتسجيل K 48- مستويات ارتباط Ub (الشكل 1I ).

اكتشفنا بعد ذلك تأثير زخرفة K 48- Ub على الخلوص البكتيري.

أدى غياب K 48- ركائز Ub إلى إعاقة التصفية البكتيرية ، مما أدى إلى تحسن كبير في الثبات داخل الخلايا لكل من سلالات SPN الطافرة (~ 1. 8- أضعاف لـ ΔbgaA و ~ 2- أضعاف لـ ΔpspA) ( الشكل 1 ك). تم التحقق من صحة عالمية نهج التنبؤ الركيزة الخاص بنا من خلال تحديد العديد من البروتينات المعرضة للسطح في العديد من مسببات الأمراض الأخرى كركائز مفترضة للتواجد في كل مكان (الجدول S1). أحد هذه المرشحين المفترضين ، وهو بروتين غشاء خارجي RlpA على STm تم تأكيده كهدف لآلة انتشار المضيف ، حيث أظهر متحولة ΔrlpA ~ 1. 5- ضعف الارتباط مع K 48- Ub مقارنة بالبرية -النوع (WT) STm (الشكل 1 لتر). حددت هذه النتيجة التطبيق الواسع لاستراتيجية اختيار الركيزة الخاصة بنا. على حد علمنا ، هذه هي البروتينات السطحية البكتيرية الأولى التي تم الإبلاغ عن التعرف عليها بواسطة آلات تواجد المضيف لاستشعار مسببات الأمراض وتطهيرها.

يعد التصميم الثلاثي شرطًا أساسيًا لوضع علامات على اليوبيكويتين الدقيق لبروتينات السطح البكتيرية

بعد تحديد الركيزة ، نهدف إلى اختبار السمات الحاسمة للعنصر الثلاثي الذي شكل العمود الفقري لشاشتنا (الشكل 2 أ والشكل S2A). أدى حذف تسلسل degron (102VTPKEE107) في BgaA-T إلى انخفاض بنسبة 50 في المائة تقريبًا في ارتباط نوع سلسلة Ub K 48- ، مقارنةً بـ WT SPN بغض النظر عن حركيات النمو المماثلة وقدرة التزام الخلية (الشكل 2C) والشكل S3 و A و B). كان هذا التخفيض مشابهًا لسلالة خروج المغلوب ΔbgaA ، مما يؤكد النمط الظاهري الخاص بالدرون. بصرف النظر عن تسلسل الديغرون ، فإن بقايا اللايسين الموجودة في الجوار القريب أمر بالغ الأهمية لربط جزء اليوبيكويتين بالركيزة. في BgaA ، يترافق تسلسل الديغرون مع تواجد K48 مخفض بشكل كبير مقارنةً بـ BgaA-T (الشكل 2D). بشكل ملحوظ ، تم إبطال إمكانية التغيير التوافقي الشديد في بروتين BgaA-TΔDegron للتأثير على التواجد في كل مكان من خلال التنبؤ السيليكو والتحليل الطيفي ثنائي اللون (CD) لبروتين BgaA-TΔDegron المنقى ، والذي أظهر توقيعات هيكلية مماثلة لـ BgaA-T (الشكل S3 ، C و D). مثل BgaA ، أدى حذف تسلسل degron (327PETPAPE333) وطفرة ليسين (K315R) في PspA أيضًا إلى انخفاض كبير في ارتباط K 48- Ub ، إلى جانب القدرة على البقاء لفترة طويلة (الشكل S4 ، A إلى D).

قمنا بعد ذلك بهندسة البروتين السطحي لـ SPN HysA ، الذي يفتقر في الأصل إلى تسلسل درجة أولي ، عن طريق إضافة تسلسل ديغرون داخل منطقة مضطربة هيكليًا من البروتين الذي يحتوي على بقايا ليسين (الشكل 2 ، F و G ، والشكل S2 ، C إصبع قدم). منح هذا التعديل اعترافًا وانتشار K48 لبروتين HysA الذي لم يكن موجودًا في السابق. K 48- مستويات ارتباط Ub لسلالات SPN التي تحمل بروتين HysA المهندسة (ΔbgaA: pHysADegron-BgaA و ΔpspA: pHysADegron-PspA) كانت 2. 2- و 3. 2- أضعاف مقارنة بـ إما ΔbgaA و ΔbgaA: سلالات pHysA أو ΔpspA ، على التوالي (الشكل 2H).

الزخرفة المحسّنة لـ ΔbgaA: pHysADegron-BgaA و ΔpspA: سلالات pHysADegron-PspA مع K 48- Ub سلبت SPN كسب البقاء الذي يوفره عدم وجود degron في ΔbgaA و ΔbgaA: pHysA أو ΔpspA (الشكل 2I). أنتجت جميع سلالات SPN المهندسة مستويات مماثلة من النيوموليسين الذيفاني المكون للمسام (Ply) (الشكل 2 و B و G) ، وهو شرط أساسي لتلف الغشاء الداخلي والانتشار اللاحق (25). هذا يبطل المساهمة المحتملة لتلف الغشاء المنخفض أو الواسع الذي يعزز تغييرًا ملحوظًا في مستويات التواجد في سلالات SPN المتحولة. بشكل جماعي ، تشير هذه الدراسات إلى أن الإضافة الاصطناعية لتسلسل درجة حرارة الجسم تعزز الكشف عن مسببات الأمراض والقضاء عليها بوساطة اليوبيكويتين. والجدير بالذكر أن تسلسل درجة الحرارة في BgaA كان محفوظًا بدرجة عالية عبر الأنماط المصلية المختلفة للمكورات الرئوية (الشكل S5A).

ومع ذلك ، في النمط المصلي 19F الذي غالبًا ما يرتبط بزيادة خطر الوفاة من الالتهاب الرئوي الجرثومي والإنتان (29-31) ، وجد أن درجة الحرارة الأولية قد تحور (P104Q). لاحظنا أن محاكاة هذه الطفرة في BgaA (الشكل S5B) نقلت انتشارًا ضعيفًا في كل مكان وتحسين القدرة على البقاء على قيد الحياة إلى ΔbgaA: pBgaA-TP104Q مقارنة بـ ΔbgaA: pBgaA-T (الشكل S5 و C و D). يسلط هذا الضوء على التعرف على درجة الحرارة كاستراتيجية يستخدمها المضيف لحماية نفسه من الالتهابات البكتيرية الشديدة.

SCFFBW7 هو مضاد للميكروبات E3 يوبيكويتين يجاز

من المتوقع أن يتم تحديد تسلسل ديغرون الكنسي الموجود في ركائز يوبيكويتين المختارة بواسطة مجمع SCFFBW7 E3 ubiquitin ligase (24) ، والذي يشارك في تنظيم دورة الخلية ونموها (32). وهو يتألف من بروتينين محفوظين ، البروتين 1 المرتبط بالكيناز S-phase kinase (SKP1) وعضو من عائلة بروتين Cullin ، جنبًا إلى جنب مع بروتين F-box المتغير الذي يوفر خصوصية الركيزة (33). للتحقق من تورط SCFFBW7 في انتشار SPN ، قمنا أولاً بتقييم ارتباط FBXW7 مع SPN. وجدنا حوالي 31 بالمائة من العقيدات الرئوية الانفرادية داخل الخلايا مرتبطة بـ FBXW7 عند تحليل التألق المناعي (الشكل 3 أ والشكل S6A). من المتوقع أن تكون SPN الإيجابية لـ FBXW 7- مشتركة أيضًا مع K48 يوبيكويتين (الشكل S6B). لإثبات تورط SCFFBW7 ، تم فحص تصنيف البكتيريا بسلاسل K 48- من خلال التألق المناعي ، بعد التنظيم السفلي للتعبير عن جينات Cullin1 و SKP1 و FBXW7 باستخدام RNAs صغيرة متداخلة مستهدفة (siRNAs ؛ الشكل. S7، A to C).

على وجه الخصوص ، تم التحقق من صحة إسكات FBXW7 من خلال مستوى تراكم cyclin E1 في الخلايا المعالجة siFBXW 7- (الشكل S7F). لاحظنا انخفاضًا بنسبة 45 إلى 60 بالمائة تقريبًا في ارتباط SPN بـ K 48- Ub في خلايا ضربة قاضية Cullin1 و SKP1 و FBXW7 (الشكل 3 ب) ، مما أدى بدوره إلى ~ 1. 6- إلى 1. 75- أضعاف الزيادة في ثبات SPN داخل الخلايا المضيفة (الشكل 3E). تم إثبات الاستهداف المحدد لعنصر الديغرون بواسطة SCFFBW7 من خلال الاختلافات التي لم يتم تغييرها في K 48- Ub Colocalization وقدرة البقاء على قيد الحياة لـ ΔpspAΔbgaA و ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron سلالات في siFBXW 7- الخلايا المعالجة (الشكل S8 ، A إلى د). تم إثبات هذه النتائج من خلال التخفيضات الملحوظة في انتشار K48 لـ BgaA-T في الخلايا المضيفة بعد ضربة قاضية لـ FBXW7 (الشكل 3C).

علاوة على ذلك ، في المختبر ، التواجد في كل مكان مع BgaA-T المنقى (الشكل S9 ، A إلى D) ومكونات مجمع SCF يوضح بشكل لا لبس فيه SCFFBW7 باعتباره لغاز E3 حسن النية المسؤول عن انتشار BgaA. كان SCFFBW7 المؤتلف قادرًا على انتشار BgaA-T المنقى في كل مكان ولكنه فشل في نشر المتغير BgaA-TΔDegron المحذوف من الدرجة أو متغير الاستبدال ليسين إلى أرجينين BgaA-TK97R (الشكل ثلاثي الأبعاد). علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا المضيفة التي تعبر عن متغير FBXW7R505C ، والذي يُظهر ضعفًا في القدرة على التعرف على cyclin E1 (ركيزة من FBXW7) (الشكل S7E) ، تواجدًا منخفضًا لـ K48 (حوالي 50 بالمائة) لـ SPN ، وكذلك ~ 2- أضعاف بقاء أعلى للـ SPN مقارنة بخلايا WT (الشكل 3 و F و G). تثبت هذه التجارب الدور الرئيسي لـ SCFFBW7 E3 ligase في الكشف عن مسببات الأمراض التي تعيش في العصارة الخلوية واستهدافها نحو مسارات القتل.

GSK 3 - الفسفرة الوسيطة لعنصر الديغرون يقوي النشاط المضاد للميكروبات لـ SCFFBW7

بشكل عام ، تتعرف بروتينات F-box على ركائز الفسفرة لتعزيز انتشارها (34). لذلك ، قمنا بالتحقيق في احتمالية وتأثير الفسفرة للركائز البكتيرية على طلاء K {2}} Ub للعامل الممرض. كشف تحليل المعلوماتية الحيوية عن وجود بقايا ثريونين مفترضة قابلة للفوسفور (102VT * PKEE107) ضمن تسلسل درجة الحرارة في BgaA. لاحظنا أن سلالة SPN التي تأوي طفرة BgaA-TT103A (ΔbgaA: pBgaA-TT103A) (الشكل 4 أ) أظهرت انخفاضًا بنسبة 71 في المائة في التلوين مع K 48- Ub مقارنةً بـ WT (الشكل 4 ب) ، مما يكشف عن أهمية الفسفرة في التعرف على الركيزة من قبل مجمع SCF.

بشكل حاسم ، أدى انخفاض ميل فسفرة BgaA في ΔbgaA: pBgaA-TT103A إلى إلغاء قدرة المضيف على التخلص من الأحمال البكتيرية داخل الخلايا (~ 1. 8- أضعاف) (الشكل 4 ج). بالتوازي مع BgaA ، أظهر متغير درجة حرارة PspA (ΔpspA: pPspAT329A) أيضًا انخفاضًا بنسبة 51 بالمائة في كولوكيشن K 48- Ub الذي ارتبط بالاستمرارية الطويلة داخل الخلايا (الشكل S10 ، A إلى C). بشكل عام ، تحتوي ركائز SCFFBW7 المستهدفة على ثريونين / سيرين (T / S *) بجوار بقايا البرولين ، والتي يتم فسفرتها بواسطة بروتين كيناز موجه بالبرولين ، GSK3 (35-37). لذلك ، حاولنا كشف مشاركة GSK3 في زيادة التعرف على الركيزة.

لقد أوضحنا أولاً أن GSK3 يرتبط ارتباطًا وثيقًا بـ SPN المنتشر في كل مكان ، والمميز بـ FBXW7 (الشكل 4 و D و E). بعد ذلك ، من خلال إجراء اختبار كيناز في المختبر ، لاحظنا أن GSK3 يمكن أن يفسفوريلات BgaA-T المؤتلف. في الوقت نفسه ، ظل متغير BgaA-TT103A غير فسفري (الشكل 4F). أدى هذا إلى التحقق من صحة هوية بقايا ثريونين داخل تسلسل درجة حرارة BgaA-T كهدف لـ GSK 3 - بوساطة الفسفرة. أدت الضربة القاضية المستهدفة لـ GSK3 بواسطة siRNA (الشكل S7D) إلى انخفاض بنسبة 58 في المائة تقريبًا في انتشار K48 لـ SPN (الشكل 4G). أدى هذا الانتشار المنخفض ، بعد التنظيم السفلي لتعبير GSK3 ، إلى تقلص قدرة المضيف على إزالة مسببات الأمراض التي اجتاحت الخلايا (~ 1. 5- أضعاف) (الشكل 4H) ولكن لم يُظهر أي تأثير على ΔbgaA : pBgaA-TT103A (الشكل S8 و E و F). بشكل جماعي ، يقدم هذا الدليل الأول على كيناز مضيف ، وتحديداً GSK3 ، الذي ينظم انتشار البروتينات السطحية البكتيرية للتخلص الفعال من مسببات الأمراض (الشكل 4I).

يؤدي انتشار مسببات الأمراض الخلوية إلى مصائر مميزة للتخلص منها. على وجه الخصوص ، يشجع انتشار K48 على استهداف الركائز تجاه البروتيازومات (22). وبالمثل ، تشير نتائجنا إلى وجود ارتباط بين العقيدات الرئوية الانفرادية في كل مكان مع الوحدة الفرعية البروتوزومية ، 7 (الشكل S11 و A و C). علاوة على ذلك ، يحسن تثبيط البروتوزوم بواسطة علاج MG132 من ثبات WT SPN ولكنه لا يغير قدرة بقاء ΔpspAΔbgaA. وقد لوحظت أنماط ظاهرية مماثلة في حالة متحولة STm و ΔrlpA (الشكل S11 و B و D).

تحمي مراقبة العوامل الممرضة التي يسترشد بها الزهرون العائل من تعفن الدم

سعينا بعد ذلك إلى تحديد تأثير التعرف على العقيدات الرئوية الانفرادية عبر آلية الانتشار الخلوي على نتائج العدوى. باستخدام نموذج راسخ لـ SPN sepsis (38) ، قمنا بمقارنة ضراوة متحولة ΔbgaA مع تلك الخاصة بـ WT SPN وكذلك السلالات المكملة إما بـ BgaA-T (ΔbgaA: pBgaA-T) أو إصدار يفتقر إلى تسلسل درجة الحرارة ( ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron). تمشيا مع التقارير السابقة (39) ، أظهرت سلالة حذف bgaA ضراوة ضعيفة ، بينما الفئران المصابة بـ WT ، ΔbgaA: pBgaA-T ، أو ΔbgaA: استسلمت BgaA-TΔDegron للعدوى (الشكل 5A والشكل S12 ، A إلى D) . ومع ذلك ، أظهرت مجموعة الفئران المصابة بالسلالة SPN التي تفتقر إلى تسلسل الديغرون نسبة أعلى من الوفيات ولكن مع الوفيات المتأخرة مقارنةً بالمجموعة المصابة ΔbgaA: pBgaA-T (P=0. 0492 ، اختبار التصنيف اللوغاريتمي) (الشكل 5 أ). أكدت مقارنة الأعباء البكتيرية في الدم (الشكل 5 ب) والطحال (الشكل 5 ج) والمسار الزمني لعلامات المرض المرئية في الفئران المصابة (الشكل 5 د) الاتجاه نحو زيادة الفوعة في سلالة ΔbgaA: pBgaATΔDegron.

أظهرت الدراسات السابقة أن تعفن الدم العقدي النخاعي ينشأ من خزان للبكتيريا في الطحال (38). بينما يتم مسح الموجة الأولى من البكتيريا الغازية في الدورة الدموية بسرعة من خلال آليات المناعة الفطرية للمضيف ، فإن نسبة من العقيدات الرئوية الانفرادية تبقى وتتكاثر داخل البلاعم الطحالية ، قبل إعادة البذر في الدم. افترضنا أن تأخر ظهور المرض الوخيم في الفئران المصابة بـ ΔbgaA: قد يكون pBgaA-TΔDegron نتيجة للبقاء لفترات طويلة من SPN داخل الضامة الطحالية ، بسبب انخفاض التعرف داخل الخلايا على البكتيريا بواسطة آلية انتشار المضيف. لدعم ذلك ، لاحظنا تأخر ظهور الموجة الثانية من تجرثم الدم في الفئران المصابة بـ ΔbgaA: سلالة pBgaA TΔDegron مقارنة بـ ΔbgaA: pBgaA-T (24 ساعة مقابل 12 ساعة) ، بعد مرحلة الإزالة المبكرة (الشكل 5E).

ومع ذلك ، في مرحلة الكسوف ، التي يتم خلالها تطهير الدم من البكتيريا ، كانت أعداد البكتيريا الطحالية أعلى باستمرار في الفئران المصابة بـ ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron (الشكل 5F). تشير هذه النتائج إلى أن مرحلة انتشار العقيدات الرئوية الانفرادية داخل البلاعم الطحالية تمتد في غياب التعرف داخل الخلايا على العدوى عبر آلية الانتشار. نتيجة لذلك ، يمكن أن تتراكم الكثافة البكتيرية المتزايدة في الطحال (الشكل 5F) ، وبالتالي تزرع في الدم بأعداد أكبر ، مما قد يفسر الوفيات المتأخرة والمتزايدة لـ ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron المصابة بالفئران. معًا ، تُظهر هذه البيانات أن التعرف على العقيدات الرئوية الانفرادية داخل الخلايا وانتشارها في كل مكان يسهمان في السيطرة على المضيف من مسببات الأمراض أثناء تعفن الدم.

For more information:1950477648nn@gmail.com