إستراتيجية فطرية لاستشعار مسببات الأمراض تتضمن التواجد في كل مكان لبروتينات السطح البكتيرية الجزء 2

مناقشة

تستخدم Metazoans التواجد في كل مكان كآلية متعددة الاستخدامات للحفاظ على التوازن الخلوي ، ومنع تراكم البروتينات / العضيات التالفة والدفاع ضد مسببات الأمراض الغازية (40 ، 41). نظرًا لتنوع مسببات الأمراض والمجموعات المتنوعة من البروتينات التالفة التي تمت مواجهتها ، فإن تحديد الأشكال الشائعة للتعرف على الركيزة والانتشار اللاحق يمثل استراتيجية ذكية لتحسين الموارد. عادة ما يتم التعرف على البروتينات في الخلايا حقيقية النواة المخصصة لتحلل البروتين بواسطة نموذج ديغرون ثلاثي (24).

المناعة هي قدرة الجسم على مقاومة الأمراض ، بما في ذلك الاستجابة للبكتيريا والفيروسات والمواد الضارة الأخرى. إذا تعرض جهاز المناعة في الجسم للخطر ، فلن يكون قوياً بما يكفي للتعامل مع هجوم المرض. أظهرت الدراسات أن لسوء التغذية تأثير على وظيفة الجهاز المناعي ، مما يجعل الجسم أكثر عرضة للعدوى والمرض. البروتين هو أحد المواد المهمة للحفاظ على المناعة.

تتكون البروتينات من الأحماض الأمينية ، وبعضها يسمى الأحماض الأمينية الأساسية لأنه يجب توفيرها عن طريق الطعام ولا يمكن تصنيعها بواسطة الجسم. تشمل هذه الأحماض الأمينية الأساسية التربتوفان ، والليوسين ، والفينيل ألانين ، والليسين ، والأيزولوسين ، والميثيونين ، والفالين ، والهيستيدين. إذا لم يحصل الجسم على ما يكفي من الأحماض الأمينية الأساسية ، فقد يؤدي ذلك إلى ضعف التمثيل الغذائي للبروتين ، مما قد يؤثر على وظيفة الجهاز المناعي.

بالإضافة إلى ذلك ، يساعد تناول البروتين عالي الجودة في الحفاظ على نظام المناعة الطبيعي ووظائف الجسم. عندما يفتقر الجسم إلى البروتين ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى ضعف جهاز المناعة ويكون الجسم أكثر عرضة للإصابة بالأمراض. إذا كان جسم الإنسان يفتقر إلى البروتين لفترة طويلة ، فقد يتسبب ذلك في ضرر طويل الأمد لجهاز المناعة ، مما يجعل الناس عرضة للإصابة بأمراض مختلفة.

لذلك ، فإن اتباع نظام غذائي متوازن وممارسة الرياضة المناسبة هما مفتاح الحفاظ على تناول البروتين. يمكن للناس تلبية احتياجات الجسم من البروتين عن طريق تناول المزيد من الأطعمة الغنية بالبروتين مثل اللحوم والدواجن والأسماك والفاصوليا والبيض ومنتجات الألبان والحبوب والمكسرات والبذور. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي التمارين المعتدلة أيضًا إلى زيادة طلب الجسم للبروتين وكفاءة الامتصاص. إن النظام الغذائي المتوازن والمتنوع ونمط الحياة الصحي هي مفاتيح الحفاظ على المناعة والحفاظ على صحة الجسم واستقراره ومقاومة غزو الأمراض. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين مناعتنا. يمكن أن يحسن الكستانش المناعة بشكل كبير لأن السكريات الموجودة في اللحوم يمكن أن تنظم الاستجابة المناعية لجهاز المناعة البشري ، وتحسن قدرة الإجهاد للخلايا المناعية ، وتعزز مناعة الخلايا المناعية. تأثير مبيد للجراثيم.

انقر فوق الملحق cistanche deserticola

دفعنا هذا إلى استكشاف ما إذا كان يمكن العثور على أشكال مماثلة على أسطح مسببات الأمراض ، حيث يمكن أن تعمل كبديل للتعرف على الركيزة. هنا ، نوضح أن ubiquitin ligases المضيفة تستخدم توقيعات جزيئية مماثلة لاستشعار مسببات الأمراض المتميزة نسبيًا. يعد التعرف على العوامل الممرضة عبر الأنماط / الأشكال الجزيئية الشائعة (PAMPs) سمة مميزة جيدًا للمناعة الفطرية (42). تشير نتائجنا إلى أن التسلسلات الشبيهة بالدرون داخل البروتينات السطحية البكتيرية تعمل بطريقة مكافئة لـ PAMPs ، لنقل مراقبة مسببات الأمراض داخل الخلايا. يمكن للمضيف استغلال طريقة العمل هذه لعرض مستضدات البروتين الميكروبي على معقد التوافق النسيجي الرئيسي الأول للحث على استجابة CD8 قوية موجهة ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا.

تم إبراز الأهمية المحتملة للكشف عن مسببات الأمراض بوساطة يوبيكويتين لدفاعات المضيف من خلال التواجد الكبير المتبقي الذي تم اكتشافه في SPN المتحولة التي تفتقر إلى كل من BgaA و PspA. يشير هذا إلى وجود ركائز أخرى غير محددة لآلة اليوبيكويتين ، مع التكرار الناتج الذي يضمن اعتراضًا قويًا لمسببات الأمراض. وتجدر الإشارة إلى أن بعض الأسئلة الفورية حول شكل الديغرون وأهميته للبكتيريا (بخلاف كونه وحدة يمكن التعرف عليها) توفر زاوية تطورية مثيرة للاهتمام.

يمكن الاستغناء عن شكل الديغرون في الجسم الحي ، وإذا كان هناك أي شيء ، فإن تغيير أو حذف الشكل يؤدي إلى تحسين الثبات داخل الخلايا مما يؤدي إلى زيادة الفوعة. تم إثبات ذلك من خلال نتائجنا التي تشير إلى أن الطفرة في عزر الديغرون يمكن استخدامها من قبل مسببات الأمراض للهروب من التعرف بوساطة اليوبيكويتين كما يظهر في النمط المصلي SPN 19F. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المحفوظة لعنصر الديغرون في BgaA عبر غالبية الأنماط المصلية لـ SPN يمكن أن توحي باستراتيجية مضادة تتبناها البكتيريا لتكون أقل فتكًا بالمضيف.

يمكن أن يوفر هذا فرصة لمسببات الأمراض لزيادة موائلها الصالحة للاحتلال. في الوقت نفسه ، يمكن أن يعدل انتشار السطح البكتيري أو البروتينات المفرزة في عزر الديغرون وظيفيًا لتثبيط أو إعادة توصيل استجابة المضيف للاستفادة النهائية (43). لذلك ، فإن وجود أو عدم وجود مجالات أو أشكال وظيفية شبيهة بحقيقيات النوى (مثل الدجرونات) يمكن أن يعتمد على مكانة مسببة للأمراض وتكييفها لتفادي أو تعديل الاستجابات المناعية للمضيف.

كما أن آلية استشعار مسببات الأمراض المماثلة تتضمن بروتينات ربط الغوانيلات متورطة في التصفية البكتيرية ؛ ومع ذلك ، على عكس التواجد في كل مكان ، تم الإبلاغ عن أن دورها يقتصر على مسببات الأمراض سالبة الجرام (44-47). يستهدف الانتشار العامل الممرض بغض النظر عن أصل الجرام ، على سبيل المثال ، تم توثيق RNF213 لاستهداف Listeria spp. بغض النظر عن عدم وجود LPS (48). لذلك ، لا نستبعد إمكانية تأثيره المضاد للميكروبات ضد العقيدات الرئوية الانفرادية أيضًا.

يمكن أن ينتشر السطح الممرض في كل مكان بأنواع سلاسل متعددة بواسطة روابط E3 مختلفة مع تفاعلات بين السلاسل (41). على وجه الخصوص ، في حالة Mtb و Smurf1 و Parkin ، فقد ثبت أنها تشكل أنواع سلاسل K48 و K63 تعمل بشكل تآزري لتحطيم العامل الممرض (12). لا يزال فهم الدور الميكانيكي لتواجد K48 و ligases E3 المتضمن أثناء سيناريوهات الإصابة غير مفهومة. في حالة STm ، تم تصوير E3 ligase ARIH1 لاستهداف عصارة خلوية STm مع سلاسل K48 ubiquitin مما يؤدي إلى إزالتها من النظام (15). بناءً على النتائج التي توصلنا إليها وتوصلنا إلى نتائج أخرى ، فإن مسببات الأمراض التي تحمل علامة K 48- تتحلل أخيرًا أثناء ارتباطها بآلات البروتياز.

ومع ذلك ، تُظهر هذه الدراسة 48- زخرفة Ub لبروتينات سطحية بكتيرية معينة. من المعروف أن بعض مسببات الأمراض تعدل بنشاط بروتيناتها السطحية ، وتحميها من الانتشار والقتل اللاحق ، وبالتالي التأكيد على أهمية توطين سطح ركيزة يوبيكويتين (10). بالإضافة إلى ذلك ، طورت مسببات الأمراض المتعددة داخل الخلايا استراتيجيات لإخراج نفسها ، أو المكونات التنظيمية المضيفة ، لتفادي التصفية بوساطة يوبيكويتين (5). تؤكد هذه النتائج معًا على أهمية إثارة الإنذار بوساطة اليوبيكويتين كآلية استشعار أساسية لمسببات الأمراض داخل الخلايا مركزية لدفاعات المضيف.

أظهرت دراستنا كذلك الدور المركزي لـ SCF E3 ligase ، لا سيما مع FBXW7 ، في الانتشار البكتيري الذي يزيد من تدهور العوامل الممرضة. الطفرات غير المتجانسة في FBXW7 ، وخاصة R505C (بقايا حرجة في جيب التعرف على الركيزة) ، تؤدي إلى العديد من السرطانات وسرطان الدم الليمفاوي في البشر (49 ، 50). أشارت دراسة حديثة قائمة على الأتراب إلى أن ما يقرب من 43 في المائة من المرضى المصابين بسرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) يخضعون للالتهاب الرئوي الجرثومي وتعفن الدم ، تليها الالتهابات الفطرية (51).

هذا يؤكد ملاحظتنا للقدرة المبطلة للخلايا المضيفة التي تحمل طفرة FBXW7 على الإحساس بمسببات الأمراض والقضاء عليها. لذلك ، توفر نتائجنا تفسيرًا جزيئيًا غير متوقع للمخاطر المتزايدة للعدوى لدى مرضى CLL. تم إثبات الصلة بين تعدد الأشكال الوراثي في ​​جينات E3 ligase وقابلية الإصابة بالعدوى البكتيرية أيضًا من قبل مرضى باركنسون ، المعرضين للإصابة بحمى التيفود أو الجذام (14) ، مما يشير إلى المساهمة الجديرة بالملاحظة لـ E3 ligases في مناعة المضيف ضد الالتهابات البكتيرية والحفاظ عليها من حالة الاستقرار الخلوي.

في الختام ، قمنا بفك تشفير لغة عالمية لاستشعار مسببات الأمراض التي تعيش في العصارة الخلوية والتي يمكن أن يطبقها المضيف بكفاءة للتعرف على الكائنات الحية الدقيقة للتخلص منها لاحقًا. بشكل جماعي ، سلطت هذه النتائج الضوء على فهم عمليات المناعة الخلوية البدائية ، والتي يمكن تسخيرها لتكثيف المناعة المضادة للبكتيريا.

المواد والأساليب

زراعة الخلايا

كلا من خط الخلية A549 لسرطان الرئة السنخي البشري (النوع الثاني من الخلايا الرئوية) [مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC) رقم. CCL185)] وخط خلية سرطان عنق الرحم هيلا (ATCC رقم CRM-CCL -2) في وسط Dulbecco المعدل النسر (DMEM ؛ HiMedia) مع 10 في المائة من مصل الأبقار الجنيني (Gibco) عند 37 درجة و 5 نسبة ثاني أكسيد الكربون.

السلالات البكتيرية وظروف النمو

تمت زراعة SPN (R6 ، النمط المصلي 2 ، هدية من Tim J. Mitchell ، جامعة برمنغهام ، المملكة المتحدة) في مرق Todd-Hewitt المضاف إليه 1.5 في المائة من مستخلص الخميرة عند 37 درجة في 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم استخدام المضادات الحيوية التالية لتنمية مزارع العقيدات الرئوية الانفرادية عند الحاجة: كاناميسين (2 0 0 ميكروغرام / مل) ، سبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) ، وكلورامفينيكول (4.5 ميكروغرام / مل). تم خلط تسعمائة ميكرولتر من 0.4 OD600 (كثافة بصرية عند 600 نانومتر) المزروعة SPN مع 600 ul من 80 في المائة من الجلسرين المعقم (32 في المائة من تركيز الجلسرين النهائي) وتم تخزينها في مجمد عميق بدرجة 80 درجة. تم استخدام مخزون الجلسرين هذا كقاح بداية لجميع التجارب.

تم زراعة Escherichia coli DH5 و STm (ATCC 14 0 28) في مرق Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة تحت ظروف الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة) ، وعند الضرورة ، تم استخدام المضادات الحيوية التالية: كاناميسين (50) ميكروغرام / مل) ، سبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) ، كلورامفينيكول (20 ميكروغرام / مل) ، والأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل). بالنسبة لجميع فحوصات العدوى ، نمت البكتيريا حتى OD ~ 0.4 ، تليها إعادة التعليق في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) إلى كثافة مماثلة قبل إصابة الخلايا المضيفة.

فحص البروتينات المستهدفة اليوبيكويتين المفترضة

تم تحديد جميع البروتينات السطحية الموجودة في بروتين STm و SPN لأول مرة من الأدبيات المنشورة. تم الحصول على تسلسل البروتين الكامل للبروتينات السطحية من UniProt ، والتي تم استخدامها بعد ذلك لتحديد وجود أشكال ديغرون. تم تنسيق مجموعة من 29 نموذجًا مفترضًا للجرون من الأدبيات المنشورة (24 ، 52 ، 53) وقاعدة بيانات حقيقية النواة الخطية. تم استخدام وحدة Regex في Python لتحديد موقع كل هذه الأشكال المنسقة في تسلسل البروتين السطحي. تم إجراء بحث خطي أيضًا لتحديد وجود بقايا ليسين قريب (8 إلى 14 من بقايا الأحماض الأمينية) لكل نموذج ديغرون محدد. من المفترض أن تعمل بقايا اللايسين هذه كموقع ربط لشق يوبيكويتين. أخيرًا ، تم تغذية تسلسل البروتين في القائمة المختصرة في IUPred (54) ، وهي أداة تنبؤية بهيكل البروتين ، لتحديد وجود منطقة مضطربة بين عزر الديغرون والليسين القريب. تم اختيار البروتينات الناتجة (BgaA و PspA لـ SPN و RlpA لـ STm) للتقييم كأهداف انتشار وفك تشفير دورها في إزالة مسببات الأمراض.

بناء سلالة بكتيرية

تم إجراء التبادل الأليلي عن طريق إعادة التركيب المتماثل باستخدام مناطق مجاورة للجينات تحمل كاسيت مضاد حيوي مدرج لتوليد سلالات متحولة في كل من SPN و STm (الجدول S2).

بالنسبة إلى SPN ، 500- تم تضخيم مناطق المنبع والمصب من bgaA و pspA وجيناته من الجينوم باستخدام بادئات مناسبة (الجدول S3) وتم تجميعها في ناقل pBKS. بعد استنساخ هذه الأجزاء ، تم إدخال كاسيت مقاوم للمضادات الحيوية (سبيكتينوميسين للحقيبة وكذلك pspA وكلورامفينيكول لـ hysA) في هذا البناء. تم بعد ذلك تحويل البلازميدات المؤتلفة الخطية إلى WT SPN باستخدام الببتيد المحفز للكفاءة 1 (GenPro Biotech) ، وتم اختيار المواد المؤتلفة باستخدام المضادات الحيوية ذات الصلة ، وتم تأكيد استبدال الجين عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وتسلسل مواقع الجينات المعنية. بالنسبة لـ STm ، تم استخدام طريقة recombinase λ الأحمر لتوليد طفرات حذف الجينات (55).

باختصار ، تم إلحاق متواليات متجانسة لنهايات جين الحبل في متواليات التمهيدي المستخدمة لتضخيم شريط مقاومة الكاناميسين. تم بعد ذلك إمداد الكاسيت بالكهرباء في سلالة WT STm ، وتم اختيار الضربات القاضية الناتجة عن إعادة التركيب المتماثل بناءً على مقاومة الكاناميسين. تم تأكيد حذف الجينات باستخدام PCR وتسلسل موضع الجين. تم استنساخ كامل الطول pspA و hysA و bgaA-T المقطوع (من 1 إلى 3168 نقطة أساس) تحت مروج P23 في ناقل المكوك pIB166 (56) واستخدمت للتكميل.

تم استخدام هذه البلازميدات المؤتلفة أيضًا للطفرات الموجهة للموقع لتوليد متغيرات مختلفة من bgaA-T (bgaA-TK96R و bgaA-TK97R و bgaA-TK96R و K97R و bgaATΔDegron) و pspA (pspAK314R و pspAK315R و pspAAK314R و pspAK315R و pspAAK314R و ) ، و (hysADegron-BgaA و hysADegron-PspA) باستخدام مجموعات التمهيدي المناسبة (الجدول S3) وتحويلها إلى طفرات ΔbgaA و ΔpspA. تم التحقق من جميع الحيوانات المستنسخة عن طريق تسلسل الحمض النووي. تم تأكيد التعبير عن أنواع مختلفة من BgaA و PspA و HysA بواسطة لطخة ويسترن باستخدام الأجسام المضادة المناسبة.

الأجسام المضادة والكواشف

مصل مضاد Enolase ومضاد PspA (S. Hammerschmidt ، جامعة جرايفسفالد ، ألمانيا) ؛ مصل مضاد لـ BgaA (S. King ، جامعة ولاية أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ والأجسام المضادة الخاصة بـ His6 (Invitrogen، MA 1-21315)، K 48- Ub linkage (Millipore، 05-1307)، K 63- Ub linkage (Millipore، 14-6077-80 )، Ply (Santa Cruz Biotechnology، sc -80500)، FBXW7 (Bethyl Laboratories، A 301-721 A)، SKP1 (Invitrogen، MA 5-15928)، Cullin1 (Invitrogen، {{15} }) و glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (Millipore، MAB374)، GSK3 [Cell Signaling Technology (CST)، D5C5Z]، phosphothreonine (CST، 9381S)، IgA، Kappa from Murine myeloma، clone TEPC -15 (Sigma-Aldrich M1421) و PSMB7 (Invitrogen ، PA 5-111404). تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: الفجل الفجل بيروكسيديز (HRP) - مضاد للأرنب ذو علامات (BioLegend ، 406401) ، مضاد للفأر بعلامة HRP (BioLegend 405306) ، مضاد للأرنب Alexa Fluor 488 (Invitrogen ، A27206) ، مضاد للأرنب Alexa فلور 555 (Invitrogen ، A31572) ، غلوبولين مناعي مترافق مع البيوتين A (تقنيات الحياة ، M31115) ، مضاد للفأر Alexa Fluor (Invitrogen ، A31570) ، مضاد للفأر Alexa Fluor 488 (Invitrogen ، A21202) ، مضاد للماعز Alexa Fluor 633 (Invitrogen، A21082) و FM 4-64 (Thermo Fisher Scientific، T13320).

تعبير البروتين وتنقيته

تم استنساخ BgaA-T ومتغيراته في pET28 باستخدام مواقع تقييد Xba I / Not I. تم تحويل البلازميدات المؤتلفة التي تشفر BgaA-T بعلامته N-terminal إلى خلايا E. coli BL21 (DE3) للتعبير عن البروتين. نمت الطوائف المحولة حديثًا في LB المحتوي على كاناميسين (5 0 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة على حاضنة شاكر لمدة 12 ساعة. تمت إضافة واحد بالمائة من الثقافة الأولية إلى لتر واحد من مرق LB وحضنت عند 37 درجة على حاضنة شاكر حتى وصل OD6 0 0 نانومتر بين 0.6 و 0.8. تم تحفيز تعبير البروتين عن طريق إضافة 100 ميكرومتر من الأيزوبروبيل - - D-thiogalactopyranoside (IPTG) وزيادة الثقافة عند 37 درجة لمدة 5 إلى 6 ساعات مع التحريك عند 150 دورة في الدقيقة.

تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي عند 6 0 00 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات. تم إعادة تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت A [25 ملي تريس (درجة الحموضة 8.0) و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم] وتم فصلها عن طريق الصوتنة. تم فصل حطام الخلية بالطرد المركزي (14 ، 000 دورة في الدقيقة ، 50 دقيقة ، 4 درجات) ، وتم وضع المادة الطافية على عمود Ni-NTA ، تمت معايرته باستخدام المخزن المؤقت A. تمت تصفية A ، والبروتينات التي تحمل علاماته باستخدام imidazole (250 مم) في المخزن المؤقت A. تم التعبير عن جميع متغيرات BgaA-T وتنقيتها باستخدام نفس الإجراء. تم استنساخ FBXW7 في متجه pGEX -4 T -1 الذي يحتوي على علامة N-terminal glutathione S-transferase (GST) من متجه pCMV 6- Entry-FBXW7 باستخدام إنزيم تقييد Eco RI.

تم التعبير عن FBXW7 الموسومة بعلامة GST في خلايا E. coli BL21 (DE3) بعد تحريض تعبير البروتين بـ 0. 1 ملي مولار IPTG والنمو عند 3 0 درجة لمدة 4 ساعات. تمت تنقية GST-FBXW7 من مستخلص خام الإشريكية القولونية باستخدام كروماتوجرافيا عمود الجلوتاثيون-سيفاروز (GE HealthCare). تم تجميع الكسور التي تحتوي على بروتينات نقية وتركيزها حتى 0.5 مجم / مل باستخدام مرشح قطع الوزن الجزيئي 10- كيلو دالتون (Amicon) بالطرد المركزي عند 4700 دورة في الدقيقة عند 4 درجات. تم فحص نقاوة البروتينات في الرحلان الكهربائي للهلام SDS – polyacrylamide (SDS-PAGE) متبوعًا بالتلوين باللون الأزرق Coomassie.

انتقال الخلايا المضيفة

تم استنساخ BgaA-T في ناقلات الدوكسيسيكلين المحرضة pAK _ Tol 2_ TRE _ Blast (Addgene no. 130261) باستخدام مجموعة استنساخ التسريب (Takara). تم تأكيد استنساخ إيجابي عن طريق تسلسل Sanger. تم إجراء طفرة FBXW7R505C عن طريق الطفرات الموجهة بالموقع باستخدام pMRX-GFP-FBXW7 كقالب وأكدها تسلسل Sanger. تم إجراء جميع عمليات العدوى باستخدام كاشف Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) ، وتم إجراء التحديدات في وجود هيدروكلوريد البلاستيدين (2 ميكروغرام / مل ؛ HiMedia).

ضربة قاضية للجينات الموجهة من siRNA

بالنسبة إلى الضربة القاضية بوساطة تداخل الحمض النووي الريبي لجينات معينة ، تم استخدام siRNAs التالية: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L -004246-00-0005) ، siCullin1 (Qiagen ، 1027423) ، siSKP1 (Qiagen ، SI00301819) ، و siGSK3 (Dharmacon) SMARTpool L -003010-00-0005). باختصار ، تم نقل خلايا A549 المزروعة في لوحة بئر 24- بشكل عابر باستخدام siRNAs الخاصة بالجينات أو التدافع (siControl) (150 pmol) باستخدام Lipofectamine 3000 وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ستة وثلاثين ساعة من تعداء العدوى ، تمت معالجة الخلايا من أجل النشاف الغربي والتألق المناعي أو فحوصات حماية البنسلين-جنتامايسين.

التنبؤ الهيكل والنمذجة

تم توقع جميع الهياكل بواسطة AlphaFold (Protein Homology / analogy Recognition Engine V 2. 0) (57) وتم تصورها باستخدام PyMOL (نظام الرسومات الجزيئية PyMOL ، الإصدار 2. 0 Schrödinger ، LLC). تم ترميز الهياكل بالألوان في PyMol بناءً على درجات IUPred (54) التي تتراوح من مرتبة (أزرق) إلى مضطرب (أحمر) إلى أبيض.

النشاف الغربي

نمت ثقافات SPN إلى {{0}}. تم ​​تحليل 4 OD600 نانومتر عن طريق الصوتنة ، وتم جمع المستخلصات الخام بعد الطرد المركزي (15 ، 000 دورة في الدقيقة ، 30 دقيقة ، 4 درجات). بالنسبة إلى A549s ، تم غسل الطبقات الأحادية عدة مرات باستخدام PBS وتم فصلها في محلول منظم للمناعة الراديوية الراديوية المثلج (RIPA) [50 ملي مولار تريس- Cl (الرقم الهيدروجيني 7.89) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 بالمائة تريتون X -100 ، 0.5 بالمائة صوديوم deoxycholate ، و 1٪ SDS] يحتوي على كوكتيل مثبط للبروتياز (Promega) ، وفلوريد الصوديوم (10 ملي مولار) ، و EDTA (5 ملي مولار). تم صوت تعليق الخلية لفترة وجيزة وطردها لجمع محللات الخلية. تم فصل البروتينات الموجودة في محللات الخلية البكتيرية أو A549 (10 أو 20 ميكروغرام) على 12 بالمائة من المواد الهلامية SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين المنشط. بعد الحجب في حليب منزوع الدسم بنسبة 5 في المائة ، تم فحص الأغشية باستخدام الأجسام المضادة الأولية المناسبة وعلامة HRP. تم تطوير البقع أخيرًا باستخدام ركيزة مضيئة كيميائية محسنة (Bio-Rad).
مقايسة حماية البنسلين جنتاميسين

نمت سلالات SPN حتى OD6 0 0 نانومتر 0. 4 في مرق Todd-Hewitt المضاف إليه 0. تم ​​تكوير 2 بالمائة من مستخلص الخميرة (THY) ، وتعليقها في PBS ( الرقم الهيدروجيني 7.4) ، وتم تخفيفه في وسط الفحص لعدوى الطبقات الأحادية A549 مع تعدد العدوى (MOI) من 10. بعد ساعة واحدة من الإصابة ، تم غسل الطبقات الأحادية بـ DMEM وحضنت بوسط اختبار يحتوي على البنسلين (10 ميكروغرام / مل) ) والجنتاميسين (400 ميكروغرام / مل) لمدة ساعتين لقتل العقيدات الرئوية الانفرادية خارج الخلية. تم بعد ذلك تحليل الخلايا باستخدام 0.025 بالمائة من Triton X -100 ، وتم طلاء المحللة على ألواح أجار Brain Heart Infusion لتعداد SPN القابلة للحياة. تم حساب النسبة المئوية للغزو على أنه [وحدات تكوين المستعمرات (CFU) في المحللة / CFU المستخدمة للعدوى] × 100. لتقييم البقاء داخل الخلايا ، بعد 9 ساعات من الإصابة (من بداية علاج البنسلين-جنتامايسين) ، تم تحضير محللات الخلية على شكل المذكورة أعلاه ، وتم تعداد البكتيريا المطلية والباقية المنتشرة. تم تمثيل كفاءة البقاء على قيد الحياة (النسبة المئوية) كتغير ضعيف في النسبة المئوية للبقاء بالنسبة للتحكم في النقطة الزمنية المشار إليها (تطبيع إلى 0 ساعة).

تألق مناعي

لمقايسة التألق المناعي ، نمت خلايا A549 أو خلايا هيلا على أغطية زجاجية وأصيبت بسلالات SPN أو STm في وزارة الداخلية ~ 25 لمدة ساعة واحدة تليها المعالجة بالمضادات الحيوية لمدة ساعتين. في النقاط الزمنية المرغوبة بعد الإصابة (9 ساعات للعدوى SPN في A549s و 3 ساعات للعدوى بـ STm في HeLa) ، تم غسل الخلايا بـ DMEM وتثبيتها بميثانول مثلج عند −2 0 درجة لمدة 10 دقائق. علاوة على ذلك ، تم حظر الأغطية باستخدام 3 في المائة من ألبومين مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT). عولجت الخلايا بعد ذلك بجسم مضاد أولي مناسب في 1 بالمائة من مساحة سطح الجسم في برنامج تلفزيوني طوال الليل عند 4 درجات ، وغسلها ببرنامج تلفزيوني ، وحضنت بجسم مضاد ثانوي مناسب في 1 بالمائة من مساحة سطح الجسم في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. أخيرًا ، تم غسل الأغطية باستخدام PBS وتركيبها على منزلقات زجاجية مع VECTASHIELD مع أو بدون 4 ′ ، 6- دياميدينو -2- فينيليندول (مختبرات المتجهات) للتصور باستخدام مجهر متحد البؤر المسح بالليزر (LSM 780 ، كارل زايس ) أقل من 40 × أو 63 × أهداف نفطية. تم الحصول على الصور بعد التقسيم البصري ثم معالجتها باستخدام برنامج ZEN lite (الإصدار 5.0). تم إجراء الفحص المجهري فائق الدقة بالمثل باستخدام Elyra 7 (Carl Zeiss) في وضع SIM. لتحليل التلوين ، تم تسجيل البكتيريا عن طريق العد البصري لـ n> 100 بكتيريا لكل تكرار.

المجهر الإلكتروني للإرسال

بعد الإصابة بـ SPN و STm ، تم غسل الخلايا بـ {{0}}. 1 M محلول كاكوديلات الصوديوم ، مثبت بنسبة 2.5 بالمائة من الجلوتارالدهيد (Sigma-Aldrich) في 0. 1 M محلول كاكوديلات الصوديوم ( Sigma-Aldrich) لمدة 3 ساعات في 4 درجات. بعد التثبيت ، تم جمع الخلايا من خلال مكشطة الخلية وتكويرها عند 2 0 00 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام محلول مؤقت لكاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار وتم تثبيته لاحقًا باستخدام 1 في المائة من رابع أكسيد الأوزميوم في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات. بعد الغسل اللاحق باستخدام محلول كاكوديلات والماء المقطر ، تم تجفيف الخلايا بعد ذلك بتركيزات متزايدة من الإيثانول (50 ، 70 ، 95 ، و 100 بالمائة) وأكسيد البروبيلين لمدة 30 دقيقة وأخيرًا يتم دمجها في راتنجات الإيبوكسي (Electron Microscopy Science ، 14300) بواسطة بلمرة عند 75 درجة لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، تم نقل الكبسولات إلى فرن 95 درجة لمدة 45 دقيقة. تم قطع المقاطع الرقيقة (70 نانومتر) باستخدام سكين ماسي على Leica EM UC7 Ultramicrotome وملطخة بنسبة 2 في المائة من أسيتات اليورانيل و 1 في المائة من سترات الرصاص وعرضها باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الحركة (Talos L120 C ، Thermo Fisher Scientific) عند 120 كيلو فولت.

انتشار الجسم الحي

تمت معالجة 549- معبر BgaA-T ومتغيراته باستخدام MG132 (5 ميكرومتر) ، وتم تحفيز تعبيرات البروتين باستخدام الدوكسيسيكلين (100 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة. تم بعد ذلك فصل الخلايا في محلول RIPA المؤقت ، وتم فصل العينات بواسطة SDS-PAGE (8 بالمائة). تم إثبات تأكيد التعبير البروتيني وانتشار BgaA-T ومتغيراته عن طريق لطخة غربية بعد التحقيق باستخدام أضداد BgaA و anti-K 48- Ub ، على التوالي.

التواجد في المختبر

بالنسبة لفحوصات التواجد في المختبر ، تمت تنقية البروتينات المؤتلفة كما هو موضح سابقًا (58). تم تحضين مركب SCFFBW7 E3 ligase مع مادة مؤتلفة 0. 1 ملي مولار E1 (UBE1 ؛ بوسطن بيوتشيم) ، 0. 25 ملي مولار إي 2 (cdc34 ؛ بوسطن بيوكيم) ، ويوبيكويتين (2.5 ميكروغرام / مل ؛ بوسطن Biochem) في وجود BgaA-T المنقى ومتغيراته. تم إجراء تفاعلات الانتعاش في محلول الفحص [5 0 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8) ، 5 ملي مولار MgCl ، 5 ملي أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، 1 ملي مولار كابتو إيثانول ، و 0.1 بالمائة توين 20] لمدة ساعتين عند 25 درجة . تم إيقاف التفاعلات باستخدام محلول 5 × Laemmli ، وحلها على المواد الهلامية SDS-PAGE ، وتحليلها عن طريق التخمير المناعي باستخدام جسم مضاد لـ BgaA.

في فحص المختبر كيناز

لإجراء فحص في المختبر كيناز ، تم استخدام نظام إنزيم GSK3 كيناز (Promega) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة مع التعديلات التالية. باختصار ، تمت إضافة 3 ميكروغرام من BgaA-T المؤتلف إلى 0. 5 ميكروغرام من GSK3 النشط مع 4 0 0 ميكرومتر من ATP في المخزن المؤقت للتفاعل المكون من 40 ملي مولار تريس ، (درجة الحموضة 7.5) ، 20 ملي مولار MgCl2 ، BSA (0.1 مجم / مل) ، و 50 ميكرومتر ديثيوثريتول. تم تحضين التفاعل لمدة ساعتين عند 30 درجة وتوقف بإضافة 1 × منظم Laemmli. تم بعد ذلك غلي العينات وفصلها بالكهرباء من أجل النشاف الغربي كما ذكر سابقًا. تم الكشف عن BgaA-T الفسفوري بأجسام مضادة مضادة للفوسفوتريونين.

في نموذج فيفو

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 في المائة من وزن الجسم ، وإفرازات الأنف أو العين. تم الحصول على عينات الدم عن طريق ثقب القلب تحت التخدير النهائي ، وتم استئصال الطحال بعد الوفاة من أجل التعداد البكتيري. تمت معالجة عينات الأنسجة باستخدام الخالط اليدوي للأنسجة ، وتم تخفيف المتجانسات بشكل متسلسل في برنامج تلفزيوني قبل اكتشافها على ألواح أجار الدم. تم تحضين الأطباق طوال الليل عند 37 درجة ، و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، وتم تقييم أعداد المستعمرات البكتيرية في اليوم التالي.

تحليل احصائي

تم استخدام الإصدار 5 من GraphPad Prism للتحليل الإحصائي. الاختبارات الإحصائية التي تم إجراؤها للتجارب الفردية مذكورة في أساطير الشكل ذات الصلة. تم اعتبار P <0. 05 ذات دلالة إحصائية. تم اختبار البيانات من أجل الوضع الطبيعي وتحديد التباين لكل مجموعة تم اختبارها. تضمنت جميع التحليلات متعددة العوامل تصحيحات لمقارنات متعددة ، ويتم تقديم البيانات كوسائل ± SD ما لم ينص على خلاف ذلك.

المراجع والملاحظات

ME Bianchi و DAMPs و PAMPs و alarmins: كل ما نحتاج إلى معرفته عن الخطر. J. ليوكوك. بيول. 81 ، 1-5 (2007).

2. TH Mogensen ، التعرف على العوامل الممرضة والإشارات الالتهابية في الدفاعات المناعية الفطرية. كلين. ميكروبيول. القس 22 ، 240-273 (2009).

3. K. Ray ، B. Marteyn ، PJ Sansonetti ، CM Tang ، الحياة في الداخل: نمط الحياة داخل الخلايا للبكتيريا العصارية الخلوية. نات. القس ميكروبيول. 7 ، 333-340 (2009).

4. X. جيانغ ، ZJ Chen ، دور الانتشار في كل مكان في الدفاع المناعي وتجنب مسببات الأمراض. نات. القس إمونول. 12 ، 35-48 (2011).

5. Vozandychova، P. Stojkova، K. Hercik، P. Rehulka، J. Stulik، The ubiquitination system داخل تفاعلات البكتيريا المضيفة الممرضة. الكائنات الحية الدقيقة 9 ، 638 (2021).

6. E. Fiskin ، T. Bionda ، I. Dikic ، C. Behrends ، التحليل العالمي للمضيف والبكتيريا ubiquitinome استجابة لعدوى السالمونيلا التيفيموريوم. مول. الخلية 62 ، 967-981 (2016).

7. Q. Chai، X. Wang، L. Qiang، Y. Zhang، P. Ge، Z. Lu، Y. Zhong، B. Li، J. Wang، L. Zhang، D. Zhou، W. Li، يقوم W. Dong ، Y. Pang ، GF Gao ، CH Liu ، بتجنيد بروتين سطح المتفطرة السلية ubiquitin لتحفيز مضيف xenophagy. نات. كومون. 10 ، 1973 (2019).

8. EG Otten، E. Werner، A. Crespillo-Casado، KB Boyle، V. Dharamdasani، C. Pathe، B. Santhanam، F. Randow، Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 أثناء العدوى البكتيرية. طبيعة 594 ، 111-116 (2021).

9. A. Yamada ، M. Hikichi ، T. Nozawa ، I. Nakagawa ، FBXO2 / SCF ubiquitin ligase complex يوجه xenophagy من خلال التعرف على الجليكان السطحي البكتيري. مندوب EMBO.22 ، e52584 (2021).

10. P. Engstrom، TP Burke، CJ Tran، AT Iavarone، MD Welch، Lysine methylation تحمي العامل الممرض داخل الخلايا من الانتشار الشامل والالتهام الذاتي. علوم. حال. 7 ، eabg2517 (2021).

11. J. Celli ، LRSAM1 ، وهو E3 يوبيكويتين يجاز مع حاسة للبكتيريا. ميكروب مضيف الخلية 12 ، 735-736 (2012).

12. LH Franco ، VR Nair ، CR Scharn ، RJ Xavier ، JR Torrealba ، MU Shiloh ، B. Levine ، يعمل ubiquitin ligase Smurf1 في الالتهام الذاتي الانتقائي لمرض السل المتفطري والدفاع المضاد للسل. ميكروب مضيف الخلية 21 ، 59-72 (2017).

13. J. Noad، A. von der Malsburg، C. Pathe، MA Michel، D. Komander، F. Randow، LUBAC تقوم سلاسل يوبيكويتين الخطية المصنعة بتقييد البكتيريا التي تغزو العصارة الخلوية عن طريق تنشيط الالتهام الذاتي و NF-B. نات. ميكروبيول. 2 ، 17063 (2017).

14. PS Manzanillo، JS Ayres، RO Watson، AC Collins، G. Souza، CS Rae، DS Schneider، K. Nakamura، MU Shiloh، JS Cox، ubiquitin ligase parkin يتوسط مقاومة مسببات الأمراض داخل الخلايا. طبيعة 501 ، 512-516 (2013).

15. M. Polajnar، MS Dietz، M. Heilemann، C. Behrends، توسيع آلية الانتشار الشامل للخلايا المضيفة التي تستهدف السالمونيلا الخلوي. ممثل EMBO.18 ، 1572-1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com