تحليل تعبير MicroRNA بعد تدخل الجلوتامين في إصابة ضخ الدم بنقص التروية الكلوية الحادة

خلفية.نقص التروية-ضخهإصابة الكلى الحاد(I/R AKI) هو أمرض الكلى الحادمع ارتفاع معدل الوفيات والمراضة. هدفت هذه الدراسة إلى استكشافآلية الحماية من الجلوتامين(GLN) ضد I/R AKI.طُرق. ذتم إنشاء نموذج الفئران الإلكترونية I/R AKI، وHEتلطيخ أنسجة الكلى والكرياتينين في الدمتم إجراء الكشف عن (SCr) ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN). تم تسلسل miRNAs بواسطة إنتاجية عاليةعينات أنسجة الكلى الفئران. تم فحص miRNAs المعبر عنها تفاضليًا (DEmiRs) بين مجموعة I / R ومجموعة I / R + GLN، وتم إجراء تحليل التخصيب للجينات المستهدفة من DEmiRs. وفي الوقت نفسه، تمت زراعة خلايا HK-2 البشرية، وتم إنشاء نموذج I/R للتحقق من تعبير DEmiRs.نتائج.بالمقارنة مع مجموعة I/R، كانت مستويات SCr وBUN في كل نقطة زمنية أقل في مجموعة I/R + GLN. تم تقليل التنكس الفراغي للأنابيب الكلوية في مجموعة I/R + GLN بشكل ملحوظ. في 104 DEmiRs، اخترنا miR-132-5p وmiR- 205 وmiR-615 كـ miRNAs رئيسية. أظهر تحليل KEGG أن مسار إشارات Notch ومسار إشارات PI3K-Akt ومسار إشارات cGMP كانت مرتبطة بشكل أساسي بـ GLN ضد I/R. تحقق qRT-PCR من تقليل تنظيم miR -205 في مجموعة I/R، مقارنة بمجموعة I/R الوهمية وGLN. تم إنشاء نموذج I/R باستخدام خلايا HK-2، وانخفض التعبير عن miR- 132-5p وmiR-205.

خاتمة.قام GLN بتخفيض AKI الناجم عن I / R. كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين تعبير ميرنا في I / R بعد علاج GLN. قد تكون عملية GLN ضد AKI الناجم عن I / R مرتبطة بمسار إشارات Notch و PI3K-Akt.

مستخلص سيستانش مع 25% إكيناكوسيد و9% أكتيوسايد للكلى

1 المقدمة

إصابة الكلى الحاد(آكي) يتميز بوظيفة الكلى الحادةويؤثر على 13.3 مليون شخص كل عام [1]. من بين مجموعة متنوعة من العوامل، الكلىإصابة نقص التروية - ضخه(I/R) هو أحد الأسباب الأساسية لـ AKI ومشكلة حتمية فيزرع الكلى[2، 3]. يرتبط التهاب المفاصل الروماتويدي المرتبط بـ I / R بارتفاع معدلات المراضة والوفيات وليس له حاليًا علاج فعال [4].

في الممارسة السريرية، يتجلى AKI من خلال تراكم المنتجات النهائية لاستقلاب النيتروجين (اليوريا والكرياتينين) وانخفاض إنتاج البول [5]. بالإضافة إلى ذلك، كان هناك ضرر مصاحب للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية والأوعية الدموية واستجابة التهابية قوية [6، 7]. وقد وجدت الدراسات الحديثة أن الجلوتامين، وهو دواء يستخدم كعلاج غذائي تقليدي لالتهاب المفاصل الروماتويدي، يمكن أن يحمي الكلى عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي [8، 9]. في ظل ظروف فسيولوجية معينة، يستخدم الجلوتامين على نطاق واسع كوقود استقلابي رئيسي للكلى والجهاز المناعي [10، 11]. ومع ذلك، فإن آلية الحماية المحددة له لا تزال قيد الدراسة.

تم الإبلاغ عن أن microRNAs (miRNAs)، وهو جزيء صغير محفوظ للغاية يتكون من 21-25 نيوكليوتيدات، مرتبط بـ I / R الكلوي و AKI [12، 13]. يمكن أن تلعب miRNAs دورًا وقائيًا في I / R الكلوي عن طريق تخفيفالاستجابة الالتهابية[14]. على الرغم من اكتشاف التأثيرات الوقائية لبعض miRNAs على IRI الكلوي، إلا أن آلية الحماية لا تزال غير واضحة.

حتى الآن، تم إجراء القليل من الدراسات حول آليةحماية الكلى بوساطة الجلوتامينعلى مستوى ميرنا. في هذه الدراسة، قمنا بتطبيق تقنية التسلسل عالي الإنتاجية لتحليل التعبير التفاضلي للmiRNAs في I / R الكلوي بعد تدخل الجلوتامين. اكتشفنا كذلك آلية الحماية للجلوتامين ضد I / R الكلوي على مستوى ميرنا.

2. المواد والأساليب

2.1. حيوان تجريبي.

تم توفير ما مجموعه 72 فئران Sprague Dawley (SD) من الذكور SPF، يتراوح وزنها بين 180 و260 جرامًا وتتراوح أعمارهم بين 90 و120 يومًا، من قبل مركز الحيوانات التجريبية التابع للمستشفى الأول التابع لجامعة شينجيانغ الطبية. تم الاحتفاظ بالفئران في بيئة ذات درجة حرارة ثابتة مع حصة يومية تجريبية موحدة دون التحكم في استهلاك المياه. + تم توزيعهم بصورة عشوائية بالتساوي إلى ثلاث مجموعات: المجموعة الوهمية، ومجموعة I/R، ومجموعة I/R + GLN. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي +e من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في المستشفى الأول التابع لجامعة شينجيانغ الطبية +e.

2.2. إنشاء النموذج الحيواني.

تم تخدير فئران SD عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 2٪ بنتوباربيتال الصوديوم (4 0 ملغم / كغم). مجموعة I/R: تم عمل شق في خط الوسط في البطن وتم كشف الكليتين، وتم استئصال الكلية اليمنى، وتم تثبيت الشريان الكلوي الأيسر. وبعد 45 دقيقة، تمت إزالة المشبك الوعائي. + تغير لون الكلى من الأحمر الداكن إلى الأحمر الفاتح، مما يعني أن الطفل خضع لعملية فيزيولوجية مرضية I/R، وتم ملاحظة الفئران لمدة ساعتين بعد إغلاق تجويف البطن. تم حقن NS والجلوتامين (0.75 جم/كجم) على التوالي باستخدام مضخة دقيقة من الوريد الذيلي بمعدل 0.5 مل/دقيقة بعد اكتمال النمذجة. مجموعة الشام: تم استئصال الكلية اليمنى بنفس الطريقة، ولم يتم تثبيت عنيق الكلية اليسرى. تم حقن المحلول الملحي الطبيعي (NS) باستخدام مضخة دقيقة من الوريد الذيلي بمعدل 0.5 مل/دقيقة بعد اكتمال النمذجة.

2.3. جمع العينات واختبارها.

تم اختيار ستة فئران من كل مجموعة بشكل عشوائي في كل نقطة زمنية (ساعة واحدة، 5 ساعات، 12 ساعة، و 24 ساعة بعد النمذجة)، ثم قُتلت الفئران تحت التخدير. + تم كشف الشريان الأورطي البطني، وتم جمع الدم الوريدي باستخدام حقنة. تم فصل المصل بشكل روتيني وتخزينه في الثلاجة عند درجة -80. + تم استئصال الكليتين بسرعة، وبعد ذلك، تم أخذ قطعة واحدة من الأنسجة من الكليتين الثنائيتين لوضعها في 10٪ من الفورمالديهايد المحايد وتثبيتها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجة. تم اختبار الكرياتينين في الدم (SCr) ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN) باستخدام محلل الكيمياء الحيوية الأوتوماتيكي بيكمان. تم تحضير كتلة البارافين من أنسجة الكلى الثابتة بعملية التجفيف والشفافية والتشريب بالشمع وتضمين الجفاف. ثم تم قطع كتل البارافين إلى أقسام، وتم إجراء تلطيخ.

2.4. تحليل التسلسل عالي الإنتاجية.

تم استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي لعينات أنسجة كلية الفئران من مجموعة I/R ومجموعة I/R + GLN وتقييمها للتأكد من جودتها. وفقا لعملية بناء مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة، تم نسخ عكس الحمض النووي الريبي (RNA) للأنسجة الكلوية المنقى إلى [كدنا]. +en، تم إجراء تضخيم PCR، وتنقيته، والكشف عن جودة مكتبة [كدنا] لاستكمال بناء مكتبة عينات التسلسل. ثم حصلنا على بيانات ملف FASTQ الأصلية.

2.5. تحليل المعلوماتية الحيوية.

Clean reads were classified and annotated from the FASTQ file. +e Rfam database, species reference transcripts, and repetitive sequence database were used to analyze the known miRNA annotations, miRNA prediction, and miRNA quantification. +e differentially expressed miRNAs (DEmiRs) were analyzed using the DESeq R package with |log2FoldChange|>2 و ف < 0.05. + تم إجراء التنبؤ الجيني المستهدف باستخدام قواعد بيانات RAID وmiRanda، على التوالي. تم أيضًا إجراء تحليل التخصيب لمسارات الجينات (GO) وKEGG للجينات المستهدفة باستخدام حزمة ClusterProfiler R. تم اعتبار P <0.05 بمثابة إثراء كبير.

2.6. تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).

تم جمع العينات منأنسجة الكلى الفئرانبعد 24 ساعة من النمذجة. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) ، وتم الحصول على منتجات [كدنا] من جميع miRNAs باستخدام مجموعة توليف [كدنا] الأولى من miRNA (Shenggong ، شنغهاي ، الصين). تم إجراء الكشف الكمي الإسفار باستخدام مجموعة PCR الكمية مضان ميرنا (Shenggong، شنغهاي، الصين) مع 3 الاشعال الخاصة ميرنا (الجدول 1). + تم استخدام طريقة التحليل الكمي النسبي (2−ΔΔCt) لحساب التعبير النسبي للميرنا المستهدف في كل مجموعة من العينات. + تم حساب التعبير النسبي لـ miRNA في كل مجموعة باستخدام تعبير U6 في كل عينة في كل مجموعة كمرجع.

2.7. تحليل احصائي.

تم تحليل البيانات بواسطة SPSS19.0. تم التعبير عن جميع البيانات على أنها الانحراف المعياري المتوسط ​​(يعني ± SD). تم استخدام اختبار +e t للمقارنة الزوجية بين المجموعات. أشارت P <0.05 إلى أن الفرق كان ذا دلالة إحصائية.

3. النتائج

3.1. تأثير الجلوتامين على وظيفة الكلى لدى الجرذان بعد إعادة ضخ الدم الإقفاري.

تم فحص مستويات SCr وBUN لأول مرة في المجموعات الثلاث من الفئران (الشكلان 1 (أ) و1 (ب)). استمر +e SCr وBUN في الزيادة من 1 إلى 24 ساعة، ووصل إلى الذروة عند 24 ساعة في مجموعة I/R، والتي كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في المجموعة الوهمية (P < 0.{{11} }5). في مجموعة I/R + GLN، تمت زيادة مستويات SCr وBUN من ساعة واحدة إلى 12 ساعة، ولكن الاتجاه المتزايد كان أبطأ من ذلك في مجموعة I/R. كانت مستويات SCr وBUN في كل نقطة زمنية أقل من تلك الموجودة في مجموعة I / R (P <0.05).

3.2. التغيرات النسيجية في كلى الفئران.

في المجموعة الوهمية، بعد 24 ساعة من الجراحة، كشفت المراقبة المجهرية أن بعض الأنابيب الكلوية في منطقة القشرة قد توسعت، وأظهرت بعض ظهارة الأنابيب الكلوية وذمة وانحطاطًا فجويًا، ولم يكن هناك أي شذوذ واضح في الكبيبات (الشكل 2 (أ) )). في مجموعة I/R، اختفت حدود الفرشاة للنبيبات الكلوية في المنطقة القشرية والمنطقة الانتقالية القشرية النخاعية، وأظهرت أعداد كبيرة من الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية وذمة وانحطاطًا فجويًا، في حين أظهر بعضها حركية النواة، وبقع السيتوبلازم الحمراء، نخر التخثر، والانفصال، وتشكيل الزهر

الشكل 1: التغييرات في مستويات الفئران Scr (a) وBUN (b) في نقاط زمنية مختلفة في كل مجموعة. ∗P < 0.05 مقارنة بالمجموعة الوهمية؛ # P <0.05 مقارنة بمجموعة I / R

الشكل 2: التغيرات النسيجية المرضية لكلية الفئران المكتشفة بواسطة تلطيخ HE. (أ) مجموعة الشام، (ب) مجموعة I/R، و(ج) مجموعة I/R + GLN. البار: 200×.

(الشكل 2 (ب)). لم يكن هناك أي علامة على وجود التهاب في النسيج الخلالي، ولم يلاحظ أي خلل واضح في الكبيبات. في مجموعة I/R + GLN، كان هيكل الكبيبة طبيعيًا تحت المجهر، وكانت بعض الخلايا الظهارية الأنبوبية منتفخة وأظهرت تنكسًا متضخمًا، وتم استئصال بعض الخلايا الظهارية الأنبوبية، وتوسعت بعض الأنابيب، وتم العثور على كمية صغيرة من البروتين المصبوب. (الشكل 2 (ج)).

3.3. تحديد miRNAs المعبر عنها تفاضليًا.

تم إجراء التحليل الإحصائي على miRNAs المعبر عنها تفاضليًا والتي تم فحصها من مجموعة I / R ومجموعة I / R + GLN. بالمقارنة مع مجموعة I/R + GLN، تم فحص ما مجموعه 104 miRNAs معبرًا عنها تفاضليًا كبيرًا في مجموعة I/R (الشكل 3 (أ)). من بينها ، أعرب 76 عن ميرنا المنتظم ، و 28 عبروا عن ميرنا المنتظم (الشكل 3 (ب)). بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام RAID وMiranda لإجراء التنبؤ الجيني المستهدف للجزيئات miRNA المعبر عنها بشكل تفاضلي كبير. وجدنا 436 جينة مستهدفة للتقاطع (الشكل 3 (ج)). +en، قمنا ببناء الشبكة التنظيمية للجينات المستهدفة لـ miRNA (الشكل S1). الأهم من ذلك أننا اخترنا miR -132-5 p و miR -205 و miR -615 منظمًا في مجموعة I / R باعتبارها miRNAs رئيسية لمزيد من الدراسة. أيضًا ، كان هناك 65 جينًا مستهدفًا لهذه miRNAs الثلاثة (الشكل 3 (د)). وفقًا لنتائج اكتشاف qRT-PCR في أنسجة الكلى، انخفضت مستويات التعبير لـ miR-132-5p وmiR-205 وmiR-615 في مجموعة I/R (الشكل 4 ).

3.4. الوظائف البيولوجية للجينات المستهدفة.

لتحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء التأثيرات العلاجية لـ GLN، أجرينا تحليلًا لإثراء الجينات المستهدفة. في نتائج GO (الشكل 5 (أ)) ، تم إثراء نقل الإشارة داخل الخلايا، وتنظيم تكاثر الخلايا الجذعية، والاستجابة الخلوية لنقص الأكسجة في العمليات البيولوجية (BP) بواسطة الجينات المستهدفة. علاوة على ذلك، تم إثراء مسار إشارات Notch ومسار إشارات PI3K-Akt ومسار إشارات cGMP PKG لمسارات KEGG بشكل كبير (الشكل 5 (ب)). ومن المثير للاهتمام أن rno-miR-132-5p يشارك في مسار cGMP-PKG من خلال استهداف Mylk.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

احصل على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد لعلاج عدوى الكلى