التمييز الكيميائي والوراثي لـ Cistanches Herba على أساس UPLC-QTOF / MS و DNA Barcoding

جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng و Xue Jiang و Labin Wu و Zenghui Wang و Linfang Huang *

الملخص

سيستانشHerba (Rou Cong Rong) ، المعروف باسم "Ginseng of the Desert" ، له تأثير علاجي مذهل على القوة والتغذية ، وخاصة في تقوية الكلى لتقوية اليانغ. ومع ذلك ، فإن الأصول النباتية اثنين من Cistanches Herba ،Cistanche DeserticolaوCistanche tubulosa، تختلف من حيث العمل الدوائي والمواد الكيميائيةعناصر. لتمييز أصل النباتسيستانشHerba ، وهو نظام يجمع بين أسلوبالمواد الكيميائيةووراثيتم استخدام تقنية –UPLC-QTOF / MS والترميز الشريطي للحمض النووي- أولاً في هذه الدراسة. أشارت النتائج إلى أنه تم الحصول على ثلاثة مركبات علامة محتملة (أيزومر كامبنوسيد II ، وسيستانوسيد C ، وسيستانوسيد أ) لتمييز الأصلين عن طريق تحليلات PCA و OPLS-DA. مكّن تشفير الحمض النووي الشريطي من التفريق بين أصلين بدقة. أظهرت شجرة نيوجيرسي أن أصلين يتجمعان في مجموعتين. النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن أصل اثنين منسيستانشتمتلك Herba مختلفةالمواد الكيميائيةالتراكيب ووراثيالاختلافات. هذا هو أول تقييم تم الإبلاغ عنه لأصلسيستانش هربا، وستسهل النتائج مراقبة الجودة وتطبيقها السريري.

انقر هنا للحصول على مزيد من المعلومات حول Cistanche

مقدمة

سيستانشHerba (Rou Cong Rong) ، المعروف باسم "Ginseng of the Desert" ، ينشأ من السيقان النضرة المجففةسيستانشDeserticola YC Ma و Cistanche tubulosa (Schrenk) شعر مستعار وفقًا لدستور الأدوية الصيني (إصدار 2010) ، ويشتهر بتوحيد لون الكلى ، مما يفيد جوهر الحياة ويريح الأمعاء. حاليًا ، يتم توزيع Cistanches Herba بشكل أساسي في الصحاري القاحلة والدافئة في شمال غرب الصين ، خاصة في مقاطعتي شينجيانغ ومنغوليا الداخلية. ومع ذلك ، فإن أصول Cistanches Herba تختلف من حيث نشاطها الدوائي والمواد الكيميائيةعناصر. تو وآخرون. التحقيق في ديكوتيون من ثلاثةسيستانشالأنواع (C. تشانغ وآخرون. قارن النشاط الدوائي بين C. ذكرت الأبحاث السابقة أنالمواد الكيميائيةمكون وأشار إلى اختلافالمواد الكيميائيةمكون ومحتوى لأصول النباتسيستانشهربا [3]. بالنسبة للتطبيق السريري والدورة الدموية في السوق ، كمنشط ، تم استخدام C. tubulosa تقليديًا كعامل محفز للدورة الدموية وفي علاج العجز الجنسي والعقم وألم الظهر وضعف الجسم في اليابان [4] - [8].

وبالتالي ، فإنه من الأهمية بمكان التمييز بين أصلينسيستانششركة Herba لمراقبة الجودة والتطبيق السريري. ومع ذلك ، لا يوجد تركيز بحثي على التمييز بين أصلين من Cistanches Herba. تم استخدام العديد من الطرق التي تم البحث عنها ، بما في ذلك الفحص المجهري ، والكشف عن الأشعة فوق البنفسجية ، والأشعة تحت الحمراء ، وطريقة تكرار التسلسل البسيط لتحديد جنس Cistanches ، ولكن ليس فقط لأصلين خاصة [9] - [20]. هنا ، استخدمنا بشكل مشتركالمواد الكيميائيةوالتقنيات الجزيئية للتمييز بين أصلينسيستانشHerba و UPLC-QTOF / MS (كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بمقياس الطيف الكتلي الرباعي لوقت الرحلة) وتشفير الحمض النووي الشريطي. يوفر UPLC-QTOF / MS المعلومات بسرعة وكفاءة أكبر مقارنة بالتقنيات الأخرى. أدت الانتقائية العالية والحساسية لـ UPLC-QTOF / MS إلى تطبيقه في كل من التحليلات الكمية والنوعية ، وكذلك في تحليل الأيض وتحديد المركبات المعقدة في الطب الصيني التقليدي [21] - [22]. تم أيضًا تطوير تحليل المكون الرئيسي (PCA) والإسقاط المتعامد لتحليل تمييز البنية الكامنة (OPLSDA) لتحديد مركبات الواسم المحتملة. يستخدم ترميز الحمض النووي الشريطي ، وهو تقنية علامات جزيئية أسهل وأكثر عالمية ، جزء من الحمض النووي لتحديد الأنواع أو الأجناس. إنه موضوعي وأكثر دقة وأسهل في الأداء من طرق التحديد التقليدية وتقنيات الواسمات الجزيئية الأخرى. علاوة على ذلك ، تم تطبيق تشفير الحمض النووي الشريطي بنجاح لتحديد الحيوانات والنباتات ، بما في ذلك النباتات الطبية [23] - [26].

الغرض من هذا البحث هو إنشاء نظام طريقة علمية ، يجمع بين UPLC-QTOF / MS و DNA barcoding ، للتمييز بين أصلين نباتيين منسيستانشهيربا.

المواد والأساليب

بيان الأخلاق

نؤكد أن الدراسات الميدانية لم تشمل الأنواع المهددة بالانقراض أو المحمية. تم تضمين إحداثيات نظام تحديد المواقع العالمي (GPS) في نموذج المعلومات ، يرجى الاطلاع على الجدول 1. "

الجدول 1 عينات منسيستانشDeserticola و Cistanche tubulosa.

WLMQ تعني مدينة Wu Lu Mu Qi ؛ GJH يعني Gan Jia Hu ؛ HBKSEMG تعني مقاطعة هوبوكسار منغول المتمتعة بالحكم الذاتي ؛ KLMY تعني مدينة Ke La Ma Yi ؛ BDJLSM تعني صحراء بدعين جران ؛ ALSZQ تعني Alxa Left Banner ؛ DSX تعني مقاطعة Dong San ؛ CL تعني مقاطعة Ce Le ؛ MF تعني مقاطعة مين فنغ ؛ HT يعني مقاطعة He Tian.

المواد النباتية والكواشف

ينبع من النضرةسيستانشتم جمع Herba من المناطق الصحراوية البرية في منغوليا الداخلية ، مقاطعات تشينغهاي ، منطقة شينجيانغ الويغورية ذاتية الحكم ، جمهورية الصين الشعبية (الجدول 1) في مايو 2012. تم جمع عينات البحث جميعًا في المناطق الصحراوية البرية ، وليس في الأراضي الخاصة ، حيث لا توجد أذونات محددة مطلوبة. تم تأكيد الهويات النباتية للسيقان من قبل الدكتور لينفانغ هوانغ. تم إيداع عينات القسيمة في معهد تطوير النباتات الطبية. تم استخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) - أسيتونيتريل من الدرجة (Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا) وحمض الفورميك (Tedia ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحليل UPLC. تمت تنقية المياه منزوعة الأيونات باستخدام نظام Milli-Q (ميليبور ، بيدفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). كل الآخرينمواد كيميائيةكانت من الدرجة التحليلية.

إعداد عينة

سيستانشتم نقل عينات Herba (1. 0 جم ، 65- شبكة) إلى دورق مخروطي 50- مل ، وتمت إضافة 5 0 مل من 70 بالمائة من الميثانول. بعد النقع لمدة 30 دقيقة ، تم إجراء الموجات فوق الصوتية (35 كيلو هرتز) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي عند 10 ، 000 دورة / دقيقة لمدة 10 دقائق ، تم تخزين المادة الطافية عند 4 درجات وتصفيتها من خلال غشاء 0. 22- ميكرومتر قبل الحقن في نظام UPLC-QTOF / MS للتحليل.

UPLC-QTOF / MS

لتحليل UPLC ، تم استخدام الأنظمة / المعلمات التالية: نظام Waters Acquity (Waters) المجهز بمضخة توصيل مذيبات ثنائية ، وجهاز أخذ العينات التلقائي وكاشف PDA متصل بمحطة بيانات Waters Empower 2 ؛ ultrasonication (25 0 غربًا ، 5 0 كيلوهرتز ، Kunshan Ultrasonic Instrument Co. ، Zhejiang ، الصين) ؛ ونموذج ميزان تحليلي إلكتروني AB 135-2 (Mettler-Toledo.، Greifensee، Zurich، Switzerland). تم استخدام عمود Waters Acquity UPLC BEH C18 (1.7 ميكرومتر ، 2.1 × 1 0 0 مم ، مياه) وعمود حماية Waters C18 (نفس المادة ، المياه) وصيانتهما عند 30 درجة. كان الطور المتحرك 0.1 في المائة من محلول حمض الفورميك المائي (أ) وأسيتونيتريل (ب) مع برنامج التدرج على النحو التالي: 0-3 دقائق ، 10-22 في المائة ب ؛ 3-4 دقائق ، 22-23 في المائة ب ؛ 4-6 دقائق ، 23-35 في المائة ب ؛ 6-8 دقائق ، 35-37 في المائة ب ؛ 8-11 دقيقة ، 37-42 في المائة ب ؛ 11-12 دقيقة ، 42-48 في المائة ب ؛ 12-15 دقيقة ، 48 في المائة - 50 في المائة ب بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة. كان حجم الحقن 5 ميكرولتر.

تم إجراء تحليل UPLC / MS على نظام QTOF Synapt G2 HDMS (ووترز ، مانشستر ، المملكة المتحدة) المجهز بمصدر تأين بالرش الكهربائي (ESI) يعمل في وضع الأيونات السالبة. تم استخدام N2 كغاز الإذابة. تم ضبط درجة حرارة الذوبان على 45 {{1 0} درجة بمعدل تدفق 800 لتر / ساعة ، وتم ضبط درجة حرارة المصدر على 120 درجة. تم ضبط الفولتية الشعرية والمخروطية على 2500 و 40 فولت على التوالي. تم جمع البيانات بين 50-1200 Da مع وقت فحص 0. 1- و 0. 01- s interscan تأخير خلال 15- دقيقة وقت التحليل. تم استخدام الأرجون كغاز تصادم عند ضغط 7.06661023 باسكال. تم جمع جميع بيانات MS باستخدام نظام LockSpray لضمان دقة الكتلة وقابلية التكاثر. تم استخدام [MH] - أيون ليسين إنكيفالين عند m / z 554.2615 ككتلة قفل في وضع ESI السالب.

بيانات UPLC-QTOF / MS لـسيستانشتم تحليل عينات Herba لتحديد المتغيرات التمييزية المحتملة. تم إجراء البحث عن الذروة والمحاذاة والتصفية لبيانات ES الأولية باستخدام مدير تطبيقات Marker Lynx ، الإصدار 4.1 (ووترز ، مانشستر ، المملكة المتحدة). كانت المعلمات المستخدمة على النحو التالي: زمن الاستبقاء (tR) من 0 - 15 دقيقة ، والكتلة من 5 0 - 12 0 0 دا ، والتسامح لوقت الاستبقاء 0.02 دقيقة ، والكتلة تحمل 0.02 Da. تم استخدام ثلاث عينات مكررة تم جمعها من كل موقع جغرافي (ن = 3). تم استخدام إجمالي 639 متغيرًا لإنشاء النموذج.

تشفير الحمض النووي الشريطي: استخراج الحمض النووي ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتسلسل

تم فرك العينات المأخوذة من السيقان اللحمية المجففة لنبات C. تم استخراج الحمض النووي وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة (Tiangen). على وجه التحديد ، تم تعديل البروتوكول بحيث تم استبدال الكلوروفورم بمزيج من الكلوروفورم: كحول أيزو أميل (24∶1 في نفس الحجم) ، ومحلول عازل GP2 مع أيزوبروبانول (نفس الحجم). تم وضع المسحوق في أنابيب إيبندورف 1.5 مل ، وإضافة 700 ميكرولتر 65 درجة مسخن مسبقًا GP1 و 1 ميكرولتر - كابتو إيثانول للخلط باستخدام دوامة لمدة 10-20 ثانية ، وحضنت لمدة 60 دقيقة عند 65 درجة ؛ إضافة 700 ميكرولتر من خليط الكلوروفورم: كحول أيزو أميل (24-1) ، جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 12000 دورة في الدقيقة (∼13400 × جم) ؛ مادة طافية بالماصة في أنبوب جديد ، بإضافة 700 ميكرولتر من الأيزوبروبانول ، والمزج لمدة 15-20 دقيقة ؛ وضع كل الخليط في عمود الدوران CB3 وجهاز الطرد المركزي لمدة 40 ثانية عند 12000 دورة في الدقيقة ؛ التخلص من المرشح وإضافة 500 ميكرولتر GD (إضافة كمية من الإيثانول اللامائي قبل الاستخدام) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية ؛ التخلص من المرشح وإضافة 700 ميكرولتر PW (إضافة كمية من الإيثانول اللامائي قبل الاستخدام) لغسل الغشاء ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 40 ثانية عند 12000 دورة في الدقيقة ؛ التخلص من المرشح وإضافة 500 ميكرولتر PW ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 40 ثانية عند 12000 دورة في الدقيقة ؛ التخلص من المرشح والطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 12000 دورة في الدقيقة لإزالة بقايا عازلة الغسيل PW ؛ نقل عمود الدوران CB3 إلى أنبوب إيبندورف نظيف سعة 1.5 مل ، وتجفيفه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق ؛ أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 12000 دورة في الدقيقة للحصول على الحمض النووي الكلي. اعتمدت المواد الأولية لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على التسلسلات التي تم الإبلاغ عنها سابقًا [4] ، [5]. احتوت مخاليط تفاعل PCR على 2- قالب DNA ميكرولتر ، 8. 5- ميكرولتر ddH2O ، 12. 5- ميكرولتر 2 × Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co. ، الصين) ، 1 / ​​{ {57}} من البادئات الأمامية / العكسية (F / R) ميكرولتر (2.5 ميكرومتر) ، في الحجم النهائي 25 ميكرولتر. تم إجراء تضخيم PCR كما وصفه Kress et al. [4]. كان التمهيدي لتفاعل PCR هو fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5 ′ -3 ′) ومراجعة TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5 -3 ′). تم فصل منتجات PCR واكتشافها بواسطة 1 في المائة من الاغاروز الكهربائي للهلام. تمت تنقية منتجات PCR باتباع بروتوكول الشركة المصنعة وتعرضت مباشرة للتسلسل.

محاذاة التسلسل والتحليل

تم جمع تسلسلات ITS و ITS2 من قاعدة بيانات GenBank. تم تقديم تسلسل من تسلسل العينات إلى قاعدة بيانات GenBank (تم إدراج أرقام الانضمام في الجدول 1) ، وتم تجميعها باستخدام CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co. ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ومحاذاة باستخدام ClustalW. كيمورا 2- مسافات المعلمة (K2P) ومحتوى GC للقاعدة وأشجار الانضمام المجاورة (NJ) تم حسابها وإنشاؤها باستخدام MEGA 5.05 مع طريقة Bootstrap (1000 إعادة تشكيل) ونموذج K2P [27]. فجوة الترميز الشريطي (منطقة المباعدة التي تكونت بين محددات داخلية وداخليةوراثيتم رسم الاختلافات) وكفاءة تحديد الهوية (القدرة على تحديد الهوية لمقارنة الرموز الشريطية المختلفة) وحسابها بناءً على الطريقة التي أبلغ عنها ماير وبولاي [28].

نتائج

تخصيص الذروة المؤقت بواسطة UPLC-QTOF / MS

يوضح الشكل 1 المخططات اللونية التمثيلية لنبات C.سيستانشعينات هربا. تم اكتشاف ما مجموعه 23 قمة كتلة مؤهلة وتم تحديد 16 قمة من خلال مطابقة أوقات الاحتفاظ وأطياف الكتلة مع تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقًا (الجدول 2) [29] - [35]. تم تحديد القمم 2 و 3 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 11 و 12 و 15 و 16 و 17 و 20 و 21 و 22 و 23 مبدئيًا على أنها cistanoside F ، mussaenoside acide ، cistanbuloside C1 / C2 ، campneoside II ، أيزومر من كامبنوسيد II ، إشيناكوسيد ، سيستانوسيد أ ، أكتيوسيد ، إيزوكتيوسيد ، سيرينغاليد أ -3 ′ - - L-rhamnopyranoside ، cistanoside C ، 2′-acetylacteosid ، osmanthuside B ، cistanoside ، D ، tubuloside cistancinenside A ، على التوالي.المواد الكيميائيةتم تحديد المكونات لتكون في المقام الأول جليكوسيدات فينيلثانويد (PhGs) ، في حين أن مركب واحد ، حمض موسينوسيد ، كان عديد السكاريد إيريدويد. PhGs هي المركبات النشطة الرئيسية من حيث علاج نقص الكلى ، ومضادات الأكسدة وتأثيرات الحماية العصبية [36].

الشكل 1 الشكل 1. اللوني التمثيلي لـ C. Deserticola و C. tubulosa.

على الجانب الأيسر ، تم جمع مخططات كروماتوجرام لنبتة C. الصحراء من مواقع مختلفة ؛ كان الجانب الأيمن عبارة عن مخططات كروماتوجرافية لـ C. tubulosa تم جمعها من مواقع مختلفة. يوضح هذا الشكل الاختلافات بين هذين الأصلين فيالمواد الكيميائيةمظهر.

الجدول 2 حدد مبدئيًا المركبات من C. Deserticola و C. tubulosa.

الأنيسول الخماسي الكلور من C. deserticola و C. tubulosa

تم استخدام الأنيسول الخماسي الكلور لتمييز عينات الأنواع النباتية المختلفة. PCA هي طريقة غير خاضعة للرقابة لتحليل البيانات متعددة المتغيرات تهدف إلى تصور أوجه التشابه و / أو الاختلافات داخل البيانات متعددة المتغيرات لتكوين المستقلب الثانوي [37]. شكل نموذج PCA المكون من مكونين 46.04 بالمائة من التباين (PC1 ، 36.43 بالمائة ؛ PC2 ، 9.61 بالمائة). يوضح الشكل 2 أن 24 عينة تم تجميعها في مجموعتين في درجات PCA المرسومة وفقًا لأصل الأنواع ، مما يشير إلى أن التركيب الكيميائي لنبات C.

الشكل 2 الشكل 2 PCA من C. Deserticola و C. tubulosa.

تم تجميع هذه العينات في مجموعتين وفقًا لأصل الأنواع ، مما يشير إلى أن التركيب الكيميائي بين C. الصحراء و C. tubulosa كان مختلفًا بشكل كبير.

تحديد OPLS-DA والعلامة

لتحديد الإمكاناتالمواد الكيميائيةعلامات التمييز بين النوعين ، تم إنشاء S- مؤامرة OPLS-DA (الشكل 3). في مخطط S ، تمثل كل نقطة زوجًا واحدًا من الأيونات tR – m / z. يمثل المحاور X و Y مساهمة وثقة الأيون ، على التوالي ؛ كلما زادت المسافة التي يشير إليها زوج الأيون t R-m / z عن الصفر ، زادت مساهمة / ثقة هذا الأيون في الفرق بين المجموعتين. وبالتالي ، فإن أيون tR – m / z الذي يشير إلى طرفي حرف "S" يمثل العلامات المميزة بأعلى ثقة في كل مجموعة.

الشكل 3 الشكل 3 OPLS-DA (S- مؤامرة) من C. Deserticola و C. tubulosa.

تمثل قطعة واحدة زوجًا واحدًا من الأيونات tR – m / z. كانت هذه المؤامرات المربعة هيالمواد الكيميائيةتم العثور على أيونات العلامة لتمييز أصلين. كانت المربعات المربعة في الربع الثالث عبارة عن أيونات العلامات الكيميائية ذات المساهمة العالية والثقة في C.

أظهرت نتائج OPLS-DA أنه يمكن استخدام UPLC-QTOF / MS لتمييز C.الصحراءمن C.توبولوسا(تين. 3). تم تحديد ما مجموعه ستة علامات موثوقة وهامة لتسهيل التمييز بين هذه المجموعات (الجدول 3). تم تعيين هويات ثلاث علامات محتملة مبدئيًا. تم تحديد المكونات المرتبطة بهذه الأيونات الثلاثة مبدئيًا على أنها أيزومرات من Campneoside II و cistanoside C و cistanoside A. ويمكن استخدام مركبات الواسم a و b و c للتمييز بين نوعي النباتين ، حيث إن شدة أيون a و b في C.الصحراءأعلى مما كانت عليه في C. tubulosa (الشكل 4 أ ، 4 ب) ، ويمكن اكتشاف الواسم ج في C. tubulosa ، ولكن ليس في C. الصحراء (الشكل 4 ج).

الشكل 4 شدة أيون للعلامات a و b و c.

كانت شدة أيونات العلامة a و b في C. deserticola أعلى من تلك الموجودة في C.

الجدول 3 أزواج Marer tR – m / z الأيونية في مخطط S.

ترميز الحمض النووي الشريطي: تسلسل المعلومات وكفاءة تحديد الهوية

تم عرض معلومات التسلسل في الجدول 4. المتوسطوراثيكانت مسافة psbA-trnH (0. 1732) أكبر من المنطقتين الأخريين (0. 0 74 0 ، 0.1197) بشكل ملحوظ. كان متوسط ​​محتوى GC لـ psbA-trnH (20.64 بالمائة) أصغر من المنطقتين الأخريين (55. 00 بالمائة ، 55. 00 بالمائة). على الرغم من أن معدل نجاح ITS و ITS2 لم يتم الحصول عليه في هذه الدراسة ، إلا أن منطقة psbA-trnH أدت أداءً جيدًا في تضخيم وتسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل (100 بالمائة ، 87.23 بالمائة). تم تحقيق كفاءة تحديد الهوية من خلال تحليل BLAST1 وطريقة أقرب مسافة ، وتعكس بشكل أساسي معدل نجاح الرموز الشريطية. كانت منطقة psbA-trnH أعلى بشكل واضح من الرمزين الشريطيين الآخرين في كفاءة تحديد الهوية بناءً على طريقتين. من المرجح أن يكون نقص التسلسلات هو السبب في أن منطقة ITS أظهرت كفاءة تحديد بنسبة 100 في المائة بناءً على طريقة BLAST1 ، و 0 بناءً على طريقة أقرب مسافة.

الجدول 4 كفاءة تحديد ثلاثة مواضع باستخدام طرق مختلفة لتحديد الأنواع.

تحليل الاختلاف الجيني باستخدام ستة معايير

تم استخدام ستة معلمات لتحليل التباين داخل محدد والاختلاف بين الأنواع باستخدام ثلاثة رموز شريطية (الجدول 5). كان الاختلاف الكبير بين الاختلافات الداخلية والداخلية مؤشراً على فائدة أكواد DNA الشريطية. هنا ، كان الحد الأدنى للمسافة بين الأنواع الثلاثة من الرموز الشريطية أعلى من المسافة القصوى بين الأنواع. علاوة على ذلك ، تتمتع منطقة psbA-trnH بمسافة قصوى أكبر داخل المحدد ومتوسط ​​مسافة بين النوعين من الرمزين الشريطيين الآخرين ، مما يشير إلى أن منطقة psbA-trnH تؤدي أداءً جيدًا في التمييز بين أصليسيستانشهيربا.

الجدول 5 تحليل الاختلاف بين الأجناس المحددة والاختلاف الداخلي المحدد لثلاثة رموز شريطية.

تحليل فجوة الترميز لتحديد C. Deserticola و C. tubulosa

تقدم فجوة التشفير الشريطي التباين الملحوظ بين الأنواع وداخلها وتوضح توزيعات منفصلة وغير متداخلة بين العينات داخل وبين العينات. في هذه الدراسة (الشكل 5) ، تم ضبط نطاق المسافة على 0 - 0 .45 ، لأن أكبر مسافة K2P لـ psbA-trnH بين C. {11}} 45. أظهرت الرموز الشريطية الثلاثة فجوات واضحة في توزيعات الاختلاف داخل وبين الاختلافات المحددة. علاوة على ذلك ، كانت فجوة psbA-trnH أكبر بكثير من الرمزين الشريطيين الآخرين. لذلك ، يمكن أن تكون منطقة psbA-trnH رمزًا شريطيًا مثاليًا للتمييز بين أصلين منسيستانشهيربا.

الشكل 5 التوزيع النسبي للاختلاف بين الأنواع والتباين داخل المحدد في ثلاثة رموز شريطية.

تم تحليل ثلاثة أكواد شريطية من ITS2 و ITS و psbA-trnH من أجل التوزيع النسبي للاختلاف بين الأنواع والتباين داخل النوعي بين C.وراثيمسافه: بعد.

شجرة الجار المنضم (نيوجيرسي)

توضح شجرة نيوجيرسي العلاقة بين الأنواع وتسهل تحديد مجموعاتها. في هذه الدراسة ، تم بناء شجرة NJ المكونة من ثلاثة رموز شريطية بناءً على نموذج K2P (الشكل 6). أظهرت النتائج أن اثنين من أصولسيستانشتتجمع هيربا في جزئين منفصلين. وهكذا ، تميزت شجرة نيوجيرسي بوضوح بينC. Deserticola و C. tubulosa.

الشكل 6 شجرة نيوجيرسي من C. Deserticola و C. tubulosa مع ثلاثة رموز شريطية.

تم بناء شجرة نيوجيرسي من C. يتم عرض درجات التمهيد (1000 مكررات) (أكبر من أو تساوي 50 بالمائة) لكل فرع. تم تجميع C.

المناقشة والاستنتاجات

سيستانشالأعشاب هي مادة طبية مهمة تستخدم عادة لتغذية المجتمع الآسيوي [38]. ومع ذلك ، فإن أصول Cistanches Herba و C. في الوقت نفسه ، يختلف الأصلان في التطبيق السريري وسوق السلع. تصنيفسيستانشهو الخلط والبدائل الهائلة والزناة تغمر السوق بسبب نقص الموارد وبيئة النمو الخاصة لـ Cistanches Herba. تم قبول جنس Cistanche ليشمل أربعة أنواع ومتغير واحد: C. deserticola و C. tubulosa و C. Sinensis و C. salsa و C. salsa var. البيفلورا [39]. اعتبر الباحثون في اليابان أصل Cistanches Herba على أنه C. salsa [40] - [43] ، بينما تم تحديده على أنه C. Deserticola بواسطة Tu [44] - [46]. لذلك ، يتم الخلط بينه وبين تصنيف Cistanche ، ومن الصعب التمييز بين أصل Cistanches Herba.

الطرق التقليدية لمراقبة جودةسيستانشHerba عبارة عن تحديد شكلي [47] ، [48] ، تحديد مجهري [49] و TLC (كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة) [50] ، [51] ، FTIR (تنظير فورييه للتحول الطيفي بالأشعة تحت الحمراء) [14] ، HPLC (كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ) [52] ، [53]. يمكن للطرق المورفولوجية والمجهرية التفريق بسهولة بين الأنواع من الأجناس أو العائلات المختلفة التي تمتلك اختلافات كبيرة في الخصائص المورفولوجية والميكروسكوبية ، بينما يصعب التمييز بين الأنواع الشقيقة. يمكن لـ TLC و FTIR التمييز بوضوح بين الأنواع التي تمتلك أنواعًا مختلفة من التركيبات الكيميائية ، في حين أنه من الصعب تحديدالمواد الكيميائيةالمكون والمحتوى. يستخدم HPLC بشكل أساسي للتمييز بين الأنواع المختلفةالمواد الكيميائيةمحتويات العناصر ، ومع ذلك ، فإن وقت التحليل أطول والحساسية أقل نسبيًا مقارنة بـ UPLC. في المقابل ، كانت تقنية UPLC-QTOF / MS أسرع وأكثر دقة في تحديد التركيب الكيميائي مقارنة بالطرق الكيميائية الأخرى. تظهر طرق التحديد الجزيئي جيدًا في التمييز على أساسوراثيالاختلاف ، مثل SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) [54] ، AFLP (تعدد الأشكال في طول الجزء المضخم) [55] ، [56]. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق الجزيئية ليست سهلة التشغيل وليست عالمية. في المقابل ، يمكن أن يميز الترميز الشريطي للحمض النووي DNA بين الأنواع بشكل أكثر شمولية وسرعة ودقة من الطرق الجزيئية الأخرى. للأنواع من نفس الجنس والقريبةوراثيالعلاقة ، هذه الأساليب وحدها قد لا تؤدي بشكل جيد في تحديد الهوية. هنا ، قمنا بدمج الترميز الشريطي UPLC-QTOF / MS والحمض النووي في تحديد C. تم اكتشاف 23 قمة كتلة مؤهلة وتم تحديد 16 باستخدام UPLC-QTOF / MS ، وتم العثور أولاً على ثلاثة مركبات علامة محتملة لتسهيل التمييز بين أصلين بواسطة تحليل PCA و OPLS-DA. علاوة على ذلك ، تم تقييم أربعة مؤشرات بواسطة تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي من حيث قدرتها على التمييز بين أصلين: كفاءة تحديد الهوية ، والكفاءة الوراثية ، وفجوة الترميز الشريطي ، وتحليل شجرة نيوجيرسي. تم دعم منطقة psbA-trnH ككود باركود DNA مناسب لتمييز C. deserticola و C. tubulosa.

في الختام ، أنشأنا أولاً جزيئيًا جديدًا والمواد الكيميائيةطريقة الجمع بين التحليل للتمييز ومراقبة الجودة في أصلين منسيستانشهيربا. يمكن أن يميز الترميز الشريطي للحمض النووي بين أصلينوراثيتنوع الأنواع وتوثيقها عالميًا ودقيقًا ؛ يمكن لتكنولوجيا UPLC-QTOF / MS تحليل التركيب الكيميائي لتقييم جودة المواد الطبية بسرعة وبدقة. تضمن الطريقة المدمجة للتشفير الشريطي للحمض النووي وتقنية UPLC-QTOF / MS تحديد مصادر متعددة للمواد الطبية بشكل أكثر دقة وعلمية وقد تكون بمثابة طريقة لتحديد الأنواع أو الأجناس المربكة الأخرى في التصنيف.

بيان التمويل

تم دعم الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (رقم 81274013 ، موقع الويب: www.nsfc.gov.cn). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو التحليل أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

مراجع

1. Tu PF ، Lou ZC ، Li SC ، Wang CS ، Jiang WY ، وآخرون. (1996) مقارنة بين تغذية الكلى واليانغ لتقوية فعالية ثلاثة أنواع مختلفة من الأعشابالمسافات. مجلة المواد الطبية الصينية 19: 420-421. [منحة جوجل]

2. Zhang Y، Wu H، Wang SN، Zheng HC (1994) مقارنة بين تغذية الكلى ووظائف تقوية اليانغ لثلاثة أنواع مختلفة من عشبة السيستان. مجلة الصين للمواد الطبية الصينية 19: 169 - 171. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

3. Lei L ، Song ZH ، Tu PF (2003) تقدم في أبحاثالمواد الكيميائيةالمكونات في نباتاتسيستانشهوفينج. وآخرون الارتباط. الأدوية الصينية التقليدية والعشبية 34: 473-476. [منحة جوجل]

4. Yoshikawa M و Matsuda H و Morikawa T و Xie H و Nakamura S et al. (2006) oligoglycosides فينيلثانويد و oligosugars acylated مع نشاط vasorelaxant من Cistanche tubulosa. بيورغ ميد تشيم 14: 7468-7475. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

5. Shimoda H و Tanaka J و Takahara Y و Takemoto K و Shan SJ وآخرون. (2009) تأثيرات نقص الكولسترول في الدم لمستخلص Cistanche tubulosa ، وهو دواء خام صيني تقليدي ، في الفئران. Am J Chin Med 37: 1125-1138. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

6. Yamada P ، Iijima R ، Han J ، Shigemori H ، Yokota S ، وآخرون. (2010) التأثير التثبيطي لأكتيوسيد المعزول منسيستانشtubulosa علىالمواد الكيميائيةإطلاق وسيط وإنتاج السيتوكين الالتهابي بواسطة خلايا RBL -2 H3 و KU812. بلانتا ميد ، 1512-1518. [PubMed]

7. Morikawa T، Pan Y، Ninomiya K، Imura K، Matsuda H، et al. (2010) oligoglycosides فينيل إيثانويد أكيل مع نشاط كبد من نبات الصحراءسيستانشتوبولوسا. بيورج ميد كيم 18: 1882-1890. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

8. Morikawa T، Pan Y، Ninomiya K، Imura K، Yuan D، et al. (2010) Iridoid و acyclic monoterpene glycosides و kankanosides L و M و N و O و P من Cistanche tubulosa. كيم فارم بول (طوكيو) 58: 1403-1407. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

9. He YP، Yin ZZ، Tu PF، Lou ZC (1997) تحديد ومسح العقار الخام التجاري من herba cistanchis. مجلة المواد الطبية الصينية 20: 117-122. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

10. Zhu SY (2001) التحديد الدوائي لـ Cistanche tubulosa وهو نوع مرتبك منسيستانشالصحراء. مجلة المواد الطبية الصينية 24: 24-25. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

11. Xu XQ ، Ni H ، Wei HY ، Jia XG ، Zhang BG ، وآخرون. (2013) التحديد المجهري لثلاثة سيستان أعشاب في شين جيانغ. الطب Shizhen وبحوث المواد 24: 881-883. [منحة جوجل]

12. Zhang M، Fu XL، Wang SY (2004) تحديد مجهري لـ Herba Cistanches التجارية بتقنية التصوير الرقمي. مجلة المواد الطبية الصينية 27: 400-402. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

13. Li JS، Yao ZQ، Yu MX (2000) دراسة حول التعرف على الأعشابcistanchesوالزناة. الطب Shizhen وبحوث المواد 11: 317-318. [منحة جوجل]

14. Xu R و Sun SQ و Liu YG و Chen J و Liu TN وآخرون. (2010) دراسات طيفية FTIR و 2D-IR على مصادر مختلفة من الأعشابcistanches. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897-900. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

15. Chen J، Sun SQ، Xu R، Liu YG، Yu J، et al. (2009) تحديد Cistanche deserticola من Boschniakla rossica و Cynomorium songaricum باستخدام التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء FTIR والارتباط ثنائي الأبعاد. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502-1507. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

16. Yang HC، Xia PX، Huang JX، Yuan HZ (2008) Study on HPLC fingerprint ofسيستانشالصحراء. العناية بالصحة والعناية بالصحة 8: 255-257. [منحة جوجل]

17. Xie JN، Zhao MB، Wu FW، Tu PF (2005) بصمة كروماتوغرافية لـ Cistanche deserticola بواسطة HPLC. الأدوية الصينية التقليدية والعشبية 36: 268-271. [منحة جوجل]

18. هان جي بي ، سونج جي ، ليو سي ، تشين جي ، تشيان جي ، وآخرون. (2010) تحديدسيستانشالأنواع (Orobanchaceae) استنادًا إلى تسلسل المنطقة الجينية psbA-trnH البلاستيد. أكتا فارماسيوتيكا سينيكا 45: 126-130. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

19. شي إتش إم ، وانغ جي ، وانغ ماي ، تو بي إف ، لي إكس بي (2009)المواد الكيميائيةو Inter-simple Sequence Repeat Fingerprint. بيول. فارم. ثور. 32: 142-146. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

20. Han LF ، Yiadom MB ، Liu EW ، Zhang Y ، Li W ، et al. (2012) التوصيف الهيكلي والتعرف على فينيلثانويد جليكوسيدات منسيستانشDeserticola YC Ma بواسطة UHPLC / ESI-QTOF- MS / MS. التحليل الكيميائي النباتي 23: 668-676. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

21. Jiang X ، Huang LF ، Wu LB ، Wang ZH ، Chen SL (2012) تحليل UPLC-QTOF / MS للقلويدات في Coptis Chinensis Franch التقليدية المصنعة. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384. [مقالة مجانية عن PMC] [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

22. Wu LB، Jiang X، Huang LF، Chen SL (2013) التحقيق في تكنولوجيا المعالجة لورقة Loquat (Eriobotrya japonica) بواسطة كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء - قياس الطيف الكتلي الرباعي زمن الرحلة جنبًا إلى جنب مع القياسات الكيميائية. بلوس ون 8: e64178. [مقالة مجانية عن PMC] [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

23. Hebert PD، Ratnasingham S، Waard JR (2003) Barcoding للحياة الحيوانية: cytochrome c أوكسيديز الوحدة الفرعية 1 الاختلاف بين الأنواع وثيقة الصلة. بروك. R. Soc. لوند. ب 270 ملحق 1S96-99. [مقالة مجانية عن PMC] [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

24. Hebert PD، Cywinska A، Ball SL، Waard JR (2003) التعريفات البيولوجية من خلال الرموز الشريطية للحمض النووي. علوم بروك بيول ، 270 313: 321. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kress WJ، Wurdack KJ، Zimmer EA، Weigt LA، Janzen DH (2005) استخدام أكواد الحمض النووي لتحديد النباتات المزهرة. بروك ناتل أكاد علوم. 102: 8369-8374. [مقالة مجانية عن PMC] [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

26. Chen S ، Yao H ، Han J ، Liu C ، Song J ، et al. (2010) التحقق من صحة منطقة ITS2 كرمز شريطي جديد للحمض النووي لتحديد أنواع النباتات الطبية. PLoS One 5: e 8613. [مقالة مجانية عن PMC] [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

27. Tamura K ، Peterson D ، Peterson N ، Stecher G ، Nei M ، et al. (2011) MEGA5: التطور الجزيئيعلم الوراثةالتحليل باستخدام طرق الاحتمالية القصوى ، والمسافة التطورية ، والحد الأقصى من البخل. مول بيول إيفول 28: 2731-2739. [مقالة مجانية عن PMC] [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

28. Meyer CP، Paulay G (2005) ترميز الحمض النووي الشريطي: معدلات الخطأ على أساس أخذ العينات الشامل. بلوس بيول 3: e422. [مقالة مجانية عن PMC] [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

29. كوباياشي إتش ، كاراساوا إتش ، مياسي تي ، فوكوشيما إس (1984) دراسات حول المكونات سيستانشيس هيربا. رابعا. عزل وتركيب اثنين من جليكوسيدات Phenylpropanoid الجديد ، Cistanosides C و D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [منحة جوجل]

30. كوباياشي إتش ، كاراساوا إتش ، مياسي تي ، فوكوشيما إس (1985) دراسات حول مكونات سيستانشيس هيربا. السادس. عزل وتركيبات جليكوسيد إيريدويد الجديد ، 6- Deoxyeatalpol. كيم فارم بول 33: 3645–3650. [منحة جوجل]

31. Jiang Y، Li SP، Wang YT، Chen XJ، Tu PF (2009) Differentiation of Herbaسيستانشعن طريق بصمات الأصابع مع كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء - كشف مصفوفة الصمام الثنائي - قياس الطيف الكتلي. مجلة الكروماتوغرافيا أ 1216: 2156-2162. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

32. Han LF ، Boakye YM ، Liu E ، Zhang Y ، Li W ، et al. (2012) التوصيف الهيكلي والتعرف على جليكوسيدات فينيليثانويد من Cistanches deserticola YC Ma بواسطة UHPLC / ESI-QTOF-MS / MS. Phytochem Anal 23: 668-676. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

33. Li L، Tsao R، Yang R، Liu CM، Young JC، et al. (2008) عزل وتنقية جليكوسيدات الفينيثانويد من Cistanche deserticola بواسطة كروماتوجرافيا عالية السرعة للتيار المعاكس. كيمياء الغذاء 108: 702-710. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

34. Lu DY و Zhang JY و Yang ZY و Liu HM و Li S et al. (2013) التحليل الكمي لـسيستانشHerba باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء مقترنة باكتشاف صفيف الصمام الثنائي وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة جنبًا إلى جنب مع طرق القياس الكيميائي. J Sep Sci 26: 1945–1952. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

35. كوباياشي إتش ، كاراساوا إتش ، مياسي تي ، فوكوشيما إس (1985) دراسات حول المكونات سيستانشيس هيربا. V. عزل وتركيب اثنين من جليكوسيدات Phenylpropanoid الجديد ، Cistanoside E و F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457. [منحة جوجل]

36. Jiang Y، Tu PF (2009) Analysis ofالمواد الكيميائيةالمكونات في أنواع Cistanche. ي تشروماتوجر أ 1216: 1970-1979. [PubMed] [الباحث العلمي من Google]

37. Masssart DL، Vandeginste BGM، Deming SN، Michotte Y، Kaufman L (1988) معالجة البيانات في العلوم والتكنولوجيا. القياسات الكيميائية: كتاب مدرسي.

38. Huang LF، Zheng SH، Wu LB، Jiang X، Chen SL (2014) Ecotypes ofسيستانشعلى أساس الصحراءالمواد الكيميائيةالتكوين والصفات الجزيئية. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318-328. [منحة جوجل]

39. Tu PF ، Jiang Y ، Guo YH (2011) ، البحث والتطوير الصناعي لأعشاب cistanches. مجلة الأدوية الصينية 46: 882-887. [منحة جوجل]

40. Kobayashi H ، Oguchi H ، Takizawa ، Miyase T ، Ueno A ، et al. (1987) جليكوسيدات فينيليثانويد جديدة منسيستانشخطاف tubulosa (SCHRENK). F. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314. [منحة جوجل]

41. كوباياشي هـ ، كاراساوا إتش ، مياسي تي ، فوكوشيما س (1984) دراسات حول مكونات سيستانشيس هربا الثالث. كيم فارم بول 32: 3009-3014. [منحة جوجل]

42. كوباياشي هـ ، كاراساوا إتش ، مياسي تي ، فوكوشيما س (1984) دراسات حول مكونات سيستانشيس هربا الرابع. كيم فارم بول 32: 3880–3885. [منحة جوجل]

43. Kobayashi H، Karasawa H، Miyase T، Fukushima S (1985) دراسات حول مكونات Cistanchis herba VI. كيم فارم بول 33: 3645–3650. [منحة جوجل]

44. Moriya A و Tu PF و Karasawa D و Arima H و Deyama T et al. (1995) دراسات العقاقير من Cistanchis Herba (I). نات ميد 49: 383-393. [منحة جوجل]

45. Moriya A و Tu PF و Karasawa D و Arima H و Deyama T et al. (1995) دراسات Phamacognostical ل Cistanchis Herba (II). نات ميد 49: 394 - 400. [منحة جوجل]

46. ​​Liu XM، Jiang Y، Sun YQ، Xu XW، Tu PF (2011) Study onالمواد الكيميائيةمكوناتسيستانشالصحراء. تشين فارم جي 46: 1053-1058. [منحة جوجل]

47. Gu XY، Wang X (2013) التعرّف بين النباتات الأصلية لـ RouCongRong والأصناف المشوشة. المجلة الغربية للطب الصيني التقليدي 26: 17-18. [منحة جوجل]

48. Zhang HJ، Ding XF Identification of Cistanche deserticola and adulterants. الطب Shizhen وبحوث المواد ، 183.

49. Xu XQ ، Ni H ، Wei HY ، Jia XG ، Zhang BG ، وآخرون. (2013) بحث تحديد مجهري لثلاثة أنواع من Cistanche نشأت من مقاطعة شينجيانغ. الطب Shizhen وبحوث المواد 24: 881-883. [منحة جوجل]

50. Huang M ، Liu G (2004) تحديد البحثسيستانشالصحراوية و Cynomorium Songaricum. مجلة هوبي للطب الصيني التقليدي. 26: 54-55. [منحة جوجل]

51. Liu YG، Xu R، Wang W، Liu TN، Chen J (2009) تقدم البحث في مراقبة الجودة وتقييم Cistanche deserticola YC Ma. العلوم والتكنولوجيا العالمية - تحديث الطب الصيني التقليدي. 11: 439 - 444. [منحة جوجل]

52. Ma ZG (2011) التمايز بين Cistanche Sinensis G.Beck و Herba Cistanches المجهزة بواسطة بصمات HPLC. ذقن. فارم ج .46: 899-902. [منحة جوجل]

53. Huang LX ، و Wang YE ، و Shi MH ، و Jia XG ، و Xie X ، وآخرون. (2011) بحث بصمات HPLCسيستانشتوبولوسا. مجلة شينجيانغ للطب الصيني التقليدي. 29: 54-56. [منحة جوجل]

54. Chen P، Guo YH، Wang BM، Zhai ZX (2006) SDS-PAGE للبروتينات القابلة للذوبان في أربعة نباتات من Cistanche Hoffing. إت الارتباط. الأدوية الصينية التقليدية والعشبية 37: 1399-1402. [منحة جوجل]

55. Xu R، Chen J، Chen SL، Liu TN، Na R (2007) تحليل AFLP حول تنوع موارد الأصول الوراثية في Cistanche Deserticola المزروعة والبرية. الأدوية الصينية التقليدية والعشبية 38: 1703-1707. [منحة جوجل]

56. Gan XY، Li M، Ma HA، Song YX (2011) Study on Inraspecific Variation ofسيستانشDeserticola YCMa باستخدام علامات جزيئية AFLP. البستنة الشمالية ، 141-143.

يتم توفير مقالات من PLoS ONE هنا بإذن من المكتبة العامة للعلوم

بلوس واحد. 2014 ؛ 9 (5): e98061.

تم النشر على الإنترنت 2014 22 مايو. doi: 10.1371 / journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031