كيف يتم استخدام Phosphoinositide 3- kinase Inhibitor Alpelisib لعلاج متلازمة Lowe / مرض Dent؟

يستعيد مثبط الفوسفوينوزيتيد 3- kinase alpelisib تنظيم الأكتين ويحسن الخلل في الأنابيب القريبة في المختبر وفي نموذج فأر لمتلازمة لوي ومرض دنت

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

مارين بيركيز^1,5، جوناثان ر. جادسبي^2,5بياتريس باولا فيستا^1,5ريتشارد بتلر³ ، ستيفن ب.جاكسون²، فاليريا بيرنو⁴، أليساندرو لوتشياني 1 ، أوليفييه ديفيست^1,6وجنيفر إل جالوب^2,6

الكلمات الرئيسية: الهيكل الخلوي. الالتقام. الدهون. النبيبات الدانية؛ متلازمة فانكوني الكلوية

تسبب طفرات فقدان الوظيفة في جين OCRL ، الذي يشفر phosphatidylinositol [PI] 4 ، 5- ثنائي الفوسفات [PI (4،5) P2] 5- فوسفاتيز OCRL ، حدوث خلل في الالتقام الخلوي وخلل في الأنابيب القريبة فيمتلازمة لوي ومرض دنت2. يرجع الخلل إلى زيادة مستويات PI (4،5) P2 وبلمرة الأكتين الشاذة ، مما يحول دون تهريب الجسيمات. تم تحديد PI 3- الفوسفات [PI (3) P] مؤخرًا كمنشط مع PI (4،5) P2 في مسار الأكتين. هنا ، قمنا باختبار الفرضيةفوسفوينوزيتيد 3- كينازقد تنقذ مثبطات (PI3K) الخلل الداخلي الناتج عن فقدان OCRL ، عن طريق إعادة موازنة إشارات الفوسفوينوزيتيد إلى آلية الأكتين. النطاق الواسع PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)مثبط copanlisib والفئة IA p110a PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز) مثبط alpelisibتقليل بلمرة الأكتين الشاذة في خلايا الكلى البشرية التي تعاني من نقص OCRL في المختبر. تم تخفيض مستويات PI 3،4 و 5- trisphosphate و PI (4،5) P2 و PI (3) P مع معالجة alpelisib ، وضربة siRNA من الوحدة الفرعية الحفزية PI3K p110a تم نسخ النمط الظاهري للأكتين. في نموذج OcrlY / الماوس المتوافق مع البشر ، قلل alpelisib تلطيخ الأكتين الداخلي مع استعادة بنية ألياف الإجهاد ومستويات الميجالين في الغشاء البلازمي لخلايا الأنابيب القريبة ، وهو ما ينعكس من خلال امتصاص الالتحام المحسن للبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي في الجسم الحي. وبالتالي ، فإن النتائج التي توصلنا إليها تدعم الارتباط بين دهون الفوسفوينوزيتيد ، وبلمرة الأكتين ، والاتجار الداخلي في الأنبوب القريب ، وتمثل إثباتًا لمفهوم إعادة استخدام alpelisib فيمتلازمة لوي / مرض دنت2.

بيان متعدية

متلازمة لوي ومرض دنت2 ، التي تسببها طفرات في شحوم الفوسفوينوزيتيد 5- فوسفاتاز OCRL ، تظهر مع خلل في الأنابيب القريبة وبيلة ​​بروتينية منخفضة الوزن الجزيئي مع توفر رعاية داعمة فقط. النتائج التي توصلنا إليها تكشف أنفوسفوينوزيتيد 3- كيناز مثبط alpelisib، الذي تمت الموافقة عليه حاليًا لعلاج السرطان ، يخفف من توازن الفوسفوينوزيتيد الشاذ والنمط الظاهري للأكتين المرتبط بفقدان OCRL ، مما يتسبب في تحسن كبير في آلية الالتقام والقدرة الاستيعابية في الأنظمة الخلوية ونموذج الماوس المتوافق مع البشر لمتلازمة لوي / مرض دنت 2. نظرًا لملف تعريف الأمان الواضح الخاص به ، يعد alpelisib مرشحًا واعدًا لإعادة استخدام الأدوية فيمتلازمة لوي ومرض دنت.

تمتلك الخلايا الظهارية المبطنة للنبيبات القريبة (PTs) للكلية مسارًا داخليًا فعالًا يتوسطه مستقبلات والذي يستعيد ويعالج المواد الأساسية التي يتم ترشيحها من خلال الكبيبة. الاضطرابات الخلقية التي تؤثر على الجسيمات الداخلية تسبب خللًا وظيفيًا في PT (متلازمة فانكوني الكلوية) مع فقد البول للبروتينات المذابة والبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW) ، وغالبًا ما تكون معقدة بسبب مضاعفات التمثيل الغذائي والنمو وتطور أمراض الكلى المزمنة.¹ارتبطت الطفرة المعطلة في OCRL بمرض دنت 2 (MIM # 300555) ، وهو اضطراب يتميز بخلل وظيفي في PT ، وحصوات الكلى ، والفشل الكلوي التدريجي ، ومتلازمة لوي (MIM # 309000) ، والتي تظهر بالإضافة إلى ذلك لخلل PT والفشل الكلوي ، المظاهر الجهازية مثل إعتام عدسة العين الخلقي ، والإعاقة الإدراكية ، ونقص التوتر.^2-4العلاجات الحالية لمرض دنت 2 ومتلازمة لوي داعمة فقط.

الشكل 1|PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)تقوم مثبطات بتخفيف تجميع الأكتين الشاذ في الجسيمات الداخلية في نموذج خلية كلية بشرية تعاني من نقص OCRL (HK2). (أ) خطوات تحويل دهون الفوسفوينوزيتيد ذات الصلة بهذه الدراسة تشير إلى التحويلات بين PI (4،5) P2 و PI (3،4،5) P2 و PI (3) P مع الإنزيمات الأكثر صلة بخط عريض وأكثر صلة التحويلات في خطوط صلبة ، وأخرى في خطوط متقطعة. PI (4،5) P2 مرتفع في متلازمة لوي بسبب نقص نشاط الفوسفاتيز 5- من OCRL وهو مصنوع من فسفرة PI بواسطة فوسفاتيديلينوسيتول 4- كينازات (PI4Ks) و PI (4) 5- كيناز (PIP5K). PI (4،5) P2 تتم فسفرته بواسطة الفئة I PI3Ks لإنتاج PI (3،4،5) P3. يمكن نزع الفسفرة PI (3،4،5) P3 إلى PI (4،5) P2 بواسطة PTEN أو إلى PI (3،4) P2 بواسطة SH -2 - تحتوي على إينوزيتول 50 بولي فوسفات (SHIP) 1 و 2 ، synaptojanin 1 و 2 ، وكذلك OCRL ، على الرغم من أن هذا (تابع)

الشكل 1|(تابع) يعتقد أنه طفيف. يتم إزالة الفسفرة PI (3،4) P2 إلى PI (3) P بواسطة فوسفاتيز الإينوزيتول من النوع IA (INPP4A) و B. PI (3) P أيضًا في الإندوسومات عبر فسفرة PI بواسطة الفئة III PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)، بروتين الفرز الفراغي Vps34. (ب) اللطخات الغربية التي توضح فقدان التعبير OCRL في خط الخلية HK2 OCRL CRISPR بالضربة القاضية (KO) مقارنة بخلايا التحكم من النوع البري (WT) HK2 مع tubulin كعنصر تحكم في التحميل. (ج - هـ) صور مجهرية متحد البؤر تمثيلية من Airyscan والتقدير الكمي لمستضد الإندوسوم المبكر 1 (EEA1) / تداخل الأكتين (معبرًا عنه كنسبة مئوية من إجمالي حويصلات EEA1þ المكتشفة) لخلايا HK2 WT أو OCRL KO المعالجة إما بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (د) أو المانع المشار إليه والمثبت باستخدام 4٪ فورمالدهايد الإصلاح. في جميع الحالات ، توضح الصور شريحة z واحدة من مكدس متحد البؤر تمت معالجته بواسطة Airyscan من الخلايا ذات التصنيف المناعي لـ EEA1 (أصفر) ، و phalloidin (أكتين ، أرجواني) ، و 4 0 ، 6- ديميدينو { {14}} فينيليندول (DAPI) (سماوي). أشرطة =5 ملم. في عمليات القياس ، تشير الخطوط إلى المتوسط ​​± SEM وكل نقطة بيانات هي خلية فردية. في جميع التجارب ، تم تطبيق المعالجات قبل التثبيت بـ 16 ساعة. في جميع عمليات القياس ، تم تقييم الأهمية الإحصائية من خلال تحليل Kruskal-Wallis (KW) للتباين مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Dunn. (ج) خلايا WT أو KO تعامل إما بـ DMSO أو 1 0 0 نانومتر من copanlisib ، مما يدل على إنقاذ تداخل الأكتين الداخلي. اختبار KW: *** P <0. 0="" {{5="" 0}="" 1="" ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" و="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" copanlisib="" كلاهما="" ***="" p=""><0. 001="" و="" wt="" copanlisib="" مقابل="" ko="" copanlisib="" p="0." 44="" (غير="" مهم="" [ns]).="" n="52" و="" 85="" و="" 67="" و="" 63="" خلية="" لـ="" wt="" dmso="" و="" wt="" copanlisib="" و="" ko="" dmso="" و="" ko="" copanlisib="" على="" التوالي.="" (د)="" خلايا="" wt="" أو="" ko="" تعامل="" إما="" بـ="" dmso="" أو="" 10="" ملي="" مولار="" من="" alpelisib="" ،="" مما="" يدل="" على="" إنقاذ="" التداخل="" الداخلي="" للأكتين.="" اختبار="" kw:="" ***="" p=""><0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" و="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" alpelisib="" كلاهما="" ***="" p=""><0.001 و="" wt="" alpelisib="" مقابل="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0.99 (نانوثانية). N =31 و 30 و 43 و 41 خلية لـ WT DMSO و WT alpelisib و KO DMSO و KO alpelisib على التوالي. (هـ) خلايا WT أو KO المعالجة إما بـ DMSO ، أو 10 ملي مولار من GSK2636771 ، أو 10 ملي مولار من idelalisib ، مما يدل على أن أيًا من المركبين غير قادر على تقليل التداخل الداخلي للأكتين بشكل كبير. اختبار KW: *** P <0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" ،="" ***="" p=""><0.001 ،="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" gsk="" ،="" *="" p="0." 04="" ،="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" idelalisib="" ،="" p=""> 0.99 (ns). N =159 و 130 و 203 و 122 و 131 و 145 خلية لـ WT DMSO و WT GSK2636771 و WT idelalisib و KO DMSO و KO GSK2636771 و KO idelalisib ، على التوالي. لتحسين عرض هذه الصورة ، يرجى الاطلاع على النسخة الإلكترونية من هذه المقالة على www.kidney-international.org

كيف يتم استخدام phosphoinositide 3- kinase inhibitor alpelisib لعلاج متلازمة لوي / مرض دنت؟

البيلة البروتينية LMW هي ميزة ثابتة لوحظت في متلازمة لوي / مرض دنت 2 ، مما يكشف أن OCRL يؤثر على الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات.⁵يقوم OCRL بترميز phosphatidylinositol (PI) 4 ، 5- bisphosphate [PI (4،5) P2] 5- phosphatase OCRL ،⁶الذي يتحكم في الهوية الدهنية في مسار الجسيم الداخلي عن طريق تحطيم PI (4،5) P2 (الشكل 1 أ). التحلل الناقص لـ PI (4،5) P2 من خلال OCRL متورط في الفشل في إزالة الحويصلات المطلية بالكالاثرين في الأرومات الليفية ، مصحوبًا بتكوين هياكل "مذنبة" من الأكتين الخيطي المبلمر من العضيات الشاذة الناتجة المبكرة الشبيهة بالجسيم الداخلي.^7-9في أنواع الخلايا الأخرى ، وأبرزها خلايا PT في الكلى ، ينتج عن نقص OCRL في بنية "سلة" F-actin المحيطة بالعضيات الداخلية الشاذة.¹⁰يمنع الأكتين الزائد من F-actin تهريب الغشاء من خلال مسار endocytic and endolysosomal ، ويُقترح تقليل إعادة تدوير ميجالين مستقبلات متعددة القوالب إلى الغشاء القمي ، مما يؤدي إلى تفاقم الخلل داخل مسار الجسيم الداخلي.¹¹بالاتفاق مع الدور الرئيسي لـ F-actin الشاذ ، يتم التخفيف من امتصاص خلل الالتقام الناجم عن طفرات OCRL عن طريق استهداف آلية الأكتين باستخدام latrunculin B ، أو عن طريق استنفاد البروتينات المنظمة للأكتين وكذلك بواسطة الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) - النضوب الوسيط من PI (4) P 5- كيناز لضبط تركيب PI (4،5) P2^7,10(الشكل 1 أ).

تُفهم بلمرة الأكتين بشكل متزايد على أنها لا تنشأ فقط من PI (4،5) P2 ولكن أيضًا من دهون الفوسفوينوسيتيد الأخرى. على سبيل المثال ، PI (3،4،5) P3 ينشط Rho-type GTPase Rac ، ويعمل PI (3) P جنبًا إلى جنب مع PI (4،5) P2 لتحفيز بلمرة الأكتين في اتجاه مجرى نهر آخر من نوع Rho ، Cdc42.^12-14يقترن التحويل البيني لهذه الفوسفاتوزيتيدات بحركة الدهون من خلال المسار الداخلي والداخلي. PI (4،5) P2 فسفرته من الفئة الأولى فوسفاتيديلينوسيتول - 30 - كيناز (PI3K) إلى PI (3،4،5) P3 في غشاء البلازما ويصبح تدريجياً منزوع الفسفرة إلى PI (3،4) P2 و PI (3) P أو PI (4،5) P2.^14,15يتم إثراء PI (3) P في الإندوسومات ، حيث يكون ضروريًا لوظيفتها ويتم تصنيعه في الغالب عن طريق الفسفرة المباشرة لـ PI بواسطة الفئة III PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)، Vps34¹⁶(الشكل 1 أ). في خط الخلايا الظهارية المصطبغة (RPE) التي تعاني من قصور في OCRL ، يتم تقليل مذنبات الأكتين الناتجة عن طريق العلاج باستخدام PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)مثبطات wortmannin و Vps 34- IN1 ، بالاتفاق مع الدراسات البيوكيميائية التي تظهر تنظيم الأكتين من خلال تزامن كل من PI (3) P و PI (4،5) P2.¹⁴

لوحظ إنقاذ الالتقام الخلوي عند استهداف آلية الأكتين في مرضى OCRL وخلايا خروج المغلوب (KO) ،^7,10مع تنظيم المنبع من الأكتين بواسطة PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)نشاط¹⁴والطبيعة شديدة الترابط لتحويل PI ، توفر إمكانية مثيرة للاهتمام أن الفئة الأولى PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)قد تكون مثبطات مفيدة في متلازمة لوي. تمت الموافقة على هذه المثبطات ، المطورة لعلاج السرطان ، للاستخدام السريري¹⁷وبالتالي من المحتمل أن تكون قابلة لإعادة استخدام الأدوية. على الرغم من وجود مركبات مثل copanlisib¹⁸لها خصوصية واسعة وآثار جانبية ، فقد تم إثبات نجاح حديث لمثبطات أكثر تحديدًا. Idelalisib ،¹⁹التي تستهدف PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)تمت الموافقة على الوحدة الفرعية p110d لعلاج سرطان الغدد الليمفاوية المزمن ، وتمت الموافقة على استخدام alpelisib ، الذي يستهدف p110a ، في سرطان الثدي.^20,21علاوة على ذلك ، أظهر alpelisib فائدة سريرية في الأطفال الذين يعانون من متلازمة PROS / CLOVES ،²²متلازمة فرط النمو النادرة الناتجة عن تنشيط PIK3A.

هنا ، اختبرنا الفرضية القائلة بأن الفئة I PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)قد تنقذ مثبطات خلل الالتقام بسبب فقدان OCRL ، باستخدام النماذج الخلوية والماوسية الراسخة.^10,11,23نظهر أن تثبيط PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)النشاط عن طريق copanlisib أو alpelisib ، أو استنفاد SiRNA بوساطة الوحدة الفرعية الحفزية المستهدفة alpelisib p110a يقلل من بلمرة الأكتين الزائدة في خلايا الكلى البشرية (HK2) التي تعاني من نقص في OCRL. بالتركيز على alpelisib باعتباره المركب الأكثر تحديدًا للاستخدام السريري ، نظهر أنه يقلل من بلمرة الأكتين ويحسن الامتصاص من خلال المسار الداخلي في خلايا PT من Ocrl المتوافق مع البشر.^Y/-الفئران في المختبر. علاوة على ذلك ، فإن علاج alpelisib في الجسم الحي يخفف من البيلة البروتينية ، ويقلل من خلل PT ، وينقذ المستويات الخلوية للميجالين في Ocrl المتوافق مع البشر.^Y/-الفئران. تدعم هذه النتائج alpelisib كمرشح لإعادة استخدام الدواء فيمتلازمة لوي ومرض دنت 2.

الشكل 2|تكون تأثيرات Alpelisib على الأكتين مستجيبة للجرعة ويتم إعادة تلخيصها بواسطة siRNA لـ PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)ص 11 0 أ. (أ) صور مجهرية متحد البؤر من Airyscan (مثبتة باستخدام 4 في المائة فورمالدهايد فيكس ومسمى مناعي لمستضد إندوسوم 1 [EEA1] ، أصفر ؛ أكتين [phalloidin] ، أرجواني ؛ و 4 {{4 0}} ، {{ 5}} ديميدينو -2- فينيل إندول [DAPI] ، سماوي ؛ قضبان=5 مم) وتحديد كمية خلايا الكلى البشرية من النوع البري (WT) أو بالضربة القاضية (KO) (HK2) المعالجة بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو الجرعات المحددة من alpelisib لمدة 16 ساعة ، مما يدل على الاستجابة للجرعة الإنقاذ لتداخل الأكتين الداخلي. في جميع الحالات ، تشير الخطوط إلى متوسط ​​± SEM وتشير النقاط إلى الخلايا الفردية. N=31 و 3 0 و 71 و 42 و 9 0 و 89 و 41 و 69 و 66 و 67 خلية للتحكم في WT و WT 10 ملم و WT 50 ملم و KO DMSO و KO 2.5 و 5 و 10 و 15 و 25 و 50 ملي ألبيلسيب على التوالي. تم تقييم الأهمية الإحصائية بواسطة اختبار Kruskal-Wallis (KW) مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Dunn: إجمالي *** P <0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" و="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" 5="" و="" 15="" و="" 25="" و="" 50="" ملم="" alpelisib="" الكل="" ***="" p=""><0.001 ،="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" 2.5="" ملم="" alpelisib="" *="" p="0." 0131="" ،="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" 10="" mm="" alpelisib="" **="" p="0." 0043،="" wt="" dmso="" مقابل="" كل="" من="" wt="" 10="" و="" 50="" ملي="" alpelisib="" p=""> 0.9999 (غير مهم [ns]). (ب) اللطخة الغربية لـ p110a والتحكم في التحميل a-tubulin لخلايا WT أو KO المعالجة إما بالتدافع (Scram.) أو p110a siRNA. (ج) صور مجهرية متحد البؤر من Airyscan (مثبتة باستخدام 4 في المائة من الفورمالديهايد المثبت والمسمى المناعي لـ EEA1 ، أصفر ؛ أكتين [phalloidin] ، أرجواني ؛ و DAPI ، سماوي ؛ قضبان =5 مم) والتقدير الكمي لخلايا WT أو KO المعالجة مع التدافع (S) أو p110a siRNA ، مما يدل على تقليل تداخل الأكتين في المنطقة الاقتصادية الأوروبية 1- على استنفاد p110a. اختبار KW مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Dunn: *** P <0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" تدافع="" wt="" مقابل="" تدافع="" ko="" ،="" تدافع="" ko="" مقابل="" ko="" p110a="" sirna="" كلاهما="" ***="" p=""><0.001. n="79" و="" 108="" و="" 93="" و="" 131="" خلية="" على="" التوالي.="" hk2="" ،="" كلية="" بشرية="" ؛="" pi3k="" ،="" فوسفاتيديلينوسيتول="" -30="" -="" كيناز="" ؛="" sirna="" ،="" صغير="" ،="" رنا="" متداخل.="" لتحسين="" عرض="" هذه="" الصورة="" ،="" يرجى="" الاطلاع="" على="" النسخة="" الإلكترونية="" من="" هذه="" المقالة="" على="">

الشكل 3|مستويات فوسفاتيديلينوسيتول (PI) 4 ، 5- ثنائي الفوسفات [PI (4،5) P2] مرتفعة مع خروج OCRL بالضربة القاضية (KO) ، و PI (3،4،5) P3 ، PI (4،5) P2 ، يتم قمع PI (3) P بواسطة علاج alpelisib. في جميع التجارب ، تم تطبيق المعالجات المشار إليها قبل التثبيت بـ 16 ساعة. في عمليات القياس ، تشير الخطوط إلى المتوسط ​​± SEM ، وتنتج كل نقطة بيانات من خلية فردية. في جميع عمليات القياس ، تم تقييم الأهمية الإحصائية من خلال تحليل Kruskal-Wallis (KW) للتباين مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Dunn. أشرطة =20 ملم في كل الصور. (أ) صور مجهرية تمثيلية واسعة النطاق لخلايا الكلى البشرية من النوع البري (WT) أو خلايا الكلى البشرية (HK2) المعالجة بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو 10 ملي مولار من alpelisib ثم تثبيتها بغشاء البلازما فيفكس والمسمى المناعي لـ PI (3،4،5) ) P3 (أحمر) و 40 ، 6- ديميدينو -2- فينيليندول (DAPI) (سماوي) ، مع تحديد كمية متوسط ​​كثافة العلامات الخلوية PI (3،4،5) P3 ، مما يوضح فعالية alpelisib العلاج على تخليق PI (3،4،5) P3. N =96 و 128 و 109 خلية لـ WT DMSO و WT alpelisib و KO DMSO و KO alpelisib على التوالي. KW (تابع)

الشكل 3|(تابع) test: إجمالي *** P <0. 0="" 0="" 1="" ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" و="" wt="" dmso="" مقابل="" wt="" alpelisib="" و="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" alpelisib="" all="" ***="" p=""><0. 0="" {{7="" 0}="" 1.="" (ب)="" صور="" مجهرية="" متحد="" البؤر="" تمثيلية="" لخلايا="" wt="" أو="" ko="" hk2="" المعالجة="" إما="" بـ="" dmso="" ،="" أو="" 1="" 0="" ملي="" مولار="" ،="" أو="" 50-="" ملي="" ألبليسيب="" لمدة="" 16="" ساعة="" ثم="" يتم="" تثبيتها="" بإصلاح="" golgi="" وتمييزها="" باستخدام="" m="" ch="" {{1="" 0}}="" xfyve="" pi="" (3)="" مسبار="" p="" (أرجواني)="" و="" dapi="" (سماوي)="" ،="" مع="" التقدير="" الكمي="" لعدد="" pi="" (3)="" نقاط="" إيجابية="" p="" المكتشفة="" في="" الخلايا="" المعالجة="" بنطاق="" من="" تركيزات="" alpelisib="" ،="" كما="" هو="" موضح="" ،="" يتم="" تقليل="" نقاط="" pi="" (3)="" إيجابية="" p="" بطريقة="" تستجيب="" للجرعة.="" n="280" و="" 254="" و="" 21="" 0="" و="" 287="" و="" 324="" و="" 239="" و="" 340="" و="" 250="" و="" 240="" و="" 215="" خلية="" للتحكم="" في="" wt="" و="" wt="" 10="" ملم="" و="" wt="" 50="" ملم="" و="" ko="" dmso="" و="" ko="" 2.5="" ،="" 5="" و="" 10="" و="" 25="" و="" 50="" ملي="" ألبيلسيب="" ،="" على="" التوالي.="" اختبار="" kw:="" إجمالي="" ***="" p=""><0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" ،="" wt="" dmso="" مقابل="" wt="" 10="" و="" 50="" ملي="" alpelisib="" ،="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" 50="" ملي="" alpelisib="" الكل="" ***="" p=""><0.001 ؛="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" 2.5="" و="" 5="" ملي="" alpelisib="" كلاهما="" p=""> 0.9999 (غير مهم [ns]) ؛ KO DMSO مقابل KO 10 ملم alpelisib ** P =0. 0049 ؛ KO DMSO مقابل KO 25 ملم alpelisib *** P =0. 0002. (ج) صور مجهرية تمثيلية واسعة النطاق لخلايا WT أو KO HK2 المعالجة بـ DMSO أو 10 ملي مولار من alpelisib ثم تثبيتها بغشاء البلازما فيفكس والمسمى المناعي لـ PI (4،5) P2 (أصفر) و DAPI (سماوي) ، مع القياس الكمي لـ متوسط ​​كثافة العلامات الخلوية PI (4،5) P2 ، والتي تُظهر زيادة غشاء البلازما PI (4،5) P2 في خلايا KO ، والتي يتم تقليلها عن طريق معالجة alpelisib ، خاصة في خلايا KO. N =126 و 112 و 85 و 116 خلية لـ WT DMSO و WT alpelisib و KO DMSO و KO alpelisib على التوالي. اختبار KW: إجمالي *** P <0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" و="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" alpelisib="" كلاهما="" ***="" p=""><0.001 ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" wt="" alpelisib="" p="0." 4752="" (ns).="" (د)="" صور="" مجهرية="" تمثيلية="" واسعة="" النطاق="" لخلايا="" wt="" أو="" ko="" hk2="" المعالجة="" بـ="" dmso="" أو="" 10="" ملي="" مولار="" من="" alpelisib="" ثم="" تثبيتها="" بـ="" 4="" في="" المائة="" فورمالدهايد="" فيكس="" ومُنعت="" من="" أجل="" pi="" (4،5)="" p2="" (أصفر)="" و="" dapi="" (سماوي)="" ،="" مع="" القياس="" الكمي="" من="" عدد="" pi="" (4،5)="" p="" 2-="" نقطة="" إيجابية="" ،="" تظهر="" زيادة="" pi="" (4،5)="" p2="" نقطة="" في="" خلايا="" ko="" ،="" والتي="" يتم="" تقليلها="" عن="" طريق="" علاج="" alpelisib="" ،="" وتحديدًا="" في="" خلايا="" ko.="" n="75" و="" 65="" و="" 52="" و="" 69="" خلية="" لـ="" wt="" dmso="" و="" wt="" alpelisib="" و="" ko="" dmso="" و="" ko="" alpelisib="" على="" التوالي.="" اختبار="" kw:="" إجمالي="" ***="" p=""><0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" ko="" dmso="" و="" ko="" dmso="" مقابل="" ko="" alpelisib="" كلاهما="" ***="" p=""><0.001 ؛="" wt="" dmso="" مقابل="" wt="" alpelisib="" p=""> 0.99 (ns). au ، وحدات عشوائية. لتحسين عرض هذه الصورة ، يرجى الاطلاع على النسخة الإلكترونية من هذه المقالة على www.kidney-international.org.

كيف يتم استخدام phosphoinositide 3- kinase inhibitor alpelisib لعلاج متلازمة لوي / مرض دنت؟

1. النتائج

1.1 تقلل مثبطات الفئة الأولى PI3K من تراكم الأكتين في خلايا OCRL-KO HK2

استخدمنا التحرير الجيني CRISPR-Cas9 للضربة القاضية (KO) OCRL في خط الخلية HK2 للسماح باختبار الفئة I PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)مثبطات على تجميع الأكتين المميز في المقصورات داخل الليزوزومات.^7,9,10,14تحقق النشاف الغربي من 98. 0 ± 0. انخفاض بنسبة 7 بالمائة في تعبير OCRL في lysates من خلايا KO HK2 (الشكل 1 ب). قام OCRL KO بتلخيص النمط الظاهري لسلة الأكتين في خلايا HK2 ، كما يتضح من زيادة التداخل بين F-actin ومستضد الإندوسوم 1 المبكر (EEA1) ، والذي تم تحديده كميًا على مكدسات Z المجهرية متحد البؤر Airyscan (الشكل 1c-e). تم عكس هذا التداخل المتزايد الذي لوحظ في خلايا OCRL KO عن طريق العلاج باستخدام copanlisib (C) ، وهو PI3K واسع النطاق (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)المثبط الذي يستهدف p110a و d وبدرجة أقل الأشكال الإسوية p110b و g (الشكل 1 ج). من خلال النشاف الغربي لمستخلصات الخلية الكاملة HK2 ، وجدنا أن PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)تم التعبير عن الوحدات الفرعية التنظيمية p110 a و b و d بشكل جيد في كل من الخلايا البرية (WT) و KO ، مع وجود مستويات تتبع فقط من الشكل الإسوي p110g الموجود (الشكل التكميلي S1A).

ميزنا PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)خصوصية تثبيط F-actin باستخدام alpelisib (A) ، مثبط انتقائي لـ p110a ، و GSK2636771 (G) و idelalisib (I) ، مثبطات انتقائية لـ p110b و p110d ، على التوالي (الشكل التكميلي S1A). على الرغم من أن معالجة alpelisib أعطت انخفاضًا مشابهًا في بلمرة الأكتين الباطنية مقارنةً بـ copanlisib (الشكل 1 د) ، فإن GSK2636771 و idelalisib كان لهما تأثير ضئيل على تراكم الأكتين (الشكل 1 هـ). الفئة I PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)لم يكن للمثبطات سمية متزايدة على OCRL KO بالنسبة للخلايا غير المعدلة ، بناءً على مقايسة MTT (الشكل التكميلي S1B).

1.2 ينقذ Alpelisib و p110a النمط الظاهري للأكتين في خلايا HK2

بالنسبة لدراساتنا اللاحقة ، ركزنا على alpelisib لأنه PI3K الأكثر انتقائية والأقل سمية (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)تم تطويره حتى الآن ، ويستخدم حاليًا لعلاج فرط نشاط الفسيفساء من PI3K class Ia في الأطفال المصابين بمتلازمة PROS / CLOVES.²²قلل Alpelisib سلال الأكتين في خلايا OCRL KO HK2 بطريقة تستجيب للجرعة (الشكل 2 أ). لوحظت التأثيرات عند جرعة 10 ملي مولار بمجرد 4 ساعات بعد العلاج ، دون سمية ظاهرة (الشكل التكميلي S2). لاختبار ما إذا كان PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)كان تثبيط alpelisib مصدرًا لتلطيخ الأكتين المنخفض ، لقد قللنا على وجه التحديد هدفه ، الوحدة الفرعية p110a ، باستخدام siRNA (الشكل 2 ب). بالمقارنة مع العلاج باستخدام SiRNA (مخلوط بالتسلسل) ، فإن siRNA مقابل p110a أسفر عن استنفاد 78.3 ± 4.8 بالمائة و 68.9 ± 7.7 بالمائة من بروتين p110a في خلايا WT و OCRL KO HK2 ، على التوالي ، ينعكس من خلال انخفاض كبير في سلال الأكتين ( الشكل 2 ج).

1.3 انخفاض مستويات PI (3،4،5) P3 ، PI (4،5) P2 ، و PI (3) P في خلايا HK2 المعالجة بالبيلي

لفحص كيفية تأثر دهون الفوسفوينوزيتيد بعلاج OCRL KO و alpelisib ، قمنا بتلوين خلايا HK2 بأجسام مضادة أو مجالات بروتينية ضد PI (3،4،5) P3 ، PI (3) P ، و PI (4،5) P2 ، باستخدام ظروف التثبيت الأمثل لغشاء البلازما أو تلطيخ الخلايا.^24,25PI (3،4،5) P3 له توطين منتشر لغشاء البلازما ، وأدى علاج alpelisib (10 مم) إلى انخفاض قوي في تلطيخ PI (3،4،5) P3 في كل من خلايا WT و OCRL KO ، مثل متوقع من آلية عملها وخصوصياتها للفئة IA PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)p110a (الشكل 3 أ). من المتوقع أن يتم إزالة الفسفرة PI (3،4،5) P3 بشكل تدريجي حيث يتم توطين الأغشية وتهريبها إلى داخل الجسيمات الداخلية.^14,26,27عن طريق تثبيت الخلايا بحيث يتم الحفاظ على PI (3) P داخل الخلايا ،²⁵وجدنا أن PI (3) P punctae قد تم تقليله أيضًا عن طريق معالجة alpelisib (بطريقة تستجيب للجرعة واضحة من تركيزات منخفضة تصل إلى 10 مم للعلاج 16- ساعة) في كل من خلايا WT و OCRL KO (الشكل 3 ب والشكل التكميلي S2C). كما هو متوقع ، تسبب KO لـ OCRL في خلايا HK2 في زيادة ملحوظة في مستويات PI (4،5) P2 في كل من غشاء البلازما (الشكل 3 ج) وداخل الخلايا (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، مقارنة بخلايا WT.^10,28قلل العلاج باستخدام alpelisib بشكل ملحوظ من ارتفاع PI (4،5) P2 الناتج عن OCRL KO في كلا الجزأين ، بينما لم يكن له أي تأثير في خلايا WT (الشكل 3 ج و د). تم الإبلاغ عن أن Alpelisib يثبط PI 4- كيناز ب بتركيز مثبط بنسبة 5 0 بنسبة 0.5 ملي مولار ،¹⁹وهو مصدر محتمل للانخفاض في PI (4،5) P2. بشكل جماعي ، اقترحت بياناتنا أن alpelisib يثبط تجميع الأكتين على endosomes OCRL KO عبر تأثير ثنائي الخصوصية على مستويات PI (4،5) P2 و PI (3).

الشكل 4|Alpelisib يخفف من عيوب الأكتين عن طريق الفم في Ocrl المتوافق مع البشر^Y/-الماوس PTCs (م PTCs). (أ) صور مجهرية متحد البؤر تمثيلية ذات كثافة قصوى من الإسقاط Z لـ OcrlY / þ أو Ocrl^Y/-م PTCs تمت معالجتها بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو 10 ملي مولار من alpelisib لمدة 16 ساعة ثم يتم تثبيتها باستخدام 4٪ فورمالدهيد فيكس ومُسمَّى مناعي للأكتين (phalloidin) (أبيض) و 40 ، 6- ديميدينو -2- فينيليندول (DAPI) (أزرق) ، مع التقدير الكمي لدرجة وجود ألياف الإجهاد في كل حالة ، مما يدل على أن ألياف الإجهاد فقدت في Ocrl^Y/-يتم إنقاذ م PTCs عن طريق علاج alpelisib. تشير الخطوط إلى ± SEM ، وتشير نقاط البيانات إلى كل منطقة تصوير: N =5 مناطق تصوير لكل حالة (تحتوي كل منها على ما يقرب من 15-20 خلية). تم تقييم الأهمية من خلال 1- تحليل طريقة التباين (ANOVA) باستخدام اختبار المقارنة المتعددة لهولم سيداك ، ** P =0 001 ، مقارنات متعددة ؛ Ocrl Y / þ DMSO مقابل Ocrl^Y/-DMSO **

P =0. 002، Ocrl^Y/-DMSO مقابل Ocrl^Y/-alpelisib ** P =0. 004، OcrlY / þ DMSO مقابل Ocrl^Y/- alpelisib P =0. 50 (غير مهم [ns]). أشرطة =20 ملم. (ب) تمثيلات سطحية ثلاثية الأبعاد تمثيلية عالية التكبير لـ Ocrl m PTCs المعالجة بـ DMSO أو 10 ملي مولار من alpelisib لمدة 16 ساعة ثم تثبيتها بـ 4٪ فورمالديهايد فيكس ومُعَلَّم مناعي لمستضد إندوسوم مبكر 1 (EEA1) (أرجواني) ، أكتين ( phalloidin ، أصفر) ، و DAPI (أزرق) ، والتقدير الكمي يوضح إنقاذ التداخل الداخلي الأكتيني بواسطة alpelisib. عروض التكبير المنخفضة تشير إلى لمحات عامة عن (تابع)

الشكل 4|(تابع) تظهر هذه المناطق في الشكل التكميلي S4B والأفلام التكميلية S1 – S3. تشير الخطوط إلى يعني ± SEM. N =42 و 47 و 45 حقلًا تم اختيارهم عشوائيًا لـ OcrlY / þ þ DMSO و Ocrl^Y/-þ DMSO و Ocrl^Y/-þ شروط alpelisib ، على التوالي ، في كل حالة مجمعة من 4 كلى فأر لكل حالة. تم اختبار الأهمية بواسطة Kruskal-Wallis (KW) ANOVA مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Dunn: بشكل عام *** P <0. 001="" ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="">^Y/-DMSO و Ocrl^Y/-DMSO مقابل Ocrl^Y/-alpelisib *** P <0. 001="" ؛="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="">^Y/-alpelisib P> 0. 99 (ns). أشرطة =1 ملم. (ج) الصور المجهرية التمثيلية لـ OcrlY / þ أو Ocrl^Y/-م تمت معالجة PTCs بـ DMSO أو 10- mM alpelisib ثم تم إصلاحها بإصلاح Golgi وتم تصنيفها باستخدام m Ch -2 xFYVE PI (3) P مسبار (أرجواني) و DAPI (سماوي) ، مع القياس الكمي لـ عدد PI (3) P-positive puncta المكتشفة في الخلايا. N =188 و 177 و 246 و 206 خلية من OcrlY / þ þ DMSO و OcrlY / þ þ alpelisib و Ocrl^Y/-þ DMSO و Ocrl^Y/-þ alpelisib ، على التوالي ؛ تم تجميع الخلايا من 3 كلى فموية لكل مجموعة. اختبار KW: إجمالي *** P <0. 001="" ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="">^Y/-DMSO و OcrlY / þ DMSO مقابل OcrlY / þ alpelisib و Ocrl^Y/-DMSO مقابل Ocrl^Y/-alpelisib ، الكل *** P <0. 001.="" أشرطة="20" ملم.="" (د)="" الصور="" المجهرية="" التمثيلية="" لـ="" ocrly="" þ="" أو="">^Y/-م PTCs المعالجة بـ DMSO أو 10 ملي مولار من alpelisib لمدة 16 ساعة ثم يتم تثبيتها بـ 4٪ فورمالديهايد فيكس ومُعالج مناعي للفوسفاتيدينوسيتول (PI) 4 ، 5- ثنائي فوسفات [PI (4،5) P2] (أصفر) و DAPI (سماوي) ، مع التقدير الكمي لعدد PI (4،5) P 2- نقطة موجبة ، تظهر زيادة PI (4،5) P2 نقطة في Ocrl^Y/-الخلايا ، والتي يتم تقليلها عن طريق علاج الألبليسيب. N =477 و 444 و 423 و 494 من OcrlY / þ þ DMSO و OcrlY / þ þ alpelisib و Ocrl^Y/-þ DMSO و Ocrl^Y/-þ alpelisib ، على التوالي ؛ تم تجميع الخلايا من 3 كلى فموية لكل مجموعة. اختبار KW: إجمالي *** P <0. 001="" ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="">^Y/-DMSO و OcrlY / þ DMSO مقابل OcrlY / þ alpelisib و Ocrl^Y/-DMSO مقابل Ocrl^Y/-alpelisib ، الكل *** P <0. 001.="" أشرطة="20" ملم.="" لتحسين="" عرض="" هذه="" الصورة="" ،="" يرجى="" الاطلاع="" على="" النسخة="" الإلكترونية="" من="" هذه="" المقالة="" على="">

1.4 يقلل Alpelisib من الفوسفوينوزيتيدات داخل الخلايا ويخفف من عيوب الهيكل الخلوي في Ocrl^Y/-م PTCs

اختبرنا بعد ذلك ما إذا كان alpelisib له نفس التأثيرات في الخلايا الأولية لخلايا PT المشتقة من نموذج الماوس المتوافق مع البشر (Ocrl^Y/-) ، والذي يلخص بلمرة الأكتين غير الطبيعية والعيب الخلوي الملحوظ في الخلايا المشتقة من المريض.^10,11تم التعبير عن الماوس PTCs (m PTCs) بشكل مشابه للفئة I PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز) الوحدات الفرعية التنظيمية لخلايا HK2 في كل من WT و Ocrl^Y/-الفئران وعرضت ملف تعريف سمية مماثل تجاه alpelisib عند تقييمها بواسطة فحوصات MTT (الشكل التكميلي S3). كشف التصوير عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر عن اضطراب مذهل في بنية ألياف الإجهاد الطبيعي F-actin في m PTCs من Ocrl^Y/-مقارنةً بالفئران OcrlY / ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى نقل البروتينات المنظمة للأكتين من مواقعها الخلوية الطبيعية إلى الإندوسومات ، حيث تحيط مجموعات كبيرة من الأكتين بهذه العضيات ويُعتقد أنها أصل عيب الاتجار.^10,29علاج اوكرل^Y/- استعادت m PTCs مع alpelisib (10 مم) بنية ألياف الإجهاد (الشكل 4 أ).

كيف يتم استخدام phosphoinositide 3- kinase inhibitor alpelisib لعلاج متلازمة لوي / مرض دنت؟

باعتبارها المشكلة الرئيسية فيمتلازمة لوي ومرض دنت2 هو تقليل الاتجار الداخلي وما يترتب على ذلك من تدهور الميجالين ، سعينا إلى التمييز بين الأكتين الداخلي وألياف الإجهاد. لقد جمعنا مكدسات z متحد البؤر للمسح بالليزر في جميع أنحاء الخلايا ، وأعدنا بناء نمط التلوين في العروض السطحية ثلاثية الأبعاد ، واستخدمنا شكل / معلمات الحجم لتحديد هياكل الأكتين النقطية ودرجة تداخلها مع الهياكل الداخلية (الشكل التكميلي S4 والأفلام S1 –S3). كشف هذا التحليل أن العلاج باستخدام alpelisib قلل من البلمرة الشاذة لـ F-actin في الجسيمات الداخلية الملطخة بـ EEA1 ، المتميزة عن بنية ألياف الإجهاد (الشكل 4 ب). m PTCs المشتقة من Ocrl^Y/-أظهرت الفئران تغيرات كبيرة في تلطيخ الخلايا لـ PI (3) P (انخفض) و PI (4،5) P2 (زيادة) ، مقارنة مع m PTCs من الفئران WT OcrlY / (الشكل 4 ج ود). علاج m PTCs من Ocrl^Y/- أدت الفئران مع alpelisib إلى انخفاض كبير في تلطيخ PI داخل الخلايا (3) P و PI (4،5) P2 (الشكل 4 ج و د).

1.5 Alpelisib يحسن امتصاص الخلايا الداخلية في Ocrl^Y/-م PTCs

قمنا بعد ذلك بتقييم ما إذا كان تأثير alpelisib على العيوب الهيكلية الخلوية والحويصلية التي لوحظت في m PTCs أدى إلى تغييرات في قدرة امتصاص الالتقام. للتمييز بين تأثير alpelisib على ربط و / أو استيعاب الربيطة ، تم تحضين m PTCs أولاً باستخدام ألبومين مصل البقر المسمى (BSA) ، للحث على ارتباط المسبار بمستقبلات الالتحام ، ثم حضنت مع وسط نمو ، اتبع استيعاب الألبومين (الشكل 5 أ). أوكرل^Y/-أظهرت الخلايا ارتباطًا منخفضًا بغشاء البلازما 488- لألبومين المصل البقري من Alexa جنبًا إلى جنب مع ضعف استيعاب الألبومين مقارنة بخلايا OcrlY / þ. أنقذ العلاج باستخدام alpelisib كلاً من الارتباط وامتصاص الألبومين في Ocrl^Y/-الخلايا ، مع إنقاذ إجمالي بنسبة 50 في المائة لامتصاص الالتقام (الشكل 5 ب و ج). تم دعم هذه البيانات بقياس إجمالي امتصاص الألبومين (الأشكال التكميلية S5a و b). لاحظنا أن نسبة الألبومين المصل البقري الداخلية / المقيدة من Alexa 488- ظلت متشابهة بين الظروف المختلفة (الشكل 5 د) ، مما يعني أن انخفاض امتصاص الألبومين يرجع أساسًا إلى ضعف الارتباط بدلاً من خلل في عملية الاستيعاب.

1.6 يحسن Alpelisib اختلال وظيفي في PT والالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات في Ocrl^Y/- الفئران

اختبرنا التأثير العلاجي المحتمل لـ alpelisib على خلل PT في الجسم الحي. تم إعطاء الفئران عن طريق الفم إما مع مركبة أو alpelisib (50 ملغم / كغم من وزن الجسم في اليوم) بالتزقيم عن طريق الفم لمدة 6 أسابيع (الشكل 6 أ). تم اختيار هذا النظام وفقًا لدراسات سابقة في الجسم الحي توضح الفعالية والسلامة.^22,30تمشيا مع المعروف أن إعطاء alpelisib يسبب مقاومة الأنسولين وارتفاع السكر في الدم ،²²أدى علاج alpelisib إلى زيادة كبيرة في بيلة سكرية في كل من Ocrl Y / þ و Oral^Y/-الفئران ، والتي يمكن اعتبارها علامة بيولوجية لجرعات الأدوية (الجدول التكميلي S1). بعد 6 أسابيع من علاج alpelisib ، يتم استخدام Ocrl^Y/-أظهرت الفئران انخفاضًا كبيرًا في إفراز البول لبروتينات LMW CC16 (-34 في المائة) والألبومين (-38 في المائة) ، مقارنة بعناصر التحكم المعالجة بالمركبة (الشكل 6 ب و ج) ، في حين أن حجم لم يتأثر البول والمعلمات الأخرى (الجدول التكميلي S1). أظهرت الفئران المعالجة بـ Alpelisib من كلا الطرازين انخفاضًا مشابهًا في معدل النمو بالنسبة لفئران التحكم ، كما هو موضح سابقًا.²²ومع ذلك ، اكتسبت الفئران المركبة والمعالجة وزن الجسم ، مما يشير إلى أن الدواء لا يؤثر بشدة على نمو ما بعد الولادة (الشكل 6 د والجدول التكميلي S1).

لاختبار ما إذا كان تأثير alpelisib على البيلة البروتينية LMW يعكس استعادة الالتقام بوساطة المستقبل في خلايا PT ، تابعنا امتصاص الجسم الحي لـ Cy 5- المسمى b-lactoglobulin في كلية فأر. Ocrl المعالجة بالالبليسيب^Y/-عرضت الفئران عملية إنقاذ كبيرة لـ Cy 5- المسمى امتصاص b-lactoglobulin ، بالقرب من مدى الاستيعاب الذي لوحظ في الفئران OcrlY / المعالجة بالمركبة (الشكل 6 هـ). وقد انعكس هذا من خلال إنقاذ كبير في التعبير عن مستقبلات الميجالين في خلايا PT ، كما لوحظ من خلال الوسم المناعي والنشاف الغربي لمحلول الكلى من Ocrl المعالج بالألبليسيب.^Y/-الفئران؛ لاحظ أنه لم يكن هناك أي تغيير في التعبير عن علامة PT AQP1 (الشكل 6f و g والشكل التكميلي S5C و D). تظهر هذه البيانات أن PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)مثبط alpelisibيحث على تحسين كبير في آلية PT endocytic ويقلل من البيلة البروتينية LMW في نموذج فأر متوافق مع البشر لمتلازمة لوي.

الشكل 5|Alpelisib يحسن امتصاص الخلايا الداخلية للـ Ocrl المتوافق مع البشر^Y/-الماوس PTCs (م PTCs). (أ) رسم تخطيطي يوضح تجربة مطاردة النبض المستخدمة لفحص الارتباط والاستيعاب لألبومين المصل البقري 488- Alexa (BSA) إلى m PTCs. تم تعريض الخلايا لـ Alexa 488- BSA (0. 2 مجم / مل) لمدة ساعة عند 4 درجات للسماح لـ BSA بالارتباط بمستقبلات سطح الخلية (النبض) ثم تم تسخينها إلى 37 درجة في وسط الخلية لمدة 20 دقيقة قبل التثبيت للسماح باستيعاب يجند (مطاردة). (ب) الصور المجهرية التمثيلية لـ OcrlY / þ أو Ocrl^Y/-م تمت معالجة PTCs بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو 10 ملي مولار من alpelisib لمدة 16 ساعة وخضعت لتجربة Alexa 488- BSA (الخضراء) ، قبل أن يتم إصلاحها وتصنيفها لـ 40 ، 6- ديميدينو { {6}} فينيليندول (DAPI) (أزرق). تظهر مرحلة النبض للتجربة في اللوحة العلوية لكل حالة ، مع المطاردة أدناه. أشرطة =20 ملم. (ج) القياس الكمي لسطح الخلية Alexa 488- BSA (i) و Alexa الداخلي 488- BSA (ii) ، الذي تم تقييمه على أنه متوسط ​​كثافة التألق FL لكل خلية. ينقذ Alpelisib ارتباط BSA المنقذ والاستيعاب الذي لوحظ في Ocrl^Y/-الخلايا. N =209 و 228 و 186 و 196 خلية لـ OcrlY / þ DMSO و OcrlY / þ alpelisib و OcrlY / DMSO و Ocrl^Y/-شروط alpelisib ، على التوالي في (i) و N {0}} و 183 و 199 و 233 خلية لـ OcrlY / þ DMSO و OcrlY / þ alpelisib و Ocrl^Y/-DMSO و Ocrl^Y/-شروط alpelisib ، على التوالي في (2) ، في كل حالة مجمعة من كليتي فأر لكل حالة ؛ تمثل كل نقطة بيانات متوسط ​​كثافة التألق FL في خلية فردية. تم اختبار الأهمية من خلال تحليل Kruskal-Wallis (KW) للتباين (ANOVA) مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Dunn: لـ (1) سطح الخلية BSA ، بشكل عام *** P <0. 001="" ،="" مقارنات="" متعددة:="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="">^Y/-DMSO و Ocrl^Y/-DMSO مقابل Ocrl^Y/-alpelisib *** P <{{0}}. 001="" ؛="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="" ocrly="" þ="" alpelisib="" p="0." 60="" (غير="" مهم="" [ns])="" ؛="" لـ="" (2)="" bsa="" الداخلي="" ،="" بشكل="" عام="" ***="" p=""><0.001 ،="" مقارنات="" متعددة:="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="">^Y/-DMSO و Ocrl^Y/-DMSO مقابل Ocrl^Y/-alpelisib *** P <0. 001="" ؛="" ocrly="" þ="" dmso="" مقابل="" ocrly="" þ="" alpelisib="" p="0" .66="" (ns).="" (د)="" القياس="" الكمي="" للنسبة="" بين="" سطح="" الخلية="" alexa="" 488-="" bsa="" وشدة="" التألق="" الداخلية="" alexa="" 488="" –="" bsa="" fl="" ،="" مع="" عدم="" وجود="" فروق="" ذات="" دلالة="" إحصائية="" في="" النسب="" بين="" كل="" حالة.="" تمثل="" كل="" نقطة="" متوسط="" ​​النسبة="" في="" حقل="" يحتوي="" على="" ما="" يقرب="" من="" 15-20="" خلية="" (n="13" و="" 13="" و="" 10="" و="" 11="" حقلًا="" تم="" اختياره="" عشوائيًا="" لـ="" ocrly="" þ="" dmso="" و="" ocrly="" alpelisib="" و="">^Y/-DMSO و Ocrl^Y/-شروط alpelisib ، على التوالي ، في كل حالة مجمعة من كليتي فأر لكل حالة). تم اختبار الأهمية بواسطة KW ANOVA مع اختبارات المقارنات المتعددة لـ Dunn: P =0 بشكل عام. 46 (ns) ، مقارنات متعددة: OcrlY / þ DMSO مقابل Ocrl^Y/-DMSO و Ocrl^Y/-DMSO مقابل Ocrl^Y/-alpelisib P> 0. 99 (ns) ؛ OcrlY / þ DMSO مقابل OcrlY / þ alpelisib P =0. 84 (ns). لتحسين عرض هذه الصورة ، يرجى الاطلاع على النسخة الإلكترونية من هذه المقالة على www.kidney-international.org.

الشكل 6|يعمل Alpelisib على تحسين وظيفة الأنابيب القريبة (PT) لفئران OcrlY / L ، واستعادة امتصاص ligand وتعبير megalin. (أ) الإعداد التجريبي. عولجت الفئران الفموية لمدة 6 أسابيع بجرعة فموية يومية إما من كربوكسي ميثيل سلولوز 1 في المائة (مركبة) أو ألبليسيب (50 مجم / كجم من وزن الجسم). في اليوم الأخير من العلاج ، تم حقن الفئران بـ Cy 5- المسمى b-lactoglobulin (N =6 Ocrl^Y/-، أو 8 أوكرل^Y/-الفئران لكل مجموعة). (ب - د) تشير قيم D الموضحة إلى متوسط ​​التغيير من BL إلى D42 للشرط ± SEM. (ب) تم قياس بروتين خلية كلارا 16 (CC16) ، (ج) مخرجات البول الزلال (كلاهما في غضون 15 ساعة) ، و (د) كتلة الجسم في الفئران التي عولجت باستخدام مركبة أو ألبليسيب في النقطة الزمنية المحددة. كل نقطة تمثل 1 فأر. تم تقييم الأهمية من خلال 2- اختبار الطالب المقترن الذيل ؛ في (ب) CC16 (تابع)

الشكل 6|(تابع) تغير الناتج بالنسبة لخط الأساس ؛ þ مركبة ، P =0. 98 0 2 (غير مهم [ns]) ، þ alpelisib ، * P =0. 0 334 ؛ في (ج) تغير ناتج الألبومين بالنسبة لخط الأساس ؛ þ مركبة ، P =0. 0502 (ns) ، þ alpelisib ، *** P ¼ 0.0006 ؛ في (د) تغير كتلة الجسم بالنسبة لخط الأساس ؛ þ مركبة *** P <0.0001، þ="" alpelisib،="" **="" p="0." 0083.="" (هـ)="" صور="" مجهرية="" تمثيلية="" متحد="" البؤر="" تظهر="" cy="" 5-="" المسمى="" ب-لاكتوجلوبولين="" (أرجواني)="" بعد="" 15="" دقيقة="" من="" حقن="" الوريد="" الذيل="" وتسمية="" بـ="" 40="" ،="" 6-="" ديميدينو="" -2-="" فينيليندول="" (dapi)="" (سماوي)="" ،="" بالإضافة="" إلى="" القياس="" الكمي="" لإشارات="" الفلورسنت="" fl="" المقابلة="" من="" كليتي="" الماوس="" ocrl="" (n="412" ،="" و="" 500="" ،="" و="" 588="" أنبوبًا="" ،="" على="" التوالي="" ،="" لمركبة="" ocrly="" þþ="" ،="">^Y/-þ مركبة ، واكرل^Y/-þ alpelisib) لـ 3 فئران لكل مجموعة معالجة. يتم إنقاذ امتصاص ب-لاكتوجلوبولين عن طريق علاج الألبليسيب. أشرطة ¼ 2 0 ملم. في القياس الكمي ، تمثل كل نقطة كثافة FL الفلورية التي تم تطبيعها بواسطة منطقة الأنابيب ؛ تشير البيانات المرسومة إلى المتوسط ​​± SEM. تم تقييم الأهمية من خلال اختبار Kruskal-Wallis (KW) متبوعًا باختبار Dunn للمقارنة المتعددة ؛ *** P <0.001 ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" سيارة="" ocrly="" þþ="" مقابل="">^Y/-þ مركبة واكرل^Y/-þ مركبة مقابل اوكرل^Y/-þ alpelisib ، كلاهما *** P <0. 001.="" (و)="" تحليل="" النشاف="" الغربي="" وقياس="" الكثافة="" لمستويات="" الميجالين="" في="" محلولات="" الكلى="" الكاملة="" من="" الفئران="" عن="" طريق="" الفم.="" تم="" استخدام="" التوبولين="" كعنصر="" تحكم="" في="" التحميل.="" التعبير="" الميجالين="" المنخفض="" في="">^Y/-يتم إنقاذها بواسطة alpelisib. في القياس الكمي لتحليل قياس الكثافة ، تمثل كل نقطة ماوسًا واحدًا (N =4 OcrlY / þþ مركبة و Ocrl^Y/-þ مركبة و N =3 Ocrl^Y/-þ فئران alpelisib) ؛ تشير الخطوط إلى يعني ± SEM. تم تقييم الأهمية من خلال 2- Tailed unpaired Student's t-tests: OcrlY / þþ مركبة مقابل Ocrl^Y/-þ مركبة ** P ¼ 0. 0057، Ocrl^Y/-þ مركبة مقابل اوكرل^Y/- þ alpelisib، * P =0. 0246. (ز) صور مجهرية متحد البؤر التمثيلية مع إدخالات عالية التكبير وتقدير كثافة الميجالين (الأصفر) في AQP1þ PTs (أرجواني) من الكلى الفموية تم تصنيفها أيضًا لـ DAPI (سماوي) يوضح إنقاذ مستويات الميجالين بعد علاج alpelisib. أشرطة =20 ملم. في القياس الكمي ، تمثل كل نقطة كثافة FL الفلورية التي تم تطبيعها بواسطة منطقة الأنابيب ؛ تشير البيانات المرسومة إلى المتوسط ​​± SEM ؛ N =142 و 191 و 266 أنبوبًا نبيبيًا ، على التوالي ، لمركبة OcrlY / þþ ، Ocrl^Y/-þ مركبة ، واكرل^Y/-þ alpelisib لـ 3 فئران لكل مجموعة معالجة. تم تقييم الأهمية من خلال تحليل KW للتباين متبوعًا باختبار المقارنة المتعددة لـ Dunn ؛ بشكل عام *** P <0. 001="" ،="" مقارنات="" متعددة="" ؛="" سيارة="" ocrly="" þþ="" مقابل="">^Y/-þ مركبة واكرل^Y/-þ مركبة مقابل اوكرل^Y/-þ alpelisib ، كلاهما *** P <0. 001.="" لتحسين="" عرض="" هذه="" الصورة="" ،="" يرجى="" الاطلاع="" على="" النسخة="" الإلكترونية="" من="" هذه="" المقالة="" على="">

كيف يتم استخدام phosphoinositide 3- kinase inhibitor alpelisib لعلاج متلازمة لوي / مرض دنت؟

2. المناقشة

لا يوجد حاليًا علاج للتخفيف من الإبطاء المعيب الذي يسبب خللًا وظيفيًا في PTمتلازمة لوي ومرض دنت2. تكشف النتائج التي توصلنا إليها أن alpelisib يخفف من النمط الظاهري للأكتين الشاذ عن طريق تقليل مستويات PI (4،5) P2 و PI (3) P ، مما يتسبب في تحسن كبير في آلية الالتقام والقدرة الاستيعابية في الأنظمة الخلوية ونموذج الماوس المتوافق مع البشر من أجل متلازمة لوي / مرض دنت 2. تدعم هذه النتائج الارتباط بين دهون الفوسفوينوزيتيد ، وبلمرة الأكتين ، والاتجار بالبطانة الداخلية ، مع أهمية فورية للخلايا الظهارية النشطة للغاية التي تشارك في عمليات التماثل الساكن الحاسمة (الشكل 7). نظرًا لنقص العلاجات الفعالة والسلامة الظاهرة لهذه الفئة من PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)مثبطات ، alpelisib هو مرشح واعد لإعادة استخدام الدواء فيمتلازمة لوي ومرض دنت.

البيلة البروتينية LMW هي الميزة الأكثر اتساقًا التي يواجهها المرضىمتلازمة لوي ومرض دنت2 بسبب تعطيل الطفرات في OCRL.⁴يمكن بسهولة اكتشاف بروتينات LMW هذه وتحديد كميتها ، مما يوفر علامة بيولوجية مخلصة للالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات المعيبة في خلايا PT. 1 البيلة البروتينية LMW ذات صلة بشكل خاص ، حيث يتم اكتشافها بشكل متسق وغالبًا في وقت أبكر من المواد المذابة الأخرى (على سبيل المثال ، الجلوكوز ، الفوسفات ، الأحماض الأمينية) كجزء من "متلازمة فانكوني الكلوية" الكلاسيكية - على الأقل في الاضطرابات الخلقية للمسار الجواني.¹هنا ، نظهر أن alpelisib ينقذ قدرة امتصاص الالتحام القمي لخلايا PT في المختبر وفي الجسم الحي ، بسبب المستويات المستعادة لمستقبلات الميجالين في غشاء البلازما. ينعكس هذا التأثير من خلال الانخفاض الكبير في الفقد البولي لبروتينات LMW (CC16 والألبومين) في Ocrl^Y/-عولجت الفئران بـ alpelisib لمدة 6 أسابيع. وقد لوحظت تأثيرات alpelisib هذه في m PTCs ، والتي تحافظ على تمايزها القمي وهي مناسبة بشكل خاص للتحقيق في الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات في علم وظائف الأعضاء والمرض.⁹ على وجه الخصوص ، حصلنا على m PTCs من نموذج فأر متوافق مع البشر يعبر عن INPP5B بشري في Ocrl^Y/-؛ Inpp5b^-/-الخلفية ، والتي تتيح لنا التحقيق في العواقب المحددة لفقدان نشاط OCRL.^11,23

يتم تفسير إنقاذ الالتقام الخلوي بواسطة alpelisib من خلال تأثيره على آلية الأكتين ، والذي يتضح بوضوح في خلايا OCRL KO HK2 و m PTCs. تؤكد ملاحظاتنا وتمدد الدراسات السابقة التي توضح العلاقة بين التحكم في توازن الفوسفوينوزيتيد و F-actin في المسار الداخلي المبكر في مرضى OCRL وخلايا KO.^7,10يؤدي الفقد الوظيفي لنشاط OCRL إلى إعاقة تدهور PI (4،5) P2 ، والذي يؤدي بدوره إلى فشل الحويصلات المغلفة بالكالاثرين مما يؤدي إلى عضيات داخلية شاذة في أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك خلايا PT.^7-10لقد أظهرنا مؤخرًا أن فائض F-actin يقلل من إعادة تدوير ميجالين مستقبلات متعددة التراكيب إلى الغشاء القمي لخلايا PT ، مما يتسبب في حدوث خلل في الالتقام الخلوي وبيلة ​​بروتينية LMW.¹¹

تشير بياناتنا إلى أن آلية عمل alpelisib على الأكتين الداخلي تنشأ من تأثير ثنائي الخصوصية لتثبيط alpelisib: أولاً على إنتاج PI (3،4،5) P3 وتحويله إلى PI (3) P ، والثاني على إنتاج PI (4،5) P2. يؤدي الانخفاض في مستويات PI (4،5) P2 إلى مواجهة نقص OCRL بشكل مباشر ويتفق مع العمل السابق لتخفيف الأكتين الزائد وزيادة التدفق الداخلي عن طريق خفض مستويات فوسفاتيديلينوسيتول 4- فوسفات 5- كيناز ، وهو إنزيم يولد PI (4،5) P2.¹⁰يحتوي Alpelisib على 0. تركيز مثبط بنسبة 5 ملي مولار بنسبة 50 بالمائة على PI (4،5) P2 لتوليد كيناز PI4Kb ، والذي قد يكون مسؤولاً ، أو قد ينتج عن تأثيرات عامة على توازن الفوسفوينوسيتيد الناتج عن الجمع بين OCRL علاج KO و alpelisib. لقد حددنا تلك الفئة IA PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)يرتبط تثبيط alpelisib بتثبيط الأكتين لأن استنفاد p110a بوساطة siRNA يثبط تراكم الأكتين بشكل مشابه لعلاج alpelisib و copanlisib (الذي لم يتم الإبلاغ عن تثبيط PI4Ks). في خلايا RPE ، لاحظنا سابقًا أن siRNA لـ INPP4A ، الذي يحول PI (3،4) P2 إلى PI (3) P ، يمنع تجميع الأكتين في خلايا OCRL KO ، مما يوفر مسارًا لتثبيط PI (3،4،5) إنتاج P3 إلى انخفاض في PI داخل الجسم (3) ص. لقد أظهرنا أن بعض PI (3) P متبقية ، ويفترض أن يكون البركة التي تم إنتاجها في الجسيم الداخلي المبكر بواسطة الفئة III PI3K ، Vps34 لأننا وجدنا أن تهريب الجسيمات الداخلية يتم تعزيزه بدلاً من تثبيته بواسطة علاج alpelisib. تم أيضًا تسليط الضوء على التنظيم المعقد لعملية التمثيل الغذائي لـ PI وأهميته لتثبيط OCRL في دراسة حديثة حيث تعمل الوظائف غير التحفيزية للفوسفاتاز 3- PTEN على تنشيط PI (4،5) تدهور P2 عبر PLCXD ، مما يخفف من الأنماط الخلوية وامتصاص يجند في نموذج الزرد.³¹

التخفيف من النمط الظاهري للأكتين عن طريق خفض مستويات PI (4،5) P2 و PI (3) P بواسطة معالجة alpelisib يتوافق مع الإجراء التآزري لـ PI (4،5) P2 و PI (3) P في تجنيد SNX9 لتنشيط آلية الأكتين في اندوسومات Ocrl ،¹⁴مما يشير إلى تطابق فعال للغاية لخصوصية alpelisib لمعالجة التنظيم الجزيئي لتنشيط الأكتين في الإندوسومات. في المقابل ، كما تم إثباته سابقًا ، يؤدي انخفاض تجميع الأكتين داخل الجسم ، بدوره ، إلى تحسن في الالتقام الخلوي PT في الخلايا التي تعاني من نقص OCRL.¹⁰ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التوصيف لفهم ما إذا كان تنظيم الأكتين من خلال استقلاب الفوسفوينوزيتيد هو المصدر الحقيقي للتأثير العلاجي الذي نلاحظه مع alpelisib في Ocrl^Y/-نموذج الفأر. لأن الفئة الأولى PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)تنظيم المسارات التي تتحكم في نمو الخلايا ، والتكاثر ، والبقاء ، والتمثيل الغذائي ، والالتهام الذاتي ،³²لا يمكننا استبعاد أن الإنقاذ الداخلي يرجع إلى التأثيرات على PI (3،4،5) P3 مباشرة والتأثير المشترك على المسارات الأخرى المعدلة بواسطة الفئة I PI3K. هناك حاجة أيضًا إلى مزيد من العمل لاختبار ما إذا كان PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)قد تخفف المثبطات أيضًا من المظاهر العصبية وغيرها من المظاهر السريرية للمرضى الذين يعانون من طفرات OCRL.⁴

تشير التجربة الحديثة لـ alpelisib في مرضى الأطفال المصابين بمتلازمة PROS / CLOVES إلى أن الدواء لديه القدرة على تحمله بشكل جيد. يتم تناول Alpelisib عن طريق الفم ، ويستهدف بشكل انتقائي الشكل الإسوي لـ PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)الفئة الأولى ، ويظهر مظهر سمية طفيف مقارنة بمثبطات عموم PI3K. نظرًا لأن alpelisib لا يحجب PI3K تمامًا (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)النشاط ، وبالتالي الحفاظ على وظائف مسار التشوير ، فقد يكون مناسبًا بشكل خاص للاستخدام على المدى الطويل. قد يكون من الممكن التحكم في ارتفاع السكر في الدم الناجم عن استخدام الألبليسيب عن طريق التغييرات الغذائية.²²نظرًا لأن الخلل الوظيفي في PT هو أول مظهر من مظاهر أمراض الكلى التي لوحظت عند الرضع الصغار المصابين بمرض دنت 2 ومتلازمة لوي ، فإن العلاج المبكر لخلل PT هذا ، مما يؤدي إلى تحسين المظهر الجانبي الأيضي والنمو ، قد يؤدي بالتالي إلى إبطاء التقدم إلى مرض الكلى المزمن وبالتالي لديهم تأثير كبير على العمر الافتراضي ونوعية الحياة.³³على الرغم من أن المظاهر المرضية لطفرة OCRL واسعة بشكل خاص ، إلا أن الدراسات الحديثة المستندة إلى مجموعات كبيرة من مرضى النمط الجيني المصابين بمتلازمة لوي لمرض دنت 2 لم تثبت وجود آثار مهمة لنوع الطفرة أو موقع الطفرة على بقاء الكلى.³⁴بشكل جماعي ، تسلط بياناتنا الضوء على إمكانية إعادة استخدام alpelisib لعلاج اختلال وظيفي في PT في متلازمة لوي / مرض دنت 2 ، وبالتالي توفير أساس للنشر السريع والفعال من حيث التكلفة في التجارب السريرية البشرية.

3. الطرق

3.1 يمكن العثور على التفاصيل الكاملة في الطرق التكميلية.

عولجت خلايا HK2 باستخدام copanlisib أو alpelisib أو GSK2636771 أو idelalisib بتركيزات محددة لمدة 16 ساعة ما لم ينص على خلاف ذلك. تم استخراج البروتينات باستخدام الطرق القياسية من الخلايا أو أنسجة الكلى وتم إجراء النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة المنشورة أو المتاحة تجارياً. تم إجراء ضربة قاضية لـ siRNA باستخدام 2 transfections 72 و 24 ساعة قبل التحليل. استخدمنا OcrlY / þ المطابقة للعمر والجنس ؛ Inpp5b^{- /-}؛ و Ocrl^Y/-؛ Inpp5b^-/- رفقاء الفئران يؤويون تعبير BAC-INPP5B. تم إنشاء الثقافات الأولية لـ m PTCs من الكلى التي تم حصادها من فئران Ocrl عمرها 8 أسابيع وتم تقييم القدرة الداخلية لـ Oral m PTCs عن طريق قياس امتصاص الألبومين. كانت معالجات Alpelisib 10 ملي مولار لمدة 16 ساعة ما لم يذكر خلاف ذلك. تم تقييم امتصاص الألبومين في m PTCs باستخدام بروتوكول "مطاردة النبض" لتقييم الارتباط القمي والامتصاص الناتج. تم تلوين m PTCs طوال الليل مع الجسم المضاد الأولي المناسب ولمدة 45 دقيقة مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع فلوروفور FL و / أو Alexa -488 Phalloidin. تم إجراء تلطيخ PI (3) P على m PTCs باستخدام مسبار مجال FYVE. تم إجراء تحليل الصورة باستخدام CellProfifiler ، باستخدام خطوط أنابيب مخصصة لقياس تداخل الأكتين / EEA1 وعدد النقاط ، ومع ImageJ لقياس كثافة التألق المناعي والحواف المكتشفة لحساب درجة ألياف الإجهاد. تم التعبير عن البيانات الكمية كوسيلة ± الخطأ المعياري للمتوسط. بالنسبة للتجارب التي أجريت في الجسم الحي ، عولجت الفئران التي يبلغ عمرها 6 أسابيع بالمركبة أو alpelisib 50 مجم / كجم من وزن الجسم. تم جمع البول كل 14 يومًا وتم التضحية بالحيوانات بعد 42 يومًا من العلاج ، مع حصاد الدم والكلى. تم فحص قدرة PT endocytic الفئران عن طريق قياس امتصاص b-lactoglobulin.

4. الإفصاح

تحصل JLG على تمويل من AstraZeneca لمنحة دراسية في مختبرها. SPJ عضو في المجالس الاستشارية ولديها ملكية أسهم في Mission Therapeutics و Carrick Therapeutics و Adrestia Therapeutics ، وهي شريك علمي في Ahren Innovation Capital. أعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم تضارب المصالح.

5. شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منحة مجلس البحوث الأوروبي 281971 ، زمالة Wellcome Trust Research Career Development WT095829AIA ، زمالة Wellcome Senior Research 219482 / Z / 19 / Z ، صندوق مفهوم Wellcome Trust Development 209749 / Z / 17 / Z ، منحة إيزاك نيوتن للأبحاث 18.23 (ي) إلى JLG ، وجائزة Wellcome Investigator 206388 / Z / 17 / Z إلى SPJ ، ونعترف بتمويل معهد Gurdon من Wellcome Trust (092096) و CRUK (C6946 / A14492). نحن ممتنون لمؤسسة Cystinosis Research Foundation (Irvine ، CA) ، والمؤسسة السويسرية الوطنية للعلوم (منحة المشروع 310030_189044) ، وبرنامج أولوية البحث السريري (KFSP) RADIZ (مبادرة الأمراض النادرة في زيورخ) من UZH ، سويسرا

المركز الوطني للكفاءة في البحث (NCCR) مراقبة الكلى للتوازن (Kidney.CH) للحصول على الدعم ، و NIDDK / NIH و Lowe Syndrome Trust / UK لدعم تطوير الفئران الفموية. نعترف بـ Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation و UCSF ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا) و Maria Antonietta De Matteis (معهد Telethon للوراثة والطب ، جامعة Federico II Naples ، نابولي ، إيطاليا) لتوفير مؤسسي مستعمرة الفأر الفموي ؛

وإريك أولينجر (UZH ، زيورخ) لإجراء مناقشات مثمرة. نشكر Nadine Näegele و Daniela Nieri على تقديم المساعدة الفنية أثناء جمع البول وتحليله ؛ Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades ، باريس) لمشاركتنا البروتوكول المفصل لإعداد Alpelisib للعلاج في الجسم الحي ؛ وريناتا كوزيراكي وبيير فيروست لتوفير الكواشف. نشكر أيضًا مركز الفحص المجهري وتحليل الصور التابع لجامعة زيورخ (زيورخ ، سويسرا) ومرفق زيورخ لفسيولوجيا القوارض التكاملي (ZIRP) لتوفير المعدات اللازمة لاكتساب التصوير والدعم الفني أثناء التجارب في الجسم الحي.

كيف يتم استخدام phosphoinositide 3- kinase inhibitor alpelisib لعلاج متلازمة لوي / مرض دنت؟

6. المواد التكميلية

ملف تكميلي (PDF)

الطرق والمراجع التكميلية.

الجدول S1. معلمات وزن الجسم والبول والدم بمرور الوقت في الفئران الفموية التي عولجت بالألبليسيب أو المركبات.

الشكل S1. التعبير الإسوي p110 ومقايسات السمية الخلوية للاستجابة لجرعة الدواء في خلايا HK2.

الشكل 2. PI3Kمثبط alpelisibيعيد التداخل الداخلي للأكتين ويقلل من مستويات PI (3) P بطريقة تستجيب للجرعة بعد 4 ساعات من العلاج الدوائي في خلايا HK2.

الشكل S3. تعبير isoform p110 وسمية alpelisib في Ocrl mPTCs.

الشكل S4. سير عمل تحليل تداخل EEA1 / أكتين في Ocrl mPTCs.

الشكل S5. Alpelisib يعيد امتصاص الألبومين في Ocrl^Y/-mPTCs. تعبير Aqp1 غير متأثر. ملف تكميلي (افلام)

فيلم S1. يتداخل عرض Imaris ثلاثي الأبعاد لـ EEA1 / أكتين في OcrlY / mPTCs المعالجة بـ DMSO. عرض السطح ثلاثي الأبعاد التمثيلي لمكدس متحد البؤر من OcrlY / mPTCs المعالجة بـ DMSO لمدة 16 ساعة ثم يتم تثبيتها بـ 4٪ فورمالدهايد فيكس ووسم مناعي لـ EEA1 (أرجواني) ، أكتين (phalloidin ؛ أصفر) ، و DAPI (أزرق) ، يوضح القليل الأكتين / الرابطة الداخلية. شريط =5 ملم.

فيلم S2. يتداخل عرض Imaris ثلاثي الأبعاد لـ EEA1 / actin في Ocrl^Y/-mPTCs تعامل مع DMSO. عرض السطح ثلاثي الأبعاد التمثيلي لمكدس متحد البؤر من OcrlY / - mPTCs المعالجة بـ DMSO لمدة 16 ساعة ثم يتم تثبيتها بـ 4 بالمائة فورمالدهايد فيكس ووسم مناعي لـ EEA1 (أرجواني) ، أكتين (phalloidin ؛ أصفر) ، و DAPI (أزرق) ، توضيح نقطي الأكتين المترابط بالقرب من الهياكل الداخلية. شريط =5 ملم.

فيلم S3. يتداخل عرض Imaris ثلاثي الأبعاد لـ EEA1 / actin في Ocrl^Y/- mPTCs تعامل مع alpelisib. عرض السطح ثلاثي الأبعاد التمثيلي لمكدس متحد البؤر من OcrlY / - mPTCs المعالجة بـ 10 ملي مولار من alpelisib لمدة 16 ساعة ثم يتم تثبيتها بـ 4٪ فورمالدهايد فيكس ووسم مناعي لـ EEA1 (أرجواني) ، أكتين (phalloidin ؛ أصفر) ، و DAPI (أزرق) ، مما يوضح إنقاذ هياكل الأكتين المثقوبة حول الإندوسومات. شريط =5 ملم.

المراجع

1. van der Wijst J ، Belge H ، Bindels RJM ، Devuyst O. تعلم علم وظائف الأعضاء من اضطرابات الكلى الموروثة. القس فيزيول .2019 ؛ 99: 1575–1653.

2. متلازمة لوي إم لوي. Orphanet J Rare Dis. 2006 ؛ 1:16.

3. لويس آر إيه ، نوسباوم آر إل ، بروير إد. متلازمة لوي. في: Adam MP ، Ardinger HH ، Pagon RA ، et al. ، eds. GeneReviews® [الإنترنت]. سياتل (واشنطن): جامعة واشنطن ، سياتل ؛ 1993-2020. متاح على: HTTPS: // www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. نُشر في 24 يوليو 2001 ؛ تم التحديث في 18 أبريل 2019. تم الوصول إليه في 8 أغسطس 2019.

4. De Matteis MA ، Staiano L ، Emma F ، Devuyst O. إن 5- phosphatase OCRL فيمتلازمة لوي ومرض دنت2. نات ريف نفرول. 2017 ؛ 13: 455-470.

5. Devuyst O ، Luciani A. ناقلات الكلوريد والالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات في النبيبات القريبة الكلوية. ي فيزيول. 2015 ؛ 593: 4151-4164.

6. Zhang X ، Jefferson AB ، Auethavekiat V ، Majerus PW. نقص البروتين في متلازمة لوي هو فوسفاتيديلينوسيتول -4 ، 5- ثنائي فوسفات 5- فوسفاتيز. بروك ناتل أكاد سسي أوس أ. 1995 ؛ 92: 4853-4856.

7. Nández R ، Balkin DM ، Messa M ، et al. كشفت دراسات أجريت على خلايا متلازمة لوي دور OCRL في ديناميكيات الحفرة المطلية بالكلاترين وفك الطلاء. eLife. 2014 ؛ 3: e02975.

8. ميهتا ZB ، بيتكا جي ، لوي M. الوظائف الخلوية والفسيولوجية لبروتين متلازمة لوي OCRL1. حركة المرور. 2014 ؛ 15: 471-487.

9. De Leo MG و Staiano L و Vicinanza M et al. يؤدي اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم إلى استجابة جسيمية بوساطة TLR9 ويتم التحكم فيها بواسطة OCRL. نات سيل بيول. 2016 ؛ 18: 839-850.

10. Vicinanza M ، Di Campli A ، Polishchuk E ، وآخرون. يتحكم OCRL في الاتجار من خلال الإندوسومات المبكرة عبر PtdIns4،5P (2) - التنظيم المعتمد للأكتين الداخلي. EMBO J. 2011 ؛ 30: 4970-4985.

11. Festa BP ، Borquez M ، Gassama A ، et al. يؤدي نقص OCRL إلى إضعاف وظيفة الجسيم الداخلي في نموذج الفأر المتوافق مع البشرمتلازمة لوي ومرض دنت. همهمة مول جينيه. 2019 ؛ 28: 1931-1946.

12. ويلش HC ، كولدويل دبليو جيه ، إلسون سي دي ، إت آل. P-Rex1 و PtdIns (3،4،5) P 3- وعامل تبادل غوانين ونيوكليوتيد خاضع للتنظيم بواسطة Gbetagamma لـ Rac. خلية. 2002 ؛ 108: 809-821.

13. جالوب جيه إل ، والترانت أ ، كانتلي إل سي ، كيرشنر ميغاواط. تعمل الفوسفاتوينتيدات وانحناء الغشاء على تبديل وضع بلمرة الأكتين عبر التوظيف الانتقائي لـ Toca -1 و Snx9. بروك ناتل أكاد سسي أوس أ. 2013 ؛ 110: 7193-7198.

14. Daste F ، Warrant A ، Holst MR ، وآخرون. التحكم في بلمرة الأكتين عن طريق مصادفة الفوسفوينوزيتيدات وتقوس الغشاء العالي. J خلية بيول. 2017 ؛ 216: 3745–3765.

15. مالك م ، كيلكوسكا أ ، تشيسا تي ، وآخرون. ينظم PTEN إشارات PI (3،4) P2 في اتجاه المصب من الفئة I PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز). خلية مول. 2017 ؛ 68: 566-580.E510.

16. جيلولي دي جي ، مورو إي سي ، ليندسي إم وآخرون. توطين phosphatidylinositol 3- فوسفات في الخميرة وخلايا الثدييات. EMBO J. 2000 ؛ 19: 4577-4588.

17. Fruman DA و Chiu H و Hopkins BD وآخرون. The PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)المسار في مرض الإنسان. خلية. 2017 ؛ 170: 605-635.

18. ليو إن ، رولي بي آر ، بول كو ، وآخرون. BAY 80-6946 هو PI3K في الوريد انتقائي للغاية (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)مثبط مع أنشطة p110alpha و p110delta القوية في خطوط الخلايا السرطانية ونماذج xenograft. هناك سرطان مول. 2013 ؛ 12: 2319-2330.

19. Fritsch C ، Huang A ، Chatenay-Rivauday C ، وآخرون. توصيف الرواية والخاصة PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)مثبط ألفا NVP-BYL719 وتطوير استراتيجية التقسيم الطبقي للمريض للتجارب السريرية. هناك سرطان مول. 2014 ؛ 13: 1117-1129.

20. Furet P ، Guagnano V ، Fairhurst RA ، وآخرون. اكتشاف NVP-BYL719 أحد مثبطات الفوسفاتيدلينوسيتول القوية والانتقائية -3 كيناز ألفا المختارة للتقييم السريري. بيورج ميد كيم ليت. 2013 ؛ 23: 3741–3748.

21. أندريه إف ، سيرويلوس إي ، روبوفسكي جي ، وآخرون. Alpelisib لسرطان الثدي المتقدم المتطور والمتحول إلى مستقبلات الهرمونات PIK3CA. إن إنجل جي ميد. 2019 ؛ 380: 1929-1940.

22. Venot Q ، Blanc T ، Rabia SH ، وآخرون. العلاج الموجه للمرضى الذين يعانون من متلازمة فرط النمو المرتبطة بـ PIK3CA. طبيعة سجية. 2018 ؛ 558: 540-546.

23. بوثويل إس بي ، تشان إي ، برنارديني إم وآخرون. نموذج الماوس لمتلازمة لوي / مرض دنت 2 اعتلال الأنبوب الكلوي. J آم سوك نفرول. 2011 ؛ 22: 443-448.

24. Chen R ، Kang VH ، Chen J ، et al. جسم مضاد أحادي النسيلة لتصور PtdIns (3،4،5) P (3) في الخلايا. ي هيستوكيم سيتوتشيم. 2002 ؛ 50: 697-708.

25. Hammond GR، Schiavo G، Irvine RF. تكشف التقنيات الكيميائية الخلوية المناعية عن تجمعات خلوية متعددة ومتميزة من PtdIns4P و PtdIns (4،5) P (2). بيوكيم ج .2009 ؛ 422: 23–35.

26. He K ، Marsland R III ، Upadhyayula S ، وآخرون. ديناميات تحويل الفوسفوينوزيتيد في حركة مرور الخلايا الداخلية بوساطة الكلاذرين. طبيعة سجية. 2017 ؛ 552: 410-414.

27. Bilanges B، Poor Y، Vanhaesebroeck B. PI3K (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)الأشكال الإسوية في إشارات الخلية وتهريب الحويصلات. بيول ريف مول خلية نات. 2019 ؛ 20: 515-534.

28. Montjean R ، Aoidi R ، Desbois P ، et al. تُظهر الأرومات الليفية المتحولة بـ OCRL من مرضى دنت -2 تباينًا في النمط الظاهري مستقل عن INPP5B نسبيًا لخلايا متلازمة لوي. همهمة مول جينيه. 2015 ؛ 24: 994 - 1006.

29. Suchy SF، Nussbaum RL. يؤثر نقص فوسفاتيز PIP 2 5- في متلازمة لوي على بلمرة الأكتين. أنا J Hum Genet. 2002 ؛ 71: 1420-1427.

30. Mizrachi A ، Shamay Y ، Shah J ، et al. PI3K الخاص بالورم (فوسفوينوزيتيد 3- كيناز)تثبيط عن طريق التوصيل الموجه للجسيمات النانوية في سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. نات كومون. 2017 ؛ 8: 14292.

31. Mondin VE، Ben El Kadhi K، Cauvin C، et al. يقلل PTEN من PtdIns (4،5) P2 بطريقة مستقلة عن الفوسفاتاز عبر مسار PLC. J خلية بيول. 2019 ؛ 218: 2198 - 2214.

32. Jean S، Kiger AA. التنسيق بين تنظيم ووظائف RAB GTPase و phosphoinositide. بيول ريف مول خلية نات. 2012 ؛ 13: 463-470. 33. Devuyst O ، Knoers NV ، Remuzzi G ، وآخرون. أمراض الكلى الموروثة النادرة: التحديات والفرص والآفاق. لانسيت. 2014 ؛ 383: 1844-1859. 34. زانييس م ، بوكينكامب أ ، كولب إم ، وآخرون. النتيجة الكلوية طويلة المدى عند الأطفال المصابين بطفرات OCRL: تحليل بأثر رجعي لمجموعة دولية كبيرة. زراعة الكلى. 2018 ؛ 33: 85-94.

من: Kidney International (2020) 98، 883–896؛ https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

حقوق النشر ª 2 0 20 ، الجمعية الدولية لأمراض الكلى. تم النشر بواسطة Elsevier Inc. هذه مقالة مفتوحة الوصول بموجب ترخيص CC BY (HTTP: // creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institute، University of Cambridge، Tennis Court Road، Cambridge CB 2 1 QN، UK. البريد الإلكتروني: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk ؛ أو أوليفييه ديفويست ، معهد علم وظائف الأعضاء ، جامعة زيورخ ، زيورخ ، سويسرا. البريد الإلكتروني: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل.⁶شارك هؤلاء المؤلفون في توجيه الدراسة. تم استلامه في 8 أغسطس 2019 ؛ تمت المراجعة في 1 مايو 2020 ؛ قبلت 15 مايو 2020 ؛ نشرت على الإنترنت 9 سبتمبر 2020