تشتمل الخلايا العصبية اللوزية القاعدية الأمامية على ذاكرة الخوف البعيدة Engram الجزء 1

مقدمة:

غالبًا ما تولد الإشارات البيئية المهددة ذكريات خوف دائمة، ولكن كيفية تشكيلها وتخزينها لا تزال موضع بحث نشط.

ذاكرة الخوف هي شكل من أشكال الذاكرة في أدمغتنا. إنه شكل خاص جدًا من الذاكرة غالبًا ما يجعلنا نشعر بالخوف والخوف والتوتر. لكن العلاقة بين ذكرى الخوف هذه وذاكرتنا معقدة للغاية.

أولاً، لا علاقة لذكريات الخوف بذاكرتنا قصيرة المدى. يتم تخزين معظم ذكريات الخوف في بنوك الذاكرة طويلة المدى لدينا. ولهذا السبب، لدينا في بعض الأحيان ذكريات قديمة تطفو في أذهاننا.

ثانيًا، ذكريات الخوف لا تؤثر بالضرورة على ذاكرتنا. على الرغم من أنه قد يسبب تغيرات في انتباهنا ومزاجنا، إلا أنه لا يوجد دليل على أنه يسبب فقدان الذاكرة. لا يزال بإمكان العديد من الأشخاص إظهار ذكريات قوية جدًا بعد تجربة بعض الأشياء الفظيعة.

وأخيرا، لا ينبغي لنا أن نسمح للذكريات المخيفة بأن تصبح موضوعا في حياتنا. يجب علينا اتخاذ إجراءات إيجابية لمعالجة هذه الذكريات والتحرك في اتجاه أكثر إيجابية. يتضمن ذلك الحصول على العلاج، والنشاط الاجتماعي، وتدريب الجسم والعقل، والحفاظ على عقلية إيجابية وصحة عقلية.

لذا، على الرغم من أن الذكريات المخيفة قد تسبب لنا الكثير من التوتر والانزعاج، إلا أنه يجب أن نؤمن بقدراتنا وجهودنا. يمكننا مواجهة هذه الذكريات المخيفة وتقوية ذاكرتنا والنمو ونصبح أشخاصًا أفضل وأكثر ثقة. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا. يمكن لـ Cistanche deserticola أن يحسن الذاكرة بشكل كبير لأن Cistanche deserticola هي مادة طبية صينية تقليدية لها العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. تأتي فعالية اللحم المفروم من المكونات النشطة المختلفة التي يحتوي عليها، بما في ذلك الأحماض والسكريات والفلافونويد وما إلى ذلك. ويمكن لهذه المكونات أن تعزز صحة الدماغ بعدة طرق.

انقر فوق معرفة كيفية تحسين الذاكرة قصيرة المدى

يُعتقد أن استرجاع ذاكرة خوف حديثة يعكس إعادة تنشيط الخلايا العصبية، في مناطق متعددة من الدماغ، والتي يتم تنشيطها أثناء تكوين الذاكرة، مما يشير إلى أن المجموعات العصبية الموزعة تشريحيًا والمترابطة تشتمل على إنجرامات ذاكرة الخوف.

ومع ذلك، فإن المدى الذي تستمر به إنجرامات إعادة التنشيط المحددة تشريحيًا أثناء استدعاء ذاكرة الخوف على المدى الطويل، لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير. لقد افترضنا أن الخلايا العصبية الرئيسية في اللوزة القاعدية الجانبية الأمامية (BLA)، التي تشفر التكافؤ السلبي، تنشط بشكل حاد أثناء استدعاء ذاكرة الخوف عن بعد لتحفيز سلوك الخوف.

طُرق:

باستخدام ذرية الفئران البالغة TRAP2 وAi14، تم استخدام تعبير tdTomatoexpression المستمر لـ "TRAP" الخلايا العصبية aBLA التي خضعت لتنشيط Fos أثناء تكييف الخوف السياقي (الصدمات الكهربائية) أو تكييف السياق فقط (بدون صدمات) (n=5/group) . وبعد ثلاثة أسابيع، تم إعادة تعريض الفئران لنفس الإشارات السياقية لاستدعاء الذاكرة عن بعد، ثم تمت التضحية بها من أجل الكيمياء المناعية النسيجية.

نتائج:

كانت المجموعات العصبية TRAPed (tdTomato +)، وFos +، والمجموعات العصبية المُعاد تنشيطها (ذات العلامة المزدوجة) أكبر في الخوف من الفئران المكيفة بالسياق، مع إظهار المنطقة الفرعية الوسطى والأرباع الظهرية المتوسطة/الذيلية لـ aBLA أكبر كثافات لجميع مجموعات المجموعات الثلاثة.

في حين أن مجموعات الطماطم + كانت في الغالب غلوتاماتيرجية في السياق ومجموعات الخوف، لم يكن سلوك التجميد أثناء استدعاء الذاكرة عن بعد مرتبطًا بأحجام المجموعة في أي من المجموعتين.

مناقشة:

نستنتج أنه على الرغم من أن مخطط ذاكرة الخوف الشامل لـABLA يتشكل ويستمر في نقطة زمنية بعيدة، فإن اللدونة التي تؤثر على الاستجابات الكهربية للخلايا العصبية في الإنجرام، وليس حجم سكانها، تشفر ذاكرة الخوف وتدفع المظاهر السلوكية لاستدعاء ذاكرة الخوف على المدى الطويل.

مقدمة

غالبًا ما تشكل المحفزات المثيرة للخوف ذكريات ترابطية قوية ودائمة تربط الإشارات البيئية بأحداث الحياة المهددة.

تؤدي المواجهات اللاحقة مع التهديدات المتصورة المماثلة إلى سلوكيات وقائية أكثر قوة، مما يعكس استرجاع ذاكرة الخوف. يمكن أن تؤدي الأخطاء في معالجة ارتباط الخوف إلى نتائج نفسية سلبية التكافؤ، بما في ذلك القلق واضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) (توفوت وآخرون، 2015).

يعد فهم التعقيد الكامل للآليات الكامنة وراء ذاكرة الخوف أمرًا ضروريًا لتحديد تشوهات الدائرة الوظيفية التي تعزز الأمراض النفسية المرتبطة بالخوف وتقترح أهدافًا علاجية جديدة لاستعادة معالجة الخوف الطبيعية.

على مدى العقود العديدة الماضية، ركزت أبحاث ذاكرة الخوف إلى حد كبير على تكوين الذاكرة قصيرة المدى وتخزينها واسترجاعها (Kimand Jung, 2006; Kim and Cho, 2020; Lee et al., 2021).

أشارت الدراسات إلى أن المجموعات العصبية CNS المترابطة والموزعة على نطاق واسع هي المسؤولة عن تكوين ذاكرة الخوف وتخزينها (Ramirez et al., 2013; Liu et al., 2014; Roy et al., 2022). يؤدي تنشيط هذه المجموعات من خلال التهديدات المتصورة إلى تعزيز النقل التشابكي الذي يمثل بصمة جسدية مستمرة تُعرف باسم amemory engram (Yuan et al.، 2011؛ ​​Miyawaki and Mizuseki، 2022).

يُعتقد أن استدعاء الذاكرة قصيرة المدى يعكس إعادة تنشيط نفس المجموعات العصبية التي تم تنشيطها في الأصل أثناء تكوين الذاكرة، مع وجود أدلة تشير إلى أنه حتى التنشيط الجزئي لمجموعة عصبية واحدة يمكن أن يثير سلوكيات مرتبطة بالخوف، مما يدل على استدعاء الذاكرة (روي وآخرون، 2022). ). في حين أن إنجرامات الدوائر المعززة المستقرة تشريحيًا قد تفسر ذاكرة الخوف قصيرة المدى، إلا أن مدى مشاركتها في ذاكرة الخوف طويلة المدى لا يزال غير واضح.

على الرغم من أنه يُعتقد أن تعزيز ذاكرة الخوف على المدى الطويل يعتمد على التعزيز التدريجي أو المتقطع للذاكرة قصيرة المدى، إلا أن العديد من الدراسات الحديثة تشير إلى أن المجموعات العصبية لذاكرة الخوف على المدى القصير تخضع لعملية إعادة تنظيم تعتمد على الوقت، مما يؤدي إلى هجرة الذاكرة المخزنة إلى مجموعة عصبية مختلفة إما داخل نفس منطقة الدماغ (DeNardo et al., 2019) أو مناطق الدماغ المختلفة تمامًا (Frankland and Bontempi, 2005; Do Monte et al., 2016).

اللوزة القاعدية الجانبية (BLA) هي منطقة دماغية جزء لا يتجزأ من ذاكرة الخوف وقد تورطت في استرجاع ذاكرة الخوف الحديثة والبعيدة (Maren et al., 1996; Gale et al., 2004; Kitamura et al.,2017; Liu et al. ، 2022).

على وجه الخصوص، وصفت التقارير مخططًا محددًا لذاكرة الخوف قصيرة المدى في BLA والذي يتم (1) تنشيطه أثناء تكوين الذاكرة، (2) إعادة تنشيطه أثناء استدعاء الذاكرة، و (3) قادر على دفع السلوكيات الشبيهة بالخوف في سياقات غير خوف ( رويت آل، 2022؛ زكي وآخرون، 2022). ومع ذلك، فإن مدى إعادة تنشيط المجموعة العصبية aBLA التي يتم تنشيطها أثناء تكوين الذاكرة أثناء استدعاء الذاكرة عن بعد لا يزال غير مستقر.

في هذه الدراسة، قمنا باختبار الفرضية القائلة بأن إعادة تنشيط مجموعة ذاكرة BLAfear تمت ملاحظتها في نقطة زمنية بعيدة بعد 3 أسابيع من تكييف الخوف. ذات أهمية خاصة، تساهم دوائر BLA المنزلية في كل من السلوك المكروه والساعي إلى المكافأة (Hu، 2016)، مع استجابة الخلايا العصبية ذات التكافؤ السلبي لمحفزات الخوف المترجمة على وجه التحديد إلى BLA الأمامي (aBLA) (Goosensand Maren، 2001؛ Kim et al.، 2016، 2017؛ تشانغ وآخرون، 2020).

بالتركيز على aBLA، استخدمنا الجيل الثاني من إعادة التركيب المستهدف في المجموعات السكانية المنشطة (TRAP2) الفئران المعدلة وراثيًا (DeNardo et al., 2019)، حيث يرتبط نشاط Cre-recombinase بعناصر معززة الجينات المبكرة المباشرة c-fos عن طريق Cre المحسّن -مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) المعقدة. يمكن للخلايا العصبية التي تعبر عن هذا المركب أن تخضع لإعادة تركيب Cre بشكل مستمر، أي يمكن "فخها" عن طريق إعطاء ER agonisttamoxifen أو نظيره قصير المفعول 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)، مما يسمح بالتعبير المستمر عن Cre - جزيئات مراسل المستجيب أو المعتمدة.

هنا ، عبرنا الفئران TRAP2 وخط مراسل tdTomato المعتمد على Cre Ai14 (Madisen et al.، 2010) وقمنا بقياس مدى إعادة تنشيط الخلايا العصبية aBLA TRAPed (tdTomatopositive) أثناء تكييف الخوف السياقي (البروتين المناعي السريع Fos) أثناء استدعاء الذاكرة عن بعد بعد 3 أسابيع.

كما هو الحال في ذاكرة الخوف قصيرة المدى، تدعم النتائج التي توصلنا إليها وجود مجموعات عصبية من ذاكرة الخوف الغلوتاماتية طويلة المدى في الـABLA.

ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر أن حجم المجموعات العصبية aBLA، سواء تم تنشيطها أثناء التكييف أو استدعاء الذاكرة عن بعد أو كليهما، لم يكن مرتبطًا بسلوك الخوف، مما يشير إلى أن طبيعة المرونة المرتبطة بتعلم الخوف وتأثيرها النهائي على ذاكرة الخوف عن بعد تستدعي الاستجابات الفيزيولوجية الكهربية المرتبطة بمجموعة الخلايا العصبية. ، وليس حجم المجموعة السكانية، هو الذي يدفع في المقام الأول سلوك ذاكرة الخوف عن بعد.

المواد والأساليب

الموافقة الأخلاقية

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لجامعة تكساس الصحية في سان أنطونيو وتتوافق مع دليل مجلس البحوث الوطني لرعاية واستخدام حيوانات المختبر.

الحيوانات

تم عبور أزواج تربية Fos2A − iCreER / 2A − iCreER knockin (TRAP2، # 030323) و R26Ai14 / + (Ai14، # 007914) الفئران (Jackson Laboratories) لإنتاج ذكور نصفي الزيجوت TRAP2: Ai14 ذرية (الشكل 1A). بعد الفطام، تم تجميع الفئران ووضعها في أقفاص بلاستيكية (29 × 18 × 13 سم) تحتوي على فراش القوارض (Sani-chips؛ Harlan Teklad، Madison، WI، USA). تم التحكم في درجة حرارة الحوض (24 درجة مئوية) بدرجة حرارة 14 درجة. :10 دورة من الضوء والظلام (تضيء الأضواء عند الساعة 0600). الأغذية والمياه المتاحة الإرضاع بحسب الرغبة. بدأت التجارب عندما بلغ عمر الفئران 3 أشهر.

الاعتياد السلوكي

كما هو الحال في الدراسات المنشورة سابقًا (DeNardo et al., 2019)، خضعت الفئران لخمسة أيام متتالية من التدريب على التعود مباشرة قبل تكييف الخوف السياقي لتقليل تحريض CFOs استجابةً للظروف التجريبية التي لم تخضع للتحقيق (على سبيل المثال، المناولة، واستكشاف السياق الجديد، وما إلى ذلك)( الشكل 1ب).

استمرت كل جلسة تعويد يومية لمدة 3 دقائق وتألفت من التعرض لغرفة التكييف (نظام HabitestModular، وCoulbourn Instruments). تتكون الإشارات الحسية للغرفة من (1) 70٪ من الإيثانول (إشارة شمية)، (2) أرضية شبكية معدنية (إشارة لمسية)، (3) خلفية منقوشة (إشارة بصرية)، و (4) ضوء مرئي (إشارة بصرية).

بالإضافة إلى ذلك، تم حمل جميع الفئران يدويًا لمدة دقيقة واحدة قبل وضعها في غرفة التكييف وتم "تمشيطها" بلطف لمدة 10 ثوانٍ عند الخروج من الغرفة. تم تصميم جلسات التعود لتقليد طريقة التعامل التي قد تتعرض لها الفئران في يوم التكييف باستثناء عدم إجراء أي حقن داخل الصفاق (IP).

تكييف الخوف السياقي

تم بعد ذلك تعيين الفئران عشوائيًا إلى مجموعات مكيفة بالخوف (صدمة) ومجموعات مكيفة بالسياق (بدون صدمة/سياق فقط). بدأ التكييف في اليوم 0 ويتكون من فئران تم وضعها في غرفة التكييف وسمح لها بالاستكشاف لمدة 2 دقيقة. على مدى الدقائق الأربع اللاحقة، تلقت الفئران المشروطة بالخوف سلسلة من الصدمات بطول خمسة أقدام لمدة ثانية واحدة وشدتها 0.75 مللي ثانية.

تم تسليم الصدمات على فترات لا يمكن التنبؤ بها للفئران، ولكنها متسقة بين الفئران. خضعت الفئران ذات السياق المكيف لبروتوكول مماثل باستثناء صدمات القدم (الشكل 1C). عند انتهاء المهمة، تلقى كل فأر حقنة من 4- هيدروكسيتاموكسيفين (4-OHT، 100 مجم/كجم، IP) مذاب في كوكتيل 4:1 من عباد الشمس وزيت الخروع المحضر كما هو موصوف مسبقًا (DeNardo et al., 2019).

تم بعد ذلك إرجاع الفئران إلى أقفاصها المنزلية حيث تُركت دون إزعاج في الغرفة المجاورة لجناح السلوك لمدة 72 ساعة على الأقل قبل استئناف السكن الطبيعي.

بعد ثلاثة أسابيع من تكييف الخوف (اليوم 21)، خضعت الفئران لاختبار استدعاء الذاكرة (الشكل 1D) الذي يتكون من إعادة التعرض لغرفة الاختبار مع إشارات حسية مماثلة لتلك الموجودة أثناء التكييف. تم السماح للفئران باستكشاف الغرفة لمدة 5 دقائق تم خلالها تسجيل سلوك الخوف (التجميد الوضعي) باستخدام برنامج تتبع الفيديو FreezeFrame 4 (ActiMetrics، Wilmette IL، USA).

تثبيت الدماغ والأنسجة

بعد تسعين دقيقة من اختبار استرجاع الذاكرة، تم تخدير الفئران بعمق باستخدام الأيزوفلورين (5% في الأكسجين) ثم خضعت لتروية عبر القلب باستخدام 30 مل من محلول ملحي متساوي التوتر (100 وحدة/مل) متبوعًا بـ 100 مل من بارافورمالدهيد 4% (PFA). ) في 0.1 م عازلة الفوسفات.

تمت إزالة العقول، بعد تثبيتها بنسبة 4٪ PFA لمدة 6 ساعات عند درجة حرارة الغرفة (∼ 22 ◦C)، وcryoprotectedin 30٪ سكروز -0.01 M محلول ملحي للفوسفات (PBS) لمدة يومين على الأقل.

تم بعد ذلك تقطيع العقول إلى شرائح إكليلية بسماكة 30 ميكرون على مشراح متجمد (Leica Microsystems، Wetzlar، ألمانيا) وأقسام تحتوي على aBLA (Paxinos and Franklin، 2019)، وتم تخزينها في مادة البولي فينيل بيروليدون (PVP) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

الكيمياء المناعية

تم إجراء المناعية كما هو موضح سابقًا (Mitchell et al.، 2018؛ Maruyama et al.، 2019).

باختصار، تم غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لإزالة مادة الحماية من البرد PVP واحتضانها لمدة 3 0 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على بوروهيدريد الصوديوم (0.5٪) لإزالة الألدهيدات الفلورية التلقائية المتولدة أثناء التثبيت. بعد عمليات غسل PBS الإضافية، تم تحضين المقاطع في منع المخزن المؤقت (3٪ مصل الماعز، 0.05٪ Triton-X -100 في PBS) لمدة ساعتين عند درجة حرارة ∼ 22 درجة مئوية، يليها الحضانة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية في منع المخزن المؤقت الذي يحتوي على أرنب متعدد النسائل. - الجسم المضاد الأولي (Ab) لمدة 72 ساعة (1:1500، أنظمة متشابكة #226 003) أو الفأر أحادي النسيلة CaMKII PrimaryAb لمدة 24 ساعة (1:500، Enzo Life Sciences، #ADI-KAM-CA002).

بعد مزيد من الغسيل، تم تحضين أقسام Fos وCaMKII بشكل منفصل لمدة ساعتين عند درجة حرارة ∼ 22◦ مئوية في الماعز المضاد للأرنب IgG الثانوي Ab (1:25 0 EMD Millipore # AP132B) متبوعًا بالغسيل التسلسلي في 0. 05 م من محلول ملحي تريس (TBS) و 0.1 أسيتات مسوديوم ثم يتم تعريضهم للستربتافيدين-أليكسا فلور 488 (1:250، Invitrogen # S11223) لمدة ساعة واحدة في محلول مانع قائم على TBS.

أخيرًا، تم غسل المقاطع في المخزن المؤقت Tris وتثبيتها على شرائح باستخدام Fluoromount-G (Invitrogen، #00-4958-02).

التصوير والتحليل

تم استخدام أنبوب مضاعف ضوئي A{{0}} بت متصل بمجهر متحد البؤر لمسح Zeiss LSM710 بالليزر، ومجهز بخطوط ليزر مناسبة، لالتقاط صور aBLA باستخدام هدف 20 × (NA 0.8) وحجم ثقب رأس المسح الضوئي 47.5 ميكرومتر. لكل صورة، تم استخدام برنامج ImageJ (NIH، Bethesda، MD) لإنشاء خرائط بكسل منفصلة لـ tdTomato (أي TRAPed، أحمر) و Alexa -488 (Fos، أخضر) مضان.

تم تحديد شدة عتبة البكسل واكتشاف تداخل الطول الموجي لوضع العلامات المزدوجة من خلال مقارنة أقسام الأنسجة التي تمت معالجتها باستخدام وبدون Fo's Ab الأساسي الموصوف مسبقًا (Mitchell et al.، 2018؛ Maruyama et al.، 2019). تم الحصول على بيانات عد الخلايا والتوطين المشترك باستخدام هذه المكونات الإضافية ImageJ شبه المستقلة EzColocalization (Stauffer et al.,2018).

تم تقسيم صور aBLA إلى ثلاث مناطق فرعية منقارية ذيلية متساوية الحجم تقريبًا، مع تحديد كل منطقة فرعية من خلال نطاق محدد من إحداثيات التوجيه التجسيمي المنقاري والذيلي النسبي لـ tobregma: منقاري، −0.8 إلى .11.1 مم؛ الأوسط، .21.2 إلى .51.5 مم؛ والذيلية ، من .61.6 إلى .91.9 ملم (Paxinos and Franklin، 2019). تم بعد ذلك استخدام مدير منطقة الاهتمام (ROI) في ImageJ لتقسيم theaBLA على طول الأرباع الظهرية البطنية والأوسطية الجانبية بالنسبة لمحيطها. تم تطبيق هذا القالب لاحقًا على جميع الصور داخل كل منطقة فرعية منقارية ذيلية محددة.

تم استخدام ترسيم aBLAperimeter مع البرنامج الإضافي ImageJ EzColocalization لإنشاء مخطط مكاني 2-D لجميع أعداد الخلايا العصبية في كل صورة. تم بعد ذلك تراكب المؤامرات المكانية داخل المناطق الفرعية المنقارية والمتوسطة والذيلية بشكل منفصل. نتج عن ذلك 10 مخططات خوف و10 مخططات سياقية للمنطقة الفرعية المنقارية، و10 مخططات خوف و13 مخطط سياق للمنطقة الفرعية الوسطى، و12 مخططات خوف و13 مخطط سياق للمنطقة الفرعية الذيلية.

لتصحيح عدد أكبر من مخططات صور المنطقة الفرعية في مجموعة السياق، عوامل التصحيح هي 1.0(10/10)، 0.77 (10/13)، و0.92 (12/13) تم تطبيقها، على التوالي، على قطع الأراضي الفرعية المنقارية والمتوسطة والذيلية لمجموعة السياق. لتجنب انحياز التوزيع الطبوغرافي للتعدادات في بيانات السياق، تم استخدام مولد أرقام عشوائي في MS Excel لتحديد التعدادات المحددة التي سيتم استبعادها من كل منطقة فرعية من مناطق aBLAs.

بعد ذلك، قمنا أيضًا بتقسيم المناطق الفرعية لـ aBLA إلى أرباع، تم تحديدها من 1 إلى 4 (انظر الشكل 2D). وللقيام بذلك، تم تحديد إحداثيات التقاطع (0، 0) في MS-Excel كنقطة في المستوى 2-D حيث كانت مساحة كل ربع تساوي ربعًا تقريبًا من المساحة الإجمالية لكل منطقة فرعية منقارية والذيلية. تم تحديد المحاور الرباعية والإحداثيات xy لكل عدد وتدويرها بمقدار 30◦ في اتجاه عقارب الساعة، وبالتالي محاذاتها مع المحور التشريحي لـ aBLA.

ولمراعاة الاختلافات الصغيرة في حجم المناطق الفرعية وأرباعها، تمت تسوية بيانات التعداد على مساحة السطح (الأعداد/مم2) بحيث تمثل القيم المبلغ عنها كثافة الأعداد لكل منطقة فرعية أو رباعي.

لتقييم النمط الظاهري المثير للخلايا العصبية التي تم التقاطها بواسطة نظام TRAP2 الخاص بنا، تم تحديد التوطين المشترك لتعبير tdTomatoexpression المكيف مع بروتين كيناز II (CaMKII) المعتمد على الكالسيوم والهيمودولين، وهو علامة ثابتة للخلايا العصبية الجلوتاماتيرجية (ماكدونالد وآخرون، 2002)، من صور لأقسام threeaBLA على الأقل لكل ماوس باستخدام البرنامج الإضافي لعداد خلايا ImageJ.

إحصائيات

تم إجراء الاختبار الإحصائي باستخدام برنامج Prism 9.5.1 (GraphPad، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) وتضمن اختبار التوزيع الطبيعي لجميع مجموعات البيانات باستخدام اختبار شابيرو ويلك. تم إجراء مقارنات المجموعة للبيانات المستمرة مع الطلاب غير المقيدين ثنائي الذيل اختبارات t أو عن طريق ANOVA ثنائي أو ثلاثي الاتجاه متبوعًا باختبار المقارنة المتعدد لـ Sidak وTukey، على التوالي، لإجراء مقارنات زوجية بعد تفاعلات ANOVA الهامة.

تم إجراء تحليل الارتباط داخل المجموعة لتحديد معامل بيرسون r والقيمة P المقابلة. وتمت مقارنة الارتباطات بين المجموعات باستخدام تحويل Fisher'sZ (الجدول التكميلي 1). يتم التعبير عن بيانات المجموعة على أنها تعني ± SEM. تم تحديد الأهمية الإحصائية عند P <0.05.

نتائج

يؤدي تكييف الخوف إلى تحفيز إنجرام ذاكرة الخوف عن بعد

لتحديد مدى إعادة تنشيط الخلايا العصبية aBLA التي يتم تنشيطها أثناء تكوين ذاكرة الخوف أثناء استرجاع الذاكرة عن بعد، خضعت الفئران لتكييف الخوف (n=5)، أو تكييف السياق (n=5) متبوعًا بحقن 4-OHT (الأشكال 1A-C).

تمت ملاحظة فحص تكوين ذاكرة الخوف (أي تعلم الخوف)، والتفاعل الكبير في العلاج (الصدمة مقابل عدم وجود صدمة) وصندوق الوقت (فاصل زمني 30 ثانية بعد كل صدمة) على سلوك التجميد [ANOVA ثنائي الاتجاه، F(5، 40)=6.733، ص=0.0001]. أظهرت الفئران المشروطة بالخوف زيادة في وقت التجميد مقارنة بخط الأساس بعد الصدمة 3 (275 ± 68% من BL، P=0.0203)، 4 (486 ± 76% من BL، P <0.0001) و5 (402 ± 26) % من BL، P <0.0001)، وبالنسبة للفئران المكيفة بالسياق بعد الصدمة 4 (251 ± 38% من السياق، p <0.0001) و5 (375 ± 25% من السياق، p <0.0001).

كما هو متوقع، فإن إعادة التعرض لغرفة التكييف لاستدعاء الذاكرة عن بعد في اليوم 21 بعد التكييف كشفت عن أن الفئران المكيفة للخوف أظهرت وقتًا أطول بكثير في التجميد مقارنةً بعناصر التحكم في السياق [346 ± 18%، اختبار t غير مقترن، t(8) {{7} }.16، ف < 0.0001] (الشكل 1D).
بشكل جماعي، تشير البيانات في الشكل 1 إلى أن بروتوكول تكييف الخوف الخاص بنا تسبب في تكوين ذاكرة خوف قوية واستدعاء ذاكرة الخوف عن بعد.

يؤدي تعلم الخوف إلى تحفيز aBLA قوي خاص بالمنطقة الفرعية للمجموعة

كشف تحليل تعداد TRAPed (tdTomato +) عن وجود عدد أكبر بكثير من سكان aBLA المنشطين بالفوس في ظروف الخوف (110 ± 6.2) من الفئران المكيفة بالسياق (77 ± 3.1) [اختبار t غير مقترن، t(8)=4 .782، ص=0.0014] (الجدول 1). كما هو متوقع ، كان ∼ 70٪ من السياق و ∼ 80٪ من الخلايا العصبية TRAPed (n=6 aBLAsections / group) CaMKII + (الأشكال التكميلية 1A، B) ، مما يشير إلى أنها كانت في المقام الأول خلايا عصبية إسقاطية للجلوتاماتيرجيك.

على غرار التقارير السابقة (كيم وآخرون. بين مجموعات العلاج (الشكل 2D). كشفت ANOVA ثنائية الاتجاه عن تفاعل كبير بين المنطقة الفرعية والعلاج [F(2,24)=7.7099,P=0.0038].

كشفت التحليلات داخل المجموعة أن كثافة TRAPed كانت أكبر في المنطقة الفرعية الوسطى لـ aBLA في مجموعات الخوف (239 ± 9) والسياق (144 ± 12) بالنسبة إلى المنقاري (الخوف: 86 ± 6,P < { {8}}.0001؛ السياق: 81 ± 9، P=0.0035) والذيلية (الخوف: 123 ± 15، P <0.0001؛ السياق: 90 ± 12، ​​P {{20) }}.0132) المناطق الفرعية.

كشف التحليل بين المجموعات أن كثافة عدد TRAPed كانت أكبر بشكل ملحوظ في المنطقة الفرعية الوسطى من الفئران المشروطة بالخوف (P < 0.0001).

لمزيد من تحديد موقع الخلايا العصبية TRAPed، قمنا بتقسيم المناطق الفرعية aBLA المنقارية والمتوسطة والذيلية إلى أربعة أرباع لكل منها (الشكل 2E). في المنطقة الفرعية الوسطى، لوحظ تأثير العلاج الرئيسي على كثافة العدد [Three-way ANOVA, F(1,32)=17.44, P=0.0002] مع كثافة TRAPedcount أعلى في الخوف من مجموعة السياق في الأرباع 3 (218 ± 29 مقابل 107 ± 17، P=0.0031)، و4 (240 ± 16 مقابل 101 ± 12، ​​P <0.0001).

قمنا أيضًا بتقييم كثافات عدد TRAPed داخل المجموعة وداخل الربع عبر المناطق الفرعية لـ aBLA (الشكل 2E والجدول التكميلي 2). على وجه الخصوص، عند مقارنتها بالمنطقة الفرعية المنقارية (59 ± 8)، كان الربع 2 من مجموعة الخوف يتمتع بكثافة TRAPed أعلى في كل من الوسط (245 ± 21، P <0.0001) والذيلية (172 ± 23، ف=0.0040) المنطقة الفرعية.

قمنا بعد ذلك بتقييم العلاقة بين سلوك التجميد وحجم مجموعة الخلايا العصبية TRAPed في منطقة aBLA بأكملها، وفي منطقتها الفرعية الوسطى، وفي أرباع المناطق الفرعية الوسطى والذيلية حيث تختلف كثافات عدد المجموعات بين مجموعات السياق والمجموعات المشروطة بالخوف. لم تتم ملاحظة أي ارتباطات مهمة في مجموعة الخوف أو مجموعة السياق (الشكل 2F)، مما يشير إلى أن سلوك الخوف لا يعكس حجم مجموعة تعلم الخوف في المناطق الفرعية لـ BLA.

بشكل جماعي، تشير النتائج في الشكل 2 إلى أن تكييف الخوف أدى إلى مجموعة أكبر في aBLA مقارنة بتكييف السياق. كانت مجموعة الخلايا العصبية متمركزة بكثافة في المنطقة الفرعية الوسطى لـ aBLA، لكن سلوك الخوف لم يرتبط بأحجام المجموعة السكانية.

For more information:1950477648nn@gmail.com