النوى المهادية الأمامية: ركيزة مهمة للذاكرة المقترنة غير المكانية في الفئران - الجزء 2

2|المواد والأساليب

2.1|الحيوانات وظروف السكن

تم إيواء فئران ذكور لونغ إيفانز (12 شهرًا، متوسط ​​630 جم) في مجموعات من ثلاثة أو أربعة في أقفاص ماكرولون (48 × 28 × 22 سم) على دورة الضوء والظلام المعكوسة 12- ساعة (تضاء الأضواء في الساعة 8 مساءً) ).

تم إجراء الاختبارات السلوكية في المرحلة المظلمة من دورة الضوء، خمس جلسات أسبوعيًا؛ وأكدت الملاحظات أن الفئران كانت أكثر نشاطًا نسبيًا خلال المرحلة المظلمة. تم الحفاظ على الفئران عند 85٪ من وزن الجسم الذي يتغذى مجانًا بالماء حسب الرغبة، وكان الطعام حسب الرغبة قبل وبعد الجراحة للتعافي بعد العملية الجراحية.

الجراحة هي عملية علاج المرض وتحسين الصحة البدنية. تتطلب عملية التعافي بعد الجراحة اهتمامًا خاصًا. بالإضافة إلى التعافي الجسدي، يتطلب الشعور بالارتياح أيضًا التركيز على استعادة الذاكرة. هناك علاقة قوية بين التعافي بعد العملية الجراحية والذاكرة.

أثناء العملية، غالبًا ما تؤثر عوامل مثل استجابة الجسم للشدائد وتأثيرات أدوية التخدير على وظيفة ذاكرة الدماغ. بعد تعافي الجسم، يجب الاهتمام بالحفاظ على نظام غذائي جيد وممارسة التمارين الرياضية المعتدلة والنوم الكافي. خلال فترة التعافي خارج المستشفى، يجب عليك الاستمرار في تجنب الأنشطة المفرطة والحفاظ على حالة مريحة للجسم.

بالإضافة إلى عادات المعيشة، تساعد التعديلات النفسية المعقولة أيضًا في استعادة الصحة والذاكرة. استرخِ وحافظ على عقل هادئ وساعد نفسك على التكيف مع استعادة الذاكرة. وفي الوقت نفسه، يجب عليك المشاركة بنشاط في الأنشطة الترفيهية والتواصل مع الأقارب والأصدقاء للحفاظ على نشاط عقلك وتحسين قدراتك الإدراكية والذاكرة. يمكن زيادة هذا النشاط تدريجياً ويمكن القيام به بشكل أساسي مرة واحدة في الأسبوع.

باختصار، تتطلب عملية التعافي بعد الجراحة اهتمامًا شاملاً. يلعب الحفاظ على عادات المعيشة الجيدة والتعديلات النفسية دورًا مهمًا جدًا في تعزيز التعافي الجسدي واستعادة الذاكرة. فلنواجه الأمر بإيجابية، بثقة وأمل كاملين. نحن بحاجة إلى تحسين الذاكرة، ويمكن لـ Cistanche deserticola أن يحسن الذاكرة بشكل كبير، لأن Cistanche deserticola يمكنه أيضًا تنظيم توازن الناقلات العصبية، مثل زيادة مستويات الأسيتيل كولين وعوامل النمو. هذه المواد مهمة جدًا للذاكرة والتعلم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للحوم أيضًا تحسين تدفق الدم وتعزيز توصيل الأكسجين، مما يضمن حصول الدماغ على ما يكفي من العناصر الغذائية والطاقة، وبالتالي تحسين حيوية الدماغ والقدرة على التحمل.

انقر فوق معرفة طرق تحسين وظائف المخ

تمتثل جميع الإجراءات للمبادئ التوجيهية المعتمدة من لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة كانتربري. تم إنشاء أربع مجموعات من الفئران عن طريق التعيين العشوائي بعد التعرف على ما قبل الجراحة في متاهة الذراع الشعاعية (RAM) والمدرج. كانت المجموعات الأربع عبارة عن آفات ATN ثنائية أو بدون أثر بين محفزات الرائحة والأشياء عندما تم تدريبها في المهمة المرتبطة المقترنة ومجموعتي آفة الشام المقابلة.

كانت أحجام العينات النهائية (1) Sham-No Trace=7 (أي مجموعة آفة الشام مع عدم وجود فاصل زمني بين محفزات الرائحة والكائن المستخدمة في المهمة المرتبطة المقترنة)؛ (2) Sham-Trace=7 (مجموعة Shamlesion تعطى أثر 10- بين عرض الرائحة ومحفزات الكائن)؛ (3) ATN-لا يوجد أثر=8؛ و(4) ATN-تتبع=9. تم استبعاد جرذان إضافية لآفة ATN لعدم استيفائها لمعايير الآفة (انظر أدناه).

2.2|جراحة

تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران (التحريض 4٪، الصيانة 2.5٪) ووضعها في جهاز التجسيمي مع قضبان الأذن غير المؤلمة (Kopf، Tujunga، CA). تم ضبط شريط القاطعة على مسافة 7.5 ملم أسفل الخط بين الأذنين لتقليل ضرر القبو.

في كل نصف الكرة الأرضية، تم توجيه حقنتين إلى النواة الأمامية البطنية (AV؛ العلوي والسفلي)، وتم توجيه ضخ واحد إلى النواة الأمامية الإنسية (AM). استخدمت كل عملية جراحية إحداثيات واحدة أمامية وخلفية (AP) بالنسبة لمسافة Bregma-Lambda الخاصة بالفئران الفردية (جميع القيم مم). بالنسبة للآفات AV، كانت إحداثيات AP: 2.20 لـ B-L 6.9-7.2؛ 2.25 لـ B – L 7.3 إلى 7.6؛ 2.30 لـ B–L أكبر من أو يساوي 7.7. تم إجراء عمليات ضخ AV عند 5.68 و5.73 أسفل الجافية و1.52 جانبيًا حتى خط الوسط.

تم إجراء تسريب AM بمقدار {{0}}.1 ملم أماميًّا أكثر من إحداثي AV، عند 5.76 أسفل الجافية و1.16 جانبيًا؛ تم إجراء أول آفة AM بعد استكمال جميع عمليات تسريب AV وبدأت في الاتجاه المقابل لموقع آفة AV الأخير. 0.15 M N-methyl-d-aspartate (NMDA؛ Sigma، CastleHill، NSW) في 0. تم ​​ضخ 1 M فوسفات عازل (درجة الحموضة 7.20) في كل موقع عند 0.04 ميكرولتر في الدقيقة عبر 2.5-حقنة ulHamilton (رينو، نيفادا، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام مضخة التسريب الدقيقة (Stoelting، Wood Dale، IL).

تلقى نصف الكرة الأرضية AV المواقع {{0}}.12 و0.10 ul للمواقع الظهرية البطنية، على التوالي؛ تم استخدام 0.06 ul لكل موقع AM. ظلت إبرة المحقنة في مكانها لمدة 3 دقائق بعد التسريب.
استخدمت جراحات الآفة الشامية نفس الإجراء، ولكن تم خفض الإبرة إلى 1 مم فوق الجزء العلوي من الأذينية البطينية ومواقع الآفة AM مع عدم إعطاء التسريب.

2.3|المهام السلوكية

أكدت ذاكرة الوصول العشوائي ذات الثمانية أذرع ضعف الذاكرة المكانية لدى فئران آفة ATN بعد الجراحة. تم استخدام جهاز المدرج لتدريب الفئران على جميع المهام غير المكانية، أي الرائحة البسيطة والتمييز البسيط للأشياء والمهام المرتبطة بالرائحة والجسم والرائحة والأثر والأشياء.

قبل الجراحة، تم تعويد الفئران المقيدة غذائيًا على ذاكرة الوصول العشوائي ذات الثمانية أذرع، الموضحة أدناه، لاسترداد 0.1 جم قطع شوكولاتة (Foodfirst LTD Auckland، NZ) والتكيف مع فتح وإغلاق أبواب الذراع. في مدرج البرسبيكس الأحمر (الشكل 1)، تم أيضًا تشكيل الفئران على أنفها من خلال وضع غطاء بلاستيكي أبيض دائري يبلغ طوله 2- سم على ارتفاع 10 سم فوق مستوى الأرض وفي وسط إسفنجة رفيعة على ملحق شفاف من البرسبيكس تم إرفاقه به. جدار النهاية.

تم تشكيلها أيضًا لدفع (باستخدام الأنف أو الكف) جسمًا معلقًا في الجزء الخلفي من قاعدته إلى الجزء العلوي من بئر الطعام الذي كان غائرًا في وسط كتلة خشبية مقاس 5 × 8.5 × 3 سم. كان الطعام يحتوي على قطع من الشوكولاتة (وكان يحتوي على طعام لا يمكن الوصول إليه أسفل التجويف). لم يتم استخدام الكائن المستخدم للتدريب المسبق مرة أخرى. بعد الجراحة، تمت إعادة تعريف فئران التعافي بكل من ذاكرة الوصول العشوائي والمدرج.

2.4|الذاكرة العاملة المكانية في ذاكرة الوصول العشوائي

بعد الجراحة، تم اختبار الذاكرة العاملة المكانية باستخدام ذاكرة الوصول العشوائي الموجودة في وسط غرفة بلا نوافذ (33 م). تحتوي المتاهة على محور مركزي خشبي مطلي باللون الرمادي يبلغ عرضه 35 سم مع ثمانية أذرع من الألومنيوم (طولها 65 سم وعرضها 8.6 سم، وارتفاعها 4.5 سم)، ومرتفعة بمقدار 67.5 سم فوق أرضية الغرفة. تمتد جدران البرسبيكس الشفافة (طولها 19 سم وارتفاعها 25 سم) على طول جانب واحد من كل ذراع من المحور لمنع الفئران من القفز بين الذراعين.

تم وضع بئر طعام خشبي أسود (5 8.5 3 سم)، مع وجود طعام لا يمكن الوصول إليه تحته، في نهاية كل ذراع. أثناء الاختبار، كانت 2 0. 1 جرام من قطع الشوكولاتة موجودة في كل بئر طعام في بداية كل بئر. محاكمة. أبواب المقصلة الشفافة، والتي يمكن رفعها من أسفل المحور بواسطة نظام البكرة، تتحكم في الوصول إلى أذرع المحور.

تم استخدام عشرة أيام متتالية من التدريب الرسمي في ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) لاختبار الذاكرة العاملة المكانية. تم وضع الفأر في المحور المركزي، وبعد 10 ثوانٍ، تم فتح جميع الأذرع الثمانية، وسمح للفأر باتخاذ خيار محدد على أنه قدميه الخلفيتين فوق عتبة الذراع. بمجرد دخول الفأر إلى الذراع، يتم إغلاق جميع الأبواب، ويتم تقييده في الذراع لمدة 15 ثانية بغض النظر عما إذا كان قد اتخذ خيارًا صحيحًا أم لا.

تم بعد ذلك السماح للفأر بالعودة إلى المحور المركزي واحتجازه هناك لمدة 10 ثوانٍ قبل إعادة فتح جميع الأبواب للسماح باختيار ذراع آخر. اختتمت التجربة عندما زار الراثاد جميع الأذرع الثمانية، وتم اختيار 20 ذراعًا أو انقضت 10 دقائق.

2.5|المهام غير المكانية: التمييز البسيط والتعلم المزدوج

استخدم كل من التمييز البسيط والمهام المقترنة نفس مدرج البرسبيكس الأحمر (93 26 26 سم) الموضوع على طاولة بارتفاع 75- سم (الشكل 1). يمكن تقسيم المدرج بواسطة ثلاثة أبواب قابلة للإزالة عموديًا (أحمر برسبيكس، 26 × 26 سم) تم اختيارها بناءً على المهمة السلوكية المحددة. أما بالنسبة للتعرف، فإن الإسفنجة الرفيعة مقاس 6.5 × 6 × 8 مم ذات الغطاء الموجود في المنتصف تحمل مكافأة طعام من الشوكولاتة (الشكل 1).

تم ربط الإسفنجة بباب قابل للإزالة في المدرج (للمهام المرتبطة بالاقتران) أو بالجدار النهائي للمدرج (لمهمة التمييز البسيطة). تم استخدام إسفنجة مختلفة لكل رائحة، والتي تم غرسها بجوار الوعاء مع 5 مل من زيت عباد الشمس ممزوجًا بـ 20 ميكرولتر من الزيوت العطرية من مادة نيوزيلندا.

كانت الروائح هي الليمون والقرنفل في المهام الثنائية، والقرفة والليمون في مهام التمييز البسيطة، أو العكس في المجموعات المتوازنة. تم ربط الأشياء الخفيفة والمتميزة بصريًا (الشكل 1) بمفصلة في الجزء الخلفي من قاعدتها إلى الجزء العلوي من بئر الطعام حتى يتمكن الجرذ من دفع الجسم بسهولة إلى الخلف (إما الأنف أو القدم) للبحث في البئر عن مكافأة الطعام.

إطار خشبي (ارتفاعه 1.8 مترًا وعرضه 1.3 مترًا)، مغطى بستائر سوداء، يحيط بجميع جوانب منطقة الاختبار لتقليل الإشارات المكانية أثناء الاختبار.

استخدمت التمييزات البسيطة (الرائحة فقط، والكائن فقط) والمهام المرتبطة المقترنة إجراء "الذهاب/عدم الذهاب".

بدأت التجربة الأولى لكل جلسة بتقييد الفئران في منطقة البداية لمدة 120 ثانية لإعادة التأقلم مع المتاهة؛ استخدمت التجارب اللاحقة 20 ثانية في منطقة البداية هذه. تلقت Allrats 12 تجربة جماعية في كل جلسة يومية، مع تجارب sixgo (مُكافأة) وستة تجارب no-gos (غير مكافئة) بترتيب عشوائي شبه. لم يتم إجراء أكثر من ثلاث تجارب محظورة على التوالي في الجلسة.

لم يتم تكرار أي من الأزواج الأربعة المختلفة من محفزات الرائحة والأشياء في تجارب متتالية. تمت موازنة العناصر الصحيحة في مهام التمييز البسيطة وأزواج التحفيز الصحيحة في المهام المرتبطة المقترنة عبر الفئران.

بالنسبة للتمييز البسيط في الرائحة، تم تعريف الاستجابة على أنها دس الأنف في الغطاء الموجود في وسط الإسفنجة ذات الرائحة الكريهة؛ كان استنشاق الإسفنجة فقط بمثابة استجابة محظورة. كان الطعام موجودًا دائمًا في الغطاء الموجود في وسط الإسفنجة للمهام المرتبطة بالرائحة والأشياء؛ يشير جانب الذهاب/عدم الذهاب هنا إلى ما إذا كان الجسم قد تم دفعه للكشف عما إذا كانت هناك مكافأة طعام تحته، في نهاية المدرج.

بالنسبة للأشياء، تم تعريف الاستجابة على أنها أي دفعة بالأنف أو بمخلب تؤدي إلى إمالة الجسم للخلف. كان الكمون من الوقت الذي تم فيه رفع الباب الأخير وعندما تفاعل الجرذ مع الرائحة (كزة الأنف في الغطاء؛ للتمييز البسيط في الرائحة) أو مع الكائن (تم دفعه للخلف على المفصلة، ​​للتمييز البسيط للكائن والمهام المرتبطة المقترنة) كان تم قياسها باستخدام ساعة توقيت هادئة (ديك سميث، نيوزيلندا).

كان المراقب يجلس داخل الستائر وبجوار المدرج لتشغيل الأبواب وتسجيل السلوك. تم تصنيف التجربة على أنها "صحيحة" إذا استجاب الفأر في أقل من 8 ثوانٍ في تجارب الذهاب أو لم يستجب قبل 8 ثوانٍ في تجارب عدم الذهاب.

2.6|التمييز البسيط

تلقى نصف الفئران تدريبًا على مهمة تمييز الرائحة البسيطة متبوعة بمهمة تمييز الأشياء البسيطة والعكس صحيح بالنسبة للنصف الآخر. تم تسجيل الكمون بين الباب X (الشكل 1 أ) والتفاعل مع الرائحة أو الجسم في نهاية المدرج. تم تدريب الفئران على الرائحة البسيطة ومهمة التمييز البسيطة للأشياء حتى وصلت إلى المعيار (80٪ صحيح على مدار يومين متتاليين).

بالنسبة لمهمة تمييز الرائحة البسيطة، تم تقديم رائحة واحدة في كل تجربة. الهدف هو التمييز بين أي من الرائحتين تم إقرانه بمكافأة غذائية مقدمة في الإسفنجة في نهاية الحجرة B (الشكل 1 أ).

في مهمة التمييز البسيطة للأشياء، تم تقديم كائن واحد في كل تجربة في نهاية المقصورة B (لا يظهر في الشكل 1). كان على ثيرات أن يعرف أي من الشيئين تم إقرانه بمكافأة غذائية مقدمة تحت الشيء.

2.7|المهام المقترنة (التتبع وعدم التتبع) استخدمت هذه المهام تخطيطًا جديدًا للأبواب القابلة للإزالة عموديًا (الشكل 1). تعلمت الفئران أي من ثنائيات الرائحة والأشياء ستتم مكافأتها (على سبيل المثال، الرائحة 1 + الكائن أ والرائحة 2 + الكائن ب) وأي أزواج لم تتم مكافأتها (أي الرائحة 1 + الكائن ب والرائحة) 2 + الكائن أ).

بغض النظر عن الاقتران، تتلقى الفئران دائمًا مكافأة مقابل ظهور الرائحة عند السماح لها بالدخول إلى المقصورة الثانية من المدرج. كانت هذه المقصورة C لحالة "عدم وجود أثر" حيث لم يتم استخدام المقصورة A وكانت المقصورة B هي مقصورة البداية. كانت الرائحة في نهاية الحجرة B بالنسبة لحالة "الأثر"، والتي تم استخدام الحجرة A لها كمربع البداية.

تم تعريض الفئران في حالة عدم وجود أثر إلى تأخير 10- بين ظهور الرائحة ومحفزات الجسم، من خلال احتجازها في الحجرة C، بينما تم تعريض الفئران في حالة عدم وجود أثر للكائن مباشرة بعد تفاعلها مع الرائحة (بعد تناول المكافأة). في كل من ظروف التتبع وعدم التتبع، سجلنا زمن الوصول لاجتياز المقصورة D، من وقت رفع DoorZ حتى تفاعل الجرذ مع الكائن أو امتنع عن التفاعل معه لمدة 8 ثوانٍ.

تم تدريب مجموعتين من الفئران (آفة الشام وآفة ATN) على المهام المرتبطة بالرائحة والأشياء (مجموعات لا أثر لها)، وتم تدريب مجموعتين متناظرتين على المهمة المرتبطة بالرائحة والأثر والأشياء (مجموعات التتبع) حتى تم الوصول إلى المعيار (80٪ من التجارب الصحيحة عبر 3 أيام) أو بحد أقصى 50 يومًا.

2.8|اختبار الاحتفاظ بعد الاستحواذ

تم إجراء الاحتفاظ بالمهمة المقترنة لأي فأر بعد 5 أيام من الوصول إلى المعيار أو بعد 50 يومًا من التدريب. استخدمت هذه الجلسة 12 تجربة جماعية مجزية/غير مجزية في يوم واحد بطريقة مماثلة لتلك المستخدمة سابقًا مع هذا الجرذ.

2.9|علم الانسجة

2.9.1|نضح وجمع الأنسجة

في الأيام الثلاثة التي سبقت اختبار الاحتفاظ، تم تعريف الفئران المنفردة بقفص نظيف فارغ لمدة 90 دقيقة في غرفة مظلمة وهادئة. مباشرة بعد التجربة الأخيرة في اختبار الاحتفاظ، تم وضع الجرذ في قفصه في غرفة هادئة مظلمة مألوفة قبل 90 دقيقة من التروية.

تم تخدير الفئران بعمق باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم (125 مجم/كجم) وتم ضخها عبر القلب بمحلول ملحي متبوعًا بارافورمالدهيد [4% PFA في 0.1 M فوسفات عازل (PB)] لإصلاح الدماغ. تم تثبيت العقول لاحقًا في 4٪ PFA متبوعة بما لا يقل عن 48 ساعة في محلول طويل الأجل (2 0٪ جلسرين في 0.1 M PB). تم جمع المقاطع الإكليلية 40- ميكرومتر باستخدام مشراح تجميد (Thermo Fisher، UK) وتخزينها في محلول واقي للتبريد (30٪ جلسرين، 30٪ إيثيلين جلايكول في 0.1 M PB) عند 20 درجة مئوية حتى تتم معالجتها للكيمياء المناعية.

تم جمع المقاطع الإكليلية في سلسلتين منفصلتين. التقطت السلسلة الأولى مقاطع متتالية في خمسة صفائح تجميد للكيمياء المناعية (أي واحد من كل خمسة). تضمنت هذه السلسلة كتلة أمامية من المقاطع من قشرة الفص الجبهي إلى منطقة الحاجز (حوالي {{0}}.7 إلى 0.6 مم من بريجما) وكتلة خلفية من المهاد الظهري المتوسط ​​(حوالي 3.5 مم من بريجما) إلى الذيلية القشرة خلف الطحال.

السلسلة الثانية القبض على أقسام متتالية للتحقق من الآفة. تم جمع هذه المقاطع في أربعة كريوفيال من الأمام مباشرة إلى ATN إلى المهاد الوسطي الخلفي (حوالي 0.6 إلى 3.5 ملم من بريجما).

2.9.2|تلطيخ Neu-N والتحقق من آفة ATN

تم غسل المقاطع الحرة العائمة في جميع أنحاء منطقة ATN (3 1 0 دقيقة) في 0. 1 م من محلول ملحي بالفوسفات مع Triton-X (0.2٪؛ PBSTx) قبل الحضانة في المخزن المؤقت لمنع البيروكسيديز الداخلي لمدة 30 دقيقة [1% بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)، 50% ميثانول (CH3OH) في 2%PBSTx].

تم تحضين الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية من الأجسام المضادة الأولية لـ inanti-NeuN (1: 5000؛ أحادي النسيلة-MouseCat # MAB377؛ ميليبور، كاليفورنيا بالولايات المتحدة الأمريكية) في PBSTx مع مصل الماعز الطبيعي بنسبة 1٪ (NGS؛ Life Technologies، NZ).

تمت إزالة المخزن المؤقت للجسم المضاد الزائد باستخدام PBSTx وتلاه الحضانة في الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر الماعز (1: 1000 Cat # BP -9200-50: VectorLaboratories، California USA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية في PBSTx و 1٪ NGS. تم وضع المقاطع في ExtrAvidin (بيروكسيداز مترافق؛ 1: 1000؛ سيجما، نيو ساوث ويلز أستراليا)، PBSTxand 1٪ NGS لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

لإزالة الفائض من ExtrAvidin وTriton X{{0}}، تم غسل المقاطع في PBS، PB، ثم Tris buffer (الرقم الهيدروجيني 7.4 في H2 المقطر 0) لتحضير المقاطع للتصور باستخدام ديامينوبنزيدين المحضر حديثًا ( DAB 0.05%، سيجما، في 0.01% H2O2 في المخزن المؤقت Tris).

تم إيقاف تفاعل DAB (حوالي 5 دقائق) باستخدام محلول Tris (غسل لمدة 110 دقائق)، وتم وضع المقاطع في PB عند درجة حرارة 4 مئوية طوال الليل قبل التركيب على شرائح جيلاتينية والسماح لها بالجفاف. تم تجفيف الشرائح من خلال الكحول المتدرج (70% - 100%) قبل تصفيتها من الإينكسيلين وتركيبها باستخدام DPX (06522؛ Sigma-Aldrich) وساترة.

تم استخدام عدد الخلايا الإيجابية Neu-N في ATN لتحديد مدى الآفة. استخدم هذا أقسامًا من كل من نصفي الكرة الأيسر والأيمن لكل قسم من أربعة أقسام 40- ميكرومتر في جميع أنحاء ATN والمنطقة المحددة باستخدام ImageJ (NIH، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصوير تلطيخ الخلايا الإيجابية لـ NeuN في 5 أهداف باستخدام مجهر LeicaDM6 B المستقيم وكاميرا DFC7000T (Leica Microsystems، ألمانيا).

تم الحصول على التعداد الآلي للخلايا من خلال ImageJ (برنامج تحليل الصور، المعهد الوطني للصحة، NIH، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد المنطقة المحيطة بالخلايا العصبية في منطقة ATN يدويًا وتم تحويل الصور إلى تدرج رمادي بت {{0}}، وتم طرح الخلفية (المتداول=40)، وتحويلها إلى قناع وتم تطبيق وظيفة مستجمعات المياه، وتم حساب جميع الخلايا العصبية فوق العتبة (عتبة "MaxEntropy"، الدائرية 0.5–1.0).

كانت عتبة الكشف هي نفسها بالنسبة لجميع الأقسام. تم إحصاء نوى الخلايا الملطخة بـ NeuN في تسعة من الفئران الصورية (خمسة في مجموعة Sham-Trace وأربعة في مجموعة Sham-No Trace) للتعبير عن عدد الخلايا في ATN.

وتمت مقارنة التعداد الآلي للنوى الملطخة بـ NeuN للخلايا المعفاة في جميع فئران آفة ATN مقارنة بمتوسط ​​عدد خلايا NeuN التي لوحظت في الفئران الوهمية. تم تعريف الآفات المقبولة على أنها تصل إلى معيار فقدان 50% من الخلايا في ATN، بحد أدنى 25% لكل نصف الكرة الأرضية. يتوافق هذا مع معايير آفة ATN في الدراسات السابقة (Mitchell & Dalrymple-Alford، 2005، 2006؛ Perryet al.، 2018).

2.9.3|Zif268 الكيمياء المناعية

تمت معالجة المقاطع العائمة الحرة بطريقة مماثلة كما هو الحال في NeuN، ولكن تم تحضينها في الجسم المضاد الأولي Zif268 متعدد النسائل للأرنب (Egr -1؛ 1: 1000 Cat# sc-110؛ سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 72 ساعة عند 4 C في PBSTx مع 1٪ NGS، تليها الحضانة في الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرنب الماعز (1: 1000: Vector LaboratoriesBA -1000) طوال الليل في PBSTx و1٪ NGS.

بعد تصور DAB (18 دقيقة)، تم تصوير تلطيخ الخلايا الإيجابية Zif268- في كل منطقة محل اهتمام بهدف 10 باستخدام مجهر ضوئي (لايكا، ألمانيا). تم الحصول على التعداد الآلي للخلايا من خلال ImageJ ( NIH، USA) بنفس طريقة الخلايا NeuNpositive، باستثناء الدائرية التي تم ضبطها على 0.65–1.0.

استخدمت أعداد الخلايا الإيجابية Zif268- لجميع المناطق خوارزمية العتبة نفسها، مع تحديد ما بين قسمين وستة أقسام لكل منطقة محل اهتمام في كل فأر. تم استخدام متوسط ​​عدد الخلايا الإيجابية Zif268- لكل ملم2 عبر الأقسام (من كلا نصفي الكرة الأرضية) داخل المنطقة محل الاهتمام.

2.10|تحليل البيانات

تم إجراء تحليل التباين (ANOVA) باستخدام Statistica (الإصدار 13؛ شركة Dell Inc.) لاختبار فروق المتوسطات عبر المجموعات الأربع من الفئران (Sham-No Trace، وSham-Trace، وATN-No Trace، وATNTrace). تمت إضافة عوامل التدابير المتكررة لعدة أيام (ذاكرة الوصول العشوائي والتمييز البسيط)، وكتل التجارب (المهام المقترنة المرتبطة)، وتعداد Zif268 عبر المناطق ذات الصلة أو المناطق الفرعية ذات الاهتمام.

تم مقارنة ANOVA لكل من مهام ذاكرة الوصول العشوائي ومهام التمييز البسيطة بأربع مجموعات للتأكد من أن مجموعتي آفة الشام ومجموعتي آفة ATN كانت متسقة مع بعضها البعض، ولكن لاحظ أنه لم يكن هناك مكون تتبع في ذاكرة الوصول العشوائي أو مهام التمييز البسيطة. بالنسبة لكل من التمييز البسيط والمهام المقترنة في المدرج، تم استخدام التحويل المتبادل لبيانات الكمون في التجارب الفردية لضمان تجانس التباين.

في أي يوم اختبار معين، ولدت فترات الاستجابة المتحولة زمن وصول متوسطًا لكل من التجارب الست غير المكافئة والتجارب الست المكافئة. بالنسبة لمهام التمييز البسيطة، قمنا بتحليل متوسط ​​درجة فرق زمن الوصول (متوسط ​​التجارب المكافئة مطروحًا منه متوسط ​​التجارب غير المكافئة) ولكن ليس التجارب المكافئة وغير المكافئة بشكل منفصل بسبب فشل تخزين البيانات.

كانت جميع مقاييس زمن الوصول الثلاثة متاحة لمهام الذاكرة المقترنة (التجارب غير المكافئة، والتجارب المكافئة، وفرق زمن الوصول). لحساب المقارنات المتعددة ولموازنة أخطاء النوع الأول والنوع الثاني، استخدمنا مستوى الأهمية p < 0.02 للتحليلات السلوكية حيث كانت هناك ثلاثة مقاييس ذات صلة في المهمة المرتبطة المقترنة (التجارب غير المكافئة، التجارب المكافئة ويعني فرق الكمون).

كانت هناك ستة تحليلات أولية للمناطق ذات الاهتمام للتعبير Zif268، وتم تحديد الأهمية في هذه التحليلات عند p <0.01. قامت اختبارات Posthoc Newman-Keuls (NK) بتقييم الاختلافات الجماعية الزوجية. تم استخدام تحليل التأثيرات الرئيسية البسيطة عندما كانت هناك تفاعلات مهمة تتضمن عوامل التدابير المتكررة.

3|نتائج

3.1|التحقق من الآفة

استوفت جميع الفئران الـ 18 المصابة بآفات ATN باستثناء واحد منها المعيار المسبق المتمثل في حدوث ضرر ثنائي بنسبة 50٪ لـ ATN وبحد أدنى 25٪ لكل نصف الكرة الأرضية. كان متوسط ​​الضرر الثنائي 76% في مجموعتي آفة ATN (النطاق: ATN-No Trace، 61%-93%؛ ATN-Trace، 63%-93%؛ الشكل 2). كان لدى الفئران المستبعدة آفة مرضية في نصف الكرة الأرضية فقط (إجمالي 48٪، و 75٪ يسارًا، و 20٪ يمينًا).

يوضح الشكل 2 د أن تعداد NeuN للخلايا العصبية ATN في فئران آفة ATN (M=3388، SD=2024) كانت أقل بكثير من القيم الموجودة في فئران الآفة الوهمية (M=15، 339، SD=1065؛ كان هذا العدد مشابهًا لما أبلغ عنه فروست وآخرون، 2020). ثمانية من فئران الآفة الـ 17 (أربعة في مجموعة التتبع وأربعة في مجموعة عدم التتبع) لم تتعرض لأي ضرر سواء في المهاد الظهري المتوسط ​​(MD) أو نوى لم الشمل/المعيني (Re/Rh)، وكان هناك ضرر بسيط نسبيًا في هذه الهياكل في الفئران التسعة المتبقية مع الآفات.

عندما حدث تلف MD، كان ذلك في الجوانب الأمامية التي تقع بجوار ATN. لذلك، تم تقييم ضرر MD من حوالي {{0}}.72 إلى +2.10 ملم من بريجما، حيث تراوحت من 0% إلى 41% فقدان الخلايا في جميع أنحاء الجسم. المجموعة (المتوسط ​​= 21%). عندما حدث تلف Re/Rh، كان أيضًا مجاورًا لمنطقة ATN، لذلك تم تقييمه تقريبًا من 1.08 إلى 2.04 ملم من Bregma، حيث تراوح من 0% إلى 33% (الوسيط=6%). لاحظ أن قيم النسبة المئوية للإصابة لا تمثل كامل مناطق MD وRe/Rh، لأن المناطق الخلفية لكلا النواتين كانت سليمة في جميع فئران آفة ATN.

For more information:1950477648nn@gmail.com