تأثير مكافحة الشيخوخة من Urolithin A على البويضات البقري في المختبر 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.8 التحليل الإحصائي

تم تحليل البيانات من جلسات إنتاج الأجنة والجودة باستخدام Proc Glimmix من SAS (أنظمة التحليل الإحصائي ، SAS Inst. ، Inc. ، Cary ، NC ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، باستخدام التوزيع الثنائي واللوجيت كوظائف ارتباط. اشتمل النموذج المختلط الخطي المعمم على العلاج (جرعات UA ، وتأثير الشيخوخة ، وعمر الأنثى ، وتفاعلها) كتأثير ثابت ويتكرر كتأثير عشوائي. بالإضافة إلى ذلك ، تم حساب متوسط ​​كل علاج ، وأجريت مقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار PDIFF. تم تحليل بيانات JC -1 ومستويات نسخة mRNA وعدد النسخ mt-DNA باستخدام Proc Mixed of SAS مع نموذج يتضمن العلاج (تأثير UA وتأثير الشيخوخة و / أو عمر الأنثى وتفاعلها) كتأثير ثابت. تم اعتبار الجلسة ذات تأثير عشوائي. تمت مقارنة بيانات التكوينات الكروموسومية بين المجموعات باستخدام اختبار فيشر الدقيق ، في جدول طوارئ 2 × 2. اعتبر تحليل النتائج ذات دلالة إحصائية عند p<>

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

3. النتائج

3.1.المقايسة السابقة - دراسة الاستجابة للجرعة

يتم تمثيل حالة نضج البويضة التي لوحظت أثناء دراسة الاستجابة للجرعة لـ UA المكملة بوسط النضج في الشكل 1. أثرت هذه المكملات بشكل كبير على مراحل النضج النووي للبويضات. كشفت مجموعة UA 5 0 (38.9 ± 0. 5٪) عن معدل أعلى من البويضات في حالة طور AI / TI مقارنةً بمجموعة التحكم (1 0. 8 ± {{ 15}}. 5 بالمائة ، P =0. 0 3) و 1 0 UA (0. 0 ± 0. {{ 45}} بالمائة ، p =0. 0 006) المجموعات. في هذه المرحلة ، هناك معدل أعلى في مجموعة 25 UA (17.2 ± 0.5 بالمائة ، p =0. 05) مقارنةً بـ تم تحديد مجموعة 10 UA أيضًا. علاوة على ذلك ، تم العثور على اتجاه بين مجموعة 50 UA و 1 UA (14.3 ± 2.0 بالمائة ، ص =0. 08). أظهرت أعلى جرعة أيضًا تأثيرًا ضارًا ، مما قلل من عدد البويضات المصنفة في الطور الثاني. (MII) المرحلة (50 UA ، 44.4 ± 2.0 بالمائة) بالمقارنة مع مجموعة التحكم (86. 5 ± 7.0 بالمائة ، p =0. 003) ، 1 UA (82.1 ± 2.5 بالمائة ، p {{ 53}}. 01) ، 10 UA (89.3 ± 6.5 بالمائة ، p =0. 002) و 25UA (82.8 ± 9.0 بالمائة ، ص =0. 01) لم يلاحظ أي اختلافات بين المجموعات المتبقية مراحل نضج البويضات. لم تظهر مراحل النضج GV و CCl في الشكل 1 ، حيث لم يتم تقييم أي بويضات في هذه الفئات.

أظهر اختبار الاستجابة للجرعة عدم وجود تأثير معنوي لتركيزات UA على معدلات انقسام الأجنة وفقسها. ومع ذلك ، فإن معدل الأجنة المنتجة في اليوم السابع قد تأثر بتركيزات مختلفة من UA. كان لمجموعة UA 5 0 (7.2 ± 2.7 بالمائة) معدلات أقل للأجنة في day7 مقارنةً بـ 1 UA (28.5 ± 4.8 بالمائة ، p =0. 004) ، 10 UA (20.4 ± 4.0 بالمائة ، p =0. 03) و 25 UA (18.5 ± 4.7 بالمائة ، p =0. 05). بالرغم من عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعة الضابطة و 50 مجموعة UA ، تم تحديد اتجاه (ص =0. 06). علاوة على ذلك ، تميل معدلات الأجنة في اليوم السابع (p =0. 07) إلى أن تكون أعلى بعد تناول جرعة واحدة من مكملات UA مقارنةً بالمجموعة الضابطة. علاوة على ذلك ، ضاعفت مجموعة UA رقم جودة الأجنة الممتازة / الجيدة (68.9٪ من أجنة الصف الأول ، n =20) بالمقارنة مع مجموعة التحكم (34.6٪ ، n =10) و 10 UA (26.8٪) في المئة ، ن =10). تم الحصول على عدد قليل من أجنة الدرجة الأولى مع الجرعات الأعلى: 25UAgroup (15.4 بالمائة ، n =4) و 50UA (35.4 بالمائة ، n =3). بناءً على النتائج المذكورة أعلاه ، تم اختيار 1 uM UA للشروع في الدراسات التالية.

3.2. التجربة 1 - - جودة البويضات وإمكانات النمو للبويضات المسنة والناضجة فسيولوجيًا

3.2.1. النضج النووي

لقد بحثنا في تأثير مكملات UA على حالة نضوج الكروموسومات للبويضات المسنة والناضجة فسيولوجيًا التي تم جمعها من الإناث قبل سن البلوغ والبالغات. بصرف النظر عن تأثير UA ، فإن شيخوخة البويضات والتقدم في العمر للإناث له تأثير ضار كبير على النضج. تم تحديد معدلات أعلى لمرحلة MII في البويضات الضابطة مقارنة بالبويضات القديمة (22 ساعة =93. 2 ± 5.4 بالمائة مقابل 3 0 س =77. 6 ± 4.1 بالمائة ، ص {{11 }}. 0 2). علاوة على ذلك ، تم تحديد تأخير في تقدم النضج في الأمشاج المسنة والإناث قبل البلوغ مع وجود عدد أكبر من البويضات في مرحلة الذكاء الاصطناعي / TI (22 ساعة =3. 4 ± 0. 5 بالمائة مقابل 3 0 ساعة =17. 9 ± 0. 6 بالمائة ، ف =0. 01 وما قبل البلوغ =21. 1 ± 1.1 بالمائة مقابل البالغين =6. 8 ± 0.7 بالمائة p =0. 03) علاوة على ذلك ، تم تحديد عدد أكبر من البويضات المتحللة بعد 30 ساعة من IVM مقارنةً بعد 22 ساعة (7.1 ± 1.39 بالمائة مقابل 4.1 ± 0.89 بالمائة ، ص =0. 02) . لم يتدخل عمر الأنثى ومكملات UA (p 0.05) مع عدد البويضات المتدهورة.

أثر كل من الشيخوخة في المختبر ومكملات UA لوسط النضج بشكل كبير على التكوين الكروموسومي للبويضات في الإناث قبل سن البلوغ والبالغات (p.<0.05, figure="" 2).="" on="" the="" al/ti="" phase="" of="" the="" maturation="" status,="" higher="" rates="" of="" oocytes="" were="" found="" in="" this="" stage="" in="" the="" control="" aged="" 30="" h="" prepubertal="" group="" (46.7±0.5%)="" when="" compared="" to="" control="" prepubertal="" (0.0±0.0%,p="0.05)" and="" ua="" aged="" 30h="" prepubertal="" (0.0="" ±0.0%,p="0.02),and" both="" adult="" control="" (5.6±0.5%,p="0.01" and="" ua="" adult,0.0±0.0%,="" p="0.0002)and" control="" aged="" 30h="" adult="" (9.1±10%,p="0.02)groups." a="" trend="" was="" also="" identified="" between="" ua="" adults="" and="" ua="" aged="" 30="" h="" adult="" (p="">

فيما يتعلق بمرحلة MII المقابلة للنضج النووي الكامل ، تم العثور أيضًا على اختلافات كبيرة بين المجموعات (الشكل 2). تم العثور على معدلات أقل من البويضات في مرحلة MII في المجموعة الضابطة التي تتراوح أعمارها بين 3 0 ساعات قبل البلوغ (53.3 ± 2. 0 في المائة) مقارنةً بمرحلة ما قبل البلوغ الضابطة (1 0 {{2 { {27}}}}. 0 ± 1.5 بالمائة ، ف =0. 05) ، UA بعمر 30 ساعة ما قبل البلوغ (100.0 ± 2.5 بالمائة ، p =0. 02) و UA بالغ (100.0 ± 10.5 بالمائة ، p =0. 0002) ومجموعة المجموعة الضابطة التي تتراوح أعمارها بين 30 عامًا (86. 0 ± 5.5 بالمائة ص =0. 056). علاوة على ذلك ، أظهرت مجموعة UA البالغة معدلات أعلى من البويضات الناضجة (MII) مقارنةً بعمر UA البالغ من العمر 30 ساعة (76.2 ± 11.3 بالمائة ، ص =0. 01) ، مجموعة التحكم بعمر 30 ساعة للبالغين (86. 0 ± 5.5 بالمائة ، ف =0. 08) والبالغ الضابط (83.3 ± 4.5 بالمائة ، ص =0. 057).

لم يلاحظ أي فروق بين المراحل المتبقية من نضج البويضات.الفلافونويد ،باختصار ، تحسنت مكملات UA في تقدم نضج المختبر في البويضات الخاضعة لعملية الشيخوخة ، خاصة في الإناث قبل سن البلوغ. وهكذا تم تحديد تأثير مهم لمكافحة الشيخوخة من UA.

3.2.2. إمكانات غشاء الميتوكوندريا

من أجل تحليل تورط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا في البويضات المسنة للإناث وتأثير UA وعمر الأم ، تم تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) في البويضات من مجموعات مختلفة.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

بصرف النظر عن عمر الإناث وتأثيرات UA ، كان لشيخوخة البويضات تأثير ضار كبير على MMP تم تقييمه على أنه نسبة التألق الأحمر والأخضر المقاس (نسبة 22 ساعة =0. 54 ± 1.8 في المائة مقابل 30 ساعة {{6} } .47 ± 1.5 بالمائة ، ص =0. 002).

أثر الجمع بين عمر الأنثى وتأثير الشيخوخة والمكملات الغذائية مع UA أثناء النضج بشكل كبير (p {0}. {{1 0}} 0 7) على MMP (الشكل 3). كما لوحظ في الشكل 3 ، تم الحصول على معدلات أعلى من MMP في مجموعات UA قبل البلوغ (النسبة =0. 55 ± 0.04) ومجموعة البالغين UA (النسبة =0. 63 ± 0.04) حيث نضجت البويضات لمدة 22 ساعة ، مقارنةً بمجموعة التحكم التي تبلغ 30 ساعة من البالغين (النسبة =0. 45 ± 0.04 ، p =0. 04 و p =0. 0007 ، على التوالي) و UA بعمر 30 ساعة بالغ (النسبة { {23}}. 45 ± 0.03، p =0. 03 و p =0. 0003 ، على التوالي).يستخدم هسبريدينعلاوة على ذلك ، لوحظت زيادة ملحوظة في نسبة التجميع / المونومرات {{0} JC ، والتي تشير إلى زيادة ملحوظة في MMP ، في مجموعة UA البالغة بالمقارنة مع البالغين الضابطين (النسبة =0 .47 ± 0. 0 4 ، ف =0. 0 031) ، التحكم في ما قبل البلوغ (النسبة =0. 52 ± 0.04 ، ف =0. 03) ، المجموعة الضابطة التي تبلغ 30 ساعة من البالغين (النسبة =0. 48 ± 0.03، p =0. 003) و UA البالغ من العمر 30 ساعة (النسبة =0. 47 ± 0.03، p {{25) }}. 001). تم تحديد اتجاه أيضًا بين UA قبل البلوغ و UA الذي يبلغ من العمر 30 ساعة قبل البلوغ (ص =0. 07).

باختصار ، قام UA بتحسين MMP أثناء النضج الفسيولوجي ولكنه لم يكن قادرًا على التغلب على التأثير السلبي للشيخوخة في كل من البويضات قبل البلوغ والبويضات.

3.2.3. التطور الجنيني

تم تقييم إمكانات النمو الجنيني من خلال معدلات الانقسام ، D7 ، ومعدلات الأجنة المفرغة ، التي تم الحصول عليها مع العلاجات المختلفة (الشيخوخة ومكملات UA) المطبقة على موانع الحمل الفموية عند الإناث قبل البلوغ والبالغات أثناء النضج. بصرف النظر عن عمر الإناث وتأثيرات UA ، كان لشيخوخة البويضات تأثير ضار كبير على الانقسام (22 ساعة =79. 5 ± 1.7٪ مقابل 3 0 h =68. 6 ± 2.0٪ ، p =0. 0001) ومعدلات D7embryo (22 ساعة =18. 6 ± 1.9 بالمائة

مقابل 3 0 h =12. 1 ± 1.7 بالمائة ، p =0. 0 1). تم عرض مكملات UA أيضًا لتحسين معدلات الأجنة D7 (التحكم { {8}}. 1 ± 1.5 بالمائة مقابل UA =20. 0 ± 2.0 بالمائة ، p =0. 0009).

أثر الجمع بين عمر الأنثى وتأثير الشيخوخة والمكملات الغذائية مع UA أثناء النضج بشكل كبير (ع {0}}. {{3 0} 1) على نمو الجنين ، أي الانقسام و معدلات الأجنة D7 (الجدول 2). تم تحقيق معدلات أعلى من الانقسام عندما نضجت البويضات البالغة لمدة 22 ساعة مع أو بدون مكملات UA (البالغين الضابطين =1 .4 ± 3.2٪ والكبار UA =80. 9 ± 3.4 بالمائة) وبويضات ما قبل البلوغ نضجت لمدة 22 ساعة مع مكملات UA (UA قبل البلوغ =80. 6 ± 3.2 بالمائة) ، مقارنةً بعمر UA الذي يبلغ من العمر 3 0 هتل (66.5 ± 4.2 بالمائة ، p أقل من أو يساوي 0.01) ، والتحكم في عمر 30 ساعة (66.9 ± 3.9 في المائة ، p أقل من أو يساوي 0.02) و UA بعمر 30 ساعة قبل البلوغ (67.2 ± 4.0 في المائة ، p أقل من أو يساوي 0.01) (الجدول 2). تم تحديد اتجاه (ص =0. 09) أيضًا بين البالغين الضابطين ومجموعة المجموعة البالغة 30 ساعة.

Another parameter that was significantly (p=0.01) influenced by the combination of the female age, the supplementation with UA, and COCs aging was the rate of embryos produced at day 7(Table 2). Exceptions were made for the UA prepubertal and UA 30 h prepubertal groups, the UA adult group presented the highest rates of the embryo at day7 (26.8±4.3%,p≤0.05). Moreover, lower D7 embryo rates were produced from aged oocytes from both adult and prepubertal females without the supplementation of UA (control aged 30hprepubertal=7.7±2.6% and control aged 30h adult=7.7±2.6%)compared to those that were supplemented with UA, respectively (UA aged 30 h prepubertal=18.9±4.0%,p=0.03 and UA aged 30 h adult=15.9±4.0%,p=0.09). The supplementation of UA to the maturation medium did not significantly (p>0. 05) تؤثر على معدلات جودة الأجنة المنتجة من الصفين 1 و 2 و 3 ، ولا تأثير الشيخوخة أو جميع التأثيرات المدروسة معًا (الجدول 3). ومع ذلك ، تضاعف عدد الأجنة ذات النوعية الممتازة / الجيدة التي تم إنتاجها عندما تمت إضافة UA إلى البويضات الناضجة لمدة 22 ساعة (الجدول 3).

3.3 التجربة 2

3.3.1. مستويات التعبير الجيني

من أجل دراسة تأثير UA وتأثير عمر الأم على مسار إشارات Nrf2 ، تم تقييم تحليل مستويات التعبير الجيني NFE2L2 و NQO1 في ثقافة GCs من أبقار ما قبل البلوغ والبالغ بواسطة RT-qPCR. بصرف النظر عن العوامل الأخرى المدروسة ، أثر عمر الإناث بشكل كبير على التعبير الجيني NFE2L2 ، الذي انعكس في المستوى الأعلى من نسخ NFE2L2 في GCs من إناث ما قبل البلوغ (مستويات mRNA قبل البلوغ =0. 0 0 015 ± 0.0012 بالمائة مقابل البالغ =0. 00011 ± 0.0012، p =0. 048).

The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly(p>0. 05) تؤثر على مستويات التعبير الجيني لجينات NFE2L2 و NQOl و mt-ND5. يمثل الشكل 4 مستويات التعبير عن هذه الجينات التي تم تطبيعها مع عنصر التحكم الخاص بها ، في كل من الخلايا الجذعية التي تم علاجها قبل البلوغ والبالغين.

3.3.2.mt-رقم نسخة DNA

Analysis of mt-ND5 DNA content in GC culture from prepubertal and adult cows was assessed by qPCR. The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly (p>0. 05) يؤثر على رقم نسخة جين mt-ND5.فقدت الإمبراطوريةيمثل الشكل 5 رقم نسخة هذا الجين الذي تم تطبيعه باستخدام عناصر التحكم المعنية ، في كل من الخلايا الجذعية قبل البلوغ المعالجة بـ UA والبالغين.

4. مناقشة

على مدى العقود الماضية ، لوحظ زيادة في الطلب على تطبيقات العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية في الثروة الحيوانية [8،46،47]. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح تأخر الإنجاب المرتبط بتقدم سن الأم الآن العامل الرئيسي الذي يدفع النساء للجوء إلى العلاج المضاد للفيروسات القهقرية [5]. تعد جودة البويضات أمرًا بالغ الأهمية لحدوث الحمل الناجح ، كما أن شيخوخة الأمشاج الأنثوية تمثل مصدر قلق كبير لنجاح المعالجة المضادة للفيروسات القهقرية. على الرغم من التقدم المتزايد الذي تم إحرازه في هذا المجال ، فإن التقنيات المطبقة ليست قادرة بعد على استعادة الخصوبة ، وعكس الساعة البيولوجية [7]. في العمل الحالي ، تم تطوير نموذج لدراسة العقم المرتبط بالعمر في بويضات الماشية. نظرًا لأوجه التشابه بين الحمل البشري والأحداث الجريبية والغدد الصماء [48 ، 49] ، قد يكون هذا النموذج مفيدًا أيضًا للبحث البشري ، متجنبًا القيود الأخلاقية والفيزيائية التي تعيق هذه الدراسات في البويضات البشرية. أثبت نموذجنا الخاص بالشيخوخة من الإناث أنه فعال للغاية ومناسب لدراسة المشكلات المختلفة المرتبطة بالشيخوخة الإنجابية وضعف الخصوبة ، وهو حاليًا أحد أهم التحديات في العالم. علاوة على ذلك ، فإن البحث عن علاجات جديدة مضادة للأكسدة مع إمكانية منع العقم الناجم عن شيخوخة الأمشاج الأنثوية ، كما تمت دراستها في العمل الحالي ، له نفس الأهمية القصوى.

تم الإبلاغ عن النتائج المقدمة لأول مرة عن التأثير المفيد لتحليل الوصول في نتائج العلاج المضاد للفيروسات القهقرية. UA هو مستقلب غذائي قادر على منع تراكم الميتوكوندريا الخاطئة المرتبطة بالعمر عن طريق تحفيز التخفيف وإطالة عمر الخلايا [28]. نظرًا لأنه لم يتم اختبار UA من قبل في التكاثر البقري ، فقد تم تطبيق الجرعات بنجاح في خطوط خلوية مختلفة تظهر آثارها المضادة للسرطان ومضادة للالتهابات ومضادة للشيخوخة [28 ، 35 ، 39]. في دراستنا ، جرعة سابقة- تم إجراء اختبار الاستجابة وتم تحديد تركيز 1 uM UA بوضوح باعتباره الأكثر واعدة. علاوة على ذلك ، ظهر تأثير ضار عند الجرعات العالية ، خاصة عند جرعة 50 ميكرومتر من UA ، مما يضر بتطور النضج النووي حتى MII. وقد انعكس هذا التأثير على ضعف النمو الجنيني. وفقًا لذلك ، لاحظ ليو وزملاؤه (2019) انخفاضًا ملحوظًا في قابلية بقاء الخلايا وانتشار الخلايا الليفية للجلد البشري المسن ، عند تركيز UA يبلغ 50 ميكرومتر. وأشاروا إلى أن الجرعات العالية من UA تؤدي إلى تضاؤل ​​قابلية الخلية للحياة مما يؤدي إلى زيادة عدد الخلايا الموقوفة في دورة الخلية G / M [35]. على العكس من ذلك ، تم إنتاج معدلات أعلى من الأجنة في اليوم السابع بعد إضافة 1 ميكرومتر UA إلى وسط النضج مقارنة بالجرعات الأخرى. لمزيد من استكشاف الآليات المحتملة لعمل UA في تكاثر الإناث ، تم تنفيذ دراسة أثناء شيخوخة البويضات واستخدام الإناث من مختلف الأعمار كمانحات للبويضات. أبلغ ياماموتو وزملاؤه (2010) عن انخفاض مرتبط بالعمر في معدل إخصاب الأبقار القديمة ، مما يدل على أن هذه البويضات كانت أكثر عرضة لاستئناف الانقسام الانتصافي الأول أثناء النضج وغالبًا ما تكون قد بدأت بالفعل في النضج الانتصافي عند جمع البويضات [50] تشير هذه البيانات إلى أن البويضات المأخوذة من الأبقار الأكبر سناً كان لها تقدم نضج نووي أسرع ووصلت إلى مرحلة MII أسرع من البويضات من الإناث الشابات بسبب انخفاض كفاءة البويضات [51]. وفقًا لذلك ، تكشف دراستنا أن عمر المتبرعات وعملية شيخوخة البويضات يؤثران بشكل كبير على التكوين الكروموسومي للبويضات أثناء تقدم النضج. في الواقع ، أظهرت البويضات المأخوذة من أبقار ما قبل البلوغ معدلًا أعلى للمراحل المتأخرة ، مثل مراحل Al / TI (ما قبل البلوغ =21. 1٪ مقابل البالغين =6. 8٪) ، مما يدل على تباطؤ تطور النواة النضج ، والذي قد يكون بسبب انخفاض كفاءة البويضات على النحو الذي اقترحه Soto-Heras وزملاؤه (2018). تقدم البويضات المسنة أيضًا معدلات أقل من البويضات التي وصلت إلى مرحلة MII خلال فترة 30 ساعة (7.6 بالمائة) مقارنة بالفترة الفسيولوجية (93.2 بالمائة). علاوة على ذلك ، تم تحديد تأثير إيجابي مع علاج UA أثناء عملية النضج الفسيولوجي ، وكذلك التأثيرات المضادة للشيخوخة في كل من الإناث قبل سن البلوغ والبالغات.

بالاتفاق مع النتائج التي توصلنا إليها ، أظهرت دراسة أن مكملات الميلاتونين أثناء النضج في oitro يمكن أن تحفز استئناف الانقسام الاختزالي في موانع الحمل الفموية الأبقار ، في حين أن البويضات الضابطة المزروعة بدون هرمونات كان لها معدلات استئناف الانقسام الاختزالي أبطأ [52]. على العكس من ذلك ، فإن المكملات بعوامل أخرى مضادة للأكسدة ، مثل كيرسيتين وفيتامين سي أو ريسفيراترول لم تقدم أي تأثير على معدلات النضج النووي ، حتى عندما لوحظ انخفاض مستويات ROS أو زيادة مستويات إنزيم مضادات الأكسدة [53،54].استخدامات الفلافونويد المنقى المجهرية 1000 مجمعلى العكس من ذلك ، تظهر نتائجنا أن UA يمكن أن ينقذ البويضات من آثار الشيخوخة في كل من البالغين المسنين والإناث قبل سن البلوغ ، والتي تقدم كفاءة أقل ، مما يحسن معدلات النضج.

أحد الأسباب الرئيسية لنتائج الخصوبة السيئة التي تؤثر على جودة البويضات يرتبط بوظائف الميتوكوندريا ، والتي تتأثر مع تقدم عمر الأم وشيخوخة ما بعد التبويض [21،55]. تمت دراسة MMP على نطاق واسع في نماذج مختلفة ، وكشف أن كلا من الأمشاج المسنة بعد الإباضة وشيخوخة الأمهات ، تحفز فقدان وظيفة الميتوكوندريا [56]. وبالتالي ، فقد انعكس فقدان MMP سلبًا على تطور البويضات والجنين [26،57]. وفقًا لهذه النتائج ، في دراستنا ، تم العثور على نسبة منخفضة من MMP في البويضات المسنة من كل من الأبقار قبل البلوغ والأبقار البالغة. علاوة على ذلك ، أدت مكملات UA إلى وسط الثقافة إلى زيادة في MMP من البويضات قبل البلوغ والبويضات البالغة التي نضجت لمدة 22 ساعة ، يتردد صداها في معدلات الانقسام الأعلى. تتوافق هذه البيانات مع النتائج التي توصل إليها Liang وزملاؤه (2017) الذين لاحظوا تحسن MMP عندما تم استكمال البويضات البقريّة بالميلاتونين لمدة 22 ساعة [26]. ومع ذلك ، حددنا أيضًا انخفاضًا في MMP في البويضات المسنة المكملة بـ UA ، مما يشير إلى أن UA قد لا يكون قادرًا على عكس التأثير السلبي للشيخوخة في MMP. وقد لوحظت نتائج متضاربة فيما يتعلق بـ MMP بعد إضافة البويضات المسنة بمركبات مضادة للأكسدة. في الواقع ، أبلغ العديد من المؤلفين عن مستويات أعلى من MMP على البويضات بعد تناول مكملات الميلاتونين [26] واللامينارين [21] بينما لاحظ آخرون العكس ، انخفاض MMP في البويضات المسنة المعالجة بـ L-carnitine [58] والميلاتونين [38]. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Ryu وزملاؤه (2016) انخفاضًا في MMP في الخلايا العضلية للفئران المزروعة باستخدام UA [28]. فيما يتعلق بنتائجنا ، يجب معالجة مزيد من الدراسات لتعميق معرفة آلية عمل UA في ميتوكوندريا البويضات وشرح الآثار التفاضلية المحددة على البويضات المسنة والناضجة فسيولوجيًا.

تم الإبلاغ عن الجودة الجوهرية للبويضات على نطاق واسع باعتبارها المحدد الرئيسي للتطور الجنيني اللاحق. كشفت الأدلة المتراكمة أن العديد من التشوهات الخلوية والجزيئية تحدث أثناء فترات النضج الممتدة في المختبر وكذلك أثناء الشيخوخة بعد التبويض في الجسم الحي [57]. علاوة على ذلك ، يمكن أن تمارس هذه التشوهات تأثيرات ذات صلة على جودة البويضات التي يتردد صداها على إنتاج الأجنة [52]. لإثبات أن UA يمكن أن يكون بمثابة مركب مضاد للشيخوخة وتحسين جودة البويضات ، وتأخير شيخوخة البويضات ، قمنا بفحص القدرة التنموية للبويضات المسنة بعد الإخصاب في المختبر. في دراستنا ، لوحظ تأثير ضار كبير (p أقل من أو يساوي 0. 01) لشيخوخة الأمشاج على الانقسام ومعدلات إنتاج الأجنة في اليوم السابع. وبناءً على ذلك ، أشار العديد من المؤلفين إلى أن الإناث المسنات يعانين من انخفاض مرتبط بالعمر في القدرات الإنجابية ، وينعكس ذلك في انخفاض معدلات الخصوبة وضعف جودة الأجنة [44،55]. من ناحية أخرى ، أفادت الدراسات السابقة التي تختبر جزيئات مضادات الأكسدة الأخرى لإنقاذ البويضات المسنة عن التأثير المفيد لعدد قليل من هذه المركبات أثناء النضج في المختبر على نمو الأجنة للإناث المسنات من أنواع مختلفة ، مثل الماشية [58] ، الخنازير [ 38] والفئران [6]. على سبيل المثال ، تم اختبار L-carnitine على البويضات في الأبقار ولم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في معدلات الانقسام التي تم الحصول عليها. ومع ذلك ، تم تحديد زيادة كبيرة في معدل الزيجوتات التي تم تطويرها لمرحلة الكيسة الأريمية ، مقارنة بالبويضات المسنة بدون L-carnitine [59] أظهرت نتائجنا أيضًا أن مكملات UA أثناء النضج الفسيولوجي حسنت معدل الانقسام في الإناث قبل سن البلوغ والبالغات. على الرغم من أن معدلات انقسام البويضات التي تبلغ من العمر UA لم تكن مختلفة بشكل كبير عن البويضات ذات العمر الضبط ، فقد تم تحديد معدلات أعلى للجنين D7 في البويضات البالغة من العمر UA من كل من الإناث قبل البلوغ والبالغات. أشارت هذه النتائج إلى أن التأثير المضاد للشيخوخة لـ UA الذي تم تحديده مسبقًا في مزارع الخلايا المختلفة [28 ، 35] صالح للبويضات والأجنة. شيخوخة البويضات هي عملية متعددة العوامل تضعف نمو الجنين ، واستعادة القدرة التنموية للبويضات المسنة هو هدف مهم تم تحقيقه في هذه الدراسة.

بالإضافة إلى ذلك ، قمنا أيضًا بتقييم الدور الوقائي لـ UA في التدهور المرتبط بالعمر على جودة الجنين. على الرغم من عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في هذه الدراسة في معدلات جودة الجنين ، فإن البويضات المكملة بـ UA زادت من عدد الأجنة القابلة للنقل ، مقارنة بالأجنة غير المعالجة. ذكرت دراسة سابقة أن علاج L-carnitine يمكن أن يحسن جودة الأجنة التي تم تطويرها من البويضات البقريّة القديمة من خلال خفض مستويات ROS ومستويات أعلى من الجلوتاثيون بالإضافة إلى إنزيمات أخرى مضادة للأكسدة [58]. قد ترجع الاختلافات بين هذه النتائج ونتائجنا إلى الأساليب المختلفة المطبقة لتقييم جودة الجنين. يظل التقييم المورفولوجي لجودة الجنين طريقة ذاتية تعتمد على خبرة المراقب. في المستقبل ، يجب معالجة المزيد من الدراسات باستخدام تقنيات أخرى لتقييم جودة الجنين بدقة.

من المعروف على نطاق واسع أن الإجهاد التأكسدي يلعب دورًا مهمًا في انخفاض الخصوبة المرتبط بالعمر. الإجهاد التأكسدي هو أحد المساهمين الرئيسيين في انخفاض كفاءة نضج البويضات ، وتدهور جودة البويضات ، وبالتالي إضعاف نمو الجنين اللاحق [11]. يعد الاتصال بين الخلايا بين الأمشاج والخلايا الجسدية أمرًا بالغ الأهمية للتطوير السليم للبويضات عالية الجودة. تم الإبلاغ عن تغييرات في البيئة المكروية للمبايض المسنة ، مثل انخفاض النشاط الأنزيمي المضاد للأكسدة مما يؤدي إلى ضعف كفاءة الكسح ROS.oteflavonoidعلاوة على ذلك ، تبين أن الخلايا الجذعية السرطانية من الإناث الشابات وكبار السن لديها جينات معبر عنها تفاضليًا مرتبطة بالأنشطة المضادة للأكسدة وعمر الأم [2،13]. وبالتالي ، من الأهمية بمكان العثور على آليات لإدارة الإجهاد التأكسدي من أجل إنقاذ البويضات من الشيخوخة والتغلب على مشاكل العقم. تمت دراسة مسار Nrf 2- على نطاق واسع نظرًا لقدرته على التعامل مع الآثار الضارة للإجهاد التأكسدي وممارسة خصائص مضادات الأكسدة [60] لمزيد من الدراسة لتفعيل مسار إشارات Nrf2 في الخلايا الجذعية للأبقار ، قمنا بتقييم مستوى التعبير مرنا لـ NFE2L2 ومضادات الأكسدة المصب (NQO1). أظهرت نتائجنا تأثيرًا معنويًا لعمر الأنثى على مستوى نصوص NFE2L2 ، والتي تتناقص مع تقدم العمر. في الواقع ، لوحظ وجود مستويات أكبر من التعبير عن الرنا المرسال في الأبقار قبل البلوغ بالمقارنة مع البالغين. هذا يتفق مع الدراسات السابقة التي أبلغت عن مستوى معبر للغاية من بروتين Nrf2 و mRNA على أنسجة المبيض لدى الفئران الصغيرة التي تحمل الإنجاب والنساء من سن 22 و 49 عامًا ، بينما تم العثور على تعبير أقل في الفئران والنساء المسنين. اقترح أن انخفاض التعبير عن Nrf2 قد يكون متورطًا في انخفاض القدرة الإنجابية لدى النساء الأكبر سنًا وقد يكون للسيطرة عليه آثار مهمة في تأخير شيخوخة المبيض [15 ، 61]. علاوة على ذلك ، أظهر Akino وزملاؤه (2019) أن تنشيط مسار Nrf 2- Keapl من خلال إدارة ثنائي ميثيل فومارات يمكن أن يقلل من مستويات ROS ويؤدي إلى تأخر العقم [18]. تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة فيما يتعلق بتأثير UA في تقليل ROS في الخلايا الليفية لجلد الإنسان الشائخ. عندما عولجت هذه الخلايا باستخدام UA ، تم الإبلاغ عن زيادة كبيرة في تعبير mRNA للجينات المستهدفة Nrf2 ، مثل SOD1 و NQ01 و GCLC و HMOX1. [35] في دراستنا ، لاحظنا أن مستوى التعبير عن جينات NFE2L2 و NQO1 في GCs لم يتأثر بشكل كبير بمكملات UA. ومع ذلك ، ينبغي إجراء مزيد من الدراسات لتأكيد الانخفاض في ROS والتحسين اللاحق للكيسة الأريمية المنتجة ، وكذلك تأثير UA على تعبير mRNA للجينات المذكورة أعلاه على البويضات المسنة.

بالإضافة إلى الأضرار التي لحقت بالحمض النووي للميتوكوندريا (mt-DNA) ، فقد ثبت أيضًا أن اضطراب التعبير الجيني للميتوكوندريا يساهم في اختلال وظائف الميتوكوندريا مع تقدم العمر. أفاد Zhang وزملاؤه (2019) أن بعض الجينات المشاركة في OXPHOS ، وهي mt-ND2 و mt-ND3 و mt-ND4 و mt-ND4L و mt-ND5 ، تم تقليل تنظيمها بشكل كبير في مرحلة GV للبويضات من الفئران المسنة ، مقارنة مع الفئران الصغيرة [62]. في دراستنا ، لم يتم العثور على فرق كبير في تعبير mt-ND5 mRNA ، بين الخلايا السرطانية المسترجعة من أبقار ما قبل البلوغ والأبقار البالغة. علاوة على ذلك ، قمنا أيضًا بتقييم رقم نسخة mt-DNA ، لأن محتوى mt-DNA في الخلايا الجذعية السرطانية قد ارتبط بشكل إيجابي بجودة البويضات وتطور الجنين [63،64]. على الرغم من عدم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية في دراستنا بين عدد نسخ mt-DNA في GCs من أبقار ما قبل البلوغ والأبقار البالغة ، أو عند معالجتنا بـ UA ، لاحظنا عددًا أكبر من البويضات التي تطورت إلى مرحلة الكيسة الأريمية ، مقارنة بالمجموعات غير المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، أفاد Ryu وزملاؤه (2016) أن محتوى mt-DNA ومستوى البروتين من المجمعات التنفسية لم يتغير في الخلايا العضلية للفئران المكملة بـ UA [28]. يجب إجراء مزيد من الدراسات للكشف عن آلية عمل UA في تحسين خصوبة الإناث.

5. الاستنتاجات

أكدت النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة التأثير الضار لشيخوخة البويضات على كفاءتها التنموية. علاوة على ذلك ، أثبت نموذجنا الخاص بالشيخوخة في الإناث أنه فعال للغاية ومفيد لدراسة المشكلات المختلفة المرتبطة بالشيخوخة الإنجابية وما يترتب على ذلك من ضعف الخصوبة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مكملات UA أثناء عملية نضج البويضات المسنة أدت إلى تحسين معدلات النضج وإنتاج الأجنة. لذلك ، تم تحديد التأثير المضاد للشيخوخة لـ UA في إنقاذ الأمشاج المسنة لأول مرة ، مما أدى إلى تحسين تطور الكيسة الأريمية ، مما يؤدي إلى زيادة عدد الأجنة لنقلها إلى الإناث المتلقية. كما تم تحديد التأثير الإيجابي لـ UA على النضج الفسيولوجي ، و MMP ، والتطور الجنيني. في الختام ، يوفر علاج UA نهجًا علاجيًا جديدًا لمنع أو تأخير شيخوخة الأمشاج ، وتحسين تكوين الكيسة الأريمية اللاحقة ونتائج الخصوبة في ART.

تم اقتباس هذا المقال من موقع الحيوانات 2021 ، 11 ، 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals