العوامل الوظيفية المضادة للشيخوخة وآلية Cistanche Deserticola

[خلاصة] موضوعي: لاستكشافالعوامل الوظيفية المضادة للشيخوخةوآلية المادة الصالحة للأكل والطبيةسيستانش ديزيرتيكولاعلى أساس صيدلة الشبكة وفي الجسم الحيتجارب الكائن الحي النموذجيالتهاب الربداء الرشيقة. طُرق: الأهداف المحتملة للمكونات الرئيسية فيج. ديزيرتيكولا تم التنبؤ بها بواسطة قاعدة بيانات ومنصة تحليل علم الأدوية لأنظمة الطب الصيني التقليدي (TCMSP)، وSwissTargetPrediction، وGeneCards، والوراثة المندلية عبر الإنترنت في الإنسان (OMIM)، وقواعد بيانات أخرى. تم إدخال الأهداف المتوقعة في منصة تحليل شبكة STRING للحصول على شبكة تفاعل البروتين البروتين (PPI) للمكونات النشطة وأهداف المرض، وذلك لفحص الأهداف الأساسية. تم استخدام تحليل إثراء مسار موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) للتنبؤ وتحليل مسارات التمثيل، وتم إنشاء شبكة مسار المكون والهدف والدواء النشط بواسطة Cytoscape.جيم ايليجانستم تقسيمها إلى مجموعة فارغة وج. ديزيرتيكولامجموعات بتركيزات مختلفة. العمر الافتراضي والقدرة الإنجابية والقدرة على ممارسة الرياضةجيم ايليجانستمت ملاحظتها مباشرة. أنشطة فوق أكسيد ديسموتاز (SOD)، الكاتلاز (CAT)، الجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH-Px) ومحتوى المالونديالدهيد (MDA) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) فيجيم ايليجانستم تحديدها بواسطة فحص المجموعة. تم استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT PCR) لتحديد التعبير عن الجينات المرتبطة بعمر الحياة وتغير القدرة على الإجهاد فيجيم ايليجانس. نتائج: العوامل الوظيفية المحتملة يمكن أن تعمل على75الأهداف المتعلقة بالشيخوخة، و8البروتينات المستهدفة الأساسية، بما في ذلك بروتين الصدمة الحرارية HSP90- (HSP90أأ1) ، مستقبلات هرمون الاستروجين (ESR1) ، غتباز HRas (HRAS)، البروثرومبين (F2)، مصفوفة البروتينات المعدنية-2 (م.م.ب2)، هيكسوكيناز-2 (هونج كونج2) ، تم فحص السكراز-إيزومالتاز (SI) والمالتيز-جلوكوأميلاز (MGAM) عن طريق تحليل الطوبولوجيا. أظهر تحليل KEGG أن Cistanche deserticola يمكن أن تتداخل مع27المسارات بما في ذلك مسار إشارات الاستروجين، ومسار إشارات السرطان، ومسار إشارات GnRH، ومسار إشارات الأنسولين لتأخير الشيخوخة.سيستانش ديزيرتيكولايمكن أن يزيد بشكل كبير من متوسط ​​وقت البقاء على قيد الحياة ويحسن قدرة الإجهاد التأكسديجيم ايليجانس، وتعزيز أنشطة SOD وCAT وGSH-Px، وتقليل تراكم ROS وMDA، والتعبير عنداف-2والعمر-1وانخفضت، في حين أن التعبير عنداف-16والجينات المستهدفة النهائية (الاحمق-3, مل -1, ضريبة القيمة المضافة-4,كتل -1وكتل -2) وزادت كذلكسكين-1والجينات المرتبطة بالصدمة الحرارية (هسف -1, hsp-16.1وhsp-16.2). خاتمة: يتم تطبيق صيدلة الشبكة لشرح الآلية المحتملة لج. ديزيرتيكولافي مكافحة الشيخوخة، وقد أثبت ذلكج. ديزيرتيكولايمكن إطالة عمرجيم ايليجانسوتعزيز القدرة المضادة للإجهاد. قد تكون هذه الآلية مرتبطة بتثبيط مسار إشارات الأنسولين وتفعيل عوامل النسخ النهائية للبروتينداف-16والجينات المرتبطة بالصدمة الحرارية، وبالتالي تعزيز قدرة الإجهاد التأكسديجيم ايليجانس.

الكلمات الرئيسية:Cistanche deserticola YC Ma; مكافحة الشيخوخة; العوامل الوظيفية آلية؛ الإجهاد التأكسدي

مستخلص السيستانش مع 75% جليكوسيد

Cistanche deserticola YC Maهي مادة طبية صينية تقليدية ثمينة في بلدي. ومن المعروف باسم "الجينسنغ الصحراء". تم تسجيله لأول مرة في "Shen Nong's Materia Medica" وتم إدراجه كأعلى درجة. طعمه حلو ومالح ودافئ بطبيعته، ويعود إلى الكلى والأمعاء الغليظة. يعتقد الطب الصيني التقليدي أن له آثار تغذية يانغ الكلى، وتجديد الجوهر والدم، وترطيب الأمعاء وملين[1]

. في عام 2018، تم إدراج Cistanche deserticola (الصحراء) في "كتالوج المواد الغذائية والمواد الطبية الصينية تقليديًا" [2]، وتم الاعتراف بقيمتها في التطور إلى منتجات صحية. وفقا للإحصاءات، فإن تواتر Cistanche deserticola في وصفات مكافحة الشيخوخة وإطالة العمر يأتي في المرتبة الثانية بعد الجينسنغ [3]. تظهر الأبحاث الدوائية الحديثة أن Cistanche deserticola يحتوي على مضادات أكسدة مهمة، ومضاد للشيخوخة، ومضاد للتعب، وتحسين الذاكرة وغيرها من التأثيرات [4]، لكن عوامله الوظيفية وآلية مكافحة الشيخوخة لا تزال غير واضحة. Caenorhabditis elegans (المشار إليه فيما يلي باسم الديدان الخيطية) هو كائن متعدد الخلايا ذو خلفية وراثية واضحة، وعمر قصير نسبيًا، وتكاثر سريع، واستزراع سهل. مع زيادة عمره، فإنه يُظهر نمطًا ظاهريًا للشيخوخة مشابهًا لنمط البشر. يتم الحفاظ على جينات C. elegans، والبروتينات، ومسارات الإشارة بشكل كبير لدى البشر.

لديه 60٪ إلى 80٪ من التماثل مع الجينات البشرية. في السنوات الأخيرة، تم استخدام الديدان الخيطية على نطاق واسع في أبحاث مكافحة الشيخوخة في الطب الصيني التقليدي والطب الطبيعي [5]. تستخدم هذه الدراسة طرق علم الصيدلة الشبكية للتنبؤ بالمكونات النشطة والأهداف ومسارات الإشارة لـ Cistanche deserticola في تأخير الشيخوخة؛ باستخدام الديدان الخيطية ككائنات نموذجية، من خلال مراقبة عمرها وتكاثرها والمؤشرات العامة الأخرى، يتم قياس التغيرات في الإجهاد التأكسدي والقدرة على ممارسة الرياضة وعلاقتها بعمرها. التعبير عن الجينات ذات الصلة، واستكشاف آلية Cistanche deserticola في تأخير الشيخوخة، وتوفير معلومات للصحة ذات الصلة

توفير مرجع لتطوير وتطبيق المنتجات الصحية.

1 مادة

1. 1 الأدوات

SMZ-168 مجهر ستيريو (شركة Motic)؛ CKX41 مجهر مضان تباين الطور المقلوب (شركة أوليمبوس) ؛ قارئ صفيحة Multiskan FC (شركة Thermo Fisher العلمية)؛ مضخم الجينات لتفاعل البوليميراز المتسلسل Mycycler (PCR)، أداة PCR الكمية الفلورية MJ Mini™ (شركة Bio-Rad).

1. 2 اختبار الطب

تم جمع Cistanche deserticola من قاعدة زراعة Cistanche deserticola للممارسات الزراعية الجيدة (GAP) في مقاطعة يوتيان، شينجيانغ. تم التعرف عليه من قبل الباحث Zhang Tiejun من شركة Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co., Ltd. باسم Cistanche deserticola YC Ma؛ 2ʹ،7ʹ-ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين إستر حمض إيثيل (DCFH DA)، 2٪ NaN3 (شركة سيجما)؛ كاشف Trizol، مجموعة تخليق cDNA، SYBR Green Kit (Takara Bioengineering Co., Ltd.)؛ مجموعة ديسموتاز الفائق أكسيد (SOD)، مجموعة الكاتلاز (CAT)، مجموعة الجلوتاثيون بيروكسيداز (GSH Px)، مجموعة المالونديالدهيد (MDA) (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.)؛ تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي الفلوري (qRT PCR) تم تصنيع الاشعال المطلوبة بواسطة شركة Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd.، وتظهر تسلسلات التمهيدي في الجدول 1.

1.3 الديدان الخيطية

الأنواع العشرة المختلفة من الديدان الخيطية المستخدمة في التجربة كانت كلها من مركز علم الوراثة Caenorhabditis. وترد المعلومات التفصيلية في الجدول 2.

2 الطريقة

2.1 فحص العوامل والأهداف الوظيفية لـ Cistanche deserticola

من خلال مراجعة الأدبيات والجمع بين التوصيف السابق لمجموعة البحث هذه لمجموعة مواد Cistanche deserticola، تم فحص المكونات الكيميائية الرئيسية ومكونات الدم [{{0}}]. ارسم البنية المركبة في برنامج ChemDraw 19.0، وأدخلها في قاعدة بيانات SwissTargetPrediction (http://new.swissstargetprediction.ch/)، واستخدم طريقة مطابقة المستحضرات الصيدلانية العكسية للحصول على نتائج الفحص الافتراضية. وفي الوقت نفسه، تم استخدام قاعدة بيانات ومنصة تحليل علم الأدوية لنظام الطب الصيني التقليدي (TCMSP، https://tcmsp-e.com/tcmsp.php). استخدم وظيفة البحث UniProtKB في قاعدة بيانات UniProt (http://www.uniprot.org/) وقم بمراجعتها

يقوم Swiss-Prot بتصفية البروتينات، وحصر الأنواع على "بشرية"، وتصحيح البروتين المستهدف للمركب إلى اسم الجين. دمج النتائج المستهدفة لقاعدتي البيانات للحصول على مكتبة مستهدفة محتملة للمركبات.

2.2 التحليل التنبؤي للأهداف المتعلقة بالشيخوخة

استخدم قواعد بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/) وOMIM (https://omim.org/) للبحث باستخدام الكلمات الرئيسية "قديم، خرف، متهالك، شيخوخة، ضعيف، كادوسيتي"، حيث تحتوي GeneCards على جينات ذات تم فحص درجة أكبر من أو تساوي 10٪، وتم دمج نتائج قاعدتي البيانات، وتم حذف الجينات المكررة، وتم الحصول أخيرًا على الأهداف المتعلقة بالشيخوخة. ثم قم بدمج أهداف العوامل الوظيفية ضمن البند 2.1 مع الأهداف المتعلقة بالشيخوخة المذكورة أعلاه، ثم خذ التقاطع، وارسم مخطط فين.

2.3 بناء شبكة التفاعل بين البروتين والبروتين (PPI).

أدخل هدف التقاطع الذي تم الحصول عليه في منصة بيانات STRING 11.5 (http://string-db.org/)، وحدد الأنواع بـ "Homo sapiens"، أعلى مستوى ثقة في درجة التفاعل هو 0.900، والحصول على شبكة PPI. حفظ البيانات بتنسيق .TSV واستيرادها إلى Cytscope

3. 8.0 برنامج، اضبط حجم العقدة وعمق اللون بقيمة الدرجة للحصول على شبكة PPI الخاصة بالمكونات النشطة لـ Cistanche deserticola وأهداف الأمراض. تم اختيار النقاط التي كانت معلماتها الثلاثة من الدرجة والمسافة والقرب أكبر من المتوسط ​​كأهداف أساسية، وتم الحصول على إجمالي 8 أهداف أساسية بعد الفحص.

2. 4 علم الوجود الجيني (GO) التحليل الحيوي وجينات وجينات كيوتو

يستخدم تحليل إثراء مسار موسوعة المجموعات (KEGG) قاعدة بيانات OmicsBean (http://www.omicsbean.cn/login/) لإجراء التحليل الوظيفي GO وتحليل إثراء مسار KEGG على أهداف التقاطع، والفرز وفقًا لقيمة P، وتحليل المسارات الناتجة.

2.5 المواد الطبية – المكونات – الأهداف – إنشاء شبكة المسارات

قم باستيراد المواد والمكونات والأهداف والمسارات الطبية إلى برنامج Cytscope 3.8.0 لإنشاء شبكة مسارات مكونات المواد الطبية Cistanche deserticola.

2.6 ثقافة الديدان الخيطية

تم استزراع الديدان الخيطية عند درجة 20 باستخدام وسط NGM (يحتوي على 0.750 جم من NaCl، و0.625 جم من التربتون و4.250 جم من الأجار في 250 مل من الماء المقطر المزدوج). تم استخدام الإشريكية القولونية المعقمة OP50 (65 درجة، 45 دقيقة) كمصدر للغذاء وانتشرت بالتساوي على سطح وسط زراعة NGM. استخدم محلول التحلل (5% NaClO، 5 mol·L–1 NaOH) لمزامنة الديدان الخيطية، وثقافة الديدان الخيطية المتزامنة إلى المرحلة L4 في حاضنة 20 درجة. تم اختيار نيماتودا المرحلة L4 بشكل عشوائي وتقسيمها إلى مجموعة مراقبة (وسط NGM) ومجموعات إدارة Cistanche deserticola بتركيزات كتلة مختلفة للتجارب.

2.7 تحضير الدواء

خذ 10 جم من المادة الطبية Cistanche deserticola، أضف الماء المقطر وفقًا لنسبة المادة إلى السائل 1:10، ثم ارجع واستخلص مرتين، ساعتين في كل مرة، واجمع مستخلصات الماء، وتصفية وركز حتى يجف تحت انخفاض الضغط. استخدم الماء المقطر المعقم لتحضير المحلول الأم بتركيز كتلي قدره 50 مجم·مل–1 (استنادًا إلى كمية الدواء الخام). استخدم مستنبت NGM لإعداد الحلول بتركيزات جماعية نهائية تبلغ 0، 25، 50، 75، 100، 200، و500 ميكروغرام · مل – 1 لاستخدامها لاحقًا.

2.8 اختبار السمية

تم نقل الديدان الخيطية N2 إلى أطباق بتري تحتوي على تركيزات كتلة مختلفة من Cistanche deserticola (0، 25، 50، 100، 200، 500 ميكروجرام·مل–1)، 100 في كل مجموعة. تم حساب يوم الإعطاء باليوم 0. قم بتغيير الوسط الذي يحتوي على دواء طازج كل يوم وسجل موت الديدان الخيطية للحصول على نطاق الجرعة الآمن من Cistanche deserticola.

2.9 تجربة الإجهاد

تم نقل الديدان الخيطية N2 إلى الخلايا التي تحتوي على تركيزات كتلة مختلفة من Cistanche deserticola (0، 25، 50، 75 ميكروغرام · مل – 1

) في طبق بيتري، 100 في كل مجموعة. تم حساب يوم إعطاء الدواء باعتباره اليوم 0. وتم استبدال وسط الثقافة الجديد الذي يحتوي على الدواء كل يوم. تم إجراء تجربة الإجهاد في اليوم السابع من تناول الدواء. في تجربة الإجهاد التأكسدي، تم نقل الديدان الخيطية من كل مجموعة إلى وسط NGM (تمت إضافة 10 ميكرولتر من 30٪ H2O2 إلى كل 10 مل من وسط NGM)، وتم تسجيل بقاء الديدان الخيطية كل 30 دقيقة. في تجربة الإجهاد الحراري، تم تعريض الديدان الخيطية بشكل مستمر إلى 35 درجة وتم زراعتها، وتم تسجيل حالة بقاء الديدان الخيطية كل ساعتين.

2. 10 تجربة ثني الجسم

خذ الديدان الخيطية N2 وقم بتجميعها وقم بتطبيق نفس المعالجات كما في 2.9. في اليوم الثالث والسابع بعد تناول الدواء، أجريت تجربة ثني الجسم. تم أخذ 20 نيماتودا من كل مجموعة، وتم اكتشاف وتسجيل عدد انحناءات جسم الديدان الخيطية خلال 30 ثانية.

2. 11 تجربة مضخة البلعوم

خذ الديدان الخيطية N2، وقم بتجميعها وإدارتها تحت نفس الظروف مثل 2.9، ووضع 1 نيماتودا في كل طبق بتري، وتعيين 5 موازيات لكل تركيز جماعي. مراقبة تحت مجهر مجسم في الأيام 0 و3 و7 من الإدارة. ولوحظ تردد بلع الديدان الخيطية لمدة 60 ثانية في كل مرة وتم تسجيل عدد المضخات البلعومية.

2.12 تجربة الاستنساخ

خذ الديدان الخيطية L1 المرحلة N2 وضعها في وسط الدواء الدوائي وقم بتربيتها إلى المرحلة L4. ثم، قم بنقلهم إلى وسط جديد يحتوي على دواء بتركيزات كتلة مختلفة كل يوم، وقياس عدد البيض الذي تضعه الديدان الخيطية. توضع الأطباق القديمة المحتوية على البيض بعد زراعتها لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة 20 درجة، ويتم تحديد عدد النسل. يحتوي كل طبق بتري على 1 نيماتودا، ويتم تعيين 5 أشكال متوازية لكل تركيز كتلة.

2.13 تحديد تراكم الليبوفوسين

خذ الديدان الخيطية N2، وقم بتجميعها وتطبيق نفس المعالجات كما في 2.9، مع 100 ديدان خيطية في كل مجموعة. تم إجراء تجارب قياس الليبوفوسين في اليومين السابع والحادي عشر من تناول الدواء. تم اختيار 35 من الديدان الخيطية بشكل عشوائي ووضعها على صفائح الاغاروز 2٪، وتم تخديرها بـ 2٪ NaN3، واستخدمت مجهر مضان (كان الطول الموجي لضوء الإثارة 360 ~ 370 نانومتر، والضوء المنبعث (الطول الموجي: 420 ~ 460 نانومتر) لاحظ اللون الأزرق تألق ذاتي في الديدان الخيطية، واستخدام برنامج imageJ 1.51 لقياس شدة التألق.

2. 14 تحديد محتوى MDA وROS ونشاط الإنزيم المضاد للأكسدة

خذ الديدان الخيطية N2، وقم بتجميعها وتطبيق نفس المعالجات كما في 2.9، مع 100 من الديدان الخيطية في كل مجموعة. في اليوم السابع بعد الإعطاء، تم غسل الديدان الخيطية الموجودة في وسط استنبات كل مجموعة بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9% وجمعها في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل، وتجانسها على الجليد، وطردها عند 3000 دورة في الدقيقة {{ 10}} لمدة 10 دقائق (نصف قطر الطرد المركزي 42.5 مم)، خذ المادة طافية بعد الطرد المركزي، واستخدم مجموعة أدوات لقياس أنشطة محتوى SOD وCAT وGSH-Px وMDA. في تجربة تحديد ROS، تم غسل الديدان الخيطية ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت M9، ووضعها في محلول DCFH-DA بتركيز نهائي قدره 10 ميكروليتر · لتر – 1، وحضنها عند 37 درجة في الظلام لمدة 20 دقيقة، مع هزها كل 5 دقائق. دقيقة. ثم يغسل مرتين مع العازلة M9، ووضع الديدان الخيطية على شريحة زجاجية. التقاط صور باستخدام مجهر الأسفار (الإثارة الطول الموجي للضوء 485 نانومتر، الطول الموجي للضوء الانبعاث 520 نانومتر)، واستخدام برنامج ImageJ 1.51 لتقييم كثافة الأسفار النسبية.

2. 15 عامل تسريع الاضمحلال -16 (DAF -16)، الإزاحة النووية لـ SKN -1 وSOD -3، الجلوتاثيون S-transferase -4 (GST {{ 8}})، بروتين الصدمة الحرارية -16. 2 (HSP -16. 2) التصور باستخدام الديدان الخيطية المعدلة وراثيا TJ356 وLG333 على التوالي لتجارب النقل النووي للبروتين DAF-16 وSKN-1.

تم استخدام الديدان الخيطية المعدلة وراثيا CF1553 وCL2166 وTJ375 لتحديد التعبير عن بروتينات SOD-3 وGST-4 وHSP-16.2. التجميع والإدارة هما نفس ما هو أقل من 2.9. في اليوم السابع بعد تناول الدواء، تم استخدام مجهر مضان لالتقاط صور للديدان الخيطية في كل مجموعة، وتم استخدام برنامج ImageJ 1.51 لقياس كثافة مضان GFP.

2. 16 تحديد العمر الافتراضي للنيماتودا الطافرة

تم إجراء التجارب باستخدام الديدان الخيطية CF1038، وEU1، وPS3551، وDA1116، على التوالي، وتم تقسيمها إلى مجموعة مراقبة ومجموعة إدارة Cistanche deserticola 75 ug·mL–1. تم حساب معدل بقاء الديدان الخيطية في كل مجموعة يوميًا. 2. تجربة 17 qRT-PCR: تم نقل الديدان الخيطية من المرحلة L4 N2 إلى وسط استزراع NGM (يحتوي على 150 ميكرومول · لتر – 1 بنتفلورويوراسيل) الذي يحتوي على تركيزات كتلة مختلفة من Cistanche deserticola (0، 25، 50، 75 ميكروجرام · مل – 1)، 20 يحضن في درجة حرارة لمدة 6 أيام. تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الديدان الخيطية باستخدام طريقة Trizol وعكس النسخ إلى [كدنا] لتقدير مرنا. تمت معالجة البيانات باستخدام طريقة 2–ΔΔCt، وتم استخدام الفعل -1 باعتباره الجين المرجعي الداخلي.

2. 18 تحليل البيانات

تم استخدام برنامج SPSS 19.0 للتحليل الإحصائي، وتم التعبير عن البيانات بـ (-x ± s). تم تحليل الاختلافات بين المجموعات عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه، وP<0.05 was considered a statistically significant difference.

3. النتيجة

3.1 المكونات والأهداف النشطة المحتملة لـ Cistanche deserticola

من خلال مراجعة الأدبيات والجمع مع الأبحاث السابقة لهذه المجموعة البحثية، تم اختيار 12 مكونًا كيميائيًا بما في ذلك جليكوسيدات فينيليثانويد والإريدويدات والقشور كمركبات مستهدفة لأبحاث الصيدلة الشبكية. يتم عرض المعلومات المحددة في الجدول 3. بعد إزالة التكرارات من قاعدة البيانات، تم الحصول على إجمالي 86 أهداف لـ 12 مكونًا نشطًا محتملاً.