المبادئ المضادة للالتهابات من إبر Pinus Taiwanensis Hayata وفي دراسات السيليكو لآثارها المحتملة في مكافحة الشيخوخة

خلاصة:صنوبريحظى شاي الإبرة بشعبية كبيرة في الدول الشرقية مثل اليابان وروسيا وكوريا والصين. يُزعم أن شاي إبرة الصنوبر له دلالةآثار مكافحة الشيخوخة ،لكن لا يوجد دليل واضح يدعم ذلك حتى الآن. في هذه الدراسة ، خمسة عشر مركبًا غير موصوف (1–5) ، بالإضافة إلى اثنين وسبعين مركبًا معروفًا ، تم تنقيته وتمييزه عن الجزء النشط بيولوجيًا من مستخلصات الميثانول منP. taiwanensisالإبر.

أفضل منتجات الأعشاب المضادة للشيخوخة

تم فحص معظم العزلات الخاصة بهمالنشاط الحيوي المضاد للالتهاباتبواسطة نموذج العدلة الخلوية وستة مركبات (45, 47, 48, 49, 50، و51) عرضت أتثبيط كبير على جيل الأنيون الفائقوإطلاق الإيلاستاز مع قيم IC50 تتراوح من 3.3± 0. 9 إلى 8.3± 0.8 µم هذهالمكونات المضادة للالتهاباتتم إخضاعهم لحوسبة الالتحام لتقييم تقاربهم الملزم على مستقبلات الجريلين ، والتي لعبت دورًا مهمًا في تنظيم التمثيل الغذائي ، معآثار مكافحة الشيخوخة. مجمعات سكنية49, 50، و51 شكلت معقدًا مستقرًا مع مستقبلات الجريلين عبر روابط الهيدروجين وأنواع مختلفة من التفاعلات.

1 المقدمة

صنوبرجنس (Pinaceae) ، الذي يضم أكثر من 100 نوع وموزع بشكل رئيسي في نصف الكرة الشمالي ، هو بشكل عام أشجار دائمة الخضرة في حين أن بعضها عبارة عن شجيرات [1]. خشب الصنوبر خفيف وغالبًا ما يستخدم للأثاث. ومع ذلك ، فقد تم تسجيل التأثيرات الدوائية المختلفة للإبر على براعم الصنوبر في الكتب القديمة للطب الصيني التقليدي. في "The Divine Wifeman's Herbal Foundation Canon" ، عززت إبر الصنوبر نمو الشعر وإطالة العمر وإخماد العطش. في "Taiping Shenghui Fang" ، تم تسجيل أن إبر الصنوبر يمكن طهيها بالكحول وتظهر تأثيرًا مضادًا للشيخوخة. في الوقت الحاضر ، تتم معالجة إبر الصنوبر كشاي وتحظى بشعبية في آسيا. في كوريا ، مكوناتP. densifloraإبرة الشاي وكذلك لهاتم فحص الأنشطة الحيوية المضادة للأكسدة والبكتيريا على نطاق واسع [2,3]. منذ أوائل القرن الماضي ، تم التعرف على أكثر من سبعمائة مركب منإبر الصنوبر. ترتبط معظم الأدبيات المبلغ عنها بالزيت العطريP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. نيجرا[4,8]، وP. سيلفستريس[4,9]. المكونات المميزة لـصنوبرالإبر هي في الغالب benzenoids و diterpenoids و flavonoids و lignans و monoterpenoids و sesquiterpenoids [10]. إبرP. densifloraوP. morrisonicolaتم الإبلاغ عن نشاطها الحيوي المضاد للأكسدة [11–14]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مستخلص أسيتات الإيثيل من إبرP. morrisonicolaمنع التعبير البروتيني و mRNA لـ NO وiNOS في الضامة RAW 264.7 المستحثة بـ LPS ، والتي تُظهر نشاطًا حيويًا مهمًا مضادًا للالتهابات [13]. استخراج السوائل فوق الحرجة منP. densifloraعرضت الإبر التأثير المثبط على إنتاج NO الناجم عن LPS عن طريق تقليل تنظيم التعبير عنiNOS ، وتقليل تعبير IL -6 و IL -1 وتفعيل بروتينات STAT1 و STAT3 في الضامة التي يسببها LPS [15]. مستخلص الإيثانولP. thunbergiiأظهرت الإبر تأثيرًا كبيرًا مضادًا للالتهاب في الضامة ووذمة الأذن التي يسببها حمض الأراكيدونيك وتثبيط النشاط الإنزيمي للميلوبيروكسيديز [16]. علاوة على ذلك ، فإن المخمرP. morrisonicolaأظهرت الإبر نشاطها الحيوي الممتاز كمضاد للأكسدة ومضاد للالتهابات عن طريق تعديل NF-κمسار الإشارات B [17]. 

جريلين هو هرمون ببتيد يتكون من ثمانية وعشرين حمضًا أمينيًا وقد تم اكتشافه في الأصل في المعدة [18,19]. وهو يجند داخلي المنشأ لإفراز هرمون النمو (GHSR) ، وهو عضو في -فرع في الفئة A GPCRs (مستقبلات البروتين G) [18,19]. جريلين هو هرمون الببتيد الوحيد الذي يسبب الجوع لتعزيز الشهية [20]. اقترحت العديد من الدراسات أن الجريلين يلعب دورًا مهمًا في تنظيم التمثيل الغذائي وتوازن الطاقة والذاكرة ووظائف القلب والأوعية الدموية والجهاز الهضمي في جسم الإنسان.21–23]. يشارك جريلين أيضًا في العديد من الآليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية في جسم الإنسان مثل الشيخوخة [24,25] ، وقد يكون مرتبطًا بالنشاط المضاد للالتهاب [26,27]. في عام 2014 ، تم التعرف على مادة tetra glycosides الفريدة المكونة من الفلافونويد المسماة teaghrelins ، لأول مرة في شاي Chin-shin الصيني الاسود من قبل مجموعتنا وأظهرت نشاطها المعزز في إفراز هرمون النمو (GH) [28]. تم تنقية مركبين آخرين مشابهين في شاي Shy-jih-chuen أولونج وتم التحقق أيضًا من نشاطهما الحيوي على مستقبل الجريلين [29]. تسببت أنواع الشاي الأربعة في الجوع من خلال نفس المسار التنظيمي مثل الجريلين. على سبيل المثال لا الحصر الشاي ، تم أيضًا استكشاف المركبات ذات الهياكل أو الأنشطة الحيوية المماثلة لـ teaghrelinsبوليغونوم مولتيفلوروم(Hes houwu) [30], الجنكة بيلوبا[31], موروس ألبا[32]، وCistanche tubulosa [33]. تدعمنا هذه النتائج في البحث عن مبادئ طبيعية لمكافحة الشيخوخة عن طريق فحص المركبات الشبيهة بالشاي جريلين التي تمتلك تأثيرات مضادة للالتهابات. بالإضافة إلى الأداء المباشر للنشاط المعزز في إطلاق هرمون النمو في النماذج الخلوية ، فإن النمذجة الجزيئية لبعض المركبات المحتملة ستكون أكثر فاعلية في استكشاف المرشحين المحتملين [34]. تم تطبيق الأساليب الحسابية لتطوير وتقييم الفرضيات الدوائية. يعد الالتحام الجزيئي أحد أكثر التقنيات شيوعًا ويتوقع التشكل والتقارب لربط الترابط بالجيب النشط بدقة عالية [35,36]. تبحث طرق الإرساء بشكل فعال في المساحات عالية الأبعاد للتفاعل المحتمل واستخدام وظيفة تسجيل النقاط التي ترتب المرشحين بشكل صحيح [37]. 

في عام 2018 ، تمت تنقية ثلاثة مركبات من إبرP. morrisonicolaوأظهر نشاطًا مهمًا للتخدير الوعائي ، ومن بين هذه المكونات ، تم الإبلاغ عن أحدهم بهيكل يشبه جريلين الشاي [38]. في تايوان،P. taiwanensisعادة ما يتم تجفيف الإبر وخبزها ثم معالجتها كشاي بسبب نشاطها الحيوي الشهير.P. taiwanensisHayata هي واحدة من الأنواع المحلية والمتوطنة في تايوان. ويسمى أيضًا الصنوبر الأحمر التايواني ، أو الصنوبر هوانغشان. توجد إبرتان في كراسة يبلغ طولها من 8 إلى 11 سم وتكون صلبة قليلاً ومستقيمة ، وتنمو عبر الجزيرة بأكملها من الارتفاعات المنخفضة إلى المرتفعة وغالبًا ما تشكل غابة نقية [39]. في الفحص الأولي ، طبقة أسيتات الإيثيل من مستخلصات الميثانولP. taiwanensisأظهرت الإبر تثبيطًا كبيرًا لتوليد الأنيون الفائق وإطلاق الإيلاستاز باستخدام IC50 قيم 0 .8± {{0}}. 2 و 1.0± 0.1 µجم / مل ، على التوالي (الجدول S1). لذلك ، في هذه الدراسة ، فإن المكونات النشطة بيولوجيًا لـP. taiwanensisتم فحص الإبر وتقييم المركبات النقية لمضادات الالتهاب النشاط الحيوي على نموذج العدلات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العزلات منP. taiwanensisتعرضت الإبر ذات الأنشطة الحيوية المضادة للالتهابات لحوسبة الالتحام وتم التحقيق في تفاعلهم مع مستقبلات الجريلين.

2. المواد والأساليب

2.1. الإجراءات التجريبية العامة

تم الحصول على أطياف الأشعة فوق البنفسجية (UV) بواسطة جهاز Hitachi U {0}} UV / V وهو مطياف. التم فحص أطياف الأشعة تحت الحمراء (IR) باستخدام مقياس الطيف الضوئي Jasco FT / IR -4100.1H-, 13C-, وتم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي ثنائي الأبعاد (NMR) على جهاز Bruker AV -400مطياف الرنين المغناطيسي النووي. التحولات الكيميائية موضحة فيδ القيم (جزء في المليون) مع رباعي ميثيل سيلانكمعيار داخلي. الδH وδC كانت القيم للتحولات الكيميائية للإشارات ،على التوالى. كان قياس الطيف الكتلي التأين بالرش الكهربائي عالي الدقة (HR-ESI-MS)تم إجراؤها باستخدام مطياف JEOL JMS -700 (يعمل في وضع الأيونات السالبة).

2.2. المواد النباتية

إبرP. taiwanensisتم جمعها في بولي ونانتو وتايوان وتحديدهابقلم البروفيسور شنغ يانغ وانغ (قسم الغابات ، جامعة تشونغ شينغ الوطنية ،تايشونغ، تايوان). تم إيداع عينة القسيمة (PCKuo {0}}) في الأعشابكلية الصيدلة ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان ، تايوان.

2.3 الاستخراج والعزلة

2.4 البيانات الطيفية والفيزيائية من 1-5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Dihydroxy -70 - (4- هيدروكسي -3- ميثوكسيفينيل) بروبان -80 -yloxy] -2-حمض الهيدروكسي بنزويك (2)شراب عديم اللون [ ]25 D بالإضافة إلى 5.3 (c 0. 1 ، MeOH) ؛ الأشعة فوق البنفسجية (MeOH)λالأعلى(سجلε) 284 (3.59), 253 (3.80) نانومتر؛ ECD (c 3.51 × 10−4 M ، MeOH)λالأعلى(∆ε) 248 (زائد 1.33) ، 224 (زائد 1.03) ،214 (زائد 1.10) نانومتر; IR (أنيق)νالأعلى3425 ، 2927 ، 1541 ، 1384 ، 1271 سم−1;1يُسلِّم13C NMR ؛ HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− calcd لـ C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R) -12- حمض الهيدروكسيجاثيك (3)

مسحوق عديم اللون النائب: 263◦ج (ديسمبر) ؛ [ ]25 D بالإضافة إلى 30.8 (c 0. 1 ، MeOH) ؛ الأشعة فوق البنفسجية (MeOH)λالأعلى(سجلε) 225 (ش) (3.83) نانومتر ؛ IR (أنيق)νالأعلى3450 ، 2937 ، 1648 ، 1252 سم−1;1H-NMR (قرص مضغوط3التطوير التنظيمي ،400 ميغا هيرتز) δ 0. 63 (3H، s، CH3-20) ، 1.09 (ساعة واحدة ، ياردة ،J = 13. 6 ، 13.6 ، 3.6 هرتز ، ارتفاع -3 أ) ، 1.21 (3 ساعات ، ثانية ، سي إتش3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,ح -6 ب) ، 2.08 (3 ساعات ، ث ، سي إتش3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H ، dd ،J = 9. 2 ، 2.8 هرتز ، ارتفاع -12) ، 4.53 (1 ساعة ، ثانية ، ارتفاع -17 أ) ، 4.91 (1 ساعة ، ثانية ، ارتفاع -17 ب) ، 5.88 (1H، br s، H -14) ،13C-NMR (قرص مضغوط3OD ، 100 ميغا هرتز)δ 13.5 (CH3-20) ، 14.9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C -19) ؛ HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− calcd لـ C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5- Isopropyl -3- oxocyclohex -1- ene -1- حمض الكربوكسيل (4)

الكريستال المجدول عديم اللون. النائب: 235◦ج (ديسمبر) ؛ [ ]25 D بالإضافة إلى 28.6 (c 0. 3 ، MeOH) ؛ الأشعة فوق البنفسجية (MeOH)λالأعلى(سجلε) 237 (ش) (3.40) نانومتر ؛ IR (أنيق)νالأعلى3456 ، 2925 ، 1635 ، 1395 سم-1;1H-NMR (قرص مضغوط3التطوير التنظيمي ،4 0 0 ميغا هرتز) 0.88 (3 ساعات ، يوم ،J = 6. 8 هرتز ، سي إتش3-9), 0.98 (3H, d, J = 6. 8 هرتز ، سي إتش3-10), 1.84 (1H, m, H -4 أ) ، 2.02 (1H ، m ، H -4 ب) ، 2.09 (1H ، m ، H -5) ​​، 2.31 (1H ، hept ،J = 6. 8 هرتز ، ارتفاع -8) ، 2.50 (1H ، dddd ،J = 19. 2 ، 9.2 ، 4.8 ، 2.4 هرتز ، ارتفاع -6 أ) ، 2.70 (1H ، dddd ،J = 19. 2 ، 5.2 ، 5.2 ، 1.2 هرتز ، ارتفاع -6 ب) ، 6.32 (1 ساعة ، ي ي ،J = 2. 4 ، 1.2 هرتز ، H -2) ؛13C-NMR (قرص مضغوط3OD ، 100 ميغا هرتز)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C -6) ، 27.1 (C -8) ، 53.7 (C -5) ، 128.7 (C -2) ، 160.6 (C -1) ، 174.8 (C -7) ، 205.7 (C -3) ؛ HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− calcd لـ C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. حمض الستيراكسينوليك (5)

شراب عديم اللون الأشعة فوق البنفسجية (MeOH)λالأعلى(سجلε) 308 (2.89) ، 237 (ش) (3.37) ، 222 (ش) (3.70) نانومتر ؛IR (أنيق)νالأعلى3421 ، 2926 ، 1572 ، 1395 ، 1268 سم-1;1H-NMR (قرص مضغوط3OD ، 400 ميجا هرتز) 1.82 (2H ، tt ،J {0}. 0 ، 6.8 هرتز ، ارتفاع -8) ، 2.61 (2H ، t ،J {0}. 0 هرتز ، ارتفاع -7) ، 3.56 (2H ، t ،J = 6. 8 هرتز ، ارتفاع -9) ، 3.83 (3 ساعات ، ثانية ، OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2. 4 هرتز ، ارتفاع -4) ، 7.31 (1H ، د ،J = 2. 4 هرتز ، عالي -6) ؛13C-NMR (قرص مضغوط3التطوير التنظيمي ،100 ميغا هيرتز)δ 32.7 (C -7) ، 35.6 (C -8) ، 56.6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (ج -6) ، 131.9 (ج -5) ، 149.2 (ج -3) ، 150.7 (ج -2) ، 176.2 (ج -10) ؛ HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−calcd لـ C11H13O5, 225.0763).

2.5 فحص النشاط الحيوي المضاد للالتهابات

2.5.1. تحضير العدلات البشرية

أجريت الدراسة بموافقة مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى Chang Gung Memorial (رقم IRB 201800369A3). تم سحب عينات الدم من متبرعين بشريين أصحاء (من 20 إلى 30 عامًا) ، وتم عزل العدلات وتنقيتها وفقًا للبروتوكولات الموصوفة سابقًا [40]. 

2.5.2. جيل سوبيروكسيد أنيون

القياس استند اختبار قياس جيل الأنيون الفائق على الاختزال المثبط للـ SOD للفيريسيتوكروم.c كما هو موضح سابقًا [40].

2.5.3. مقايسة إصدار Elastase

تم تحديد تحلل الحبيبات اللازوردية عن طريق قياس إطلاق الإيلاستاز كما هو موصوف سابقًا [40]. 

2.5.4. التحليل الإحصائي يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). حساب 50٪ من التركيزات المثبطة (IC50) باستخدام برنامج PHARM / PCS v.4.2. تم إجراء مقارنات إحصائية بين المجموعات باستخدام الطالبt-امتحان. قيمp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. دراسة الالتحام الجزيئي

الفي السيليكوتم إجراء التقييم على برنامج AutoDock Vina [41]. تم تمييز التركيب البلوري لمستقبلات الجريلين [42] ، وأ. تم تنزيل ملف PDB من بنك بيانات البروتين (معرف PDB: 6KO5). تم إنشاء الهياكل ثلاثية الأبعاد للروابط في برنامج Chem3D. تم إجراء مكمل الهيدروجين وقياس شحنة Gasteiger لذرات البروتين واختيار الالتواءات المرنة للروابط بواسطة AutodockTools (ADT الإصدار 1.5.6). تم تصميم حجم الشبكة عند 18.5× 18.5 Å × 18.5 Å ومركز الشبكة بأبعاد (x ، y ، و z ، على التوالي): تم تحديد 9.7 ، –19.2 ، 14.6. تم توفير طاقة تقارب الربط كدرجات لرسو السفن وتظهر في كيلو كالوري / مول. تم اعتبار أفضل تفاعل فقط هو الوضع الحاصل على أعلى الدرجات. تم تحليل تصور أفضل تفاعلات الإرساء في عميل Biovia Discovery Studio 2020 [43].