الأنشطة المضادة للأكسدة والشيخوخة من الكولاجين المنتج الثانوي للخنازير المنتج المائي الجزء 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.2. تأثير الترشيح الفائق على خصائص تحلل الكولاجين

قد تكون عملية الترشيح الفائق طريقة مفيدة وصناعية مفيدة لإنتاج أجزاء صغيرة من الببتيد مع الحجم الجزيئي المطلوب والنشاط الحيوي المرتفع ، اعتمادًا على تركيبة التحلل المائي الأولي والنشاط الذي تتم دراسته [19]. يظهر الذوبان ، ومحتوى المجموعة الأمينية الحرة ، وعائد الميثان بعد التجميد (الجدول 1). كانت القابلية للذوبان ومحتوى المجموعة الأمينية الحرة لعنصر التحكم 11.95 في المائة و 0. 79 في المائة ، على التوالي. بعد التحلل الأنزيمي والترشيح الفائق بوزن جزيئي 3 كيلو دالتون ، لوحظت أعلى قابلية للذوبان (21.17 بالمائة) ومحتوى المجموعة الأمينية الحرة (14.17 بالمائة) في CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

يُعد متوسط ​​الوزن الجزيئي لتحلل البروتين عاملًا مهمًا في تحديد خصائصها البيولوجية [19]. بشكل عام ، متوسط ​​الكسر بالميغاواط<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 كيلو دالتون يمثل الكولاجين [20،21]. توزيع الوزن الجزيئي النسبي لعينة التحكم (عينة المعالجة) و CH-Alcalase و CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

يظهر تكوين الأحماض الأمينية في CHs (الجدول 2). يحتوي CHS بواسطة أنواع مختلفة من البروتياز على تركيبات مختلفة من الأحماض الأمينية وخصائص مضادة للأكسدة [23]. كان تكوين الأحماض الأمينية للكولاجين غنيًا بالجليسين (Gly) والبرولين (Pro) وحمض الجلوتاميك (Glu). محتوى الأحماض الأمينية في CHs (CH-Alcalase و CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">الجذع cistancheتم الإبلاغ عن أن هذه الأحماض الأمينية تعزز نشاط مضادات الأكسدة بسبب زيادة قابليتها للذوبان في الدهون أو عبر تفاعلات الجذور الحرة [1،24].

2.3 مضادات الأكسدة وأنشطة مكافحة الشيخوخة في الكولاجين المائي

تم قياس الأنشطة المضادة للأكسدة في CHs باستخدام 2،2'-and-bis - (3- ethylbenzothiazoline -6- حمض السلفونيك) (ABTS) مقايسة نشاط إزالة الجذور وتقليل اختبار القدرة. نشاط ABTS الكسح الجذري للتحكم (تعليق الكولاجين) ، CH-Alcalase ، و CH-Alcalase<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">استخراج الصلصا cistancheبشكل عام ، قد يتأثر نشاط مضادات الأكسدة للببتيدات بتسلسل الأحماض الأمينية ، وعدد الأحماض الأمينية الحرة الموجودة ، ودرجة التحلل المائي ، والوزن الجزيئي للببتيدات [26 ، 27]. على وجه الخصوص ، تمتلك التحلل المائي منخفض الوزن الجزيئي خصائص مضادة للأكسدة أقوى مقارنة بالمحللات عالية الوزن الجزيئي [2،26].

الشكل 5. الأنشطة المضادة للأكسدة لتحلل الكولاجين (CH) في 2،2'-and-bis - (3- ethylbenzothiazoline -6- حمض السلفونيك) (ABTS) الكسح الجذري (A) وتقليل الطاقة (B) المقاييس. تُظهر البيانات التي يُشار إليها بأحرف مختلفة (ac) فروق ذات دلالة إحصائية اعتمادًا على العلاجات المختلفة (ص<0.05).>فوائد cistanche tubulosa والآثار الجانبيةتُظهر البيانات المُشار إليها بأحرف مختلفة (AD) فروقًا ذات دلالة إحصائية اعتمادًا على التركيز (p <0. 05).

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

الصلاحيات المختزلة لعنصر التحكم ، CH-Alcalase ، و CH-Alcalase<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">استخراج cistanche tubulosaاقترحت ملاحظات مماثلة أن تحلل الكولاجين الخام قد يكون أكثر فعالية في تقليل الطاقة من ببتيدات الكولاجين فائقة الترشيح [30].

تم استخدام تثبيط نشاط التيروزيناز ، والكولاجيناز ، والإيلاستاز للتحقق من تأثيرها في مقاومة الشيخوخة في المختبر [20]. نتائج تثبيط نشاط التيروزيناز والكولاجيناز والإيلاستاز للتحكم و CH-Alcalase و CH-Alcalase<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>الإيلاستاز (لا يوجد نشاط). CH- الكالاز<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>الإيلاستاز (لا يوجد نشاط). أشارت اتجاهات مماثلة تم الإبلاغ عنها في دراسة أخرى إلى أن تحلل الكولاجين أظهر إمكانية العمل كعوامل مضادة للشيخوخة ومثبطات كولاجيناز [20].

3. المواد والطرق

3.1. المعالجة المسبقة لجلد الخنزير

تم شراء جلد الخنزير من مورد محلي (سيول ، كوريا) ، وتمت إزالة جميع الدهون والأنسجة الضامة المرئية من جلد الخنزير باستخدام شفرة حلاقة. تم الحصول على جلد الخنزير المستخدم في هذه الدراسة من خنزير واحد لتقليل الاختلاف البيولوجي. تم غسل جلد الخنزير المشذب بالماء عند 90 درجة لمدة دقيقة واحدة أربع مرات لإزالة الدهون والمواد المتبقية. تم بعد ذلك تقطيع الجلد إلى أقسام مربعة 1 سم وسحقها في الماء المقطر لمدة 3 دقائق باستخدام خلاط ذو أربعة أجنحة (CNHR -26 ، Bosch ، هونج كونج ، الصين). تم تجانس جلد الخنازير المسحوق بسرعة عالية (25 ، 000 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق باستخدام Ultra Turrax (T25 ، IKA Labotechnik ، Staufen ، ألمانيا). تم تعبئة ما يقرب من 100 جرام من خليط جلد الخنزير (50 بالمائة محتويات صلبة نهائية) بالتفريغ وتجميد عند درجة -20 وتخزينها للاستخدام خلال شهر واحد.

3.2 البروتياز والكواشف التجارية

تم شراء Alcalase و Flavorzyme و Neutrase و Protamex من Novozymes (Bagsvaerd ، الدنمارك). تم شراء Bromelain و Papain من Daesong Sangsa (سيول ، كوريا). تم شراء جميع المواد الكيميائية الخاصة باختبارات مضادات الأكسدة ومقاومة الشيخوخة من شركة Sigma-Aldrich Chemical Company (سانت لويس ، إم إس ، الولايات المتحدة الأمريكية). جميع الكواشف والمذيبات الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة كانت من الدرجة التحليلية.

3.3 إنزيم التحلل

تم تطوير التحلل المائي الأنزيمي للأنزيمات التجارية الخاصة بالطعام المستخدمة (بناءً على توصيات الشركة المصنعة ، الجدول 4). تم تخفيف خليط جلد الخنزير المحضر بالماء المقطر إلى محتوى صلب نهائي بنسبة 5 بالمائة. تم اختيار هذا التركيز لضمان سلوك التدفق بسبب لزوجته المنخفضة. تم تسمية خليط جلد الخنازير بنسبة 5 في المائة بتعليق الكولاجين (أو التحكم). تم تحلل معلق الكولاجين في مفاعلات باستخدام ستة إنزيمات تجارية من الدرجة الغذائية بمعدل إنزيم: ركيزة 1: 1 0 0. تم سحب عينات عينات (5 مل) عند 1 و 3 و 6 و 12 و 24 ساعة من التحلل المائي وتم تسخينها على الفور عند 100 درجة لمدة 10 دقائق لتعطيل الإنزيم ، متبوعًا بالتبريد إلى درجة 0 باستخدام الماء المثلج. خلال وقت أخذ العينات ، تم التحكم في الرقم الهيدروجيني باستخدام 1 مولار هيدروكسيد الصوديوم حسب الاقتضاء. بعد التبريد ، تم طرد العينات عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة ، وتم جمع المادة الطافية (تحلل الكولاجين ؛ CH). تم تركيز CH بشكل أكبر عن طريق الترشيح الفائق ، باستخدام نظام AmiconStirred Cells (رقم الكتالوج UFSC 20001 ، EMD Millipore Corporation ، Burlington ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع قطع وزن جزيئي 3 كيلو دالتون (MWCO) (UltracelMembrane ، EMD Millipore Corporation ، Burlington ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 60 رطل لكل بوصة مربعة من غاز النيتروجين ، عند 20 درجة.استعراض cistanche tubulosaتم تجفيف الميثان المحضر بالتجميد وحفظه في حاويات محكمة الغلق عند درجة 20 حتى التحليل.

3.4. تحديد الأس الهيدروجيني واستعادة البروتين ومحتوى المجموعة الأمينية الخالية من الذوبان وعائد الإنتاج تم تحديد الرقم الهيدروجيني للعينات (التحكم و CHs) باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني (الطراز S220 ، Mettler Toledo GmbH ، كولومبوس ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد استعادة البروتين أو قابليته للذوبان من خلال تقدير محتوى البروتين باستخدام مقايسة بروتين حمض البيسينشونينيك (BCA) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MS ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع ألبومين المصل كمعيار. تم تحديد محتوى المجموعة الأمينية المجانية عبر مقايسة 2،4 ، 6- حمض السلفونيك ثلاثي نيتروبنزين (TNBSA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام L-leucine كمعيار. تم قياس كل من الأوزان الرطبة والجافة لحساب مجال الإنتاج.

3.5 توزيع الوزن الجزيئي

3.5.1. الرحلان الكهربائي جل دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE)

تم قياس أنماط SDS-PAGE للعينات (التحكم و CHs) وفقًا لطريقة تم الإبلاغ عنها مسبقًا [1 0]. تم تخفيف العينات باستخدام 8 ميكرولتر من اليوريا (تركيز البروتين النهائي ، 4 مجم / مل). تم خلط كل عينة بجزء واحد من المخزن المؤقت لعينة KTG 020 (10 بالمائة من الجلسرين ، 2 بالمائة من SDS ، 0.003 بالمائة من البروموفينول الأزرق ، 5 بالمائة من مركابتو إيثانول ، و 63 ملي مولار Tris-HCl ، pH6.8) من KOMA Biotech Inc . ، （سيول ، كوريا） ، ويغلى لمدة دقيقتين. تم تحميل خليط العينة （20 ميكرولتر） في EzWayTM PAG بنسبة 6 في المائة من المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد (KOMA Biotech Inc. ، سيول ، كوريا). بعد الرحلان الكهربائي ، تم إصلاح الجل وصبغه وإزالة البقع. تم تحديد الأوزان الجزيئية باستخدام معايير الوزن الجزيئي واسعة النطاق بين 10 و 210 كيلو دالتون.

3.5.2. كروماتوغرافيا تغلغل الجل (GPC)

تم تحديد توزيع الوزن الجزيئي للعينات وفقًا لطريقة تم الإبلاغ عنها مسبقًا [3]. تم إجراء كروماتوغرافيا تغلغل الهلام (GPC) باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل عالي الأداء YL91 0 0 (YL9100 ، Youngling Instrument Co. ، Ltd ، Gyeonggi-do ، كوريا) مجهزًا بثلاثة أعمدة Ultrahydrogel TM 120 ( 7.8 × 3000 مم) من ووترز (ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). كان الطور المتحرك عبارة عن ماء مقطر / منزوع الأيونات بمعدل تدفق قدره 1.0 مل / دقيقة ، وتمت مراقبة توزيعات الوزن الجزيئي لببتيدات الكولاجين باستخدام كاشف معامل الانكسار YL 9100 عند 40 درجة. كانت مجموعة معايير الوزن الجزيئي (106-67 ، 500 Da ، Polymer Standards Service ، Mainz ، Germany) بمثابة المعيار.

3.6.Amin 0 التركيب الحمضي

تم تحليل تركيبة الأحماض الأمينية للعينات من خلال الاشتقاق باستخدام {0}} فلورينيل إيثوكسي كربونيل (FMOC) - كلوريد و o-phthalic dialdehyde (OPA) على نظام Ultimate 3 0 00 HPLC ( Dionex ، Idstein ، ألمانيا) مزودًا بجهازي كشف (كاشف الفلورة وكاشف الأشعة فوق البنفسجية） و VDSpher 100 C 18- E （4.6 مم × 150 مم ، 3.5 ميكرومتر حجم الجسيمات ، VDS Optilab ، برلين ، ألمانيا). كان حجم الحقن 1.0 لتر ، وتتكون الطور المتحرك من شطفين: 40 ملي مولار من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (الرقم الهيدروجيني 7) و 45 بالمائة (o / v) أسيتونيتريل / 45 بالمائة (حجم / حجم) محلول ميثانول. من خلال توصيل كاشف الأشعة فوق البنفسجية وكاشف التألق ، تم اكتشاف الأشعة فوق البنفسجية عند 338 نانومتر ، وتم اكتشاف مشتق OPA عند 450 نانومتر من طول موجة الانبعاث و 340 نانومتر من الطول الموجي للإثارة ، وتم اكتشاف مشتق FMOC عند 305 نانومتر من الطول الموجي الانبعاث و 266 نانومتر لطول موجة الإثارة. تم استخدام مزيج من الأحماض الأمينية (1.0 نانومول مل لكل حمض أميني) للمعايرة.

حيث كان حمض الأتوتالامين هو المحتوى بعد التحلل المائي باستخدام 6 مولار هيدروكلورايد (عند 130 درجة لمدة 24 ساعة) ، وكان الحمض الأميني أفري هو المحتوى بعد الذوبان في الماء المقطر.

3.7 تقييم نشاط مضادات الأكسدة

3.7.1.2،2'-Azino-bis - (3- ethylbenzothiazoline -6- حمض السلفونيك) (ABTS) نشاط الكسح الجذري

تم قياس نشاط الكسح الجذري لـ ABTS لـ CH وفقًا لطريقة تم الإبلاغ عنها مسبقًا [2 0]. تم إنشاء الكاتيون ABTS التقليدي عن طريق خلط محلول مخزون ABTS (7. 0 ملي مولار) مع بيرسلفات البوتاسيوم (2.45 ملي مولار) واحتضان الخليط الناتج في الظلام عند درجة حرارة الغرفة طوال الليل. تم تخفيف المحلول الجذري ABTS بمقدار 5. 0 ملي مولار من محلول الفوسفات المخزن مؤقتًا (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى مستوى امتصاص 0. 70 ± 0.02 عند 734 نانومتر. تم خلط 1 مل من محلول ABTS الجذري المخفف مع 1 مل من كل عينة. بعد عشر دقائق ، تم قياس امتصاص العينة (عينة ، مع عينة) والتحكم (عنصر تحكم بدون عينة) عند 734 نانومتر. تم حساب نشاط الكسح الجذري ABTS (نسبة مئوية) على النحو التالي:

3.7.2. تخفيض القوة

تم قياس القدرة المختزلة لـ CH وفقًا لطريقة تم الإبلاغ عنها مسبقًا [2 0]. تم خلط 1 مل من كل عينة مع 1 مل من محلول فوسفات 2 M (pH6.6) و 1 مل من 1 بالمائة فيريسيانيد البوتاسيوم. تم تحضين الخليط عند 5 0 درجة لمدة 20 دقيقة ، ثم تمت إضافة 1 مل من 10٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. تم خلط قسمة مقدارها 2 مل من خليط الحضانة هذا مع 2 مل من الماء المقطر و 0.4 مل من 0.1 بالمائة من كلوريد الحديديك. بعد 10 دقائق ، تم قياس امتصاص المحلول الناتج عند 700 نانومتر على مقياس طيف ضوئي (OPTIZEN ، Mecasys Co. ، Daejeon ، كوريا) تم اعتبار الامتصاص المتزايد (عند 700 نانومتر) لخليط التفاعل للإشارة إلى زيادة القدرة على الاختزال.

3.8 تقييم تأثير مكافحة الشيخوخة

3.8.1. تثبيط نشاط التيروزيناز

تم تحديد تثبيط التيروزيناز بالطريقة الموصوفة سابقًا [2 0]. محلول خلط مسبق يحتوي على 70 ميكرولتر من محلول فوسفات 0.1 M （pH6.8） ، 30uLof فطر tyrosinase （167U / mL ؛ Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تحضين 20 لترًا من العينة لمدة 5 دقائق عند 30 درجة. تمت إضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر من 3 ، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل- L- ألانين （L-DOPA） لبدء التفاعل الأنزيمي. تم قياس الامتصاصية عند 492 نانومتر لمدة 20 دقيقة لمراقبة تكوين L-DOPA. عمل حمض الأسكوربيك (1 مجم / مل) كعنصر تحكم إيجابي ، والذي تم استخدامه للمقارنة. تم حساب نسبة التثبيط على النحو التالي:

حيث كان A خليطًا مع tyrosinase بدون عينة ؛ كان B خليطًا بدون عينة وتيروزيناز ؛ كان C عبارة عن خليط مع عينة و tyrosinase ، و D كان خليطًا مع عينة ولكن بدون tyrosinase.

3.8.2. تثبيط نشاط الكولاجيناز

تم تحديد تثبيط إنزيم كولاجيناز بطريقة موصوفة سابقًا [2 0]. باختصار ، تم تحضير 5 0 محلول تريسين (pH7.5) يحتوي على 1 0 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم و 400 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. ثم ، 50 مل من a 1.0 ملي مولار - [3- (2- فيوريل) أكريلويل]-لو-غلي-برو-ألا محلول و 0.2 مجم / مل كولاجيناز (من Clostridium histolyticum ، النوع IA ، 0. { {19}} تمت إضافة FALGPA U / mg صلب ؛ Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) في وجود وغياب العينات. تم إيقاف التفاعل بإضافة حامض الستريك (6 بالمائة). تم فصل خليط التفاعل بإضافة أسيتات إيثيل. تم قياس امتصاص المادة الطافية عند 345 نانومتر. استخدم حمض الأسكوربيك (1 مجم / مل) كعنصر تحكم إيجابي واستخدم للمقارنة. تم حساب نسبة التثبيط على النحو التالي:

حيث كان A عبارة عن خليط مع كولاجيناز بدون عينة ؛ كان B خليطًا بدون عينة وكولاجيناز ؛ كان C عبارة عن خليط مع عينة وكولاجيناز ، وكان D خليطًا مع عينة ولكن بدون كولاجيناز.

3.8.3. منع نشاط Elastase

تم تحديد تثبيط Elastase بالطريقة الموصوفة سابقًا [2 0]. تم استخدام N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) كركيزة ، وتمت مراقبة إطلاق p-nitroaniline لمدة 2 {{2 0}} دقيقة عند 25 درجة تم إذابة جزء (1 ميكروغرام) من النوع الرابع من الإيلاستاز البنكرياس الخنازير (PPE) في 1 مل من 0. 2 M Tris-HCl عازلة (الرقم الهيدروجيني 8. 0). احتوى خليط التفاعل على 0.2 مولار من محلول تريس- حمض الهيدروكلوريك (pH8.0) ، و 1 جزء في المليون من معدات الوقاية الشخصية ، و 0.8 ملي مولار من Suc-Ala-Ala-Ala-pNA ، والعينة ، والركيزة المذكورة أعلاه. تم قياس الامتصاصية عند 214 نانومتر. استخدم حمض الأسكوربيك (1 مجم / مل) كعنصر تحكم إيجابي يستخدم للمقارنة. تم حساب نسبة التثبيط على النحو التالي:

حيث كان A عبارة عن خليط مع الإيلاستاز وبدون عينة ؛ كان B خليطًا بدون عينة والإيلاستاز ؛ كان C عبارة عن خليط مع عينة وإيلاستاز ، وكان D خليطًا مع عينة ولكن بدون إيلاستاز.

3.9 التحليل الإحصائي

يتم تقديم البيانات على أنها المتوسط ​​± الانحراف المعياري (SD). تم تقييم أهمية الاختلافات بين المجموعات باستخدام مقارنات متعددة وتحليل التباين (ANOVA) ، متبوعًا باختبار Tukey الصادق للفرق الكبير (HSD). الاختلافات مع قيم p أقل من 0. 05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية.

4 - نتائج

في هذه الدراسة ، تم إنتاج تحلل الكولاجين ، وهو مكون غذائي وظيفي ، بنجاح من خلال التحلل المائي الأنزيمي ، متبوعًا بالترشيح الفائق والتنقية. تم اختبار البروتياز التجارية المختلفة لفائدتها المحتملة في تصنيع تحلل الكولاجين المناسب. كان CHS المتحلل بالماء بواسطة Alcalase هو الميثان الأكثر فعالية في التحلل المائي ، وكان الترشيح الفائق الذي يتبعه التنقية فعالاً في توليد الببتيدات النشطة ذات الأوزان الجزيئية المنخفضة. أظهرت النتائج أن الميثانول أظهرت نشاطًا ممتازًا في مضادات الأكسدة وتثبيط الكولاجيناز. لذلك ، يمكن استخدام الميثانينات التي تم الحصول عليها من خلال هذه الدراسة في الصناعات الغذائية أو مستحضرات التجميل أو الأدوية كمادة مضافة طبيعية ، تمتلك خصائص مضادة للأكسدة ومضادة للشيخوخة. قد تكون الدراسات الإضافية التي تتضمن تقييمًا في الجسم الحي لأنشطة الشيخوخة للببتيدات النشطة في جلد الإنسان مفيدة.

تم استخراج هذه المقالة من Molecules 2019 ، 24 ، 1104 ؛ دوى: 10.3390 / جزيئات 24061104 www.mdpi.com/journal/molecules