مضادات الأكسدة أكسيد الجرافين Nanoribbon كعامل تبييض جديد يمنع آلية تكوين الميلانين

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

هسين يو تشو ، هوي مين ديفيد وانج ،* Chia-Heng Kuo و Pei-Hsuan Lu و Lin Wang و Wenyi Kang و Chia-Liang Sun*

نبذة مختصرة:في عملية تصنيع الميلانين ، تلعب التفاعلات المؤكسدة دورًا أساسيًا ، وهي استراتيجية جيدة لتثبيط إنتاج الميلانين عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي. تم اعتبار الفوليرين ومشتقاته ، أو المجمعات ، على أنها كاسحات قوية للجذور الحرة ، وقمنا كذلك بتطبيق مركبات الكربون النانوية sp2 متعددة الطبقات لاكتشافالميلانينآليات تثبيط التوليف. في هذه الدراسة ، استخدمنا مواد نانوية جديدة ، مثل الأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران (MWCNTs) ، و MWCNTs من النوع القصير ، وأكسيد الجرافين النانوي (GONRs) ، و GONRs من النوع القصير ، كعوامل مضادة للأكسدة لتنظيم إنتاج الميلانين. أظهرت النتائج أن GONRs لديها قدرات مضادة للأكسدة أفضل في منصات تحليل الإجهاد التأكسدي داخل الخلايا وخارجها من غيرها. اقترحنا أن تحتوي GONRs على مجموعات وظيفية تحتوي على الأكسجين. في اختبار ثنائي كلورو ثنائي كلورو فلورسين ثنائي كلورو فلورسين ثنائي الأسيتات ، اكتشفنا أن GONR يمكن أن يخلّب أيونات المعادن لكبح أنواع الأكسجين التفاعلية. في وجهة نظر البصيرة الجزيئية ، لاحظنا أن هذه المواد النانوية قللت من تنظيم تخليق الميلانين عن طريق تقليل التعبيرات الجينية المرتبطة بعامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم ، وكانت هناك عواقب مماثلة في تعبيرات البروتين. باختصار ، GONRs هي عامل محتمل كمضاد للأكسدة ومواد تجميل مبيضة للبشرة.

Cistanche هو أيضاعامل محتمل كروايةمضادات الأكسدةوتبييض البشرةمواد التجميل.

1 المقدمة

الجلد هو العضو الذي يغطي السطح الخارجي لجسم الإنسان. نظرًا لأن الواجهة تلامس البيئة ، تلعب طبقة الجلد دورًا مهمًا في حماية الجسم من مسببات الأمراض ، وتجنب فقدان الماء الزائد ، وتنظيم درجة حرارة الجسم ، وما إلى ذلك. تنمو الخلايا الصباغية في الغشاء القاعدي لبشرة الجلد وتمثل 5 إلى 10 في المائة من المحتوى الخلوي. وقد تم تصنيفها على أنها "غدد" أحادية الخلية لها تشعبات رقيقة وطويلة تشبه اللافتات وتشعبات. تتحرك الخلايا الصباغية عبر خلايا البشرة في جوارها المباشر ، مكونة كوكبة من خلايا البشرة حول كل خلية صباغية. هناك العديد من الأسباب الداخلية والخارجية لشيخوخة الجلد ، وأحد هذه العوامل هو الأشعة فوق البنفسجية من أشعة الشمس .1 أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، تزداد مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الجلد بشكل كبير ، وهو ما يُعرف باسم الإجهاد التأكسدي. تعمل العديد من عوامل السمية البيئية أيضًا على تعزيز الإجهاد التأكسدي للجلد ، مثل المبيدات الحشرية ورابع كلوريد الكربون والمعادن الثقيلة والأمينات العطرية والجسيمات 2.5 (PM2.5) .2 في الآلية الكيميائية الحيوية ، يتم إنشاء المؤكسدات داخل الخلايا من غير- النظام الأنزيمي ، وتحويلها إلى ROS لتحريك مسار تكون الميلانين

بالإضافة إلى ROS ، هناك العديد من العوامل التي تؤثرإنتاج الميلانين، بما في ذلك التعبير الجيني ، والالتهاب ، وتغيرات الغدد الصماء ، وامتصاص الصباغ .1 في الخطوات الأولى لإنتاج الميلانين ، يلعب التيروزيناز دورًا في تحفيز التيروزين إلى الفينوميلانين والإيوميلانين. تتشابه آليتا تصنيع الأصباغ ، والتي تشمل L- التيروزين هيدروكسيل إلى 3 ، 4- ثنائي هيدروكسي-إل-فينيل ألانين (L- DOPA) وأكسدة L-DOPA للدوباكوينون. في الخطوة التالية ، يتأكسد الدوبامين بواسطة البروتين 1 المرتبط بالتيروزيناز (TRP -1) والبروتين المرتبط بالتيروزيناز 2 (TRP -2) في الميلانوسوم ، والذي ينظمه عامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم ( MITF) لتشكيل الميلانين. أخيرًا ، ينضج الميلانين ويترسب داخل الطبقة القرنية 4.5 ، تخترق هذه الخلايا الكيراتينية المجاورة للطبقة القاعدية وتحمي حمضها النووي من أي طفرات أو تعديلات ناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية. يتم نقل الميلانين الناضج داخل الميلانوسومات إلى الخلايا الكيراتينية ويؤدي في النهاية إلى تصبغ طويل الأمد. تسبب النمش والنمش والبقع البنية / السوداء مشاكل اجتماعية عند الرجال والنساء في بعض الأحيان. يعد منع الإجهاد التأكسدي أو قمع نشاط التيروزيناز أحد الاستراتيجيات لتقليل تنظيم متلازمة فرط التصبغ والاضطرابات الجلدية. تعمل مضادات الأكسدة على علاج فرط التصبغ الناتج عن أنواع الأكسجين التفاعلية والضرر الخلوي.

الفوليرين (C60) ، الأنابيب النانوية الكربونية (CNT) ، الجرافين ، الجرافين النانوريبون (GNR) هي أربعة أنواع من الكربون النانوي sp2 الذي تم بحثه على نطاق واسع حول العالم.الزبالون الجذور الحرةلفترة طويلة. يود وآخرون. يستخدم C60 القابل للذوبان في الماء كعامل وقائي ضد التنكس الناجم عن الإجهاد التقويضي. حقن وآخرون خلص إلى أن C60 (OH) 24 هو مركب قوي مضاد للأكسدة عندما يكون الإجهاد التأكسدي مرتفعًا جدًا. أوكودا وآخرون اقترح أن مجمعات C60 يمكن أن تمنع إصابة الخلية NO بوساطة .13،14 Tong et al. أظهر أن مركبات C60 قد تكون مرشحة واعدة لعلاج الأمراض المرتبطة بالدماغ الناتجة عن زيادة مستويات الأكسيد الفائق. في الواقع ، حددت شركة يابانية الفوليرينات ذات النشاط المضاد للأكسدة القوي للاستخدام في مستحضرات التجميل في عام 2006. Lucente- Schultz et al. أظهر أن قدرة الكسح الجذري للأكسجين للأنابيب النانوية الكربونية أحادية الجدار الوظيفية (SWCNTs) أكبر بنحو 40 مرة من قدرة C60.15 - 19 شجيري Fenoglio et al. لاحظ أن الأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران (MWCNTs) تمتلك قدرة ملحوظة على الكسح الجذري عند ملامستها لمصدر خارجي لجذور الهيدروكسيل أو الأكسيد الفائق. كشفت حسابات نظرية الكثافة الوظيفية أيضًا عن نموذج من الأنابيب النانوية الكربونية المعلقة على أنها كاسحات للجذور الحرة. في عام 2004 ، نوفوسيلوف وآخرون. أظهر أولاً أن الجرافين أظهر تأثيرًا كهربائيًا قويًا ثنائي القطب ويمكن أن يكون واعدًا للتطبيقات الإلكترونية .21 بعد ذلك ، استمروا في إظهار أن الجرافين له خصائص إلكترونية مميزة لغاز ثنائي الأبعاد من الجسيمات الموصوفة في معادلة ديراك. هاتان الورقتان الرائدتان ، تم إيلاء المزيد والمزيد من الاهتمام للبحوث القائمة على الجرافين .24-30 على سبيل المثال ، Qiu et al. أظهر في عام 2014 أن أكسيد الجرافين وقليل من طبقات الجرافين يظهران نشاطًا كبيرًا مضادًا للأكسدة ويمكنهما حماية جزيئات جزيئية حيوية مختلفة من الأكسدة .31 Han et al. أثبت تجريبياً في عام 2007 أنه يمكن التحكم في فجوة الطاقة في GNRs أثناء عملية الطباعة الحجرية عن طريق تغيير عرض الشريط .32 من بين الكربونات النانوية الأربعة ، حظيت GNRs بأقل قدر من الاهتمام. على حد علمنا ، هناك القليل من الأبحاث حول الخصائص المضادة للأكسدة لأكسيد الجرافين النانوية (GONRs). وبالتالي ، في هذه الدراسة ، قمنا بإعداد MWCNTs ، و MWCNTs القصيرة ، و GONRs ، و GONRs القصيرة وتهدف إلى مقارنة خصائصها المضادة للأكسدة و النتائج ذات الصلة بشكل منهجي.

2. النتائج والمناقشة

2.1. مورفولوجيا MWCNTs و GONRs.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >1 0 ميكرومتر إلى 2−3 ميكرومتر. في الوقت نفسه ، لوحظ أن معالجة حامض النيتريك تخفف أسطح الأنابيب الملساء. يتم عرض بعض الشقوق والأشكال غير المنتظمة في الصورة عالية التكبير. علاوة على ذلك ، فإن استخدام MWCNTs و MWCNTs القصيرة من خلال تفاعلات الميكروويف يحصل على GONR و GONR القصير ، على التوالي. قمنا أيضًا بتوضيح الصور TEM ذات التكبير المنخفض والعالي لـ GONR و GONR القصير. نظرًا للفك الطولي الكبير والقطع الأفقي الطفيف ، يبدو أن GONRs كانت أقصر من MWCNTs. من ناحية أخرى ، أظهرت الصور عالية التكبير أقطارًا أكبر ، أي 0. 11−0.18 ميكرومتر ، من GONRs من تلك الخاصة بـ MWCNTs ، مما يشير إلى أن عملية فك الضغط كانت ناجحة. وبالمثل ، أظهرت GONRs القصيرة طولًا أقصر وقطرًا أكبر من MWCNTs القصيرة. في ضاغط الهواء لعملية فك الضغط الجديدة ، كانت الهياكل ذات الطبقات الرقيقة لـ GONRs أقل مما حصلنا عليه في التقرير الأول لنفس قوة الميكروويف البالغة 250 واط مع الحفاظ على MWCNTs المركزية الأكثر سمكًا. / من المرجح أن تظهر بنية GONR غير المتجانسة بدلاً من بنية النانوريبون غير المضغوطة بالكامل من خلال جميع قوى الميكروويف في العملية الجديدة. للمقارنة مع GONR القصير في دراساتنا السابقة 34 ، ولّدت طاقة الميكروويف الأعلى المزيد من الشقوق على جانب الشرائط ولم تشكل حواف شريطية لطيفة وناعمة. لاحظ أننا استخدمنا نوعين مختلفين من شبكات النحاس في الشكل 1 أ. بالنسبة إلى MWCNTs و GONRs بطول كافٍ ، تم استخدام شبكة Gu ذات شكل لاسي مع الكربون (المنتج رقم 01881- F ، Ted Pella ، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية). حالت الثقوب المفتوحة في فيلم الكربون اللاسي دون ظهور صورة انتقال متداخلة بين الكربونات النانوية وطبقة الكربون. تنتمي الشبكات الرمادية الداكنة إلى فيلم الكربون لاسي. ومع ذلك ، فإن شبكة Gu ذات الشكل المستقر مع الكربون (المنتج رقم 01800- F ، Ted Pella ، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية) كانت مطلوبة من أجل MWCNT القصير و GONR القصير. كان هذا لأن الثقوب الكبيرة في فيلم الكربون لاسي تسببت في مشاكل في حمل MWCNT القصير و GONR القصير بكفاءة. كما هو موضح في الشكل 1 ، فإن التباين الرمادي الفاتح أسفل MWCNTs القصير و GONRs القصير عبارة عن طبقة خفيفة من الكربون. هذه الطبقة الكربونية استقرت في فيلم فورفار المعرض لحزمة الإلكترون من خلال خواصه الحرارية والتوصيل الكهربائي.

2.2. تكوينات الترابط من MWCNTs و GONRs.

يتم عرض أطياف رامان لأربعة كربونات النانو في الشكل 1 ب ؛ كان النطاق D لـ GONRs أعلى من نطاق MWCNTs بعد عملية فك الضغط. يعزى ذلك إلى ارتفاع مستوى الأكسدة وزيادة عدد الهياكل الحواف لـ GONR مقارنة بـ MWCNTs. تشبه هذه الظاهرة أيضًا ما لاحظناه في 2 0 11.12 نظرًا لارتفاع مستوى الرسم البياني ، كان للنطاق G من MWCNTs أقل عدد للعرض الكامل بنصف الحد الأقصى. كانت نسب المعرف / IG لأربعة مركبات كربونية نانوية {{1 0}. 0 76 و 0. 502 و 0.483 و 0.700 على التوالي. باختصار ، أدى انخفاض الطول وأكسدة السطح إلى زيادة مستوى الخلل وبالتالي جعل نسب ID / IG أعلى. توجد ذروة D ′ في جميع الرسوم البيانية المعيبة ويُنظر إليها على أنها مقياس للجودة .35 كما هو موضح في الشكل 1 ب ، تصبح قمم D في الأطياف الأربعة أكثر وضوحًا بعد عملية القطع أو فك الضغط ، مما يشير إلى أنها مدمرة. العمليات التي تحدث العديد من العيوب. يعرض الشكل 1 ج ، د أطياف التحليل الطيفي للأشعة السينية للأشعة السينية للكربون النانوي الأربعة. على ما يبدو ، فإن قمة D ′ هي الأوضح بالنسبة لـ GONRs القصيرة. كما هو مبين في الشكل 1 ج ، ارتفع مستوى O بشكل ملحوظ من 7.6 بالمائة (MWCNTs) إلى 19.9 بالمائة (GONRs) بسبب قدرة الأكسدة القوية لـ KMnO4 في بيئة حمضية. من ناحية أخرى ، ارتفع مستوى O بشكل طفيف بنسبة 0.8 في المائة من MWCNT إلى MWCNTs القصير. الأهم من ذلك ، أن أعلى مستوى O هو 38.3 في المائة لـ GONR القصير ، مما يعني أن نهايات النانوريبون سيكون من الأسهل ربط مجموعات وظيفية أكسجين من أسطح sp2 المستوية. يوضح الشكل 1 د الرقم الأقصى للعرض الكامل عند النصف والتحول إلى طاقة ربط عالية لقمم C 1s بعد عملية فك الضغط لكل من MWCNTs و MWCNTs القصيرة. بالنسبة لأكاسيد الجرافين ، يمكن تعيين القمم المفكوكة في جانب طاقة الارتباط العالي إلى روابط C-C (CC) و C O و CO و COOH .36 لقد ميزنا GONR (200 W) في 2013 ، 37 وكانت النتائج مماثلة لنتائج هذه الدراسة. خلصت هذه الدراسة إلى ظاهرة أطياف رامان ، مما يعني أنه تم إنشاء المزيد من المجموعات الوظيفية المحتوية على الأكسجين أثناء التحول من الأنبوب إلى الشريط (الشكل 2).

2.3 الخصائص المضادة للأكسدة لـ MWCNTs و GONRs.

2.3.1. تحديد 1 ، 1- Diphenyl -2- picrylhy- drazyl Free Radical Scavenger Activity Assays.

1 ، 1- Diphenyl -2- picrylhydrazyl (DPPH) هو عبارة عن منصة مضادة للأكسدة تستخدم لاكتشاف القدرة المضادة للأكسدة ؛ تم وصف نتائج الكربونات النانوية الأربعة في الجدول 2. في مقايسة DPPH ، تم استخدام فيتامين C بتركيز 1 0 0 ميكرومتر كعنصر تحكم إيجابي. لاختبار الأنشطة المضادة للأكسدة لـ MWCNTs ، و MWCNTs القصيرة ، و GONRs ، و GONRs القصيرة ، تم تحضين جرعات 1 و 5 و 1 0 مجم / لتر في محلول التفاعل لقياس الخصائص. كانت MWCNTs ، و MWCNTs القصيرة ، و GONRs ، و GONRs القصيرة تتمتع بقدرات تثبيط معتدلة عند 1 0 ملغم / لتر (19.2 ± 0. 3 ، 12.1 ± 0. 3 ، 26.8 ± 0.3 ، و 30.0 ± 0.4 بالمائة) ، في حين أن فيتامين C كان له حالة مماثلة عند 100 ميكرومتر (93.4 ± 0.1 بالمائة) للقمع.

2.3.2. فحص نشاط الأيونات المخلبية.

في حالة الإجهاد التأكسدي ، يمكن للفيروزين تطوير مركب يحتوي على Fe2 plus ليتم قياسه كميًا. في وجود وسطاء مخلبين ، ينكسر المركب ، مما يتسبب في اختزال الأيونات الحديدية من اللون الأحمر الداكن لمركب Fe2 plus. استخدمنا EDTA كعنصر تحكم إيجابي. يوضح الجدول 2 أن MWCNTs و MWCNTs القصيرة و GONRs و GONRs القصيرة كان لها نشاط مخلب عند 1 0 مجم / لتر (29.2 ± {{1 {14}}}} .8 ، 28.7 ± 0 .7 و 69.7 ± 0. 6 و 68.9 ± 0.3 بالمائة) ، بينما التحكم الإيجابي كان له نفس الحالة عند 100 ميكرومتر (93.4 ± 0.1 بالمائة).

2.3.3. قياس الطاقة المضادة للأكسدة الحديديك.

المقايسة المحتملة لخفض الحديديك هي اختبار بسيط وموثوق يستخدم لتحديد تخليق مركب Fe (III) −ferricyanide. في هذا الاختبار ، تم الكشف عن القوة المختزلة للكربونات النانوية الأربعة المنتجة لمركب الحديد (III) −TPTZ من خلال التغيرات في لون المحلول من الأصفر إلى الأخضر والأزرق. يوضح الجدول 2 أن قوى الاختزال لـ MWCNT و MWCNT القصير و GONR و GONR القصير كانت الكثافة البصرية (OD) 1.11 و 1.13 و 1.15 و 1.11 عند 10 مجم / لتر.

2.3.4. تمنع MWCNTs و GONRs تراكم ROS داخل الخلايا.

أظهرت العديد من التقارير أن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تدمر السلامة الهيكلية لأغشية الخلايا ، بما في ذلك أغشية الخلايا والأغشية النووية مما يؤدي إلى تلف الخلايا وفقدان الوظيفة الطبيعية. الميلانين ، وتثبيط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية هو استراتيجية جيدة لخفض إنتاج الميلانين. في هذه الدراسة ، استخدمنا مقايسة تلطيخ 2 ′ ، 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) لتحليل مستوى الإجهاد التأكسدي داخل الخلايا في خلايا العلاج MWCNT و GONR. تسبب Phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA) في تحفيز مؤكسد في مجموعات MWCNT و GONR واستخدم كعنصر تحكم سلبي .41 عندما كان تركيز PMA 20 نانوغرام / مل ، تسبب في الإجهاد التأكسدي ، وزيادة القيمة إلى 38 في المائة ؛ بعد معالجة GONRs و MWCNTs ، تم تخفيض مستويات ROS إلى المستوى الطبيعي. أظهرت البيانات أن كلا المادتين تثبط مستويات الإجهاد التأكسدي ، وكان التأثير المضاد للأكسدة لـ GONRs أعلى من تأثير MWCNTs (الشكل 3). يوضح الجدول 1 قائمة نتائج مماثلة. أكدنا أن هناك ثلاثة أسباب للنتائج الجديدة التي توصلنا إليها: أولاً ، كان ترتيب قابلية هذه المواد للذوبان كما يلي: GONRs القصيرة> GONRs> MWCNTs القصيرة> MWCNTs ، مما يعني أن منطقة التلامس لـ GONRs القصيرة كانت الأكبر ، لذلك كان متفوقة على الكسح ROS. ثانيًا ، كانت GONRs و MWCNTs عبارة عن هياكل كربون sp 2- يمكن أن تدمر كهرباء ROS من خلال تشكيل التقريب أو نقل الإلكترون .42 وجدنا أن التأثيرات المضادة للأكسدة لهياكل nanoribbon كانت أفضل من تلك الموجودة في هياكل الأنابيب النانوية ، لذلك تصنعها الأشرطة النانوية أسهل في نقل الإلكترونات من الأنابيب النانوية. أخيرًا ، في الشكل 1 ب ، نلاحظ أن موقع الكربون GONR sp 2- يحتوي على مجموعات وظيفية أكسجين أكثر من MWCNTs ، ويمكن لمجموعات حمض الكربوكسيل أن تخلّب أيونات المعادن ، ويمكن أن تكون مجموعات الهيدروكسيل متبرعًا بـ H لكبح ROS و تمنع إنتاج الميلانين.

2.4 السمية الخلوية لـ MWCNTs و GONRs المعالجة في خلايا الخلايا الليفية الجلدية البشرية.

تم تطبيق طريقة {0} (4 ، 5- Dimethylth-iazol -2- yl) -2 ، 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) لتقييم تمت زراعة الخصائص السامة للخلايا لـ GONRs على خلايا Hs68 (الشكل 3) ، والخلايا بجرعات مختلفة من 1 و 5 و 10 ميكروغرام / مل. لقد فحصنا أن قابلية الخلايا في MWCNT كانت 100.7 ± 3.7 ، 99.8 ± 4.9 ، و 94.1 ± 4.7 في المائة بتركيزات 1 و 5 و 10 ملغم / لتر ، على التوالي ؛ تم حساب قابليات MWCNT القصير بنفس الترتيب ووجد أنها 93.9 ± 2.2 ، 86 .4 ± 3.0 ، و 98.9 ± 2.1 بالمائة. لاحظنا أن خلايا B16 - F10 حضنت بتركيزات عالية ، وأن بقاء خلايا Hs68 كان أكثر من 80 في المائة ، مما يشير إلى أن MWCNT و MWCNT القصير لم يكن لهما تأثير سام على خلايا الخلايا الليفية الجلدية البشرية. كانت إمكانيات الخلية لـ GONR و GONR القصير 86. 24 ± 2.1 ، 90.87 ± 3.5 ، 88.58 ± 2.5 ، 89.03 ± 3.6 ، 90.71 ± 2.8 ، و 90.64 ± 2.5 بالمائة. يشار أيضًا في الشكل 4 أ إلى أن GONR و GONR القصير لم يكن لهما تأثير سام للخلايا واضح على خلايا HS68. في التقارير السابقة ، يمكن اعتبار استخدام المواد النانوية غير المختبرة لأغراض تجميلية أمرًا مشكوكًا فيه ، 43،44 وكان ذلك عادةً بسبب هجوم الحمض النووي بعد دخول الجسيمات النانوية إلى الخلايا. بعد اختبار السمية الخلوية ، وجدنا أن موادنا لا تسبب سمية لخلايا الجلد الطبيعية. خلصنا إلى أنه بعد دخول المواد النانوية إلى الخلايا ، تمنع المواد النانوية فقط إنتاج الميلانين عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي وأيونات المعادن المخلبية ولا تتلف الميتوكوندريا أو الحمض النووي ، مما يعني أن MWCNTs و GONRs كانت آمنة للاستخدام.

2.5 نوعان من MWCNTs و GONRs في نشاط التيروزيناز الخلوي B16 F10 ومحتوى الميلانين.

في مسار تخليق الميلانين ، يلعب التيروزيناز دورًا مهمًا. يؤكسد التيروزينيز ويشكل الإيوميلانين والفيوميلانين من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية الحيوية. من أجل تحديد ما إذا كانت GONRs و MWCNTs تثبط أنشطة التيروزيناز وتسبب انخفاضًا في إنتاج الميلانين ، قمنا بتحليل نشاط التيروزيناز في خلايا B16-F10. وجدنا أن MWCNTs و MWCNTs القصيرة تثبط نشاط التيروزيناز بحوالي 17.1 في المائة و 23 في المائة عند 10 ملغم / لتر. كان لـ GONRs و GONRs القصيرة تأثيرات أفضل في قمع نشاط التيروزيناز بنفس التركيزات مقارنة بـ GONR آخر. كانت أيضًا بطريقة تعتمد على الجرعة وتم تثبيتها بنسبة 49.8 في المائة و 44.7 في المائة من نشاط التيروزيناز ، كما هو موضح في الشكل 4 ب.

الميلانين هو صبغة لا غنى عنها في جسم الإنسان ، ولكن الإفراط في إفراز الميلانين غالبًا ما يؤدي إلى سلسلة من الأمراض. في الدراسات السابقة ، Xiao et al. استخدم مادة مماثلة ، الإسفنج الراديكالي ، جسيمات نانوية من الفوليرين ، كعامل مضاد للميلانين .45 كانت هناك بعض النتائج الجيدة ؛ يمكن منع حوالي 2 0 بالمائة من إنتاج الميلانين. من أجل تحسين كفاءتها ، قمنا بتحسين مادة الاختبار لقياس معدل تثبيط الميلانين وآليته الجزيئية ، كما هو موضح في الشكلين 4 ج و 5. قللت MWCNTs و MWCNTs القصيرة محتوى الميلانين بمقدار 17.6 ± 5.5 و 13.2 ± {{ 16}} .2٪ بمعدل 10 مجم / لتر وبطريقة تعتمد على الجرعة. خفضت GONRs و GONRs القصيرة بقوة القيم إلى 32.0 ± 2.3 و 35.3 ± 3.4 في المائة عند 10 مجم / لتر. اقترحت النتائج التجريبية أن جميع الأنواع الأربعة يمكن أن تمنع تخليق الميلانين وأن GONRs لها تأثير أقوى. من ناحية أخرى ، لاحظنا أيضًا أن GONR القصير له تأثير أفضل في تثبيط إنتاج الميلانين. نستنتج أن GONRs القصيرة لها مجموعات وظيفية أكثر ويمكن أن تمنع بشكل فعال التيروزيناز المحفز بالأيونات المعدنية ، مما يثبط إنتاج الميلانين (الشكل 2). في الجدول 1 ، نلاحظ أن جهد النوع القصير المخلب للأيونات المعدني أعلى من النوع العادي ؛ هذا يعني أنه يمكن تطبيق GONRs القصيرة هذه في مجال مستحضرات التجميل كعوامل للعناية بالبشرة.

2.6. تمنع آلية MWCNTs و GONRs محتوى الميلانين الخلوي B16 F10.

تستجيب الخلايا للإجهاد التأكسدي الخارجي من خلال تنظيم تعبير البروتين. تعمل خلايا B16 − F10 على تعزيز التعبير الجيني c-myc و AMPK المنظم لتقليل مستويات الأكسدة ، 46 وفي هذا العمل ، MITF هو عامل نسخ محدد من التيروزيناز لتنظيم مسار إشارة تخليق الميلانين الجزيئي. 5a و MWCNTs و GONRs يقللون من تنظيم عامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي ، وبعد ذلك ، تم أيضًا تقليل تنظيم الجين المصب TRP -1 و TRP -2. بالنسبة لمستوى البروتين ، تم العثور على ظاهرة مماثلة ، حيث خفضت MWCNTs و GONRs مسار تكوين الميلانين المرتبط بـ MITF ثم خفضت في النهاية محتوى الميلانين (الشكل 5 ب).

3. المواد والطرق التجريبية

3.1. إعداد MWCNTs و GONRs.

تم الإبلاغ عن العملية ذات الصلة لصنع GONRs في ورقة سابقة. تم تعليق 12 MWCNT (0. 0 5 جم) في 9: 1 H2SO4 / H3PO4 ومعالجتها بمفاعل ميكروويف (CEM-Discover) مع ضبط الطاقة على 250 واط لمدة دقيقتين. بعد إضافة KMnO4 (0.25 جم) إلى المحاليل ، تمت معالجة المحاليل بنفس طاقة الميكروويف عند 65 درجة لمدة 4 دقائق ثم قمنا بتعديل هذه العملية باستخدام وقت ميكروويف أقصر للمرحلة الثانية يبلغ 8 دقائق باستخدام ضاغط هواء. هنا ، يتم استخدام ضاغط الهواء للتحكم في درجة حرارة مفاعل الميكروويف أثناء العملية. تم ضبط طاقة الميكروويف على 250 واط في الاختبارات الأولية.

3.2 إعداد MWCNTs قصيرة و GONRs قصيرة.

تم الإبلاغ عن العملية ذات الصلة لجعل GONRs قصيرة في ورقتنا السابقة .34 تم اختيار وقت المعالجة الحمضية 8 ساعات. تم ضبط طاقة الميكروويف على 250 واط ، وهي نفس قوة الحصول على GONRs.

3.3 نشاط الكسح الجذري DPPH.

تم استخدام DPPH بشكل متكرر لتحديد قدرة الكسح للعينات وخصائص مضادات الأكسدة. 50 DPPH هو كاشف أرجواني يغير اللون من اللون الأرجواني إلى الأصفر إذا تم نقل الجذور الحرة إلى التحليل. تمت إضافة عينات إيجابية مضادة للأكسدة بتركيزات مناسبة إلى المحلول ، وتم تحليل العينات عند 517 نانومتر لمدة 30 دقيقة. استخدمنا النسب المئوية المتبقية من DPPH بالإضافة إلى عينات الاختبار لقياس كمية مضادات الأكسدة المطلوبة لتقليل جذور DPPH السابقة. تم استخدام فيتامين ج عند 100 ميكرومتر كعنصر تحكم إيجابي. تم قياس نشاط الكسح (نسبة مئوية) على أنه

سعة الكسح (بالمائة)=(Asample - Ablank) / (Acontrol - Ablank) × 100 بالمائة (1)

3.4. نشاط استخلاب المعادن.

أيون المعدن هو العامل الذي يسبب أكسدة الدهون المفرطة ، و Fe2 plus هو أحد أكثر الأيونات تأثيرًا ، حيث تم تحميل تركيزات مختلفة من المواد النانوية (1 ميكرولتر) في 96- صفيحة البئر ، والتي تحتوي على 2 ملي مولار FeCl2 · 4H2O (10 ميكرولتر) ، ثم تحميلها في فيروزين (5 مم ، 20 ميكرولتر). تم مزج الخليط بالكامل مع 69 ميكرولتر من المنثول وحفظه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تمت ملاحظة محلول تفاعل العينة عند 562 نانومتر. تم استخدام EDTA كعنصر تحكم إيجابي عند 100 ميكرومتر ، واستندت صيغة حساب نشاط خالب المعادن على المعادلة 1.

3.5 الحد من قوة.

يعتمد حساب القدرة المختزلة على دراسة سابقة 50 أولاً ، تم خلط 2.5 ميكرولتر من مواد الجرافين مع محلول PBS (67 ملي مولار ، ودرجة الحموضة 6.8) و K3Fe (CN) 6 (2.5 ميكرولتر ، 20 بالمائة) ثم حضنت عند 50 درجة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، تم مزج 10 بالمائة من حمض أسيتيك ثلاثي كلورو (160 ميكرولتر) مع الكواشف عند 300 جم بالطرد المركزي لمدة 20 دقيقة. تم تحديد طول الامتصاص عند 700 نانومتر بعد خلطه مع 25 ميكرولتر من FeCl3 (2 بالمائة). تم استخدام هيدروكسيانيزول بوتيل (BHA) عند 100 ميكرومتر.

3.6 فحوصات انتشار الخلايا.

تم استخدام خط خلية الخلايا الليفية الجلدية البشرية HS68 لتحليل نسبة تكاثر الخلايا. تم تحضين HS68 في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10 في المائة من مصل بقري جنيني و 1 في المائة من البنسلين والستربتومايسين مختلط 50،51 بعد العلاج بتركيزات مختلفة من العينات ، طبقنا MTT للكشف عن نسبة تكاثر الخلايا. تم بذر 8000 خلية في 96- أطباق جيدة ومعالجتها بالعينات لمدة 24 ساعة. تمت إزالة المحلول الطاف ، واستخدمنا محلول MTT للثقافة لمدة ساعتين عند 37 درجة. بعد الحضانة ، أزلنا الوسائط المحتوية على MTT وقمنا بحلها باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تمت قراءة المحلول عند OD 590 نانومتر والمعدل المحسوب بواسطة مكافئ 1.

3.7 تقييم محتويات الخلوية الميلانين.

استخدمنا طريقة مع تعديلات طفيفة بناءً على الاختبار السابق. تم حل 52،53 كريات خلوية من B16 F1 0 من مركز أبحاث وجمع المصادر الحيوية (BCRC ، CRL 6323 ، Hsinchu ، تايوان) في خليط من 2.0 N هيدروكسيد الصوديوم و 10 بالمائة DMSO. تم تسخين العينة بعد ذلك لمدة ساعة واحدة عند 90 درجة وطردها عند 10 ، 000 جم لمدة 10 دقائق أخرى للحصول على المادة الطافية الموضحة. تم تحديد عدد الميلانين من خلال مراقبة OD للطاف عند 475 نانومتر.

3.8 نشاط التيروزيناز الخلوي B16 − F10.

بالنسبة إلى نشاط التيروزيناز الخلوي B16 − F10 ، أشرنا إلى العمل السابق مع بعض التعديلات. تمت زراعة 50 خلية في 12- ألواح بئر في 105 خلية لكل بئر. بعد العلاج بالعينات ، تم تفكيك الخلايا بنسبة 1 بالمائة Triton X -100 / PBS و 2 ملي مولار من L-tyrosine (50 ميكرولتر) لمدة 3 ساعات. بعد الحضانة ، أزلنا الوسائط وقرأنا الامتصاصية عند OD 590 نانومتر. تم حساب صيغة نشاط التيروزيناز بواسطة مكافئ 1.

Cistanche هو مثبط للتيروزيناز.

3.9 الكشف عن ROS عن طريق تلطيخ DCFDA.

بالإشارة إلى الدراسة السابقة ، 54 1. 2 1 تم زرع خلايا 105 B16 − F10 في 6- أطباق جيدة وتم معالجتها بتركيزات مختلفة من العينات. تم تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني ثم تحميلها بـ DCFDA (5 ميكرومتر) في DMEM أحمر غير الفينول لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة. تم استخدام مقياس التدفق الخلوي (جوافة ، ميرك ، ألمانيا) لاكتشاف إشارة الفلورسنت الخاصة بـ DCFDA. كانت أطوال موجات الإثارة والانبعاثات من DCFDA 488 و 535 نانومتر ، على التوالي.

3.10. تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.

اتبعنا طرق Lin et al. (2018) .1 في الوقت الحقيقي يتألف تفاعل النسخ العكسي الكمي للبوليميراز المتسلسل (qRT-PCR) من مسبار تمهيدي حصري لتوليد مضان. استخدم تقنية الكشف عن التألق التي تستشعر كل دورة باستخدام 7500 qRT-PCR System (Applied Biosystems ، الولايات المتحدة الأمريكية). اكتشف الدورة بناءً على كمية التألق الصادرة ، ثم تم حساب ناتج كل دورة للمحتوى الناتج ، مما أدى إلى تحقيق أغراض كمية في الوقت الفعلي. تم استخدام Trizol (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) لاستخراج الحمض النووي الريبي الكامل من أنسجة الرئة ، وفقًا للإرشادات التي قدمتها الشركة المصنعة. بعد ذلك ، تم استخدام مجموعة النسخ العكسي (تاكارا ، اليابان) لتوليد الحمض النووي. في qRT-PCR باستخدام الاشعال ، المدرجة في الجدول 1 ، أولاً ، تم تسخين العينة لتشكيل حبلا واحد من الحمض النووي ؛ ثم تم إجراء ارتباط تمهيدي لتكوين DNA مزدوج الشريطة (dsDNA) ، وبعد ذلك تم دمج SYBR Green dsDNA ، حيث تم استخدام مجموعة SYBR green plus كاشف (Roche ، Basel ، Swiss) ، مما أدى إلى إطلاق مضان. تم تمرير الناتج من خلال نظام الكشف عن الأسفار. تم الكشف عن إشارات الفلورسنت أثناء مرحلة الاستطالة أو التلدين لكل دورة ؛ بعد الاكتشاف ، تم دفع محتويات العينة للخلف بواسطة شدة التألق المكتشفة. 55 تم تطبيع مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة إلى مستويات -Tubulin باستخدام طريقة 2 − Ct.

ميريستين

3.11. اختبار اللطخة الغربية.

تم تحليل خلايا B16 − F10 عند 4 درجات خلال الليل باستخدام محلول مؤقت لفحص ترسيب مناعي إشعاعي (شركة Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والذي يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني. تم استخدام مجموعة فحص بروتين حمض bicinchoninic (BCA ، Sigma-Aldrich Corp. ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحديد كمية البروتين. تم فصل بروتينات العينة على هلام دوديسيل كبريتات - بولي أكريلاميد بنسبة 10 بالمائة ونقلها إلى غشاء بولي فينيلدين ديفلوريد (PVDF) (PALL Life Science ، آن أربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حظر غشاء PVDF بمخزن مؤقت للحظر (Thermo Scientific) لمدة ساعة واحدة واحتضانه بالجسم المضاد الأولي المحدد طوال الليل عند 4 درجات. بعد ذلك ، تم غسل الغشاء باستخدام محلول ملحي Tris - Tween 20 مرتين وحضنته بأجسام مضادة ثانوية لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك ، تم غمس الغشاء في كواشف الكشف عن اللمعان الكيميائي (علمي حراري) وتحليله بواسطة مصور MiniChemi Chemiluminescence (Beijing Sage Creation Science ، الصين). تضمنت مصادر الأجسام المضادة الأرانب المضادة لـ MITF ، والأرنب anti-TRP -1 ، والأرنب anti-TRP -2 ، و -actin (Thermo Scientific).

3.12. تحليل المواد.

تم استخدام TEM (JEOL JEM -1230 ، 100 كيلو فولت) لمراقبة شكل المركبات الكربونية النانوية. تم تطبيق مطياف رامان الصغير (PTT ، RAMaker) لفحص أوضاع الرنين للكربون النانوي. تم أيضًا إجراء قياسات التحليل الطيفي الضوئي للأشعة السينية (XPS ، Kratos Axis Ultra DLD) لتحديد التحليل التركيبي.

3.13. تحليل احصائي.

تم تكرار جميع العينات والتجارب القياسية ثلاث مرات على الأقل. طبقنا اختبار الطالب للمقارنة والتعبير عن متوسط ​​القيم المتوسطة ± الانحراف المعياري إحصائيًا.

4 - نتائج

باختصار ، لاحظنا أن GONR القصير كان مادة محتملة لمنتجات العناية بالبشرة نظرًا لخصائصه الوظيفية الحيوية المتعددة (الشكل 6). أظهرت النتائج أن المركبات الكربونية النانوية لعبت دورًا كمضاد للأكسدة خارج الخلايا وداخل الخلايا. وفي الوقت نفسه ، فإن الكربون النانوي يثبط نشاط التيروزيناز ومحتوى الميلانين ولم يسبب أي إصابة خطيرة للخلايا الصبغية. أسس هذا العمل الوظائف المضادة لتكوين الميلانين لأربعة أنواع من الكربونات النانوية ؛ ستفحص الدراسات المستقبلية آلية هذه المركبات على تعبيرات جينية وبروتينية محددة تتعلق بنضج الميلانين ونقله وتراكمه.

Cistanche يحسن التبييض.

الرجاء الضغط على الصورة والحصول على مزيد من التفاصيل.