مقاومة موت الخلايا المبرمج للخلايا الشائخة هي حاجز جوهري لانحلال الكبريت الناجم عن جليكوسيدات القلب

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخصيعتبر القضاء المستهدف على الخلايا الشائخة ، والتحليل ، أحد الاتجاهات الأساسية في العلاج المضاد للشيخوخة. ثبت مؤخرًا أن الجليكوسيدات القلبية هي دواء للشيخوخة واسع الطيف. لم يكن لجليكوسيدات القلب أي قدرة على التحلل للشيخوخة تجاه hMSCs الشيخوخة من أصول مختلفة. باستخدام الأساليب البيولوجية والمعلوماتية الحيوية ، نقارن تطور الشيخوخة في "حساس لجليكوزيدات القلب" A549 و hMSCs "حساسة". تم العثور على عدم وجود تحليل كان التوسط من خلال استيراد البوتاسيوم الفعال وزيادة مقاومة موت الخلايا المبرمج في hMSCs الشيخوخة. يهيئ ضعف "الدفاع المضاد للخلايا" hMSCs للتحليل. لقد كشفنا أن مقاومة موت الخلايا المبرمج ، المعترف بها سابقًا على أنها خاصية شائعة للشيخوخة ، في الواقع ، ليست سمة عامة للخلايا الشائخة. علاوة على ذلك ، فإن الخلايا المتشيخة في موت الخلايا المبرمج - البرولين فقط هي التي تكون حساسة للتحليل الناتج عن غليكوزيد القلب. وبالتالي ، يمكننا التكهن بأن فعالية التحليل قد تعتمد على ما إذا كانت الخلايا الشائخة أصبحت بالفعل مقاومة لموت الخلايا المبرمج مقارنة بنظيراتها المتكاثرة.

الكلمات الدالةالخلايا الجذعية. انحلال الجلد - الشيخوخة - موت الخلايا المبرمج - مقاومة الإجهاد

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

مقدمة

يعتبر الشيخوخة الخلوية اليوم تفاعلًا شائعًا لجميع أنواع الخلايا المتكاثرة تقريبًا ، بما في ذلك الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية ، بالإضافة إلى بعض الخلايا اللاحقة للانقسام الخيطي لمجموعة متنوعة من المحفزات المجهدة [1-3]. يمكن تمييز الأنواع التالية من الشيخوخة الخلوية وفقًا لأصل العامل المحرض: التكرار (بسبب تلف الحمض النووي في نهايات التيلومير القصيرة) ، الناجم عن الجينات الورمية (استجابة للتنشيط الشاذ للإشارات الورمية) ، والناجم عن الإجهاد ( بوساطة تلف الحمض النووي الناجم عن الإجهاد التأكسدي ، والصدمة الحرارية ، والأشعة فوق البنفسجية ، والأشعة فوق البنفسجية ، وما إلى ذلك) والعلاج الكيميائي (الذي يتم تنشيطه في الخلايا السرطانية استجابة لأدوية العلاج الكيميائي) [4-7]. هناك عدم تجانس في الواسمات التي تعبر عنها الخلايا الشائخة اعتمادًا على نوع الخلية والإهانة المستخدمة للحث على الشيخوخة. ومع ذلك ، هناك العديد من السمات المشتركة النموذجية لمعظم أنواع الخلايا الشائخة. السمة الأساسية للشيخوخة لأي نوع من الخلايا المنقسمة هي خسارة الانتشار التي لا رجعة فيها [8].استخراج cistanche tubulosaيتم التحكم في عدم رجعة إيقاف دورة الخلية بواسطة مثبطات كيناز (CDK) المعتمدة على السيكلين pl6 و p21 وغالبًا ما يتم تنظيمها بواسطة بروتين مثبط الورم p53 [8،9]. السمات المهمة الأخرى للخلايا الشائخة هي تنشيط الاستجابة المستمرة لتلف الحمض النووي ؛ تضخم الخلايا ، الذي ينشأ غالبًا نتيجة خلل في التكوين الحيوي للريبوسومات وتخليق البروتين ؛ اضطراب التحلل الليزوزومي والخلل في أنظمة التحلل الباقية ؛ زيادة نشاط إنزيم الليزوزومات المعين المرتبط بالشيخوخة - - galactosidase ؛ مختلف التعديلات الميتوكوندريا. اكتساب النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) ، والذي يتكون من عوامل مؤيدة للالتهابات ، وإنزيمات تحطيم المصفوفة ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ، وما إلى ذلك ؛ تغييرات المناظر الطبيعية اللاجينية والكروماتينية ، بما في ذلك تكوين البؤر غير المتجانسة المرتبطة بالشيخوخة والتمدد المرتبط بالشيخوخة للأقمار الصناعية [8-10]. وبعبارة أخرى ، تحافظ الخلايا الشائخة على النشاط الأيضي والحيوية ، ولكن وظيفتها تتغير بشكل كبير مقارنةً بالشيخوخة الخلايا الأصلية.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

من الواضح الآن أن الخلايا الشائخة يمكنها تعديل البيئة الدقيقة المحيطة التي تؤثر على كل من الخلايا المجاورة والمنافذ الخلوية ، مما قد يؤدي إلى خلل في الأنسجة وبالتالي قد يكون مرتبطًا بتطور الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر [11 ، 12]. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يتركز المزيد من الاهتمام اليوم على استراتيجيات "القتل" المستهدف للخلايا الشائخة [13-15]. تحقيقا لهذه الغاية ، هناك فئة جديدة من الأدوية تسمى senolytics تتطور بنشاط. يستهدف دواء Senolytics مسارات الإشارات التي تساهم في مقاومة الخلايا الشائخة نحو موت الخلايا المبرمج ، وبالتالي تحفيز موت الخلايا المبرمج بشكل تفضيلي في الخلايا الشائخة [16]. يتم تجديد قائمة senolytics باستمرار بوكلاء جدد. أكثر المركبات المعروفة ذات النشاط المسبب للشيخوخة هي navitoclax (مثبط عائلة Bcl -2) ، وهو مزيج من dasatinib (مثبط للعديد من كينازات التيروزين) وكيرسيتين (فلافونول طبيعي) ، ومثبطات Hsp90 ، ومثبطات MDM2 ، و FOXO { {8}} الببتيد المتداخل p53 ، ومزيل بروتين عائلة BET ، و CAR-T الخاص بـ uPAR ، و navitoclax المترافق مع galacto ، والعديد من المركبات الطبيعية الحالة للشيخوخة [16-24]. في الآونة الأخيرة ، باستخدام فحص الأدوية عالي الإنتاجية ، حددت مجموعتان بحثيتان مستقلتان جليكوسيدات القلب ، ولا سيما الأوابين والديجوكسين والبوفالين ، باعتبارها أدوية للشيخوخة واسعة الطيف [25 ، 26].استعراض cistanche tubulosaمن الجدير بالذكر أن جميع الأدوية الحالة للشيخوخة المعلنة تقريبًا لها قيود ، مثل الآثار الجانبية غير المرغوب فيها أو عدم الفعالية تجاه بعض أنواع الخلايا. تتميز الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، الموجودة فعليًا في جميع أعضاء / أنسجة ما بعد الولادة ، بالقدرة على التجديد الذاتي (الانقسامات المتماثلة) والتمييز ، وبالتالي المساهمة في الحفاظ على الأنسجة المقيمة وتجديدها [27]. نظرًا لهذه الخصائص الفريدة ، جنبًا إلى جنب مع الوظائف القوية المضادة للالتهابات وكبت المناعة ، يتم تطبيق MSCs على نطاق واسع في العلاج باستبدال الخلايا لعلاج الأمراض المختلفة ، بما في ذلك داء السكري ، والتصلب المتعدد ، واحتشاء عضلة القلب ، وما إلى ذلك [28]. ومع ذلك ، على غرار نسلها المتمايز والخلايا أحادية القدرة الأخرى ، فإن الخلايا الجذعية السرطانية قادرة على التكاثر أو الاستجابة المبكرة لتفعيل الجينات الورمية والمحفزات المجهدة [29 ، 30]. من مجموعة الخلايا الجذعية ، وانخفاض صيانة الأنسجة وتجديدها ، وضعف قدرة التمايز ، وانتشار الشيخوخة بوساطة SASP ، وانخفاض خصائص الأوعية الدموية ، وتعديل مكان الخلايا الجذعية [29 ، 31-33]. مع الأخذ في الاعتبار الأهمية البيولوجية للأداء السليم لخلايا MSCs ، يمكن اعتبار MSCs المتقدمة هدفًا حاسمًا للتحليل. تماشياً مع هذا الاقتراح ، تم نشر عدد من المراجعات التي تسلط الضوء على النتائج المفيدة المحتملة لإزالة الخلايا الجذعية الوسيطة في العام الماضي [29 ، 31 ، 34 ، 35]. ومع ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من البيانات التجريبية المتعلقة بهذه المشكلة [36-40].

في هذه الدراسة ، أظهرنا لأول مرة أن جليكوسيدات القلب ، وبالتحديد ouabain و bufalin ، تفشل في عرض النشاط الانحلالي تجاه MSCs البشرية (hMSCs) المستمدة من بطانة الرحم (END-MSCs) ، الأنسجة الدهنية (AD-MSCs) ، لب الأسنان (DP-MSCs) و Warton jelly (WJ-MSCs). بالإضافة إلى ذلك ، نؤكد أن كلا الجليكوزيدات القلبية قادرة على إحداث موت الخلايا المبرمج بشكل تفضيلي في senes-cent A549 و SK-HEP -1 ، كما تم وصفه سابقًا في الدراسات التجريبية [25 ، 26]. من خلال تقييم التغييرات في الاستتباب الأيوني الناجم عن مستويات Nat / K plus -ATPase والتعبير عن الجينات ذات الصلة ، نكشف أن غياب التحليل الناجم عن ouabain يمكن التوسط فيه من خلال الفعالية المعززة لاستيراد K plus التعويضي في senescent END- MSCs بالمقارنة مع A549 الشيخوخة. علاوة على ذلك ، باستخدام المعلومات الحيوية المتقدمة ، نظهر أن شيخوخة الخلايا الجذعية السرطانية النهائية ، المقاومة للتحليل الناجم عن ouabain ، مصحوبة باكتساب النمط الظاهري المقاوم لموت الخلايا المبرمج ، في حين أن شيخوخة A549 الحساسة لـ ouabain ليست كذلك. الأهم من ذلك ، أن منع نشاط البروتين المضاد للخلايا MCL -1 قبل العلاج بجليكوسيد القلب أدى إلى تحليل الخلايا الجذعية السرطانية النهائية المقاومة لموت الخلايا المبرمج. لذلك ، نقدم دليلًا واضحًا على أن مقاومة موت الخلايا المبرمج ليست سمة عامة للخلايا الشائخة. استنادًا إلى البيانات التي تم الحصول عليها ، نستنتج أن فعالية الأساليب التحليلية قد تعتمد على ما إذا كانت الخلايا بالفعل مقاومة لموت الخلايا المبرمج أثناء تطور الشيخوخة.

المواد والأساليب

الخلايا

تم الحصول على END-MSCs و WJ-MSCs و DP-MSCs و AD-MSCs و A549 و SK-Help من المجموعة الروسية لثقافات الخلايا (معهد علم الخلايا ، سانت بطرسبرغ ، روسيا). تمت المصادقة على خطوط A549 و SK-Help من خلال اختبارات علم الكريات ، والأورام ، و isoenzyme (LDH و G6PD) ، وتحليل STR. تمت زراعة الخلايا في وسط كامل DMEM F12 (Gibco BRL) مكمل بـ 10 بالمائة FBS (HyClone) ، 1 بالمائة بنسلين ستربتومايسين (Gibco BRL) و 1 بالمائة جلوتاميك (Gibco BRL). تم اختبار جميع الخلايا بشكل روتيني لتلوث المايكوبلازما.

الشيخوخة والظروف المسببة للتوتر

بالنسبة للشيخوخة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي ، تم علاج END-MSCs / WJ-MSCs بـ 200 ميكرومتر / 100 أوم H O (Sigma) لمدة ساعة واحدة. بالنسبة للشيخوخة التي يسببها دوكسوروبيسين ، تم علاج DP-MSCs / A549 بـ 1 ميكرومتر من دوكسوروبيسين （Veropharm） لمدة 3 أيام. في كل حالة ، اعتبرت الخلايا شيخوخة في موعد لا يتجاوز 14 يومًا بعد العلاج. بالنسبة للشيخوخة التكرارية ، تم تحديد AD-MSCs في وقت سابق من المقطع الرابع كخلايا تحكم ولاحقًا من العاشر كخلايا شائخة. بالنسبة للشيخوخة التي يسببها الإيتوبوسيد ، تم علاج A549 / END-MSCs / SK-Help بـ 2 uM / 5 uM / 3 uM etoposide (Veropharm) لمدة 3 أيام وتحليلها في موعد لا يتجاوز 7 أيام بعد تحريض الشيخوخة. في هذه الحالة ، يتطابق تصميم العلاج تمامًا مع تلك الموصوفة في الدراسة التي نشأت منها بيانات RNA-seq (Wang et al. ، 2017). استخدمنا اثنين من جليكوسيدات القلب كمركبات حال للشيخوخة - - وابين (سيغما) وبوفالين (كالبيوتشيم).

من أجل مقارنة مقاومة الإجهاد بين التحكم والشيخوخة الطرفية MSCs أو A549 ، عولجت الخلايا إما بـ 4 0 0/800 uM H O2 (Sigma) لمدة ساعة واحدة أو مع 0.3 / 1 uM staurosporine (Sigma). تم تحليل صلاحية الخلية بعد 48 ساعة من تحريض الإجهاد.

لحظر نشاط MCL -1 ، تمت معالجة END-MSCs مسبقًا بـ 10 uM من A -1210477 (Sigma) لمدة 3 أيام.

تحليل التدفق الخلوي

تم إجراء قياسات بقاء الخلية ، والتكاثر ، وحجم الخلية ، والتألق التلقائي ، ومعدلات موت الخلايا المبرمج ، وانقسام كاسباس 3/7 ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وإزالة استقطاب الغشاء عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام CytoFLEX (Beckman Coulter) وتم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الإصدار 2 من برنامج CytExpert. 0. تم شطف الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وحصادها عن طريق التربسين. تم تجميع الخلايا المنفصلة وتعليقها في وسط جديد ومن ثم عدها وتحليقها من أجل التألق الذاتي. من أجل الوصول إلى صلاحية الخلية ، تمت إضافة 50ug / ml propidium iodide Life Technologies إلى كل عينة قبل التحليل مباشرة. تم تقييم حجم الخلية عن طريق تشتت الضوء الأمامي للخلايا السالبة PI. تم التحقق من تحريض موت الخلايا المبرمج باستخدام تلطيخ Annexin-V-APC (Invitrogen) و DAPI (Sigma) التالي لتعليمات الشركة المصنعة. تم تقييم نشاط Caspase باستخدام CellEventTM Caspase -3 / 7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) عقب بروتوكول التصنيع. تم تقييم فقدان إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام صبغة قياس النسبة JC -1 (Invitrogen). تم تنفيذ إجراء التلوين وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. لإزالة استقطاب الغشاء ، استخدمنا مسبار الفلورسنت DiBAC4 (3) (Invitrogen).

تلطيخ الجالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة

تم إجراء تلطيخ غالاكتوزيداز المرتبط بشركة Senescence (SA - - Gal) باستخدام مجموعة تلطيخ الشيخوخة-galactosidase (تقنية تشوير الخلية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء التحليل الكمي للصور باستخدام حزمة MatLab ، وفقًا للخوارزمية الموصوفة سابقًا [41]. لكل نقطة تجريبية ، تم تحليل ما لا يقل عن 50 خلية تم اختيارها عشوائيًا.

النشاف الغربي

تم إجراء النشاف الغربي كما هو موضح سابقًا [41]. تم إجراء الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، والنقل إلى غشاء النيتروسليلوز ، والتكتل المناعي باستخدام ECL (Thermo Scientific) وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة القياسية (مختبرات Bio-Rad). تم استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات التالية: glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) (clone 14C1 0) ، phospho-p53 (Ser15) ، p21 (clone 12D1) ، phospho-Rb (Ser807 / 811) ، HMGB1 (استنساخ D3E5) ، وكذلك الماعز المترافق مع بيروكسيداز الماعز المضاد للأرنب IgG. كانت معدلات التخفيف 1: 1000 لجميع الأجسام المضادة الأولية و 1: 7000 للأجسام المضادة الثانوية. تم شراء جميع الأجسام المضادة من إشارات الخلية. تم استخدام Scion Image 4.0 (شركة Scion) لتحديد وتحديد كثافة الخلفية التي تم طرحها للنطاقات في جميع المواد الهلامية والبقع.

تحليل النسخ

تم استخدام عينات من مجموعات بيانات Gene Expression Omnibus الثلاثة التالية (GEO) RNA-seq في التحليل: GSE102639 (GSM 2742113- GSM2742114 و GSM 2742121- GSM2742122 forcontrol and senescentA549cells ، وفقًا لذلك) ؛ GSE122081 (GSM 3454482- GSM3454484 و GSM 3454500- GSM3454502 لخلايا التحكم والشيخوخة IMR -90 ، وفقًا لذلك) ؛ ومجموعة البيانات GSE160702 (GSM 4877895- GSM4877898 و GSM 4877907- GSM4877910 للتحكم و MSCs النهائية المتقادمة ، على التوالي). تمت معالجة البيانات الخاصة بجميع مجموعات البيانات بنفس الطريقة.

يقرأ Raw البيانات التي خضعت لتصفية الجودة وتشذيب المحول عبر البرامج النصية FilterByTile و BBDuk من حزمة BBtools (الإصدار 38.75) باستخدام الخيارات الافتراضية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت تصفية القراءات المتبقية وتشذيبها باستخدام نص ثلاثي من حزمة FastqPuri (الإصدار 1. 0. 7).cistanche المملكة المتحدةتم تطبيق عملية التشذيب لكلا طرفي القراءات إذا كانت تحتوي على N أو كانت جودتها أقل من عتبة الجودة المحددة على 27 ، وتم تجاهل جميع القراءات الأقصر من 25 قاعدة. تم إجراء مراقبة جودة التشذيب باستخدام برنامج FastQC (الإصدار 0. 11.7) ونصوص FastqPuri. القراءات ، بعد اجتياز جميع العمليات ، تشكل ما لا يقل عن 90 في المائة من البيانات الأولية.

تم تقدير وفرة النص باستخدام تعيين Salmon lightweight (الإصدار 1.1. 0) الذي يعمل في وضع المحاذاة الانتقائية. تم إنشاء قائمة الأفخاخ استنادًا إلى جينوم المرجع البشري لـ Gencode GRCh38.p13 (الإصدار 33) واستخدمت بشكل أكبر لبناء الفهرس على الملفات المرجعية للنسخة المتسلسلة والجينوم Gencode (الإصدار 33) باستخدام حجم kmer 21. مع إشارات إضافية —— numBootstraps 30 —— الترتر —— gcBias— التحقق من صحة التعيينات. كانت معدلات الخرائط الناتجة حوالي 70 بالمائة.

تم إجراء مزيد من معالجة البيانات باستخدام الإصدار R 3.6.3 مع مجموعة Tidyverse من الحزم (الإصدار 1.3. 0). تم تحميل أعداد الجينات المقدرة والبيانات الوصفية ونطاقات النسخ في R وتم تلخيصها على مستوى الجينات باستخدام tximeta (الإصدار 1.4.5). تم ترشيح مصفوفة العد الناتجة لتحتوي على صفوف بها 5 أعداد مقدرة على الأقل في جميع العينات ، واحتوت المصفوفة الناتجة على 20400 جين.

بالنسبة لتمثيل PCA و heatmap ، تمت تسوية أعداد القراءة باستخدام تحويل السجل من حزمة DESeq2 (الإصدار 1.26. 0).cistanche wirkungتم إنشاء خرائط الحرارة باستخدام مرشح الجينات (الإصدار 1.38. 0) وخريطة الحرارة (الإصدار 1. 0. 12) حزم R. تم إجراء التحقق من صحة عينات الانقسام عن طريق متغير الشيخوخة من خلال إعادة تعداد القراءة المقيسة بواسطة الجينات المرتبطة بمصطلح علم الوجود الجيني "الشيخوخة الخلوية" (GO 0 0 9 0 398). تم حساب تحليل التعبير التفاضلي وتقدير تغييرات أضعاف اللوغاريتمات باستخدام DESeq2 للمتغير الأخير في صيغة التحكم في صيغة التصميم لحالة شيخوخة الخلايا ، وتفاعل علاج ouabain ، وتفاعل العوامل المشار إليها. لتعزيز اختبار التعبير التفاضلي ، تم تطبيق تصحيح تغيير طية السجل باستخدام مجموعة من مقدر الانكماش التكيفي من حزمة راحة اليد (الإصدار 1.8. 0) وتحديد عتبة تغيير طية لوغاريتمية إضافية تساوي 0.667. تم استخدام التقديرات المنكمشة الناتجة بشكل أكبر لترتيب الجينات وتشغيل تحليل إثراء مجموعة الجينات باستخدام ملف تعريف الكتلة (الإصدار 3.14.3) وحزم R المصهر (الإصدار 1.12.0) R مع قيم p معدلة لمقارنات متعددة وفقًا لطريقة Benjamin-Hochberg. تم الحصول على عينات ميكروأري Affymetrix للتحكم و AD-MSCs senes-cent من قاعدة بيانات GEO (GSE66236) ومعالجتها باستخدام تطبيق الويب Phantasus مع تطبيع log2 وتعداد التعداد الكمي. تم إجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات باستخدام حزمة مصهر (الإصدار 1.12.0) R.

استخراج الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي و PCR في الوقت الحقيقي

تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي و PCR في الوقت الحقيقي كما هو موضح في دراستنا السابقة [32]. تم الحصول على الكواشف لاستخراج الحمض النووي الريبي (كاشف ExtractRNA) والنسخ العكسي (مجموعة MMLV RT) و PCR في الوقت الحقيقي (مجموعة HS SYBR) من Evrogen. تم تقييم مستويات التعبير الجيني باستخدام مضخم PCR BioRad CFX -96 في الوقت الحقيقي (BioRad) مع برنامج التشغيل التالي لجميع الجينات التي تم فحصها: 40 دورة من الانصهار لمدة 10 ثوانٍ عند 95 درجة ، التلدين لمدة 15 ثانية عند 57.5 درجة ، والتركيب لمدة 15 ثانية عند 72 درجة. تم تطبيق تحليل منحنيات الانصهار للتحكم في خصوصية التفاعلات. تم إجراء التحليل التالي للبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج Bio-Rad CFX Manager (BioRad) مع طريقة القياس الكمي القياسية 2deltaCt باستخدام تعبير GAPDH كمرجع. يتم سرد تسلسل التمهيدي في الجدول 1.

تحليل احصائي

للحصول على أهمية في الاختلاف بين المجموعتين تم تطبيق اختبار t للطالب أو اختبار t ويلش. لإجراء مقارنات متعددة بين المجموعات ، تم استخدام ANOVA مع Tukey's HSD. ما لم يُذكر خلاف ذلك ، يتم عرض جميع البيانات الكمية على أنها متوسط ​​± SD وتشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة على النحو التالي: ns ، غير مهم ، * p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

نتائج

H2O 2- المعالجة النهائية - MSCs تدخل الشيخوخة المبكرة

في هذه الدراسة ، استخدمنا الخلايا الجذعية اللحمية البشرية المعزولة من بطانة الرحم المتقشرة (END-MSCs) ، والتي تفي بالمعايير الدنيا التي اقترحها ISCT لتحديد hMSCs [41]. في السابق ، قمنا بتطوير نموذج تجريبي موثوق لدراسة الجوانب المختلفة للشيخوخة المبكرة للخلايا الجذعية السرطانية النهائية [30]. على وجه التحديد ، لقد أظهرنا أن الخلايا الجذعية السرطانية النهائية التي تعرضت للإجهاد التأكسدي شبه المميت اكتسبت تدريجياً جميع السمات النموذجية للخلايا الشائخة ، بما في ذلك بؤر عمر السدود المستمرة للحمض النووي والاستجابة النشطة لتلف الحمض النووي ، وتوقيف دورة الخلية غير القابل للعكس بوساطة p53 / p21 / Rb الكلاسيكي. المسار ، فقدان الانتشار ، تضخم الخلايا ، ظهور SA - - تلطيخ غال وتطور النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة [30 ، 32 ، 42]. طبقنا هنا النموذج المصمم لدراسة تأثير الحالة للشيخوخة لأوابين وكذلك للكشف عن التغيرات الأساسية داخل الخلايا في التوازن الأيوني. في البداية ، من خلال تقدير المعلمات الأكثر شيوعًا ، أكدنا أن العلاج بجرعة واحدة ساعة و 200 ميكرومتر） H O كان كافياً للحث على الشيخوخة في الخلايا الجذعية السرطانية النهائية. الأهم من ذلك ، اعتبرت الخلايا الجذعية السرطانية النهائية المجهدة شيخوخة بعد أسبوعين من الإجهاد التأكسدي ؛ لذلك ، تم تقييم جميع علامات الشيخوخة في موعد لا يتجاوز 14 يومًا بعد علاج H-Oz. في الواقع ، أدى علاج H-Oz لـ END-MSCs إلى كتلة التكاثر ، وتضخم الخلايا كما يتضح من زيادة حجم الخلية ، وتراكم الليبوفوسسين المكتشف عن طريق ارتفاع التألق الذاتي ، وظهور SA - - غال ، وتفعيل مسار p21 / Rb وفقدان HMGB1 معًا يدعمان إنشاء الشيخوخة في ظل الظروف التجريبية المختارة (الشكل. ac ، e ، f).

يعتقد أن أكثر الآثار الضارة للخلايا المتشيخة على مستوى الأنسجة والكائنات الحية هي نتيجة لحيويتها الطويلة. تماشياً مع هذه النقطة ، احتفظت الخلايا الجذعية السرطانية النهائية المعالجة بـ H O بصلاحية عالية حتى في المراحل المتأخرة من تطور الشيخوخة (تم تقييم قابلية بقاء الخلايا الجذعية السرطانية النهائية الشائخة 17 يومًا (14 يومًا 3 أيام) بعد الإجهاد التأكسدي الأولي) (الشكل 1 د ). وخلاصة القول ، إن العلاج شبه المميت لـ HO 2- لـ END-MSCs هو النموذج المناسب للشيخوخة المبكرة وهو ذو صلة بالتحقيق في آثار المركبات الحالة للشيخوخة على الخلايا الجذعية الوسيطة النهائية.

لا يحتوي جليكوسيد القلب ouabain على أي نشاط مضاد للشيخوخة تجاه الخلايا الجذعية السرطانية النهائية الشائخة في نطاق تركيز واسع

تشير الأدلة الحديثة إلى أن جليكوسيدات القلب ، بما في ذلك الأوابين والديجوكسين والبوفالين ، تمثل عائلة من المركبات ذات النشاط الانحلالي [25 ، 26]. على الرغم من أن الجليكوسيدات القلبية تعتبر اليوم من العوامل المسببة للشيخوخة واسعة النطاق ، إلا أن البيانات المتعلقة بتأثيرها على hMSCs غير متوفرة. لذلك ، قمنا هنا باختبار ما إذا كان لدى ouabain القدرة على إحداث الموت بشكل انتقائي في كبار السن من MSCs. للقيام بذلك ، قمنا بتقييم قابلية التحكم و MSCs senes-centre الجدوى بعد العلاج مع ouabain في نطاق التركيز الواسع (من 10- 'إلى 10 ~ M). ومن المثير للاهتمام ، أن أيا من التركيز المطبق أدى إلى انخفاض ملحوظ في صلاحية كل من خلايا التحكم والخلايا الشائخة في اليوم الأول بعد تطبيق ouabain (الشكل 2 والشكل التكميلي S1).

ومع ذلك ، في اليوم الثالث بعد علاج ouabain ، كشفنا عن انخفاض كبير يعتمد على الجرعة في قابلية التحكم في نهاية الخلايا الجذعية السرطانية (الشكل 2 أ والشكل التكميلي S1). بشكل غير متوقع ، تبين أن الخلايا الشائخة تكون أكثر مقاومة للأوابين عند كل تركيز تم اختباره. تماشيًا مع هذه النتيجة ، 10- أدى M ouabain إلى موت موت الخلايا المبرمج أكثر عرضة في الخلايا الضابطة (20.75 بالمائة An plus / PI-and 36.47٪ An plus / PI plus) مقارنةً بالشيخوخة (15.01 بالمائة An ＋ / PI - و 12.15 بالمائة An plus / PI plus) (الشكل 2 ب). تظهر النتائج التي تم الحصول عليها بوضوح أنه في سياق الخلايا الجذعية السرطانية النهائية المتخلفة ، لا يوجد نشاط مضاد للشيخوخة في ouabain.

لاستبعاد التأثيرات المحتملة المرتبطة بتنوع المحفزات المسببة للشيخوخة على عمل ouabain التحلل للشيخوخة ، أجرينا مجموعة إضافية من التجارب. وبالتحديد ، تعاملنا مع الخلايا MSCs النهائية باستخدام الإيتوبوسيد بدلاً من الإجهاد التأكسدي للحث على الشيخوخة المبكرة.بيوفلافونويدس الحمضياتعرضت END-MSCs المعالجة بـ Etoposide جميع الميزات النموذجية للخلايا الشائخة (الشكل 3 أ-هـ).

الأهم من ذلك ، لم يكن لدى ouabain أي تأثير انحلالي تجاه الخلايا الجذعية السرطانية النهائية المتخلفة المعالجة بالإيتوبوسيد (الشكل 3f والشكل العقلي المرن الشكل S2). توفر هذه البيانات تأكيدًا إضافيًا للنتائج المذكورة أعلاه ودليلًا على أن عدم وجود التحليل الذي يسببه ouabain ليس نتيجة لمحفز الشيخوخة الملموس المستخدم للحث على الشيخوخة.

الشكل 1 التحقق من صحة نموذج الشيخوخة المبكرة للشيخوخة المبكرة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. Senescent END-MSCs انتشار فضفاض ، b يخضع للتضخم ، c يكتسب تألق ذاتي مرتفع ، يحتفظ بقدرة عالية على البقاء للخلية d وعرض نشاط SA - - مقارنةً بالنشاطات الضابطة. f مستويات الفسفرة لـ p53 و Rb ومستويات التعبير عن البروتينات p21 و HMGBI في السيطرة والشيخوخة END-Ouabain ليس لها أي تأثير انحلالي تجاه الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية من أصول مختلفة لتوسيع ملاحظاتنا فيما يتعلق بغياب التحليل الناجم عن ouabain في الخلايا الجذعية الوسيطة النهائية ، قمنا بتحليل تأثيرات ouabain على hMSCs المعزولة من مصادر أخرى بما في ذلك الأنسجة الدهنية ولب الأسنان وهلام وارتون. لتقوية بياناتنا بشكل إضافي ، طبقنا نماذج مختلفة من الشيخوخة - - الشيخوخة التكرارية لـ AD-MSCs ، والشيخوخة التي يسببها الدوكسوروبيسين لـ DP-MSCs ، والشيخوخة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي لـ WJ-MSCs (الشكل 4 أ-و).

كما هو مبين في الشكل 4g ، اختلفت أنواع مختلفة من hMSCs في الجدوى عند علاج ouabain ، على سبيل المثال ، كان كل من التحكم و DP-MSCs المسن أكثر مقاومة لعمل ouabain من WJ-MSCs (الشكل 4g والشكل التكميلي S3b ، ج). ومع ذلك ، لم يكن ouabain قادراً على إحداث انحلال الشيخوخة في أي نوع من hMSCs الشيخوخة (الشكل 4g والشكل التكميلي S3). معًا ، تُظهر البيانات التي تم الحصول عليها أن غياب التحليل الناجم عن ouabain هو سمة مشتركة لأنواع مختلفة من hMSCs. MSCs. القيم المعروضة تعني ± SD. بالنسبة لمقارنات المجموعات المتعددة في a و d ، تم تطبيق ANOVA أحادي الاتجاه ، n =3 ، ns غير مهم ، *** p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل

فشل القلب بوفالين جليكوسيد في قتل نهاية الشيخوخة MSCS

للتحقق من عدم وجود تأثير حال للشيخوخة من جليكوسيدات القلب تجاه hMSCs ، طبقنا البوفالين ، وهو مركب آخر له نشاط مضاد للشيخوخة مذكور ينتمي إلى عائلة جليكوسيدات القلب [25]. لم يكن لـ Bufalin أي تأثير تقريبًا على قابلية التحكم و H2O 2- المعالجة النهائية لـ MSCs في نطاق تركيز واسع (من 10-7 إلى 10-5 M) (الشكل 5 أ والتكميلي) الشكل S4a).

على غرار ما لاحظناه في علاج ouabain ، كان غياب التحليل على bufalin مستقلاً عن المحفزات المسببة للشيخوخة ، نظرًا لأن قابلية ESCs التي تم تشكيلها إما استجابة للإجهاد التأكسدي أو للإيتوبوسيد لم تتأثر (الشكل 5 أ ، ب ، الشكل التكميلي 5 أ). . S4a ، ب). تؤكد النتائج الموصوفة أعلاه أن جليكوسيدات القلب تبين أنها غير فعالة لتحريض الموت المستهدف في الخلايا الجذعية السرطانية النهائية الشائخة. MSCs. القيم المعروضة تعني ± SD. بالنسبة لمقارنات المجموعات المتعددة في a و d ، تم تطبيق ANOVA أحادي الاتجاه ، n =3 ، ns غير مهم ، *** p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

فشل القلب بوفالين جليكوسيد في قتل نهاية الشيخوخة MSCS

للتحقق من عدم وجود تأثير حال للشيخوخة من جليكوسيدات القلب تجاه hMSCs ، طبقنا البوفالين ، وهو مركب آخر له نشاط مضاد للشيخوخة مذكور ينتمي إلى عائلة جليكوسيدات القلب [25]. لم يكن لـ Bufalin أي تأثير تقريبًا على قابلية التحكم و H2O 2- المعالجة النهائية لـ MSCs في نطاق تركيز واسع (من 10-7 إلى 10-5 M) (الشكل 5 أ والتكميلي) الشكل S4a).

على غرار ما لاحظناه في علاج ouabain ، كان غياب التحليل على bufalin مستقلاً عن المحفزات المسببة للشيخوخة ، نظرًا لأن قابلية ESCs التي تم تشكيلها إما استجابة للإجهاد التأكسدي أو للإيتوبوسيد لم تتأثر (الشكل 5 أ ، ب ، الشكل التكميلي 5 أ). . S4a ، ب). تؤكد النتائج الموصوفة أعلاه أن جليكوسيدات القلب تبين أنها غير فعالة لتحريض الموت المستهدف في الخلايا الجذعية السرطانية النهائية الشائخة.

الشكل 2 لا يوجد لدى Ouabain أي نشاط انحلالي تجاه HO 2- المعالجة النهائية للخلايا الجذعية السرطانية في نطاق تركيز واسع. قابلية بقاء الخلية النسبية (النسبة المئوية) للسيطرة و MSCs النهائية المتقادمة في 3 أيام بعد العلاج بـ 1077،10 ~ 6 ، 10-5 M ouabain. ب تحريض موت الخلايا المبرمج في نهاية MSCs عند 10-6 تقييم M ouabain بواسطة تلطيخ مزدوج من Annexin V / DAPI. ن =3 تجارب مستقلة. تتوافق جميع البيانات مع المتوسط ​​± SD. تم تقييم الأهمية الإحصائية من خلال اختبار ويلش t: ns ليست مهمة ، *** p<>

كل من جليكوسيدات القلب ouabain و bufalin قادران على إحداث موت الخلايا بشكل انتقائي في خلايا A549 و SK-Hep1 الشائخة

مع الأخذ في الاعتبار حقيقة أن نتائجنا لا تتوافق مع الأدلة المنشورة مؤخرًا فيما يتعلق بعمل حال الشيخوخة واسع النطاق لجليكوسيدات القلب ، فقد قررنا إعادة إنتاج هذا التأثير باستخدام النموذج الخلوي الموصوف في الدراسات ذات الصلة [25 ، 26]. وهكذا ، أجرينا سلسلة من التجارب باستخدام خلايا سرطان الرئة A549 الضابطة والشيخوخة. تم تحفيز الشيخوخة في خلايا A549 عن طريق العلاج بالإيتوبوسيد. شيخوخة الخلايا A549 التي يسببها الإيتوبوسيد هي نموذج يستخدم بشكل متكرر وبالتالي يتميز جيدًا للشيخوخة التي يسببها العلاج [4]. أيضًا ، تبين أن ouabain تقتل بشكل انتقائي خلايا A549 المتشخخة المعالجة بالإيتوبوسيد [25]. لإثبات الشيخوخة في A549 ، قمنا بتقييم معدل الانتشار ، حجم الخلية ، تراكم الدهون الدهنية ، SA - - تلوين غال ، حالة التنشيط من مسار p53 / p21 / Rb ، ومستوى تعبير HMGB1 (الشكل 6 أ-هـ).

للتحقق من النشاط الانحلالي لأوابين تجاه الخلايا السرطانية الشائخة ، قمنا أولاً بتقدير قدرة الخلية المعتمدة على الجرعة. تمشيا مع نتائجنا الموضحة أعلاه ، لم نتمكن من اكتشاف أي انخفاض كبير في عدد عناصر التحكم القابلة للحياة أو خلايا A549 الشائخة خلال 24 ساعة بعد تطبيق ouabain (الشكل التكميلي S5a). ومع ذلك ، في غضون 3 أيام بعد العلاج ، قلل ouabain بشكل كبير من صلاحية خلايا A549 الشائخة بطريقة تعتمد على الجرعة ، بينما انخفض عدد خلايا التحكم A549 إلى حد أقل بكثير (الشكل 7 أ والشكل التكميلي S5a). على وجه التحديد ، حافظ ما يقرب من 90 بالمائة من خلايا التحكم على قابلية البقاء في 10- M ouabain مقارنة بنسبة 50 بالمائة من خلايا A549 الشائخة التي تم علاجها بنفس الجرعة (الشكل 7 أ). علاوة على ذلك ، كانت خلايا A549 الشائخة أكثر عرضة لموت الخلايا الناجم عن البوفالين من نظيراتها الضابطة (الشكل 7 ب) (الشكل 5 ب والشكل التكميلي S5b).

وفقًا للبيانات المنشورة ، تسبب ouabain في حدوث موت الخلايا المبرمج المعتمد على caspase -3- في خلايا A549 الشائخة [26]. في الواقع ، كشفنا عن زيادة ملحوظة في الجزء الموجب المزدوج و / أو جزء PI في الخلايا السرطانية الشائخة المعالجة بـ 10-6 M ouabain (الشكل 7 ج). علاوة على ذلك ، باستخدام مقايسة الفلورسنت ، لاحظنا تنشيط كاسباس -3 في خلايا A549 الشائخة المعالجة بأوبين (الشكل 7 د). مجتمعة ، هذه النتائج متوافقة تمامًا مع البيانات التي وصفها مؤلفون آخرون وتؤكد النشاط الانحلالي لأوابين تجاه A549.

أيضًا ، استخدمنا دوكسوروبيسين بدلاً من إيتوبوسيد لإحداث الشيخوخة في A549 (الشكل 8 أ-هـ). كما هو متوقع ، أظهر الشيخوخة A549 المعالج بالدوكسوروبيسين ، وكذلك المعالجة بالإيتوبوسيد ، حساسية أعلى لكل من ouabain و bufalin مقارنة بنظرائهم الضابطة (الشكل 8g والشكل التكميلي S6). هذا الأخير يؤكد أن التأثيرات الحالة للشيخوخة للجليكوزيدات القلبية مستقلة عن المحفزات المسببة للشيخوخة. وبالتالي ، فإن جليكوسيدات القلب لها بالفعل الحالة للشيخوخة

الشكل 3 Ouabain غير قادر على إحداث تحلل الشيخوخة في الخلايا الجذعية السرطانية النهائية المتخلفة المعالجة بالإيتوبوسيد. التحقق من صحة نموذج الشيخوخة الناجم عن الحلقة لـ END-MSCs: قدرة التكاثر ، وحجم الخلية b ، ومستويات التألق الذاتي c و d SA - - نشاط Gal ، ومستوى الفسفرة الإلكتروني لـ Rb ومستويات التعبير عن البروتينات p21 و HMGBI. و قابلية بقاء الخلية النسبية (النسبة المئوية) للخلايا الضابطة والشيخوخة بعد العلاج بـ 10-6 ouabain. القيم تعني ± SD. بالنسبة لمقارنات المجموعات المتعددة في ANOVA أحادي الاتجاه ، تم تطبيق n =3 ، ns غير مهم ، *** p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

أخيرًا ، قررنا إعادة إنتاج التجارب التحليلية على خلايا سرطان الكبد المعالجة بالإيتوبوزيد SK-Help ، وهو نموذج خلوي آخر له تأثيرات مثبتة للشيخوخة لجليكوسيدات القلب وفقًا لـ Guerrero et al. دراسة [25] (الشكل 9 أ-هـ). أظهر SK-Help المسن المعالج بـ Etoposide حساسية أعلى لكلا العاملين مقارنة بنظرائهم الضابطين ، مما يثبت التأثير الانحلالي لجليكوسيدات القلب تجاه هذا النوع من الخلايا (الشكل 9f والشكل التكميلي S7).

تدل هذه البيانات مجتمعة على أن انتقائية انحلال الدم الناجم عن جليكوسيدات القلب تعتمد على طبيعة الخلية أكثر من اعتمادها على محفز الشيخوخة الخرسانية.

تم اقتباس هذه المقالة من علوم الحياة الخلوية والجزيئية (2021) 78: 7757-77776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x