أريل الهيدروكربون المعتمد على مستقبلات

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.2.6. زراعة الإنسان الأساسي EC

تم زراعة EC الأساسي البشري (Lonza ، كولونيا ، ألمانيا) في وسط قاعدي بطاني كامل （EBM） （Lonza ، كولونيا ، ألمانيا） مع 1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون ، 12 ميكروغرام / مل من مستخلص دماغ البقر ، 5 0 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 10 نانوغرام / مل عامل نمو بشرة الإنسان ، و 10 في المائة (س / ت) مصل عجل الجنين عند 37 درجة و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، حتى المقطع الثالث. بعد الانفصال بنسبة 0.05 في المائة (س / س) التربسين / EDTA (Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانيا) ، تمت زراعة الخلايا في أطباق استنبات 6 سم أو 6 أطباق ثقافة جيدة لمدة 18 ساعة على الأقل قبل تعداء أو العلاج.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

2.2.7. تعداء عابر للمفوضية الأوروبية

تم نقل الخلايا كما هو موضح سابقًا [65]. باختصار ، تم نقل EC باستخدام SuperFectTransfection Reagent (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحقيق الإفراط في التعبير أو ضربة قاضية لـ AhR بعد 24 أو 48 ساعة ، على التوالي. كانت كفاءة تعداء العدوى عند الإفراط في التعبير حوالي 40 بالمائة.

2.2.8. فحص الجرح الخدش للمفوضية الأوروبية

للتحقيق في سعة الهجرة للمفوضية الأوروبية ، تم إجراء فحوصات جرح الخدش كما هو موضح سابقًا [66]. بالتفصيل ، تم وضع الجروح في خلية أحادية الطبقة مع مكشطة خلية على طول خط التتبع. بعد الإصابة ، تمت إزالة الخلايا غير المتصلة بالغسيل اللطيف.استخراج الصلصا cistancheتم إجراء علاج الكركمين مباشرة بعد ضبط الجرح. تم إذابة Cur-cumin في DMSO واستخدم عند التركيز النهائي 7.5 ميكرومتر. تم قياس انتقال EC من خلال تلطيخ الخلايا بـ 5 ميكروغرام / مل 4 أوم ، 6- دياميدينو -2- فينيليندول (DAPI) (كارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق بعد إصلاح الخلايا مع 4 في المائة (حجم / حجم) لامتصاص العرق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم التقاط الصور باستخدام المجهر الفلوري Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا)) باستخدام التكبير 200-. تم حساب الخلايا المهاجرة إلى الجرح من خط التتبع تلقائيًا باستخدام وظيفة تحليل الجسيمات في الصورة] 1.52 أ] 67I بعد فصل النوى المتداخلة.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

2.2.9. المناعة من EC

تم تثبيت EC مع 4 في المائة (o / v) بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. بعد النفاذية والحجب في 0. 3 بالمائة (o / o) Triton-X 100 و 3 بالمائة (o / u) مصل الماعز الطبيعي في PBS ، تم تحضين الخلايا بجسم مضاد للأرنب ضد AhR (1: 100 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) أو Nrf2 (استنساخ D1Z9C ، 1: 100 ، تقنية تشوير الخلايا ، فرانكفورت ، ألمانيا) مخفف في مصل ماعز طبيعي بنسبة 1 في المائة (o / v) في PBS طوال الليل عند 4 درجة مئوية. برنامج تلفزيوني وحضنت مع أليكسا 594- إلى جانب الماعز المضاد للأرنب IgG (1: 500 ، Invitrogen ، دارمشتات ، ألمانيا) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.الجذع cistancheبالنسبة لتلوين الأكتين ، تم تحضين الخلايا باستخدام Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1: 7 0 ، Invitrogen ، دارمشتات ، ألمانيا) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمت مواجهة النوى بـ 0.5 ميكروغرام / مل DAPI في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتم تركيب الخلايا باستخدام ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen ، دارمشتات ، ألمانيا). تم التقاط صور الفلورسنت باستخدام مجهر فلوري زايس أكسيو فيجن أوبزيرفر D1 ، مع تكبير 400 × أو 200 ×.

2.2.10. qPCR في الخلايا

تم عزل الحمض النووي الريبي الخلوي الكلي عن طريق الجمع بين التحلل في TRIzolTM والمعالجة النهائية باستخدام مجموعة RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden ، ألمانيا)) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء تخليق (كدنا) باستخدام QuantiTect9 Reverse Transcription Kit ، Qiagen ، Hilden ، ألمانيا）） مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد مستويات النسخ النسبية بواسطة PCR باستخدام 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix ودوران حراري Rotor-Gene Q (Qiagen (Hilden ، ألمانيا)). تم استخدام نسخة البروتين الريبوسومي L32 (rpl32) كمرجع ، وتم حساب التعبير النسبي بواسطة طريقة AC [68]. تم استخدام أزواج التمهيدي التالية التي تمتد عبر Intron: رأس المال (رقم انضمام الجين NM _000499. 5): 5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT -3 '، 5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA -3' ؛ ahr (جين) رقم الانضمام NM _001621. 5): 5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA -3 '، 5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3'؛ sod2 (رقم انضمام الجين NM _000636. 4): 5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3 '؛ 5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC -3' ؛ rpl32 (رقم الانضمام إلى الجينات NM _000994. 4): 5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA -3 '، 5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC {{ 41}} '.

2.3 الفئران

2.3.1. خطوط الماوس وتربيتها

أنثى 8-12- بعمر أسبوع ("صغيرة") و 18- شهر ("قديمة") تعاني من نقص في AHR B6. 129- AHRtmlBra / J (Schmidt et al.، 1996؛ المشار إليها إلى هنا كما تم تربية الفئران AHR-KO) كزيجوت متغاير الزيجوت في منشأة حيوانات IUF. تم استخدام زملائه من النوع البري للسيطرة. تم تربية الفئران والاحتفاظ بها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في دورة مظلمة فاتحة 12/12 ساعة وتلقت طعامًا قياسيًا (شم "MZ ، SNIFF ، Soest ، ألمانيا) حسب الرغبة. 2.3.2.qPCR في الفئران

تم عزل مجموع الحمض النووي الريبي من أنسجة أعضاء لثلاثة فئران تعاني من نقص في AHR مع TriZol [. ثم تم نسخ 400 نانوغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي M-MLV (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) والبادئات العشوائية السداسية. تم قياس مستويات التعبير الجيني في نسختين لكل أنسجة فأر على Rotor-Gene Q (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا） ، في حجم نهائي 15 ميكرولتر ، يحتوي على 7.5 ميكرولتر Rotor Gene SybrGreen TM （Biorad ، Feldkirchen ، ألمانيا） ، 1 ميكرولتر من كل تمهيدي ، 1.5 ميكرولتر (كدنا) وماء خالٍ من الحمض النووي الريبي. كانت كفاءة التمهيدي بين 90 في المائة و 146 في المائة. راجع الجدول S2 لتسلسل التمهيدي والكفاءات. تمت معايرة مستويات التعبير للتعبير عن RPS6 كجين تدبير منزلي في نفس العينة باستخدام {{13 }} طريقة التصوير المقطعي المحوسب [69].

2.4 في تحليلات السيليكو

نمذجة التنادد من CeAhR LBD

تم إنشاء النموذج الهيكلي لـ C. elegans AhR LBD (بقايا 267-372) عن طريق نمذجة التماثل. تم استخدام هياكل الأشعة السينية لمجالات PASB لأفراد عائلة bHLH-PAS المتجانسين الذين يتشاركون هوية التسلسل الأعلى (حوالي 20 بالمائة) مع CeAhR PASB كقوالب: دورات الإخراج الحركية اليومية kaput (CLOCK ، PDB: 4F3L) ، البروتين 3 المحتوي على مجال PAS العصبي (NPAS3 ، PDB: 5SY7) ، العوامل المحفزة بنقص الأكسجة 20 (HIF2o ، PDB: 3H82 ، 4ZP4 ، 3F1N) و lo (HIFlo ، PDB: 4H6J). تم الحصول على النموذج مع MODELLER [70-72].فوائد cistanche tubulosa والآثار الجانبيةتم اختيار النموذج الأمثل من بين العشرة التي تم إنشاؤها ، بناءً على أفضل DOPE SCORE [73]. تم تقييم جودة النماذج باستخدام PROCHECK [74]. تم إرجاع الهياكل الثانوية بواسطة DSSPcont [75]. تم تمييز تجويف الربط داخل LBDs المنمذجة باستخدام خادم CASTp [76]. تم إنجاز تصور النماذج باستخدام PYMOL [77].

2.5 التحليل الإحصائي

ما لم يُذكر خلاف ذلك ، تم إجراء التحليلات الإحصائية في GraphPad Prism (الإصدار 6.01) (برنامج GraphPad ، شركة سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). لمقايسات مدى الحياة / الصحة ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام OASIS [53]. تم إجراء التحليل الإحصائي لبيانات المصفوفات الدقيقة في R (مؤسسة R (فيينا ، النمسا)). تم إنشاء Boxplots في GraphPad Prism (الإصدار 6.01) (GraphPad Software، Inc. سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتعرض الوسيط (الخط) و 25-75 النسبة المئوية (المربع) و 10-90 النسبة المئوية (شعر اللحية).

3. النتائج

3.1. يعزز الكركمين فترة الصحة بطريقة مستقلة ومعتمدة على AhR

يؤدي فقدان ahr -1 إلى تعزيز صحة C.elegans وعمرها في الظروف القاعدية [14] ويؤثر سلبًا على السمات المرتبطة بالعمر استجابة لمعدلات AhR في الثدييات ، مثل benzo [a] pyrene (BaP) و UVB الضوء ، والجراثيم [25]. تشكل مادة البوليفينول الغذائية ، مثل cur-cumin ، مجموعة مهمة من مُعدِّلات AhR في الثدييات مع تأثيرات مؤيدة لطول العمر في C. elegans [78،79]. وبالتالي ، فقد بحثنا في تأثير إطالة عمر الكركمين لاعتماده على ahr -1. مدد الكركمين بشكل متكرر وبشكل ملحوظ فترات الحياة والصحة لـ C. ايليجانس بطريقة تعتمد ahr -1- (الشكل 1 أ ، ب). سابقًا ، أظهرنا أن فقدان ahr -1 يؤدي أيضًا إلى إطالة العمر الافتراضي لنماذج مرض هنتنغتون ومرض باركنسون ، مع زيادة التعبير العضلي عن بولي جلوتامين (polyQ40) و- سينوكلين (-syn) ، على التوالي ، على التوالي ، في نفس الوقت زيادة محتواها من مجاميع البروتين [25]. ومن المثير للاهتمام ، أن علاج الكركمين زاد من عدد مجاميع polyQ40 و -syn بنفس القدر مثل ahr -7 فقدان الوظيفة (الشكل 1C). عزز الكركمين أيضًا عمر وقدرة الحركة في نماذج الأمراض هذه (الشكل 1DE) ، ولكن آثار فقدان ahr -1 ومكملات الكركمين كانت مضافة في PolyQbackground (الشكل 1 د) ، مما يكشف عن وظائف الحماية المستقلة لـ AHR -1- من الكركمين على الأقل في هذه الخلفية المهددة.

الشكل 1. يعزز الكركمين الصحة بطريقة تعتمد على AHR -1- ومستقلة. منحنيات العمر (A) و health span (B) للديدان الخيطية المعالجة بـ DMSO أو الكركمين بالوزن و ahr -1. تعرض منحنيات البقاء بيانات مجمعة عن 290-300 ديدان / حالة في 5 تجارب. الاختبار الإحصائي: اختبار الترتيب اللوغاريتمي ، # الأهمية مقابل DMSO ، * الأهمية مقابل الوزن ، قيمة Bonferronip<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt -45 يتوسط التأثيرات المضادة للشيخوخة للكركمين و ahr -1 نضوب

بحثًا عن مؤثرات محتملة تعتمد على ahr {0}} للكركمين ، اتخذنا أساليب مستهدفة وغير متحيزة. درسنا التعبير عن الجينات المستهدفة للثدييات الكلاسيكية AhR وركزنا على جينات Cyp لأن الكركمين يغير تعبير CyplA1 و CyplB1 في خلايا الثدييات [80،81]. ومع ذلك ، فإن التقدير الكمي لـ 47 نوعًا مختلفًا من أنواع الأنواع في C.elegans بواسطة PCR في الوقت الفعلي شبه الكمي (qPCR) كشف أن شجرة السنب -13 B1 فقط تم تنظيمها بشكل كبير إما عن طريق استنفاد ahr -1 أو عن طريق الكركمين بطريقة تعتمد على ahr -1- (الشكل S1A-B) ، بينما كانت الأنواع الثلاثة الأخرى (أي cyp -13 A5 و cyp -13 A8 و cyp -42 A1) يزيد الكركمين فقط في حالة عدم وجود ahr -1 (الشكل S1). تشير هذه البيانات ، جنبًا إلى جنب مع الأعمال الأخرى [25،82] ، إلى أن الفصائل القروية ليست على الأرجح الأهداف الرئيسية لـ CeAhR. ويدعم هذا أيضًا تحليلنا الترانسكريبتومي في الطفرات من النوع البري و ahr -1. في الواقع ، بما يتوافق مع دور AHR -1 في تحديد الخلايا العصبية [37،38،40،41] ، فإن تغير التعبير الجيني بين طفرات من النوع البري و ahr -1 أظهر ثراءً في العمليات المرتبطة بتطور الخلايا العصبية والتمايز وعدم وجود تغييرات كبيرة في جينات إزالة السموم الكلاسيكية (الشكل 2 أ). تحليل qPCR لبعض الجينات الأكثر تنظيماً وتنظيماً بين ahr -1 (jul45) والنوع البري (atf -2 ، K04H4.2، egl -46، T20F5.4، ptr -4، dyf -7، clec -209، C01B4.6، C01B4.7، F56A4.3) في الغالب أكدوا تبعية ahr -1- في الظروف القاعدية (الشكل 2 ب) ولكن لم يؤثر UVB [25] ولا الكركمين (الشكل 2C) بشكل كبير على التعبير عن هذه الجينات. تساءلنا عما إذا كانت التغييرات في التعبير في هذه الجينات محفوظة تطوريًا وقيمنا تعبيرها في الأنسجة المختلفة (مثل الدماغ والكبد والأمعاء والدم) من 8- و 18- شهر من النوع البري و الفئران AhR KO. أظهرت بعض الجينات ميلًا إلى زيادة التعبير في الفئران الصغيرة (متجانسة -2) أو القديمة (متماثل -4 / 5 lpr) بطريقة خاصة بالأنسجة ، ولكن لم يكن هناك نمط واضح ولا تغييرات محفوظة. لوحظ (الشكل S2). تعكس هذه النتائج الاختلافات المحتملة الخاصة بالأنواع أو نشاط النسخ AhR المعتمد على الأنسجة في الثدييات الذي تم التغاضي عنه من خلال تحليل النسخ للحيوانات الكاملة في C. elegans. كشف فحص شامل للجينات الأكثر تباينًا بين C. elegans wild-type و ahr -1 (jul45) أن التعبير عن العديد من هذه الجينات يتأثر في C. على سبيل المثال ، كيرسيتين وريسفيراترول) [25] ، مما يشير إلى دور AHR -1 في التعبير الجيني المعدل بالبوليفينول. تمشيا مع هذا السيناريو ، أظهرت بيانات ميكروأري أن معظم الجينات المعبر عنها تفاضليًا عند علاج الكركمين تم تنظيمها بالفعل بطريقة تعتمد على ahr -1- (الشكل 2 د ؛ الجدول 1).استخراج cistanche tubulosaمن بين 47 جينًا تم تغييرها بواسطة الكركمين في النوع البري (43 جينًا أعلى و 4 جينًا خاضعًا للتنظيم) ، تم أيضًا تحفيز 5 جين فقط بواسطة الكركمين في ahr -1 (ju145). من بين الجينات التي ينظمها الكركمين بطريقة تعتمد على AHR -1- إنزيمات الطور Il ، ومن المثير للاهتمام أن بعضًا منها (ugt -9 و ugt -29) تم تنظيمها في نفس الاتجاه بواسطة الكركمين أو عن طريق خسارة ahr -1 (الجدول 1). وبالتالي ، تحققنا من تعبيرها وتعبير ugt الإضافية (ugt -45 و ugt -57) التي تم التعبير عنها بشكل مختلف عند تطبيق تحليل إحصائي أقل تقييدًا ولم يتم تصحيحه لمقارنات متعددة. من بين الجينات التي تم فحصها ، تمت زيادة ugt -45 في ahr -1 (ijul45) ومن خلال علاج الكركمين (الشكل 3 أ ، ب) ، كما لاحظنا تغيرات في التعبير عن بعض جينات إزالة السموم بين النوع البري والنوع البري الفئران AhR KO بطريقة تعتمد على الأنسجة. كان التعبير التفاضلي لتلك الجينات أعلى مستوى في الدماغ ، حيث كان Ugt2a3 (ugt -9 و ugt -29 في C.elegans) منخفضًا و Hpgds (gst -4 في C. elegans) تم تنظيمه (الشكل S3A). لم يكن هناك أي تغيير في التعبير عن أي من الجينات المختبرة في عينات الكبد للفئران (الشكل S3B). تماشيًا مع بيانات C ، elegans ، أظهر ugt -45 متماثل الفئران Ugt3a2 ميلًا نحو الإفراط في التعبير في أمعاء الفئران Ahr KO (الشكل S3C). والجدير بالذكر أن ugt -45 منعت RNAi الآثار المفيدة على فترات الحياة والصحة التي يعززها استنفاد الكركمين (الشكل 3C ، D) أو استنفاد ahr -1 (الشكل 3E ، F) مما يشير إلى أن التدخلين قد يعتمدان على تعدل بشكل مشترك إشارات المصب لاستنباط نشاطها المضاد للشيخوخة.

الشكل 2. الجينات التي ينظمها الكركمين تفاضليًا يتم تنظيمها بشكل أساسي بطريقة تعتمد على ahr -1- (أ) إثراء علم الجينات (GO) للعمليات البيولوجية بعد اندماج مصطلح GO في ahr -1 مقابل wt. (ب ، ج) تم تقييم التعبير عن الجينات الأقوى والأكثر تنظيمًا بين الوزن والوزن -1 [25] بواسطة qPCR بالوزن مقابلahr -1 (B) و DMSO-vs . الديدان الخيطية المعالجة بالكركمين (C). تعرض Boxplots بيانات من 3 تجارب. يظهر التعبير بالنسبة إلى الوزن المعالج بـ DMSO (خط متقطع). الاختبار الإحصائي: 1- way ANOVA مع اختبار Tukey للمقارنات المتعددة ، * p-value<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

الشكل 3.ugt -45 مطلوب لإطالة عمر طفرات الكركمين و ahr -1. (أ ، ب) تم تقييم التعبير الجيني بواسطة qPCR بالوزن مقابلahr -1 (A) و DMSO- مقابل الديدان الخيطية بالوزن المعالجة بالكركمين (B). تعرض Boxplots بيانات من 3 تجارب. يظهر التعبير بالنسبة إلى الوزن المعالج بـ DMSO (يشار إليه كخط متقطع). الاختبار الإحصائي: 2- Way ANOVA باستخدام اختبار المقارنات المتعددة لـ Sidak ، * القيمة الاحتمالية<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3 AHR -1 والكركمين يحميان بشكل مستقل من الإجهاد التأكسدي

غالبًا ما تُعزى الخصائص المفيدة للبوليفينول إلى قدرتها على الحماية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)|83،84]. نظرًا لأن AhR متورط في عمليات الأكسدة التي تتم بوساطة الإجهاد [85-87] ، فقد تساءلنا عما إذا كان الكركمين قد يؤثر على فسيولوجيا الحيوانات من خلال الاستجابات المضادة للأكسدة التي تنظمها AhR. لاحظنا أن ahr -1 المسوخ يؤيد المزيد من الميتوكوندريا (طن متري) ROS ولديه إمكانات منخفضة لغشاء الميتوكوندريا (الشكل 4 أ ، ب) ، معلمتان ترتبطان بطول العمر [88،89]. بينما تتفق هذه الحيوانات مع نموذج تكوين الميتوهورم ahr -1 (jul45) تنتج كمية أكبر قليلاً من mtROS وتعيش لفترة أطول ، كانت هذه الحيوانات أكثر حساسية للإجهاد التأكسدي من النوع البري. على وجه التحديد ، كانت التأثيرات الضارة الناجمة عن juglone و H2O2 على الحيوانات القافزة والحركية والبقاء أقوى بشكل ملحوظ في ahr -1 (jul45) مقارنة بالنوع البري (الشكل 4C-F). تشير هذه البيانات إلى أن استنفاد AHR -1 له تأثيرات حركية مفيدة في الظروف القاعدية ، في حين أن وجوده ضروري للحماية من الإجهاد التأكسدي ، وبالتالي فصل اثنين غالبًا من العوامل المرتبطة بالعمر ، وهما العمر ومقاومة الإجهاد. بدلاً من ذلك ، حسّن الكركمين بشكل ملحوظ مقاومة H و O و juglone في كل من المسوخات من النوع البري و ahr -1 (الشكل 4E ، F) ، مما يشير إلى أن الكركمين يثير استجابة مضادة للأكسدة مستقلة ahr -1-. تمشيا مع التنظيم غير المنفصل لمقاومة العمر ومقاومة الإجهاد التأكسدي ، لم يؤثر إسكات ugt -45 على الحساسية للإجهاد التأكسدي سواء بالنسبة للطفرات -1 أو الحيوانات المعالجة بالكركمين (الشكل 4-4).استعراض cistanche tubulosaوبالتالي ، فإن الكركمين له تأثيرات داعمة لطول العمر عبر ahr -1 و ugt -45 ، ولكنه يحمي من الإجهاد التأكسدي من خلال آليات ahr {3}} المستقلة.

3.4. Nrf2 / SKN -1 يتوسط التأثيرات المستقلة لـ AhR للكركمين

لمزيد من تقييم الحديث المتبادل AhR-curcumin في الميزات الإضافية المرتبطة بالعمر ، قمنا بقياس قدرة الهجرة في EC الأساسي البشري - وهي سمة مميزة لوظيفة السفينة ، والتي تتراجع مع تقدم العمر [90] ويتم تقليلها بواسطة تنشيط AhR [14]. تمشيا مع النشاط المضاد للشيخوخة لقمع ahr -1 والكركمين ، تم تثبيط تعبير AhR بشكل كبير ، بينما زاد الكركمين ، قدرة الهجرة للمفوضية الأوروبية الأساسية (الشكل 5 أ). وتجدر الإشارة إلى أن استقراء قدرة الهجرة بواسطة الكركمين كان مشابهًا في الخلايا المنقولة بالناقلات الفارغة أو خلايا التعبير AhR (الشكل 5A). ومع ذلك ، تم تقليل هجرة الخلايا المعالجة بالكركمين بشكل كبير عن طريق الإفراط في التعبير عن AhR: يحفز الكركمين في الخلايا الفارغة المنقولة بالنواقل ما يصل إلى 60 خلية مهاجرة لكل مجال طاقة عالي ، بينما في خلايا AhR المفرطة في التعبير فقط ما يصل إلى 25 خلية لكل مجال طاقة عالي (الشكل 5 أ). تشير هذه البيانات إلى أن التأثير المؤيد للهجرة للكركمين يتم تعديله بواسطة آليات مستقلة عن AhR ولكن ربما أيضًا عن طريق تقليل نشاط AhR. حددنا بعد ذلك توزيع AhR داخل الخلايا والتعبير عن cVplal في EC البشري المعالج بالكركمين ، لم يؤثر الكركمين على نقل AhR النووي (الشكل 5 ب) أو التعبير السيبلالي (الشكل 5 ج). بحثًا عن المسارات المعدلة بواسطة الكركمين بطريقة مستقلة عن AhR ، عدنا إلى ملفات تعريف النسخ للديدان الخيطية للعثور على عوامل النسخ التي تنظم الجينات المعدلة بشكل كبير عن طريق فقدان ahr -1 أو عن طريق علاج الكركمين في الحيوانات البرية (الجدول 1 ). حدد هذا البحث في السيليكو عامل نسخ الأكسدة والاختزال SKN -1 ، وهو أخصائي تقويم العظام للعامل Nrf2 البشري (العامل النووي الكريات الحمر 2-) ، والذي غالبًا ما يتم الإبلاغ عن تنشيطه بواسطة الكركمين [91] كوسيط محتمل لـ نشاطه المضاد للأكسدة [92،93]. وفقًا لذلك ، فإن النموذج الأولي C.elegans Nrf2 / SKN -1- الجين المعتمد ، gst -4 ، يتم التعبير عنه بشكل مفرط في -1 متحولة [25] ويتم تحفيزها بواسطة الكركمين في النوع البري وأكثر من ذلك في الطفرات ahr -1 (الشكل 5 د). علاوة على ذلك ، زاد الكركمين من الاستقرار والانتقال النووي لـ Nrf2 في EC البشري الأولي (الشكل 5E) وأثار التعبير عن ديسموتاز المنغنيز الفائق (Sod2) - وهو جين مستهدف كلاسيكي Nrf2 - في الخلايا المنقولة بواسطة ناقل فارغ أو في الخلايا التي فيها تم إسكات AhR بواسطة shRNA (الشكل 5F). قد يكون نقص تحريض Sod2 بواسطة AhR shRNA في EC ناتجًا عن انخفاض جزئي (50 بالمائة) في التعبير (الشكل S3D) ، والذي قد لا يكون كافيًا لبدء تنشيط Nrf2 أو عامل النسخ الإضافي (TF) ، والذي ، في C.elegans ، قد توافق على تحريض gst -4 [94] عند استنفاد AhR الكامل. ومن المثير للاهتمام ، أن Hpgds ، وهو متماثل لـ C.elegans gst -4 ، قد زاد بشكل كبير في دماغ فئران AhR KO (الشكل S3A) ولكنه ليس هدفًا لـ Nrf2. هناك دليل آخر على الإشارات المستقلة المحتملة لـ Nrf2 / SKN -1 التي يتم تنشيطها بواسطة استنفاد ahr -1 وهو أن تنشيط gst -4 بواسطة الكركمين يتم تثبيته تمامًا بواسطة الجلد -7 RNAi في C.elegans wild type ، في حين أن طفرات ahr -1 لا تزال تحفز gst -4 على الرغم من نضوب الجلد -1 (الشكل 5G، H). ومع ذلك ، قلل الجلد -1 RNAi من مقاومة الإجهاد التأكسدي في كل من النوع البري و ahr -1 (ju145) (الشكل 5I). بشكل غير متوقع ، لم يؤثر إسكات الجلد -1 على مقاومة juglone للحيوانات المعالجة بالكركمين (الشكل 5I). تكشف بياناتنا عن سيناريو معقد حيث يعزز الكركمين ميزات مختلفة لمكافحة الشيخوخة تعتمد إما على إشارات تعتمد على AhR أو مستقلة عن AhR ولكن تعتمد على Nrf2 / SKN -1- (وإضافية).

الشكل 4. AHR -1 والكركمين بشكل مستقل يحميان من الإجهاد التأكسدي. (أ) الصور التمثيلية (يسار) وتقدير كثافة DSRed (يمين) في نيماتودا ملطخة بـ MitoSOX أو ahr {3}}. تعرض Boxplots بيانات مجمعة من 129-135 ديدان / ظروف في 3 تجارب. (ب) تم تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا بواسطة تلطيخ TRME في الديدان الخيطية من الأعمار المشار إليها. يتم عرض الصور التمثيلية (يسار) والتقدير الكمي للفلورة TMRE (يمين). تعرض Boxplots بيانات مجمعة من 3 تجارب (C ، D) نشاط ضخ البلعوم (C) والحركة (D) للوزن و ahr -1 طفرات بعد علاج H2O2. تعرض Boxplots بيانات مجمعة من 39-54 (C) أو 35-36 worms / condition (D) في 3-4 تجربة. * p-value<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

الشكل 5. ينشط الكركمين Nrf2 / SKN -1 بشكل مستقل عن AhR. (أ) اختبار خدش الجرح في الكركمين (cur) - أو EC الأساسي البشري المعالج بـ DMSO المنقولة بواسطة ناقل فارغ (EV) أو ناقل تعبير لـ AhR الإنسان. اللوحة العلوية: صور تمثيلية ؛ يمثل الخط المتقطع بداية الترحيل. شريط النطاق: 100 أم. اللوحة السفلية: القياس الكمي ؛ تعرض boxplots بيانات 4-6 من التجارب. الاختبار الإحصائي: 1- way ANOVA، * p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5 عرض الكركمين و Pro-Oxidants تأثيرات معاكسة على نشاط AHR -1

تمشيا مع تأثير مكافحة الشيخوخة لانخفاض تعبير / نشاط AhR ، تشير بياناتنا إلى أن الكركمين قد يطيل عمر الربداء الرشيقة عن طريق قمع -1- المسارات المنظمة من خلال تقليل تعبير / نشاط AHR -1 أو التمثيل على مسارات إشارات المصب المشتركة. ومن ثم ، حاولنا تحديد نشاط AHR -1 في C.elegans ، ولكن هناك محاولات عديدة لتقييم تعبير AHR -1 والتوطين دون الخلوي باستخدام الأجسام المضادة (ضد AhR للثدييات أو الأجسام المضادة المخصصة ضد CeAhR) أو ذات العلامات الفلورية المراسلين (OP562 ، UL1709 ، ZG93) لم يقدموا أدلة ذات مغزى. بالنظر إلى أن AHR -1 يرتبط بـ XREs في المختبر [35] ، فكرنا في استخدام التعبير الجيني الذي يحركه XRE كقراءة لنشاط AHR -1. وهكذا ، لجأنا إلى خلايا Cos7 المشتقة من القرود ، والتي لا تعبر عن AhR الذاتية وبالتالي لا تعرض نشاط AhR داخلي [95،96] ويمكن استغلالها لمراقبة تحريض Luciferase الذي يحركه XRE كقراءة لـ AHR -1 (Larigot et al. ؛ تم تقديمه مع هذه الدراسة). عندما تم نقل خلايا Cos7 بشكل مشترك مع المتجهات التي تعبر عن C.elegans AhR / alr -1 و ARNT / aha -1 ومحفز للجين البشري CYPIA1 يحتوي على لوسيفيراز [64] AHR { أظهر {27}} نشاطًا منخفضًا في الظروف القاعدية (المعالجة بالمركبة). من الجدير بالذكر أن العلاج باستخدام الكركمين أو غيره من المغذيات التي تعزز الشيخوخة الصحية في الربداء الرشيقة ، مثل اللوتين [97] والريسفيراترول [98،99] ، أدى إلى تثبيط نشاط AHR -1 بشكل كبير (الشكل 6 أ-ج). بدلاً من ذلك ، لم يؤثر BaP و leflunomide ، المعروفين بمنشطات AhR في الثدييات ، على نشاط AHR -1 (الشكل 6 أ ، ب) بتركيزات استخدمناها. والجدير بالذكر أن نشاط AHR -1 قد تم إلغاؤه في خلايا Cos7 المنقولة بواسطة ناقل يعبر عن أليل ahr -1 (jul45) بدلاً من أليل من النوع البري (الشكل 6A-C) ، مما يشير إلى أن jul45 صحيح أليل فقدان الوظيفة وأن شدة اللوسيفيراز المقاسة ترجع إلى AHR الوظيفي -1.

سعينا بعد ذلك إلى التحقق مما إذا كان الكركمين يقلل من نشاط AHR -1 عن طريق الربط المباشر أو التعديل غير المباشر. حتى الآن ، لم يتم تحديد أي روابط لـ C.elegans AHR -1 ، وبما أنه لا توجد معلومات متاحة عن LBD ، فقد أجرينا تحليلًا بالسيليكو لتوصيفها. تمت محاذاة شكلي AHR -1 ، la و 1b ، وعلى الرغم من اختلافهما في الطول ، إلا أن تسلسل مجال PASB الخاص بهما متطابق. تمت محاذاة هذا التسلسل بعد ذلك مع مجال PASB الخاص بـ Drosophila melanogaster ، ومع نطاق اثنين من AhRs من الفقاريات التي تم إنشاء نماذج هيكلية لها سابقًا ، وهما الفأر (Mus musculus) [100] ، وسمك الزرد (Danio rerio) [101] (الشكل 6 د). أظهرت المحاذاة اختلافات واضحة بين الأنواع ذات الخصوصية الرئيسية لللافقاريات التي تحجب تسلسل الحذف في المنطقة الأكثر تغيرًا في مجال PAS ، المقابلة للمنطقة المرنة ، بما في ذلك الحزمة الحلزونية (الحلزونات C ، D ، E) والحلقات القصيرة التي تربط هذه العناصر (الشكل 6 د ، ه). يمكن أن تقلل عمليات الحذف هذه المساحة المتاحة في تجويف الربط لهذه AhRs. ثم أنشأنا نموذجًا ثلاثي الأبعاد لـ AHR -1 PASB عن طريق نمذجة التماثل. يقدم هذا النموذج طية PAS النموذجية ، ولكن مع حلزون Do أقصر مقارنةً بـ AhRs الأخرى. ومع ذلك ، فإن التجويف الداخلي لديه بعض الخصائص ؛ يحتوي على المزيد من المخلفات الكارهة للماء ويتم اقتطاعه إلى النصف بواسطة بعض السلاسل الجانبية الداخلية. على وجه الخصوص ، تواجه H365 و H274 ويمكن أن تشكل رابطة هيدروجينية في منتصف التجويف ؛ علاوة على ذلك ، يمكن أن تعيق السلاسل الجانبية Y332 و L363 و L302 التجويف ، مما يقلل المساحة الداخلية المتاحة للروابط (الشكل 6E). هذا التجويف الصغير والمبتور على الأرجح لا يسمح بربط الروابط الكبيرة (على سبيل المثال ، TCDDor الكركمين). على غرار النموذج الهيكلي AHR -1 ، أظهر نموذج لسمك الزرد zfAhRla أن تجويف LBD يتم اقتطاعه مقارنةً بمشابهات ربط TCDD zfAhR1b و zfAhR2 [101]. تقوم الروابط الصغيرة والمرنة ، مثل leflunomide ، بربط وتنشيط zfAhRla ، لكن تركيز leflunomide الذي اختبرناه لم ينشط AHR -1 في نظام خلايا Cos7 لدينا (الشكل 6 ب). ثم تساءلنا بعد ذلك عما إذا كانت الطفرات في الأحماض الأمينية المسؤولة عن التجويف الصغير لـ LBD قد تسمح للروابط الكلاسيكية بتنشيط CeAhR. تتطابق بقايا CeAhR L363 (الشكل 6 د) مع A375 في mAhRb-I و V375 في مدريد ، وهذه البقايا لها تأثير كبير على ربط الترابط [102]. وبالمثل ، يسهم T386 من zfAhRla (الشكل 6D) ، المطابق لـ A375 في mAhRb -1 و A386 في zfAhR1b و zfAhR2 ، في عدم وجود ارتباط TCDD لـ zfAhRla ، وعند التحول إلى ألانين ، يستعيد حساسية TCDD عندما يكون Y296H أيضًا قدم [101]. الحمض الأميني Y296 هو بالفعل هيستيدين في C.elegans (H274). وهكذا ، قمنا بتحور فقط الليوسين في الموضع L363 في ناقل CeAhR إلى ألانين (L363A) (الشكل 6D ، E المشار إليه بواسطة سهم). علاوة على ذلك ، قمنا بتحور الهيستيدين القريب في الموضع H365 إلى الجلوتامين (H365Q) ، وهو Q377 في الفئران (الشكل 6D ، E المشار إليه بواسطة سهم) لأنه من المحتمل أن يشكل رابطة هيدروجينية مع H274 وقد يساهم في التجويف الصغير لـ AHR { {49}} (الشكل 6E). ثم اختبرنا ما إذا كانت روابط AhR للثدييات تؤثر على نشاط AHR -1 عند تحور L363 و H365. ومع ذلك ، فإن هذه التعديلات ، بدلاً من استعادة الاستجابة للروابط الغريبة الحيوية كما في الزرد [101] ، ألغت حتى نشاط AHR الأساسي -1 ، على غرار أليل ju145 (الشكل 6F). تُظهر هذه النتائج اختلافات واضحة بين LBDs في C.elegans وسمك الزرد ، لكنها تُظهر أن LBD أساسي لنشاط AHR الأساسي -1. جنبًا إلى جنب مع الدراسات السابقة [35،38،82] ، تشير نتائجنا إلى أنه من غير المحتمل أن تشارك AHR -1 في استجابة المعاملات الكلاسيكية التي يسببها الكائنات الحية الأحيائية ، والتي قد لا تكون بالتالي ذات صلة بتنظيم ahr -1- الشيخوخة الفسيولوجية. بدلاً من ذلك ، قد تمارس المركبات المشتقة من النباتات تأثيرات محفوظة على الأقل جزئيًا عن طريق قمع -1- المسارات المعدلة AHR. يقترح نموذجنا ثلاثي الأبعاد أن الكركمين لا يعدل نشاط AHR -1 من خلال ربط LBD الخاص به. وبالتالي ، فإن قمع نشاط AHR -1 بواسطة الكركمين يمكن أن يكون بسبب تأثيره المضاد للأكسدة. تمشيا مع هذا الاحتمال ، والحساسية المتزايدة لطفرات C.elegans ahr -1 للإجهاد التأكسدي ، وجدنا أن نشاط AHR -1 يزداد بالفعل عن طريق العوامل المسببة لـ ROS. على وجه التحديد ، أظهرت خلايا Cos7 التي عولجت بالروتينون المؤكسد زيادة نشاط AhR عند نقل العدوى إما مع C.elegans أو الفئران AhR ولكن ليس عند نقلها باستخدام أليل jul45 أو الأليل مع طفرات LBD (الشكل 6G ، H).

بشكل عام ، في حين أن تنشيط CeAhR يحمي من الإجهاد التأكسدي في وقت مبكر من الحياة ، فإن تعبيره المنخفض يقاوم الشيخوخة ويتوسط التأثير المفيد لمكافحة الشيخوخة للكركمين (الشكل 7). وبالتالي قد يساعد الكركمين في موازنة تنشيط TF الأكسدة والاختزال بطريقة تعتمد على السياق والوقت ويفضل قمع AhR مباشرة من خلال تأثيره المضاد للأكسدة و / أو من خلال تنشيط Nrf2 / SKN -1 (أو TF آخر) ، والذي قد يكون في نفس الوقت التوسط في نشاط مكافحة الشيخوخة للكركمين.

الشكل 6. الكركمين والمواد المؤكسدة لها تأثيرات معاكسة على نشاط AHR -1. (AC) تقييم نشاط AHR -1 بعد العلاج بالمركبات المشار إليها في خلايا Cos7 المنقولة إما بالوزن AHR -1 (بالوزن) أو AHR -1 الذي يحمل طفرة نقطة ju145 (ju145) و AHA -1 بالإضافة إلى luciferase المستحث بـ XRE. تعرض Boxplots بيانات 3-5 تجربة. * قيمة احتمالية<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

الشكل 7. نموذج مقترح لمسار إشارات AHR -1 في استجابة C.elegan للمواد المؤيدة ومضادات الأكسدة. في الظروف "العادية" (اللوحة الوسطى) ، يتم تنشيط AHR -1 بواسطة ROS داخل الخلايا. يؤدي هذا إلى التخلص من المرافقين من AHR العصاري الخلوي -1 والانتقال النووي اللاحق لـ AHR -1. في النواة ، يشكل AHR -1 مغايرًا مع المترجم النووي AHR (AHA { {7}}) ويرتبط بـ XREs للجينات المستهدفة ، مما يؤدي بدوره إلى انخفاض مستويات ROS داخل الخلايا. في هذه الظروف ، يؤدي فقدان وظيفة ahr -1 إلى زيادة العمر الافتراضي. في ظل وجود مضادات الأكسدة (اللوحة اليسرى) ، تكون تركيزات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا منخفضة مما يؤدي إلى استقرار AHR -1 في السيتوبلازم المرتبط بعوامله المساعدة. يؤدي تثبيط نشاط AHR الأساسي -1 إلى إطالة العمر الافتراضي. في وجود المؤكسدات المؤيدة (اللوحة اليمنى) يتم تنشيط AHR -1 عن طريق ROS المفرط ، مما يؤدي إلى انتقاله النووي ، وتكوين AHR -1- AHA -1 غير المتجانسة ، وبدء النسخ الجيني المستهدف. في شهر -1 KO ، أدى تقليل إزالة السموم من ROS من خلال الجينات المستهدفة المستحثة AHR -1- إلى تراكم ROS وجعل ahr -1 KO عرضة للتأثر.

4. مناقشة

تم اكتشاف AhR في الأصل في الثدييات بسبب نشاط استجابة الكائنات الحية الغريبة الناجم عن ارتباط المواد السامة البيئية أو الروابط الداخلية ، ولكن توجد أيضًا عوامل لا تعتمد على الارتباط بالرابط ولكن يتم التحقيق فيها بشكل أقل بكثير. يمثل C.elegans كائنًا نموذجيًا فريدًا للتحقيق في أنشطة AhR المستقلة عن استجابته للأحياء الغريبة التقليدية نظرًا لأن CeAhR لا يربط النموذج الأولي بروابط AhR [35 ، 39]. باستخدام هذا النموذج ، حددنا وظيفة محفوظة تطوريًا لـ AhR في عملية الشيخوخة [14] وأظهرنا أن بعض مُعدِّلات AhR في الثدييات (مثل البكتيريا ، Bal ، و UVB) تؤثر على معلمات الشيخوخة من خلال AHR -1 في بطريقة تعتمد على السياق [25]. هنا ، تابعنا النتائج السابقة التي توصلنا إليها بإجراء تحقيق أكثر آلية لخصائص الشيخوخة التي تنظمها AhR عبر الأنواع عن طريق الكركمين البوليفينول الغذائي. كشفت تحليلاتنا المجمعة في الجسم الحي وفي المختبر وفي السيليكو عن سيناريو جديد ومعقد: بينما يعزز الكركمين ميزات مكافحة الشيخوخة في الديدان الخيطية والمفاصل الأساسي البشري على الأقل جزئيًا بطريقة تعتمد على AhR ، تعتمد آثاره المضادة للأكسدة في كلا النوعين على الآليات المستقلة عن AhR ولكن بشكل أساسي تعتمد على Nrf2 / SKN -1.

أظهرنا لأول مرة أن الكركمين أخر شيخوخة الربداء الرشيقة بطريقة تعتمد على AHR -1-. في البحث عن مؤثرات الكركمين التي تعتمد على ahr -1- المحتملة ، استخدمنا طرقًا مستهدفة وغير متحيزة ووجدنا أن غالبية الجينات المنظمة تفاضليًا عند معالجة الكركمين يتم تنظيمها بطريقة تعتمد على AHR -1-. علاوة على ذلك ، أظهر العديد من هذه الجينات نمط تعبير مماثل في AHR -1- الحيوانات المستنفدة والمعالجة بالكركمين ، مما يشير إلى أن الكركمين يعزز إطالة العمر من خلال قمع نشاط AHR -1. والمثير للدهشة أن لا التحليل المستهدف ولا التحليل الترانسكريبتومي يشير إلى دور رئيسي لأهداف AhR الكلاسيكية مثل الأكواب ، والتي تم العثور عليها بدلاً من ذلك إلى حد كبير غير معبر عنها بشكل كافٍ في الخلايا العصبية (Larigot et al. ؛ تم تقديمها مع هذه الدراسة). ومن المثير للاهتمام ، أن هذه النتائج قد تشير إلى أن النسخ الحيوانية الكاملة قد تخفي التأثيرات العصبية المحددة لـ AhR ، في هذه الحالة المحددة من خلال جينات cps. وجدنا أنه من بين الجينات المعبر عنها تفاضليًا ، ينتمي الكثير منها إلى إنزيمات إزالة السموم من المرحلة الثانية ، مثل القناة الهضمية -45 ، والتي زادت بسبب استنفاد كل من ahr -1 (وفي دماغ فئران AhR KO) وعلاج الكركمين للتوسط في إطالة عمرهم. بدلاً من ذلك ، أدى علاج الكركمين واستنفاد ahr -1 إلى زيادة التعبير عن إنزيم آخر لإزالة السموم من المرحلة الثانية ، GST -4 ، من خلال آليات مختلفة: يعتمد الأول على Nrf2 / SKN -1 ، وهو TF التقليدي للاختزال الذي يحث GST -4 على الإجهاد التأكسدي في C.elegans [103]. علاوة على ذلك ، في حين أن الكركمين يحفز الاستجابات المعتمدة على Nrf2 / SKN -1- في C.elegans (تعبير GST -4) والتركيبة الأساسية البشرية (تعبير Sod2 وقدرة الترحيل) ، فإنه يحمي أيضًا C. بطريقة مستقلة SKN -1-. في C.elegans ، لا يمكن للكركمين إطالة العمر الافتراضي في طفرات الجلد المريضة جدًا -1 (zu67) [104] ، بينما يمكن تحفيز GST -4 بطريقة SKN -1- المستقلة عن طريق إشارات EGF [94] وتم الإبلاغ عن الحديث المتبادل بين مسار EGF و AhR في الثدييات [105].

ومن المثير للاهتمام ، أنه على عكس السلالة البرية ، لاحظنا تأثير AHR -1- المستقل للكركمين على هيلثسبان في نماذج الديدان الخيطية لمرض هنتنغتون وباركنسون ، على التوالي. في هذه السلالات ، أدى علاج الكركمين إلى زيادة عدد مجاميع البروتين بنفس القدر مثل نقص AHR -1 ، مما يشير إما إلى التأثير الوقائي لتجمع البروتين نفسه و / أو تنشيط الكركمين للمسارات التي تحمي من تراكم البروتين بشكل مستقل عن / استنفاد -1 ساعة. إن تأثير الكركمين على تراكم البروتين مثير للجدل: فقد ثبت أنه يثبط تكوين ليفي ولكن أيضًا لربط الأنواع السابقة للليف / قليل القوام من البروتينات النشواني المنشأ ، وبالتالي تسريع تجميعها وتقليل السمية العصبية الكلية [106]. من الجدير بالملاحظة أن الكافيين ، الذي يحمي أيضًا من سمات شيخوخة القلب والأوعية الدموية [66،107] ، يمنع أيضًا الشلل الناجم عن A دون تقليل التراكمات A ولكن من خلال تنشيط المسار الوقائي المعتمد على Nrf2 / SKN -1- [108]. سيكون من المهم تقييم ما إذا كان التأثير الوقائي الناجم عن الكركمين أو جميع -1 الاستنفاد في نماذج مرض الرشيقة الرشيقة يتم توسطه من خلال آليات تعزز إزالة الأنواع قليلة القسيمات / ما قبل الليف إلى تكتلات أقل سمية و / أو بواسطة تفعيل الآليات الأخرى ، مثل Nrf2 / SKN -1 ، والتي قد تحمي في نفس الوقت من السمية البروتينية. تجدر الإشارة إلى أن إنزيمات إزالة السموم قد تحتوي على كل من XRE و ARE (عناصر مستجيبة لمضادات الأكسدة) ، وقد تم وصف التفاعل بين الإشارات المنظمة لـ Nrf2 / ARE و AhR / XRE [109]. وبالتالي سيكون من المثير للاهتمام توضيح كيفية تعزيز الكركمين لتأثيراته المفيدة المختلفة المضادة للشيخوخة من خلال التوازن بين الإشارات التي تنظمها Nrf2 و AhR.

أظهرت مناهجنا المشتركة أن الكركمين يثبط نشاط AHR -1. في الثدييات ، تم اقتراح أن التأثير المثبط لـ AhR للكركمين يتم توسطه عن طريق الارتباط المباشر بجسم LBD [110] أو تثبيط بروتين كيناز C الذي يعمل على فسفوريلات AhR [79]. أشارت دراسة أخرى إلى أن نشاط النسخ من AhR يعتمد على حالة الأكسدة الخلوية وبنية الكروماتين ، وكلاهما يتأثر بالكركمين [111]. في حين أن AHR -1 لا يربط TCDD ، فإنه يربط XRE في المختبر [36] ولكن الدراسات المنهجية ، التي تتناول إمكانات الهيدروكربونات متعددة الحلقات ، أو بروابط AhR للثدييات الأخرى لتعديل AHR -1 ، مفقودة بشكل أساسي بسبب عدم وجود أدوات مناسبة لتقييم ذلك. تحاول دراساتنا سد هذه الفجوة ، واستغلال خلايا Cos7 التي تعبر عن AHR -1 المقترنة بمقايسات luciferase (Larigot et al. ؛ المقدمة جنبًا إلى جنب مع هذه الدراسة) وفي نمذجة السيليكو لـ C. elegans LBD ، كشفت أن الكركمين يقمع AHR -1 ، ولكن ليس من خلال ربط LBD المباشر. أكد الفحص في المختبر المستخدم في دراستنا أن CeAhR لا يتم تنشيطه من خلال إشارات xenobiotics الكلاسيكية. ومع ذلك ، فإنه لن يكشف عن الأنشطة بسبب ارتباط AhR بتسلسل الحمض النووي بخلاف XRE "الكلاسيكي" الموجود في CYP1A1 مثل البوليفينول (كيرسيتين) - المستجيب XRE الموجود في PON1 [112،113]. يجادل أيضًا التحلل المناعي في EC الأساسي البشري ضد الكركمين الذي يحفز الانتقال النووي لـ AhR ، والذي ، جنبًا إلى جنب مع التأثير المعزز لقدرة الهجرة في خلايا AhR المفرطة في التعبير ، قد يشير أيضًا إلى أن الكركمين يثبط نشاط AhR.

نقترح أن التأثير المثبط للكركمين ، بدلاً من الاعتماد على الارتباط بـ AhR ، يتضمن قدرته المضادة للأكسدة ، والتي قد ترتبط بالفعل ، أو حتى تعتمد على ، تنشيط Nrf2 / SKN -1. يتم تنشيط Mammalian AhR بواسطة ROS عبر تعديل مؤكسد مستقل عن LBD [85] ، لكن بياناتنا توضح أن تحريض نشاط AHR -1 بواسطة الروتينون المؤكسد يتطلب LBD. آلية غير مباشرة لتنشيط AhR بوساطة ROS هي تشكيل يجند AhR الفعال FICZ [114]. ومع ذلك ، فإن FICZ هو جزيء مستو كبير ، وفقًا لنموذجنا في السيليكو ، لا يناسب AHR -1 LBD. في حين أن الآلية الدقيقة التي يتم من خلالها تعزيز نشاط AHR -1 بواسطة ROS وتثبيطه بواسطة الكركمين (إما عن طريق التبريد المباشر لـ ROS أو بشكل غير مباشر عن طريق تنشيط Nrf2 أو الجينات المنظمة لمضادات الأكسدة الأخرى) لا يزال يتعين تحديده ، هذا مدعوم بقوة من قبلنا النتائج: يتم تنشيط AHR -1 بواسطة rotenone ، وتعرض طفرات ahr -1 المزيد من mtROS ، مما يقلل من إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتكون أكثر حساسية لـ H و O و juglone بالإضافة إلى UVB و BaP [25] ، وكلاهما ينتج ROS [115،116]. في هذا السياق ، من المثير للاهتمام ملاحظة أن طفرات ahr -1 تعرض تغيرًا طفيفًا في وظائف الميتوكوندريا ، والتي تشبه وظائف الميتوكوندريا [117. يشير هذا إلى أن كل -1 الاستنفاد (والكركمين المحتمل عن طريق تثبيط AHR -1) قد يعزز المدى الصحي من خلال إجهاد الميتوكوندريا الخفيف ، والذي يُعرف بإطالة عمر C. {20}} طفرات [118،119]. علاوة على ذلك ، ما إذا كان Nrf2 / SKN -1 والميتوكوندريا يلعبان دورًا في تعديل نشاط AHR -1 عند علاج الكركمين ، فإن ذلك يعد احتمالًا مثيرًا للاهتمام لا يزال يتعين التحقق من صحته.

بشكل عام ، بالاستفادة من الميزات المتعددة التي توفرها الديدان الخيطية C.elegans للدراسات في الجسم الحي ، نقترح أن وظيفة الأسلاف لـ AhR قد تكون في تنظيم إنزيمات المرحلة الثانية المتعلقة بمضادات الأكسدة بدلاً من الاستجابات الغريبة الحيوية. على عكس التأثيرات الضارة الناجمة عن المستويات العالية من أنواع الأكسجين التفاعلية ، يمكن التوسط في الآثار المفيدة التي يعززها نقص AhR من خلال إجهاد خفيف للميتوكوندريا و / أو إنتاج ROS خفيف (تكوين الميتوهورميس) ، والذي يعتمد أيضًا على Nrf2 / SKN -1. نقدم أيضًا أدلة قوية على التفاعل بين الكركمين و AhR. يتم الحفاظ على تثبيط الكركمين لإشارات AhR تطوريًا ومن المحتمل ألا يتم التوسط فيه من خلال الارتباط بـ AhR LBD ، ولكن من خلال خصائص الكركمين ROS أو تنشيط Nrf2 / SKN -1. يمكن بالفعل تنشيط مسار إشارات Nrf2 بواسطة الكركمين بطرق مختلفة [91]. أخيرًا ، أظهرت بياناتنا أن الكركمين يعزز التأثيرات المضادة للشيخوخة أيضًا بطريقة مستقلة في كل من C.elegans (زيادة تعبير GST -4 ومقاومة الإجهاد التأكسدي) والمفوضية الأوروبية الأولية البشرية (زيادة تعبير Sod2 وقدرة الهجرة ) ، والذي يمكن أن يفسر أيضًا التأثيرات الإضافية للكركمين وفقدان وظيفة AHR -1 على النطاق الصحي للحيوانات التي تعبر عن polyQ.

5. الاستنتاجات

في الختام ، من خلال مزيج أصلي من الأساليب في السيليكو ، وفي المختبر ، وفي الجسم الحي ، أظهرنا أنه في حين أن تنشيط CeAhR يحمي من الإجهاد التأكسدي في وقت مبكر من الحياة ، فإن تعبيره المنخفض يقاوم الشيخوخة ويتوسط التأثير المفيد لمكافحة الشيخوخة للكركمين (الشكل 7) . وبالتالي قد يساعد الكركمين في موازنة نشاط عوامل النسخ المختلفة المتضمنة في استجابات إزالة السموم / مضادات الأكسدة (قمع AhR وتنشيط Nrf2) في الظروف التي يتم فيها تغيير هذه (زيادة AhR وتقليل Nrf2 / SKN -1) ، مثل الشيخوخة أو الاضطرابات المرتبطة بالعمر. يضيف عملنا مستوى إضافيًا من التعقيد إلى الأنشطة الواسعة بالفعل والمتعددة الوظائف والمحددة السياق لـ AhR ، مع تداعيات مهمة على صحة الكائن الحي وعمره. علاوة على ذلك ، يفتح الباب أمام دراسات إضافية ، باستخدام نظام الديدان الخيطية لاكتشاف واستقصاء وظائف الأجداد لـ AhR ، والتي تقل احتمالية تحديدها في الثدييات.

تم استخلاص هذه المقالة من مضادات الأكسدة 2022 ، 11 ، 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants