المراقبة الحيوية للسموم الفطرية في بلازما مرضى الزهايمر ومرض باركنسونⅡ

2. النتائج والمناقشة

2.1. تحليل LC-MS / MS

نظرًا لخصائصها الفيزيائية والكيميائية المختلفة ، تم تقسيم السموم الفطرية للفصل الكروماتوجرافي إلى مجموعتين (انظر قسم المواد والطرق). توضح الأشكال التالية (الأشكال 1-4) المخططات اللونية المستخرجة المتراكبة للسموم الفطرية في أجهزة المعايرة وعينة البلازما (المقننة كعينات 1-4) ، قبل وبعد المعالجة الأنزيمية. كما يتضح ، يظهر OTA في العينات قبل وبعد المعالجة الأنزيمية (الشكل 1 ؛ الشكل 3) ؛ بينما يظهر STER فقط بعد العلاج الأنزيمي (الشكل 3). لم يتم اكتشاف أي من السموم الفطرية الأخرى التي تم تحليلها في عينات البلازما.

كل من منحنيات المعايرة المستخدمة في القياس الكمي للسموم الفطرية تفي بالمعايير المحددة مسبقًا أثناء التحقق من صحة الطريقة. يتم عرض أمثلة لمنحنيات المعايرة التي تم الحصول عليها لكل سم فطري في الجدولين S1 و S2. تم أيضًا تقييم هوية المركبات: تم ملاحظة التحولات المؤهلة (q) والتقدير الكمي (Q) لكل من السموم الفطرية المكتشفة في كل من الأفراد والعينات الإيجابية ، والخطأ النسبي الذي تم الحصول عليه (RE) بين قيم نسبة q / Q لـ كان كل سم فطري في أجهزة المعايرة وفي العينات أقل من 2 0 بالمائة [32]. بالإضافة إلى ذلك ، لم تختلف أوقات الاستبقاء في العينات وأجهزة المعايرة بأكثر من 2.5 بالمائة [33] (1.3 بالمائة لـ OTA قبل و 1.6 بالمائة بعد العلاج الأنزيمي ؛ 0.3 بالمائة لـ OTB و 1.8 بالمائة لـ STER).

2.2. عينات البلازما

تم تجنيد ما مجموعه 93 شخصًا ، بما في ذلك 25 من الضوابط الصحية (CNT) و 68 مريضًا من خدمة الأعصاب في مستشفى سان بيدرو في لاريوخا (إسبانيا). كان المتبرعون بالرقابة رفقاء غير مرتبطين بالمرضى الذين لا يعانون من أمراض عصبية ظاهرة أو مشخصة. تم تقسيم المرضى حسب الأمراض: 44 مريضا يعانون من شلل الرعاش و 24 مريضا بمرض الزهايمر.

انقر فوق cistanche tubulosa كبسولات لمرض الزهايمر ومرض باركنسون

تم إجراء تشخيص وتطور المرض للمرضى المعينين من قبل أطباء الأعصاب الخبراء وفقًا لمقياس Hoehn و Yahr (HY) لـ PD (الجدول S3) ومقياس التدهور العالمي (GDS) لـ AD (الجدول S4). أظهر جميع مرضى الزهايمر بالفعل علامات سريرية على التدهور المعرفي المعتدل أو الخرف (من 3 إلى 7 ، مقياس GDS). تم تقسيم مرضى PD إلى مجموعتين حيث كان تطور المرض مختلفًا بين المرضى الذين لم يظهروا أي ضعف في ردود الفعل الوضعية (1 و 2 ، مقياس HY) وآخرون يظهرون بالفعل ردود فعل وضعية ضعيفة (من 2.5 إلى 3 ، مقياس HY).

ومع ذلك ، نظرًا لقلة عدد العينات ، تم إجراء التحليل الإحصائي لمرضى PD كمجموعة واحدة. تم الإبلاغ عن عدد الموضوعات المسجلة لكل مجموعة ومجموعة فرعية ، جنبًا إلى جنب مع الجنس والمدى العمري وتطور المرض ، في الجدول 1. المعلومات الفردية الكاملة حول الموضوعات المعينة للدراسة ترد في المواد التكميلية (الجدولان S5 و S6).

2.3 وجود السموم الفطرية

من بين 19 سمًا فطريًا تم تقييمها ، تم اكتشاف OTA و OTB و STER فقط في العينات. كان OTA موجودًا قبل وبعد العلاج بمزيج الجلوكورونيداز / أريل سلفاتاز ، بينما كان OTB قابلاً للاكتشاف فقط من قبل ولم يظهر STER إلا بعد العلاج الأنزيمي. وتجدر الإشارة إلى أنه نظرًا للحجم المحدود لبعض العينات ، لم يكن التقييم بعد العلاج الأنزيمي ممكنًا إلا لـ 74 عينة من أصل 93 عينة تم جمعها.

تم تلخيص النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها لـ OTA و OTB و STER في الجدول 2. نظرًا لتأكيد معايير التعريف (يجب أن تكون انتقالات q و Q موجودة ومقارنتها مع معايرات RE لكليهما ، ونسبة q / Q ووقت الاحتفاظ ، والتي ينبغي أقل من 20 بالمائة أو 2.5 بالمائة ، على التوالي) ، تم استخدام عينات ذات قيم أكبر من أو تساوي LOD لتحليل معالجة البيانات. لذلك ، تم إجراء الحسابات بتبني طريقة استبدال منخفضة الحد [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) في العينات التي تمت معالجتها قبل العلاج الأنزيمي. فيما يتعلق بوجود OTA ، تم العثور على عينات أسفل LOD في جميع المجموعات. يتوافق الحد الأقصى لمستوى OTA (8.81 نانوغرام / مل) مع امرأة تبلغ من العمر 66 عامًا في المجموعة الضابطة. فيما يتعلق بمجموعة التحكم ، كانت OTA و OTB موجودة في 92 بالمائة و 24 بالمائة من العينات على التوالي.

تتوافق هذه النتائج مع دراسة حديثة أجريت في نافارا ، وهي منطقة مجاورة في إسبانيا. في تلك الدراسة ، كان OTA موجودًا في 97.3 بالمائة و OTB في 10 بالمائة من العينات (n=438) [35] تم قياسه بنفس الطريقة المستخدمة في الدراسة الحالية [36]. في هذه الدراسة ، كان متوسط ​​مستويات OTA (2.15 نانوغرام / مل) أقل قليلاً من المستويات التي تم قياسها في نافارا (2.87 نانوغرام / مل). تراوحت مستويات OTA من LOD إلى 8.81 نانوغرام / مل ، بينما في العينات من Navarra ، تراوح تركيز OTA بين LOD و 19.9 نانوغرام / مل (مع عينة وصلت إلى 45.7 نانوغرام / مل في 66- عام لامرأة).

فيما يتعلق بالجنس ، وبالتوافق أيضًا مع دراسة نافارا [35] ، يمكن ملاحظة أن قيم OTA المتوسطة قبل العلاج الأنزيمي تميل إلى أن تكون أعلى عند الرجال منها لدى النساء في جميع المجموعات. على الرغم من أن النسبة المئوية للعينات الإيجابية للأوكراتوكسين A تتفق مع الدراسات السابقة التي أجريت في إسبانيا ، فإن متوسط ​​ومستويات OTA القصوى في مجموعة CNT في الدراسة الحالية ودراسة Navarra الأخيرة [35] أعلى من تلك الخاصة بالدراسات السابقة من إسبانيا .

نظرًا لأنه تم الحصول على هذه المعلومات قبل عام 2011 ، فإن بياناتنا تدعم الحاجة إلى مواصلة المراقبة الحيوية لمستويات السموم الفطرية في عموم السكان. كما لوحظ سابقًا [35] ، كان OTB موجودًا في بضع عينات وكان دائمًا متزامنًا مع OTA (باستثناء رجل واحد من CNT). والمثير للدهشة أنه لم يتم اكتشاف OTB في مجموعة AD. OTB هو التناظرية منزوعة الكلور من OTA ولم يتم قياسه في دراسات المراقبة الحيوية البشرية التي أجريت حتى الآن.

يمكن أن يكون OTB موجودًا في العينات البشرية لأنه من المعروف أنه موجود في بعض مصفوفات الطعام ، مثل النبيذ [37] ، ولكنه قد يكون أيضًا مستقلبًا بشريًا لـ OTA [38]. لسوء الحظ ، في هذه الدراسة ، من المستحيل التمييز بين المصادر المحتملة لـ OTB أو معرفة ما إذا كان غياب OTB في مجموعة AD يمكن أن يكون بسبب نمط استهلاك غذائي مختلف للمرضى أو إلى عملية التمثيل الغذائي المختلفة بسبب المرض ، أو بسبب قلة عدد العينات التي تم تحليلها. أظهر تحليل البيانات بعد العلاج الأنزيمي أن OTA لا يزال يُكتشف (89 بالمائة من العينات).

علاوة على ذلك ، كما لوحظ سابقًا في المتبرعين الأصحاء لـ Navarra [35] ، ظهر STER في غالبية العينات (88 بالمائة) ، بينما لم يتم اكتشاف OTB بعد الآن. عند مقارنة وجود OTA قبل وبعد العلاج الأنزيمي ، كانت النسبة المئوية للعينات الإيجابية قبل العلاج الأنزيمي في CNT أعلى منها في المرضى ؛ بينما ، بعد العلاج الأنزيمي ، تضاءل وجود OTA لـ CNT بينما زاد في مرضى AD و PD. يدعم بعض المؤلفين الفرضية القائلة بأن اتحادات OTA قد تتشكل أثناء عملية التمثيل الغذائي للإنسان [39-41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) في 88 بالمائة من العينات التي تم تحليلها. تدعم هذه البيانات الفرضية القائلة بأن STER-glucuronides تتشكل أثناء التمثيل الغذائي البشري [35 ، 42].

2.4 تحليل احصائي

وفقًا للنتائج التحليلية ، تم إجراء الحسابات الإحصائية فقط لـ OTA و STER. لم يتم تضمين OTB في التحليل الإحصائي لأن 12 عينة فقط (13 بالمائة) كانت أكبر من أو تساوي LOD. تم رفض فرضية التوزيع الطبيعي (اختبار شابيرو-ويلك) ، وبالتالي تم استخدام الاختبارات غير البارامترية ، والتي لا تتضمن أي افتراض للتوزيع ، للمعالجة الإحصائية. تم اكتشاف STER فقط بعد العلاج الأنزيمي ، لذلك تم إجراء التحليل الإحصائي لـ STER على 74 نتيجة متاحة تم الحصول عليها بعد الهضم الأنزيمي. من ناحية أخرى ، توفرت مجموعتا بيانات من النتائج لـ OTA ، واحدة تم الحصول عليها من بيانات المعالجة قبل العلاج الأنزيمي والأخرى التي تم الحصول عليها بعد المعالجة الأنزيمية (أي ، OTA قبل وبعد).

نظرًا لعدم اكتمال OTA بعد مجموعة البيانات (74 سجلًا) ، فقد تقرر إجراء حسابات إحصائية مع مراعاة OTA فقط قبل مجموعة البيانات (93 سجلًا). لتأكيد قرار استبعاد OTA بعد مجموعة البيانات ، تم إجراء اختبار تصنيف موقع Wilcoxon للأزواج المتطابقة لاستكشاف الاختلافات المحتملة بين النتائج المزدوجة لـ OTA قبل مجموعات البيانات وبعدها.

لم يبرز الاختبار أي فرق كبير عند تطبيقه على قيم OTAbefore و OTAafter لإجمالي مجموعة السكان (n=74، z=−1.438، p-value=0. 1503) ، تأكيد أن مجموعة البيانات OTA الكاملة قبل ذلك تناسب التقييمات الإحصائية. كما ذكرنا سابقًا ، لا توجد دراسات سابقة ترصد السموم الفطرية في عينات البلازما من مرضى PD أو AD. لذلك ، لالتقاط جميع الاختلافات والارتباطات المحتملة لمستويات تركيز OTA و STER بين المجموعات والمجموعات الفرعية ، تم إجراء اختبار تصنيف Wilcoxon أو اختبار Kruskal-Wallis للمقارنة متعددة المتغيرات.

بالإضافة إلى ذلك ، تم استكشاف الاختلافات المحتملة ذات الدلالة الإحصائية من خلال تقسيم المجموعات حسب الجنس والمرض (مرضى PD و AD) ، مع الأخذ في الاعتبار أيضًا مرحلة المرض (مقياس HY أو GDS). ملخص لجميع الاختلافات ، التي كانت ذات دلالة إحصائية (القيمة الاحتمالية <0. 050) عند مقارنة توزيعات OTA أو STER بين المجموعات ، بين CNT ومجموعة المرضى (ككل ومجموعة PD و AD) ، بين يوضح الجدول 3 الأجناس وبين المجموعات في كل من متغير الجنس والجنس.

تم العثور على الاختلافات بين مستويات توزيع OTA لتكون ذات دلالة إحصائية عند مقارنة مجموعة CNT ، PD ، و AD ، ولكن هذا الاختلاف (قيمة p=0. 0447) يسترشد بمقارنة PD / AD (p- القيمة=0. 0114) ، كونها PD مجموعة المرضى التي تتميز بقيم أعلى. عند النظر في مرحلة المرض ، ومقارنة توزيعات المجموعة الفرعية 1 و PD للمجموعة الفرعية 2 ، لم يلاحظ أي فرق ، مما يشير إلى أنه في مجموعة PD ، لا تؤثر مرحلة المرض على اختلاف في التوزيع. في المقارنة بين الجنسين ، أعطت مستويات OTA للرجال والنساء مقارنةً فروقًا إحصائية إما في جميع الموضوعات أو في مجموعة المرضى (PD plus AD) ، حيث أظهر الرجال دائمًا مستويات أعلى من النساء.

ومن ثم ، فإن توزيعات OTA لا تختلف عن مقارنة CNT ومجموعات المرضى ، ولكن يبدو أن الجنس قد يكون بمثابة محرك للاختلافات في توزيعات مستوى OTA أكثر من مرض التشخيص. علاوة على ذلك ، في اختبار الفروق في توزيعات OTA للرجال والنساء بشكل منفصل ، بين المجموعات (CNT ، PD ، AD) لم يظهر الاختبار أي فرق.

أظهر التحليل الإحصائي على مستويات STER بين CNT ومجموعة المرضى توزيعات مختلفة إحصائيًا (قيمة p <0. 0 001) ، مع انخفاض قيم CNT. أظهرت مجموعة CNT / PD / AD توزيعات مختلفة إحصائيًا (قيمة p=0. 0001) وتم تأكيد الفرق أيضًا بمقارنة CNT / PD و CNT / AD (قيمة p <0.0001 في كلتا الحالتين) ، مع متوسط ​​القيمة الأقل في المجموعة الإعلانية.

لذلك ، في مستويات STER ، كان توزيع مجموعة CNT مختلفًا دائمًا في المقارنات مع المرضى ومجموعات المرض. أثناء مقارنة التوزيعات بين الجنسين ، بين الرجال والنساء ، تم تسليط الضوء على أي فرق إحصائي ، وكانت مستويات STER في المجموعات الفردية للرجال والنساء مختلفة في جميع المقارنات (CNT / PD / AD ، CNT / مجموعة المريض ، CNT / PD ، CNT / AD) ، وكان الرجال والنساء في مجموعة CNT دائمًا أقل من مجموعات المرضى.

يشير هذا إلى أن تشخيص المرض قد يؤثر على توزيعات مستوى STER. تم التحقيق أيضًا في الاختلافات بين مستويات تركيز OTA و STER من خلال مقارنة توزيعات مجموعتي المرضى (PD و AD) في كل جنس (عند الرجال والنساء) ومقارنة مقياس المرض ، GDS في مجموعة مرضى AD ، ومقياس HY في مجموعة مرضى الزهايمر ، ولم يُثار أي فرق إحصائي. لم يُظهر توزيع OTA ولا STER أي اختلاف أيضًا في مقارنة مقياس HY باعتباره المتغير الثنائي HY _ d=0 (PD المجموعة الفرعية 1 ، مقياس HY في النطاق 1-2) و HY {{6 }} d=1 (مجموعة فرعية PD 2 ، مقياس HY في النطاق 2.5 - 3).

وبالتالي ، عند مقارنة سلوك توزيع OTA و STER ، يتم تحديد أن الاختلافات OTA موجودة داخل الجنس (مع M> W) وداخل مجموعات المرضى (PD> AD) ، وظهر اختلاف إحصائي ملحوظ في جميع المقارنات. بالنسبة إلى STER ، تم تسجيل الاختلافات في التوزيعات لمقارنة CNT ومجموعة المرضى (مجموعة المرضى> CNT) ، وكانت جميع التقييمات دائمًا تختبر فرقًا إحصائيًا. من ناحية أخرى ، لم تؤكد السميتان الفطريتان اللتان تم فحصهما أي اختلاف من خلال الاستكشاف داخل المجموعات الفرعية للمرضى و / أو مرحلة المرض.

على حد علمنا ، لا توجد دراسات أخرى متاحة لمقارنة مستويات السموم الفطرية في المرضى الذين يعانون من أمراض التنكس العصبي. ومع ذلك ، اقترح بعض المؤلفين الحاجة إلى مزيد من التقييم لدور السموم الفطرية في تدهور المظاهر السريرية لاضطرابات طيف التوحد [43 ، 44].

في الواقع ، سلط المؤلفون الضوء على فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة بالسموم الفطرية (DON ، DOM -1 في البول و AFM1 ، OTA ، و FB1 في البلازما) بين مجموعات الأطفال المصابين بالتوحد ومجموعة التحكم. تتماشى نتائج الدراسة الحالية أيضًا مع دراسة أحدث أجرتها مجموعتنا [45] ، حيث وجد أن معدل حدوث OTA وتركيزات البلازما أعلى في أطفال المجموعة الضابطة مقارنة بالأطفال الذين يعانون من طيف التوحد أو اضطرابات فرط الحركة ونقص الانتباه.

فيما يتعلق بتأثير الجنس ، ووفقًا لنتائج هذه الدراسة ، في معظم الدراسات المنشورة ، كانت مستويات OTA في البلازما أعلى من النساء [46] ؛ على الرغم من أن Warensjö et al. (2020) لدى المراهقين السويديين [47] ، وكورونيل وآخرون. (2011) [48] لم يجد اختلافات في مستويات البلازما OTA بين الرجال والنساء. أخيرًا ، لتقييم العلاقة بين مستويات OTA و STER في البلازما ومتغير العمر ، تم حساب معامل ارتباط رتبة سبيرمان (rho).

تم تلخيص جميع قيم rho ذات الدلالة الإحصائية (قيم p <0. 0 50) في الجدول 4. بشكل عام ، تم العثور على ارتباطات سلبية وإيجابية ضعيفة: OTA و STER يرتبطان بشكل ضعيف مع العمر. على وجه الخصوص ، تنخفض مستويات OTA مع تقدم العمر (الارتباطات السلبية ، rho <0) ، وتزداد قيمة rho عند اختيار مجموعة PD أو مجموعة الرجال ؛ إلى جانب ذلك ، تكون قيمة rho أعلى عند تحديد قيم الرجال في مجموعة PD. على العكس من ذلك ، تكون ارتباطات STER إيجابية وذات دلالة إحصائية عند اختيار مجموعة النساء.

لتمثيل الارتباطات التي تمت ملاحظتها ، تم الإبلاغ عن المخططات المبعثرة OTA / الرجال في مجموعة مرضى PD و STER / النساء في جميع الموضوعات في الشكل 5. وهي توضح مؤامرة التبعثر ذات المتغيرين للسموم والعمر ، ويساعد الخط المجهز على تصور الارتباط.

آلية علاج Cistanche لمرض باركنسون ومرض الزهايمر

Cistanche هو عشب صيني تقليدي تم استخدامه لسنوات عديدة لفوائده الصحية المحتملة. في الدراسات الحديثة ، وجد أن Cistanche قد يكون لها تأثيرات اعصاب وقد تكون فعالة في علاج مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD).

تُعزى آلية Cistanche في علاج AD و PD بشكل فعال إلى مكوناته النشطة ، مثل echinacoside و acteoside و cistanosides. يُعتقد أن هذه المركبات لها خصائص مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات يمكن أن تقلل من الإجهاد التأكسدي والالتهابات في الدماغ ، والتي ترتبط بتطور وتطور الأمراض التنكسية العصبية.

يمكن أن يعزز Cistanche أيضًا نمو الخلايا العصبية وتحسين الوظيفة الإدراكية عن طريق زيادة مستويات عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، وهو بروتين يلعب دورًا حاسمًا في نمو الخلايا العصبية والحفاظ عليها. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن Cistanche يقلل من لويحات اميلويد ، وهي سمة مميزة لمرض الزهايمر ، ويقلل من تراكم السينوكلين في الدماغ المرتبط بمرض باركنسون.

بشكل عام ، تعد الفوائد العلاجية المحتملة لـ Cistanche في علاج AD و PD واعدة ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح آليات عملها الدقيقة وتأكيد فعاليتها وسلامتها في البيئات السريرية.

يتبع...

Beatriz Arce-López 1، Lydia Alvarez-Erviti 2، Barbara De Santis 3، María Izco 2، Silvia López-Calvo 4، Maria Eugenia Marzo-Sola 4، Francesca Debegnach 3، Elena Lizarraga 1، Adela López de Cerain 5،6، Elena González-Peñas 1، and Ariane Vettorazzi 5،6، *،

1 قسم التكنولوجيا الصيدلانية والكيمياء ، مجموعة الأبحاث MITOX ، كلية الصيدلة والتغذية ، جامعة نافارا ، 31008 بامبلونا ، إسبانيا ؛ barce@alumni.unav.es (BA-L.) ، elizarraga@unav.es (EL) ؛ mgpenas@unav.es (مصر - ف.)

2 مختبر البيولوجيا العصبية الجزيئية ، مركز البحوث الطبية الحيوية لاريوخا (CIBIR) ، بيكيراس 98 ، الطابق الثالث ، 26006 لوغرونيو ، إسبانيا ؛ laerviti@riojasalud.es (LA-E.) ، mizco@riojasalud.es (MI)

3 المعمل المرجعي الوطني للسموم الفطرية والسموم النباتية ، Istituto Superiore di Sanità ، 00161 روما ، إيطاليا ؛ barbara.desantis@iss.it (BDS) ؛ francesca.debegnach@iss.it (فد)

4 Servicio de Neurología، Hospital San Pedro، Piqueras 98، 26006 Logroño، Spain؛ slcalvo@riojasalud.es (SL-C.) ، memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain