تأثير موت الخلايا المبرمج للسكريات القيصرية على اللوكيميا

مؤلف:

لي يان,زانغ جين,زانغ جينغ نان,وآخرون.

منغوليا الداخلية, الصين

للتحقيق في تأثير موت الخلايا المبرمج لـCistanche السكريات( CDP) على الإنسانسرطان الدم الحادخلايا جوركات خط الخلية．طُرقتم تطبيق اختبار MTT للكشف عن تأثير CDP على تكاثر الخلايا, تم استخدام النشاف الغربي لاكتشاف تنشيط caspase -9 و caspase -3, كما تم اختبار جزيئات إشارة موت الخلايا المبرمج．النتائجتم منع تكاثر الخلايا التائية بمقدار 1 مجم / مل و 2 مجم / مل CDP, تم إحداث موت الخلايا المبرمج بواسطة 5 مجم / مل CDP، وتم تقليل تعبيرات pro-caspase -9 و pro-caspase -3 بشكل كبير． تم تثبيط تعبيرات مستقبلات سطح الخلية CD45 و CD71 بشكل كبير بواسطة 5 مجم / مل من CDP, تم إحداث الفسفرة EＲK, وتم منع الفسفرة JNK．

الاستنتاجات

【الكلمات الدالة】Cistanche السكريات؛ موت الخلايا المبرمج. Ｒ مستقبل. caspase -9 ؛ كاسباس -3

ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد (ALL) هو مرض نسيلي خبيث يصيب الجهاز اللمفاوي بدرجة عالية من عدم تجانس النمط المناعي. ، من السهل الانتكاس ، وما إلى ذلك. في الوقت الحاضر ، تشمل طرق العلاج الشائعة زرع نخاع العظام ، والعلاج التعريفي ، والعلاج المناعي ، والعلاج الكيميائي المشترك ، وما إلى ذلك ، نظرًا لقدرة معظم أدوية العلاج الكيميائي على استهداف الأورام وقتلها ، فقد تسبب أضرارًا خطيرة للجهاز الهضمي ، ونظام الدم ، القلب والأوعية الدموية والدماغ والأوعية الدموية ، إلخ. أثناء تلقي العلاج ، غالبًا ما يكون مصحوبًا بردود فعل سلبية كبيرة ، بعضها قاتل. مع تقدم العلاج الكيميائي ، يميل الجسم إلى تطوير القدرة على تحمل أدوية العلاج الكيميائي ، مما يزيد من خطر تكرار المرض.

لذلك ، أصبح البحث عن علاج اللوكيميا أو العلاج المساعد عالي الفعالية ومنخفض السمية ومحور الاهتمام الحالي.سيستانشيسمى Chagangaoya باللغة المنغولية. إنه ينتمي إلى عائلة Ledangaceae وجنس Cistanche. إنه طفيلي على جذور الأشجار الصحراوية وله سمعة "الجينسنغ الصحراوي".

تشمل المكونات النشطة الرئيسية لـ Cistanche جليكوسيدات فينيلثانويد ، قشور ، بيتاين ، ستيرول ، أحماض أمينية ، وعديد السكاريد. مضاد للالتهابات والفيروسات ومضادات الأكسدة وتنظيم المناعة وغيرها من الآثار.

لقد وجدت الدراسات ذلكعديد السكاريد السيستانش (CDP) ،كأحد مكوناته النشطة الرئيسية ،له تأثيرات مضادة للأورام والتأثيرات المناعية.وجد الباحثون أن CDP له تأثير قتل كبير على خلايا سرطان الدم K562 و THP -1 ، واقترحوا أن CDP له دور معين فيالوقاية أو العلاج من سرطان الدم. بالإضافة إلى ذلك ، في مجمع الطب الصيني التقليدي ، cistanche ، لعلاج الحادةسرطان الدم, سيستانشيلعب أيضًا دورًا كأحد المكونات المهمة. ومع ذلك ، فإن آلية محددة للعملسيستانشليس معروفا. في هذا البحث تم عزل وتنقيةCistanche CDPتمت دراسة تأثير القتل والآلية المرتبطة بـ CDP على خط خلايا سرطان الدم الحاد البشري Jurkat.

1.1 الكواشف والأدوات الرئيسية

تم شراء مسحوق Cistanche من Sichuan WecistancheGroup Co، Ltd. ، تم شراء خط خلايا سرطان الدم الحاد البشري Jurkat من بنك الخلايا التابع لمعهد شنغهاي لبيولوجيا الخلية ، وتم شراء ثيازول بلو (MTT) وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من شركة Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co.، Ltd. تم شراء مصل الأبقار الجنيني (FBS) من Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co.، Ltd. ، كاسباس المحتوي على السيستين -3 ، كاسباس -9 ، CD71 ، CD45 ، الفسفرة c-Jun amino-terminal kinase (p -JNK) والأجسام المضادة خارج الخلية التي تنظم إشارة الفسفرة (p-ERK) من Cell Signaling Technology ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وتم شراء الأجسام المضادة للأكتين من Shanghai Biyuntian Biotechnology Co.، Ltd. الشركة العلمية للولايات المتحدة ، والكواشف الأخرى كانت من الدرجة التحليلية المحلية. Gel-View 6000 plus محطة عمل الصور الذكية (منتج من شركة Guangzhou Boluteng Biotechnology Co. المحدودة).

1.2 فصل وتنقية CDP خذ 500 جم منمسحوق استخراج سيستانش، ينقع في 95 في المائة من الإيثانول طوال الليل ، قم بترشيحه بشاش ، اجمع بقايا المرشح ، قم بغليه بالماء الساخن عند 60 درجة لمدة ساعتين / مرة ، ما مجموعه 3 مرات. بعد النهاية ، تم دمج المرشحات ثلاث مرات ، وتركيزها تحت ضغط مخفض إلى 2/3 من الحجم الأصلي ، وإضافة 3 أضعاف حجم 95 بالمائة من الإيثانول ، والسماح لها بالوقوف عند 4 درجات طوال الليل. في اليوم التالي ، جهاز الطرد المركزي عند 4 000 دورة / دقيقة لمدة 10 دقائق ، قم بجمع الرواسب ، قم بإزالة البروتين بطريقة Sevag ، قم بترسيب الإيثانول المطلق ، وقم بالتجميد الجاف للحصول على CDP.

1.3 زراعة الخلايا تم تخزين خط خلايا سرطان الدم البشري الحاد في النيتروجين السائل في مختبر Jurkat. عند استخدامها ، تم استرداد الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة 37 درجة وتم تربيتها في وسط RPMI1640 (يحتوي على 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 وحدة / مل من الستربتومايسين) مع 10 بالمائة من FBS. تمت زراعة الخلايا في حاضنة خلايا ثاني أكسيد الكربون بدرجة 37 درجة و 5 في المائة ، وتمريرها كل يومين إلى ثلاثة أيام ، وتم إجراء التجارب عندما دخلت الخلايا مرحلة النمو اللوغاريتمي.

1.4 تم أخذ خلايا Jurkat في تجربة MTT في مرحلة النمو اللوغاريتمي ، وطردها مركزيًا للحصول على حبيبات الخلية ، وتم عدها عند 5 × 105 خلية / مل. خذ 96- لوحة زراعة خلايا البئر ، وقم بتلقيح 100 خلية في كل بئر ، ثم أضف 100 ul RP-MI1640 وسط كامل كمجموعة تحكم ؛ تم تقسيم المجموعة التجريبية إلى 3 مجموعات ، أولاً باستخدام وسط RPMI1640 لتحضير تراكيز مختلفة من CDP ، ثم إضافة 100 مايكرولتر من وسط RP-MI1640 لكل بئر. تم استخدام خلايا ul Jurkat و 100 ul من محلول CDP لجعل التركيز النهائي لـ CDP عند 1 و 2 و 5 مجم / مل على التوالي. تم إنشاء كل مجموعة مع 5 آبار مكررة وحضنت في حاضنة خلية 37 درجة لمدة 48 ساعة. بعد الحضانة ، أضف 20 ميكرولتر من MTT (تركيز محلول المخزون هو 5 مجم / مل) في كل بئر ، وأعده إلى حاضنة الخلية ، واستمر في الحضانة لمدة 4 ساعات ، وأخيراً أضف 100 مايكرولتر بنسبة 20 بالمائة SDS لإذابة فورمازان عند 37 درجة بين عشية وضحاها ، واستخدامها في اليوم التالي. تم الكشف عن الامتصاصية عند 570 نانومتر لكل مجموعة بواسطة قارئ الصفيحة الدقيقة ، وتم حساب معدل التثبيط لتركيزات مختلفة من CDP على تكاثر خلايا Jurkat بالصيغة.

تم أخذ 1.5 من خلايا Jurkat النشاف الغربية في مرحلة النمو اللوغاريتمي وبذرها في 6- صفيحة بئر بكثافة 2 × 105 خلية / مل ، و 500 مايكرولتر / بئر ، وأضيف 500 ميكرولتر RPMI1640 وسط كامل إلى عنصر التحكم مجموعة. قم بإعداد 3 مجموعات تجريبية ، مجموعات معالجة عديد السكاريد 1 و 2 و 5 ملغ / مل ، CDP

تم إذابته في وسط RPMI164 0 الكامل مقدمًا ، تمت إضافة 500 مايكرولتر من الخلايا و 500 مايكرولتر من محاليل CDP بتركيزات مختلفة إلى 6- لوحة البئر واحتضانها عند 37 درجة لمدة 48 ساعة. بعد الثقافة ، تم جمع المعلقات الخلوية لكل مجموعة ، وطردها عند 1 500 دورة / دقيقة لمدة 5 دقائق للحصول على كريات الخلايا ، وغسلها مرتين بمحلول ملحي مبرد مسبقًا بالفوسفات (PBS). بعد الغسيل ، تمت إضافة 20 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية إلى كل مجموعة ، وتم فصل الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. تم استخلاص البروتين الكلي وتعديل تركيز الخلية باستخدام طريقة برادفورد. تم أخذ 20 ميكروغرام من البروتين من كل مجموعة من أجل SDS-polyacrylamide electrophoresis (PAGE) ، وتم نقل البروتين إلى غشاء polyvinylidene fluoride (PVDF) عن طريق التثقيب الكهربائي. ممنوع بمسحوق الحليب الخالي من الدسم في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ، وإضافة الأجسام المضادة للأرانب المضادة للإنسان -3 والأجسام المضادة -9 بنسبة تخفيف 1: 1 000 ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h ، يتم شطفه 3 مرات باستخدام شاكر فوسفات توين (PBST) (10 دقائق / مرة) ، أضف بيروكسيداز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المسمى (1: 1 000) ، احتضنه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، اشطفه 3 مرات مع PBST ، اشطف مرة واحدة مع PBS ، أضف ركيزة ECL ، واستخدم محطة عمل الصورة الذكية للتصوير ، وتمت مقارنة تغييرات النطاق لكل مجموعة لدراسة موت الخلايا المبرمج لخلايا Jurkat التي يسببها CDP. للكشف عن البروتينات المتعلقة بمسار موت الخلايا المبرمج ، كانت ثقافة الخلية وظروف علاج CDP هي نفسها كما هو مذكور أعلاه. بعد التفاعل ، تم تفكيك الخلايا لتقدير كمية البروتين. تم نقل البروتين إلى غشاء PVDF بواسطة SDS-PAGE والتثقيب الكهربائي. بعد الحجب بمسحوق الحليب منزوع الدسم لمدة ساعة ، تمت إضافة الأجسام المضادة لـ CD71 و CD45 و p-JNK و p-ERK (1: 1 000) ، وتم تحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم تحضين الجسم المضاد الثانوي المسمى HRP (1: 1 000) لمدة ساعة واحدة ، وأخيرًا ، تم استخدام محطة عمل التصوير الذكي للتصوير لدراسة جزيئات الإشارة ذات الصلة لموت الخلايا المبرمج Jurkat الناجم عن CDP. تم تحديد النطاقات التجريبية الناتجة باللون الرمادي باستخدام Image J (1.8.0).

انقر هنا لمعرفة تأثير Cistanche على تأثير مضاد للورم ومضاد للسرطان

1.6 التحليل الإحصائي تم استخدام برنامج SPSS21. 0 لاختبار t وتحليل التباين

2 نتائج وظيفة Cistanche علىسرطان الدم

2.1 مستوى تكاثر الخلايا

تم عزل CDP بنجاح ، مع أكثر من 9 {{2 0} في المائة من محتوى السكر وأقل من 5 في المائة من محتوى البروتين. كان معدل تثبيط تكاثر الخلايا في مجموعة 1 مجم / مل CDP (19. 1 ± 2. 1) بالمائة ، بينما كان معدل تثبيط تكاثر الخلايا في مجموعة CDP 2 مجم / مل و 5 مجم / مل (44.2 ± 5. 2) )) النسبة المئوية و (47.8 ± 4. 4) في المائة ، مما يشير إلى أن CDP يمكن أن يمنع بشكل كبير تكاثر خلايا Jurkat بطريقة تعتمد على الجرعة. 2.2 مقارنة بمجموعة التحكم (0. 62 ± 0. 0 4 ، 0. 56 ± {{4 0}}. {{49 }} 7) ، أدى مستوى موت الخلايا المبرمج في خلايا Jurkat المعالجة بـ 5 mg / ml CDP إلى إنزيمات caspase -9 و caspase {{3 0}}. Pro-form pro-caspase -9 (0. 0 9 ± 0. 0 2) و pro-caspase -3 ({{ 63}}. 12 ± 0. 01) تم تقليلها بشكل كبير ، وكانت مجموعات CDP 1 مجم / مل و 2 مجم / مل أقل فعالية بشكل ملحوظ في pro-caspase -3 في الخلايا. لم يكن لمحتوى Caspase -9 (0.58 ± 0.04 ، 0.51 ± 0.01) ومحتوى pro-caspase -3 (0.48 ± 0.04 ، 0.44 ± 0.05) تأثير كبير ، أي انخفاض تركيز CDP لم يحرض موت الخلايا المبرمج لخلايا Jurkat ، ولكن بشكل رئيسي منع تكاثر الخلايا ، كما هو موضح في الشكل 1.

1-4: مجموعة مرجعية ،

1 مجم / مل من مجموعة CDP ، 2 مجم / مل من مجموعة CDP ، 5 مجم / مل من مجموعة CDP ؛ نفس الشكل التالي

الشكل 1 تأثير CDP على caspase -9 و caspase -3 في خلايا Jurkat

تأثير سيستانش عديد السكاريد على اللوكيميا

2.3 كانت مستويات التعبير النسبي لـ CD71 و CD45 في مجموعة التحكم في مستقبلات موت الخلايا المبرمج 1. 00 ± 0. 0 4 ، {{1 0}. 54 ± 0. {{2 0}} 2. يمكن أن تثبط مجموعة CDP 5 مجم / مل بشكل ملحوظ CD71 (0. 0 5 ± 0. 0 2). 0 1) و CD45 (0. 13 ± {{4 0}. 03) ؛ 1 ملغ / مل و 2 ملغ / مل من مجموعات CDP يمكن أن تثبط التعبير عن CD71 (0. 52 ± 0. 06 ، 0. 43 ± 0. 07) إلى حد معين لم يكن هناك تأثير كبير على التعبير عن CD45 (0.51 ± 0.01 ، 0.48 ± 0.02). انظر الشكل 2.

الشكل 2 تأثير CDP على التعبير عن المستقبلات على سطح غشاء الخلية

2.4 المسارات المتعلقة بموت الخلايا المبرمج

كانت مستويات التعبير النسبي لـ p-JNK و p-ERK في المجموعة المرجعية 1.2 0 ± 0. 0 8 و 0. 21 ± 0 . 0 3 على التوالي. تسببت مجموعة CDP 5 مجم / مل في حدوث موت الخلايا المبرمج وخفضت بشكل كبير مستوى الفسفرة في JNK. (0. 32 ± 0. 0 4) ، أدى إلى زيادة كبيرة في مستوى الفسفرة في ERK (1. 13 ± 0. 0 5) ؛ أدى 1 مجم / مل ، 2 مجم / مل CDP إلى زيادة مستوى الفسفرة لـ JNK (1. 12 ± 0. 06، 1. 06 ± 0. 06) لم يكن له تأثير كبير ، ولكنه لا يزال يزيد من مستوى الفسفرة في ERK (0. 54 ± 0. 04 ، 0. 63 ± 0. 02). انظر الشكل 3.

الشكل 3 تأثير CDP على فسفرة JNK و ERK

3 مناقشة

في السنوات الأخيرة ، وجدت الدراسات أن CDP له تأثير مثبط معين على خطوط خلايا سرطان الدم ، لكن آلية العمل المحددة لم تُعرف بعد.

في عملية موت الخلايا المبرمج ، يعد caspase -9 أحد جزيئات الإشارات الأولية في عملية موت الخلايا المبرمج المعتمدة على caspase. بعد تحفيز الإشارة ، يتحلل pro-caspase -9 بشكل كبير لإنتاج شكل منشط من caspase المشقوق -9 ، والذي يستمر في إرسال إشارات موت الخلايا المبرمج إلى أسفل لتعزيز عملية موت الخلايا المبرمج. Caspase -3 هو جزيء كاسباس من النوع المستجيب وهو جزيء إشارة رئيسي في عملية موت الخلايا المبرمج المعتمد على كاسباس. يوجد أيضًا في شكل pro-enzyme (pro-caspase -3) في ظل الظروف العادية. بمجرد تنشيطها عن طريق التحلل المائي ، يتم إنتاج كمية كبيرة من الكاسبيز المشقوق. -3 ، ستحتوي على مجموعة متنوعة من جزيئات البروتين الرئيسية في الخلايا وتؤدي في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج. ينتمي CDP إلى عديد السكاريد النشط للجزيئات البيولوجية الضخمة ولا يمكنه دخول الخلايا بحرية من خلال غشاء الخلية. لذلك ، يحفز CDP موت الخلايا المبرمج عن طريق التأثير على التعبير وتوزيع المستقبلات على سطح أغشية خلايا Jurkat ، وبالتالي نقل الإشارات إلى داخل الخلايا ، وفي النهاية تنشيط عائلة caspase. البروتين ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. تظهر هذه الدراسة أن التركيز المنخفض لـ CDP لا يحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا Jurkat ، ولكنه يمنع تكاثر الخلايا بشكل أساسي. CD71 ، المعروف أيضًا باسم مستقبلات الترانسفيرين ، هو مستقبلات بروتين سكري عبر الغشاء من النوع الثاني تشارك في امتصاص الحديد وتنظيم نمو الخلايا وتطورها. يتم التعبير عن CD71 بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الحاد ويرتبط بمقاومة الأدوية الأولية ، أي التعبير عن CD71. كلما زادت القيمة ، كان تأثير العلاج الكيميائي الأول أسوأ. لذلك ، يعد CD71 أحد علامات التشخيص الإضافي. يتم التعبير عن CD45 على سطح جميع أنواع الكريات البيض ، والمعروف أيضًا باسم مستضد الكريات البيض الشائع. إنه ينتمي إلى النوع الأول من البروتين السكري عبر الغشاء ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بتطور الخلايا التائية وتمايزها. يحتوي CD45 على مستويات تعبير مختلفة وأنواع خيفية في أنواع مختلفة من سرطان الدم ، لذلك يمكن استخدامه كواحد من علامات التشخيص التفريقي والتنميط المناعي لسرطان الدم. تم استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة CD45 على نطاق واسع في علاج سرطان الدم ، وخاصة سرطان الدم المقاوم للأدوية. فريزين وآخرون وجدت أن النويدات المشعة

يمكن أن يؤدي CD45 mAb الموسوم إلى موت الخلايا المبرمج في سلالات خلايا سرطان الدم المقاومة للأدوية عن طريق تنشيط بروتينات عائلة الكاسبيز (بما في ذلك caspase -3 و caspase -8 و caspase -9). يحفز CDP موت الخلايا المبرمج لخلايا Jurkat ، أولاً عن طريق العمل على مستقبلات سطح غشاء الخلية CD45 و CD71 ، مما يؤثر على التعبير عن الاثنين وتوزيعهما ، ونقل إشارات موت الخلايا المبرمج إلى الخلايا ، وفي النهاية تنشيط caspase -9 و caspase {{8) }} ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، يقع كل من caspase -9 و caspase -3 أسفل مسار موت الخلايا المبرمج ، وتحتاج جزيئات الإشارة في المنبع إلى مزيد من الاستكشاف. في هذه الدراسة ، تم تحفيز CDP بتركيز 5 مجم / مل من موت الخلايا المبرمج لخلايا Jurkat أثناء تثبيط التعبير عن CD45 ، والذي كان مشابهًا لذلك الموجود في الجسم المضاد أحادي النسيلة CD45 الموصوف أعلاه. لذلك ، من منظور المستقبلات المرتبطة بالاستماتة CD45 و CD71 ،سيستانشلديه إمكانية معينة للعلاج أو العلاج المساعد لسرطان الدم.يتم التعبير عن أنظمة كيناز البروتين المنشط Mitogen (MAPKs) في جميع الخلايا حقيقية النواة.

أقراص Cistanche لتحسين نظام المناعة لعلاج اللوكيميا

إنه مسار مهم للغاية لنقل المعلومات يقوم بإجراء نقل إشارة التحفيز خارج الخلية إلى الخلايا ويتكون من كينازات بروتين سيرين / ثريونين ، بما في ذلك ERK و JNK و p38MAPK. الفسفرة وإزالة الفسفرة هي مفاتيح لأنشطة حياة الخلية وتشارك في وتنظيم عملية نمو الخلايا وتكاثرها وتمايزها وتنشيطها وموت الخلايا المبرمج. تشير هذه الدراسة إلى أن نزع الفسفرة من JNK متورط في موت الخلايا المبرمج للخلايا التائية الناجم عن CDP ، بينما تشارك الفسفرة ERK في العمليتين في أن CDP يمنع تكاثر الخلايا ويحفز موت الخلايا المبرمج.

ختاماً،Cistanche CDPله تأثير سام للخلايا على خط خلايا سرطان الدم الليمفاوي التائي Jurkat ، مما يدل على أن التركيزات المنخفضة (أقل من 2 مجم / مل) تمنع تكاثر الخلايا ، في حين أن التركيزات العالية (5 مجم / مل) تحفز موت الخلايا المبرمج.Cistanche CDPيحث على موت الخلايا المبرمج في خلايا Jurkat بشكل رئيسي عن طريق التأثير على الخلايا وتغييرها.

ينقل التعبير عن المستقبلات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج CD71 و CD45 على سطح الغشاء إشارات إلى داخل الخلايا ، مما يتسبب في زيادة فسفرة ERK وإزالة فسفرة JNK ، وأخيرًا تنشيط الكاسبيز -9 ، والذي بدوره ينشط الكاسبيز {{4} } للحث على موت الخلايا المبرمج.